PL242317B1 - Method of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain and its applications - Google Patents
Method of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain and its applications Download PDFInfo
- Publication number
- PL242317B1 PL242317B1 PL433098A PL43309820A PL242317B1 PL 242317 B1 PL242317 B1 PL 242317B1 PL 433098 A PL433098 A PL 433098A PL 43309820 A PL43309820 A PL 43309820A PL 242317 B1 PL242317 B1 PL 242317B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- soil
- strain
- ensifer
- arsenic
- contaminated
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Ensifer M14 do promowania wzrostu roślin, do obniżania toksyczności arsenu w glebie, w fitoremediacji gleb, do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby oraz w remediacji gleb jak również sposobu inokulacji gleby kompozycją zawierającą szczep Ensifer M14.The invention relates to the use of the Ensifer M14 strain to promote plant growth, to reduce the toxicity of arsenic in soils, to phytoremediate soils, to improve the microbiological quality of soils and to remediate soils, as well as a method of inoculating soil with a composition comprising the Ensifer M14 strain.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
DZIEDZINA TECHNIKITECHNICAL FIELD
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Ensifer M14 przez inokulację gleby do promowania wzrostu roślin w glebie oraz do remediacji gleby zanieczyszczonej arsenem i/lub ropopochodnymi związkami organicznymi, jak również sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14.The subject of the invention is the use of the Ensifer M14 strain by soil inoculation to promote plant growth in the soil and to remediate soil contaminated with arsenic and/or petroleum organic compounds, as well as a method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain.
STAN TECHNIKISTATE OF TECHNOLOGY
Wydajność procesu fitoremediacji zależy od wielu czynników, w tym od zdolności roślin do akumulowania zanieczyszczeń, poziomu zanieczyszczeń w glebie, warunków fizycznych i chemicznych gleby, a także od ilości i aktywności mikroorganizmów glebowych. W przypadku zanieczyszczenia gleb arsenem proces fitoremediacji może być wspomagany poprzez bezpośrednie lub pośrednie działania różnych grup mikroorganizmów. Mechanizmy bezpośrednie obejmują (i) wzrost rozpuszczalności i biodostępności arsenu dla roślin, np. z zastosowaniem biosurfaktantów lub bakterii mobilizujących fosfor oraz (ii) biotransformację (redukcja lub utlenianie) arsenu, prowadzącą do zmiany toksyczności. Z kolei mechanizmy pośrednie mają na celu poprawę ogólnej kondycji i/lub promowanie wzrostu roślin, co w konsekwencji prowadzi do zwiększonej bioakumulacji arsenu w tkankach. W tym celu stosuje się mikroorganizmy, zdolne do (i) wytwarzania syderoforów, (ii) wiązania azotu cząsteczkowego lub (iii) wytwarzania kwasów organicznych i fitohormonów.The efficiency of the phytoremediation process depends on many factors, including the ability of plants to accumulate pollutants, the level of pollutants in the soil, the physical and chemical conditions of the soil, as well as the amount and activity of soil microorganisms. In the case of soil contamination with arsenic, the phytoremediation process can be supported by direct or indirect action of various groups of microorganisms. Direct mechanisms include (i) increasing the solubility and bioavailability of arsenic to plants, e.g. using biosurfactants or phosphorus-mobilizing bacteria, and (ii) biotransformation (reduction or oxidation) of arsenic leading to a change in toxicity. On the other hand, indirect mechanisms are aimed at improving the general condition and/or promoting plant growth, which in turn leads to increased bioaccumulation of arsenic in tissues. For this purpose, microorganisms capable of (i) producing siderophores, (ii) fixing molecular nitrogen or (iii) producing organic acids and phytohormones are used.
Najbardziej efektywnymi grupami mikroorganizmów stosowanych w celu poprawy wydajności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem wydają się być te, które wykazują aktywność promującą wzrost roślin jednocześnie za pomocą mechanizmów bezpośrednich oraz pośrednich. Do grupy tych mikroorganizmów należą bakterie transformujące arsen, których aktywność prowadzi nie tylko do utleniania lub redukcji arsenu w glebie (mechanizm bezpośredni), ale może również przyczyniać się do zmian różnorodności autochtonicznej mikrobioty w glebie lub stymulować jej aktywność (mechanizm pośredni). Wśród bakterii transformujących arsen wyróżniane są bakterie redukujące arseniany (ang. arsenates reducing bacteria - ARB) i bakterie utleniające arseniny (ang. arsenites oxidizing bacteria - AOB). Aktywność ARB prowadzi do mobilizacji arsenu z zanieczyszczonej gleby (redukcja arsenianów do arseninów), który następnie wychwytywany jest przez rośliny. Zwiększanie efektywności fitoremediacji poprzez aktywność ARB badano głównie u roślin zdolnych do hiperakumulacji arsenu, ponieważ tylko te rośliny są odporne na bardzo wysokie stężenia arseninów - najbardziej toksycznych związków arsenu. Ograniczeniem zastosowania ARB jest zatem nie tylko konieczność wykorzystania wyspecjalizowanych gatunków roślin (hiperakumulatorów), ale także wysokie ryzyko środowiskowe związane z mobilizacją arsenu z gleby i migracja zanieczyszczeń do innych środowisk, dopóki arsen nie zostanie zakumulowany przez rośliny.The most effective groups of microorganisms used to improve the efficiency of phytoremediation of arsenic-contaminated soils seem to be those that show plant growth-promoting activity by both direct and indirect mechanisms. These microorganisms include arsenic-transforming bacteria, whose activity leads not only to the oxidation or reduction of arsenic in the soil (direct mechanism), but may also contribute to changes in the diversity of indigenous microbiota in the soil or stimulate its activity (indirect mechanism). Arsenic-transforming bacteria include arsenates-reducing bacteria (ARB) and arsenites oxidizing bacteria (AOB). ARB activity leads to the mobilization of arsenic from contaminated soil (reduction of arsenates to arsenites), which is then taken up by plants. Increasing the efficiency of phytoremediation through the activity of ARBs has been studied mainly in plants capable of hyperaccumulating arsenic, because only these plants are resistant to very high concentrations of arsenites - the most toxic arsenic compounds. Therefore, the limitation of the use of ARBs is not only the need to use specialized plant species (hyperaccumulators), but also the high environmental risk associated with the mobilization of arsenic from the soil and the migration of pollutants to other environments until arsenic is accumulated by plants.
Aktywność AOB prowadzi z kolei do utleniania arseninów do arsenianów i przyczynia się do zmniejszenia toksyczności tego pierwiastka w glebie. Bioutlenianie arseninów powoduje, że rośliny są narażone na mniej toksyczne związki arsenu (arseniany) i przez to mogą go akumulować w większych ilościach. Rośliny są zdolne do pobierania z gleby obu związków arsenu i obydwa wykazują znaczącą fitotoksyczność, natomiast wpływ arseninów wydaje się być silniejszy. W przypadku większości roślin niebędących hiperakumulatorami arsenu (zwykłe akumulatory lub rośliny niezdolne do akumulacji), arseniany pobierane z gleby redukowane są wewnątrzkomórkowo do arseninów, które następnie są przekształcane w lotne związki organiczne, które są uwalniane przez liście. Wśród nie-hiperakumulatorów występują różne gatunki roślin, między innymi te rodzime, które naturalnie zasiedlają obszary zanieczyszczone arsenem. Gatunki te, mimo, że nie są zdolne do hiperakumulacji arsenu, mogą także wykazywać znaczący potencjał w procesach fitoremediacji gleb zanieczyszczonych tym pierwiastkiem. Wykorzystanie rodzimych gatunków porastających skażone arsenem obszary wydaje się znacznie bardziej korzystne ze środowiskowego punktu widzenia niż sadzenie hiperakumulatorów, które mogą nie przetrwać w nowych środowiskach, często zanieczyszczonych również innymi związkami. Wykorzystanie rodzimej flory do remediacji zanieczyszczonych arsenem gruntów przyczynia się również do znaczącej redukcji kosztów oczyszczania.The activity of AOB, in turn, leads to the oxidation of arsenites to arsenates and contributes to the reduction of the toxicity of this element in the soil. Biooxidation of arsenites causes that plants are exposed to less toxic compounds of arsenic (arsenates) and thus can accumulate it in larger amounts. Plants are able to take up both arsenic compounds from the soil and both show significant phytotoxicity, while the effect of arsenites seems to be stronger. For most plants that are not hyperaccumulators of arsenic (normal accumulators or non-accumulating plants), arsenates taken up from the soil are reduced intracellularly to arsenites, which are then converted to volatile organic compounds that are released by the leaves. Among the non-hyperaccumulators there are various species of plants, including native ones that naturally inhabit areas contaminated with arsenic. These species, despite the fact that they are not capable of hyperaccumulation of arsenic, may also show significant potential in the processes of phytoremediation of soils contaminated with this element. The use of native species growing in arsenic-contaminated areas seems to be much more beneficial from an environmental point of view than planting hyperaccumulators that may not survive in new environments, often also contaminated with other compounds. The use of native flora for the remediation of arsenic-contaminated land also contributes to a significant reduction in cleaning costs.
Bioaugmentacja gleby za pomocą bakterii utleniających arseniny, może mieć pozytywny wpływ również na liczebność i aktywność autochtonicznej mikrobioty glebowej. Zmniejszenie toksyczności arsenu w glebie przyczynia się nie tylko do poprawy kondycji roślin ale także naturalnego zespołu mikroorganizmów w glebie, co również może odgrywać ważną rolę w oczyszczaniu gleb z arsenu. Zwiększenie liczebności oraz stymulacja aktywności mikrobioty autochtonicznej za pomocą bioaugmentacji gleby AOB może sprzyjać promowaniu wzrostu roślin i tym samym zwiększać efektywność procesu fitoremediacji (mechanizm pośredni). Co więcej, poprawa kondycji mikrobiomu glebowego może także zwiększać podatność gleby na procesy samooczyszczania, w sytuacji gdy jest ona zanieczyszczona np. związkami organicznymi (ropopochodnymi). Zwiększenie liczebności oraz aktywności mikroorganizmów glebowych przyczynia się do szybszej degradacji związków organicznych, powodując jej szybsze oczyszczenie.Soil bioaugmentation with arsenite-oxidizing bacteria may also have a positive effect on the number and activity of autochthonous soil microbiota. Reducing the toxicity of arsenic in the soil contributes not only to the improvement of the condition of plants, but also to the natural complex of microorganisms in the soil, which can also play an important role in the removal of arsenic from soils. Increasing the number and stimulating the activity of autochthonous microbiota by means of AOB soil bioaugmentation may promote plant growth and thus increase the efficiency of the phytoremediation process (an indirect mechanism). Moreover, improving the condition of the soil microbiome may also increase the susceptibility of the soil to self-cleaning processes when it is contaminated with, for example, organic (petroleum) compounds. Increasing the number and activity of soil microorganisms contributes to faster degradation of organic compounds, causing its faster cleaning.
Szczep Ensifer M14 jest szczepem, którego sekwencja genomu jak również znajdujących się w nim dwóch plazmidów została poznana i jest dostępna w ogólnie dostępnych bazach sekwencji nukleotydowych.The Ensifer M14 strain is a strain whose genome sequence as well as its two plasmids have been identified and are available in publicly available nucleotide sequence databases.
Sekwencja całości genomu szczepu Ensifer M14 jest dostępna pod nr dostępu i linkiem: GCA_003355565.1, https://www.ncbi.nlm.nih.goV/assembly/GCF_003355565.1/, sekwencja plazmidu pSinA jest dostępna pod nr dostępu i linkiem JF809815-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF809815 oraz przedstawiona w zgłoszeniu patentowym PL399883, natomiast sekwencja plazmidu pSinB jest dostępna pod nr dostępu i linkiem - KU140623 - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU140623.The complete genome sequence of strain Ensifer M14 is available at Accession No. and link: GCA_003355565.1, https://www.ncbi.nlm.nih.goV/assembly/GCF_003355565.1/, pSinA plasmid sequence is available at Accession No. and link JF809815 - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF809815 and presented in the patent application PL399883, while the pSinB plasmid sequence is available under the accession number and link - KU140623 - https://www.ncbi.nlm.nih .gov/nuccore/KU140623.
UJAWNIENIE WYNALAZKUDISCLOSURE OF THE INVENTION
W świetle opisanego stanu techniki, w celu przezwyciężenia wskazanych niedogodności, twórcy niniejszego wynalazku opracowali nowy sposób wykorzystania szczepu Ensifer M14 (dalej również jako M14) polegający na jego zastosowaniu do promowania wzrostu roślin w glebie, do remediacji gleby zanieczyszczonej arsenem i/lub ropopochodnymi związkami organicznymi. Twórcy niniejszego wynalazku opracowali również nowy sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14. Niniejsze zgłoszenie dotyczy także zwiększenia efektywności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem, promowania wzrostu roślin, a także poprawy jakości biologicznej gleb. Bioaugmentacja gleby szczepem M14 przyczynia się do (i) promowania wzrostu roślin, (ii) zwiększenia zdolności roślin do bioakumulacji arsenu, a także (iii) zwiększenia liczebności oraz stymulacji aktywności naturalnej mikrobioty glebowej. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykorzystania tego szczepu do (iv) wspomagania (bio)remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi, a także (v) sposób bioaugmentacji (inokulacji) gleby szczepem Ensifer M14.In the light of the described state of the art, in order to overcome the indicated disadvantages, the inventors of the present invention have developed a new method of using the Ensifer M14 strain (hereinafter also referred to as M14) consisting in its use to promote plant growth in soil, to remediate soil contaminated with arsenic and/or petroleum organic compounds . The present inventors have also developed a new method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain. The present application also concerns increasing the efficiency of phytoremediation of soils contaminated with arsenic, promoting plant growth, and improving the biological quality of soils. Soil bioaugmentation with the M14 strain contributes to (i) promoting plant growth, (ii) increasing the ability of plants to bioaccumulate arsenic, and (iii) increasing the number and stimulating the activity of natural soil microbiota. The subject of the invention is also the method of using this strain to (iv) support the (bio)remediation of soils contaminated with organic compounds, and (v) the method of soil bioaugmentation (inoculation) with the Ensifer M14 strain.
Nowy sposób wykorzystania szczepu Ensifer M14 polega na jego zastosowaniu w celu zwiększania efektywności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem, a także do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby. Bioaugmentacja gleby szczepem Ensifer M14 przyczynia się do obniżenia toksyczności arsenu w glebie (szczep Ensifer M14 jest zdolny do wydajnego utleniania arseninów do arsenianów, co ma bezpośredni wpływ na obniżenie jego fitotoksyczności) i promowania wzrostu roślin. Obniżenie toksyczności arsenu w glebie, poprawa kondycji roślin oraz ich wyższa biomasa przyczynia się wprost do zwiększonego pobierania arsenu z gleby przez rośliny a tym samym do zwiększania efektywności fitoremediacji. Pozytywny efekt działania szczepu Ensifer M14 potwierdzono na roślinach niebędących hiperakumulatorami arsenu, a należących do grupy roślin występujących dość powszechnie, zasiedlających różne środowiska, w tym także tereny zanieczyszczone arsenem. Oznacza to, że bioaugmentacja gleby szczepem Ensifer M14 umożliwia zastosowanie rodzimych gatunków roślin jako akumulatorów arsenu, zwiększając ich potencjał fitoremediacyjny względem tego pierwiastka.A new way of using the Ensifer M14 strain consists in its use to increase the efficiency of phytoremediation of soils contaminated with arsenic, as well as to improve the microbiological quality of the soil. Soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain contributes to the reduction of arsenic toxicity in the soil (the Ensifer M14 strain is capable of efficient oxidation of arsenites to arsenates, which has a direct impact on reducing its phytotoxicity) and promotes plant growth. Reducing the toxicity of arsenic in the soil, improving the condition of plants and their higher biomass directly contribute to the increased uptake of arsenic from the soil by plants and thus to increasing the efficiency of phytoremediation. The positive effect of the Ensifer M14 strain was confirmed on plants that are not hyperaccumulators of arsenic, and belong to the group of plants that are quite common, inhabiting various environments, including areas contaminated with arsenic. This means that soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain enables the use of native plant species as accumulators of arsenic, increasing their phytoremediation potential with respect to this element.
Nieoczekiwanie okazało się, że obecność szczepu Ensifer M14 w glebie przyczynia się także do promowania wzrostu roślin hodowanych nie tylko w skażonej arsenem glebie, ale także w glebie pozbawionej zanieczyszczeń. Oznacza to, że utlenianie związków arsenu obecnych w glebie nie jest jedynym mechanizmem promowania wzrostu roślin. Szczep Ensifer M14 może zatem zostać wykorzystany także do promowania wzrostu wszystkich roślin, nie tylko roślin rosnących na terenach zanieczyszczonych. Promowanie wzrostu roślin rosnących w niezanieczyszczonej glebie, pod wpływem obecności szczepu Ensifer M14, umożliwia jego wykorzystanie jako biostymulatora wzrostu innych roślin np. uprawnych. Mechanizm promowania wzrostu roślin przez szczep Ensifer M14 w glebach niezanieczyszczonych arsenem i/lub metalami ciężkimi lub ich związkami, choć jest wyraźny, to nie został na razie wyjaśniony.Surprisingly, the presence of the Ensifer M14 strain in the soil also contributes to promoting the growth of plants grown not only in arsenic-contaminated soil, but also in uncontaminated soil. This means that the oxidation of arsenic compounds present in the soil is not the only mechanism to promote plant growth. The Ensifer M14 strain can therefore also be used to promote the growth of all plants, not just plants growing in polluted areas. Promoting the growth of plants growing in uncontaminated soil, under the influence of the presence of the Ensifer M14 strain, makes it possible to use it as a biostimulator of the growth of other plants, e.g. crops. The mechanism of plant growth promotion by the Ensifer M14 strain in soils not contaminated with arsenic and/or heavy metals or their compounds, although clear, has not yet been elucidated.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Ensifer M14 poprzez inokulację gleby do promowania wzrostu roślin w glebie.The subject of the invention is the use of the Ensifer M14 strain by soil inoculation to promote plant growth in the soil.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że rośliny rosną na glebach niezanieczyszczonych.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the plants grow on uncontaminated soils.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że rośliny rosną na glebach zanieczyszczonych arsenem, korzystniej ponadto zanieczyszczonych metalami ciężkimi i/lub ich solami.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the plants grow on soils contaminated with arsenic, more preferably further contaminated with heavy metals and/or their salts.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany do promowania wzrostu roślin dla uzyskania wzrostu plonowania roślin i/lub wzrostu bryły korzeniowej.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to promote plant growth to achieve an increase in plant yield and/or root ball growth.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany do promowania wzrostu korzeniowych roślin uprawnych, korzystnie marchwi, pietruszki, selera, buraka, rzodkiewki, rzepy, brukwi, chrzanu, ziemniaków i batatów.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to promote the growth of root crops, preferably carrots, parsley, celery, beets, radishes, turnips, rutabaga, horseradish, potatoes and sweet potatoes.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie szczepu Ensifer M14 poprzez inokulację gleby do remediacji gleby zanieczyszczonej arsenem i/lub ropopochodnymi związkami organicznymi. Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany do obniżania toksyczności arsenu w glebie zanieczyszczonej arsenem.The subject of the invention is also the use of the Ensifer M14 strain by soil inoculation for the remediation of soil contaminated with arsenic and/or petroleum organic compounds. Preferably, the use of the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to reduce arsenic toxicity in arsenic-contaminated soil.
Korzystniej, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany do obniżania toksyczności arsenu w glebie dodatkowo zanieczyszczonej metalami ciężkimi i/lub ich solami.More preferably, the use of the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to reduce arsenic toxicity in soil further contaminated with heavy metals and/or their salts.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany do zwiększenia efektywności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem. Korzystniej, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany w glebie dodatkowo zanieczyszczonej metalami ciężkimi i/lub ich solami.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to increase the phytoremediation efficiency of soils contaminated with arsenic. More preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is applied in soil additionally contaminated with heavy metals and/or their salts.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 jest stosowany do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby poprzez biostymulację mikrobioty glebowej.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to improve the microbiological quality of the soil by biostimulation of the soil microbiota.
Korzystniej, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 stosowany jest do stymulacji wzrostu liczebności mikroorganizmów heterotroficznych w glebie, korzystnie do stymulacji wzrostu mikroorganizmów zdolnych do denitryfikacji, nitryfikacji i/lub rozkładu celulozy.More preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to stimulate the growth of heterotrophic microorganisms in the soil, preferably to stimulate the growth of microorganisms capable of denitrification, nitrification and/or decomposition of cellulose.
Korzystnie, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 stosowany jest do zwiększenia efektywności remediacji gleb zanieczyszczonych ropopochodnymi związkami organicznymi.Preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used to increase the efficiency of remediation of soils contaminated with petroleum organic compounds.
Korzystniej, zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że szczep Ensifer M14 stosowany jest w glebach ponadto zanieczyszczonych arsenem, korzystniej ponadto zanieczyszczonych metalami ciężkimi i/lub ich solami.More preferably, the use according to the invention is characterized in that the Ensifer M14 strain is used in soils further contaminated with arsenic, more preferably further contaminated with heavy metals and/or their salts.
W końcu, przedmiotem wynalazku jest także sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:Finally, the invention also relates to a method for inoculating soil with the Ensifer M14 strain, characterized in that it comprises the following steps:
a) przygotowuje się hodowlę szczepu Ensifer M14 na podłożu wzrostowym, korzystnie podłożu płynnym Luria-Bertani,a) a culture of the Ensifer M14 strain is prepared on a growth medium, preferably a Luria-Bertani liquid medium,
b) odwirowuje się biomasę bakteryjną szczepu Ensifer M14, korzystnie z prędkością 7000 rpm przez 8 min,b) the bacterial biomass of the Ensifer M14 strain is centrifuged, preferably at 7000 rpm for 8 minutes,
c) zawiesza się biomasę bakteryjną szczepu Ensifer M14 w płynnym izotonicznym nośniku dopuszczonym do stosowania w rolnictwie, korzystnie wodnym roztworze 0,85% NaCl,c) the bacterial biomass of the Ensifer M14 strain is suspended in a liquid isotonic carrier approved for use in agriculture, preferably an aqueous solution of 0.85% NaCl,
d) nanosi się zawiesinę szczepu Ensifer M14 na glebę przy zachowaniu odpowiedniej proporcji objętości zawiesiny szczepu Ensifer M14 do gleby, korzystnie w proporcji 0,4 L zawiesiny szczepu Ensifer M14 na 1 kg suchej masy gleby,d) the suspension of the Ensifer M14 strain is applied to the soil while maintaining the appropriate proportion of the volume of the suspension of the strain of the Ensifer M14 strain to the soil, preferably in the proportion of 0.4 L of the suspension of the strain Ensifer M14 per 1 kg of dry mass of the soil,
e) inokuluje się glebę zawiesiną szczepu Ensifer M14 do uzyskania w glebie co najmniej 102 jednostek tworzących kolonie/ml/g s.m. gleby bakterii szczepu Ensifer M14.e) the soil is inoculated with a suspension of the strain Ensifer M14 until at least 102 colony forming units/ml/g DM are obtained in the soil. soil of Ensifer M14 strain bacteria.
Korzystnie, sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14 według wynalazku charakteryzuje się tym, że inokulację przeprowadza się do uzyskania w glebie co najmniej 103, korzystniej co najmniej 104, korzystniej co najmniej 105, korzystniej co najmniej 106, korzystniej co najmniej 107, korzystniej co najmniej 108 jednostek tworzących kolonie/ml/g s.m. gleby bakterii szczepu Ensifer M14.Preferably, the method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain according to the invention is characterized in that the inoculation is carried out until at least 103, more preferably at least 104 , more preferably at least 105, more preferably at least 106, more preferably at least 107, more preferably at least 10 8 colony forming units/ml/g dm of soil of Ensifer M14 strain.
Korzystnie, sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14 według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiesina jest nanoszona poprzez opryskiwanie, zraszanie, polewanie gleby.Preferably, the method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain according to the invention is characterized in that the suspension is applied by spraying, sprinkling, pouring onto the soil.
Korzystnie, sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14 według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiesina jest nanoszona w stosunku objętościowym zawiesiny do gleby w przedziale od 1 : 10 do 3 : 10.Preferably, the method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain according to the invention is characterized in that the slurry is applied in a volume ratio of slurry to soil in the range of 1:10 to 3:10.
Korzystnie, sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14 według wynalazku charakteryzuje się tym, że inokulacja odbywa się 14 dni przed, korzystnie 7 dni przed, korzystnie 48 godzin przed, jeszcze korzystniej 24 godziny przed planowanymi zabiegami agrotechnicznymi w glebie. Korzystnie, sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14 według wynalazku charakteryzuje się tym, że zabiegiem agrotechnicznymi w glebie jest wysiew bądź sadzenie roślin.Preferably, the method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain according to the invention is characterized in that the inoculation takes place 14 days before, preferably 7 days before, preferably 48 hours before, even more preferably 24 hours before the planned agricultural operations in the soil. Preferably, the method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain according to the invention is characterized by the fact that the agrotechnical treatment in the soil is sowing or planting plants.
Bioaugmentacja gleby szczepem Ensifer M14 ma również pozytywny wpływ na kondycję autochtonicznej mikrobioty glebowej. Obecność szczepu Ensifer M14 w glebie przyczynia się do zwiększania liczebności oraz stymulacji aktywności mikroorganizmów glebowych, które wchodząc w interakcje z roślinami również powodują promowanie ich wzrostu. Biostymulacja mikrobioty glebowej znajdującej się w glebie zanieczyszczonej arsenem powoduje, że wzrasta ogólna liczebność mikroorganizmów (heterotroficznych), w tym tych zdolnych do denitryfikacji czy rozkładu celulozy, ale także bakterii chemolitoautotroficznych zdolnych do nitryfikacji. Lepsza kondycja oraz wyższa liczebność przyczynia się także do wzrostu aktywności enzymatycznej mierzonej w ekstrakcie glebowym - odnotowano wzrost aktywności celulaz i dehydrogenaz. Wzrost liczebności oraz aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej pod wpływem aktywności szczepu M14 świadczy o poprawie jakości biologicznej gleby i zwiększa jej podatność np. na procesy samooczyszczania.Soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain also has a positive effect on the condition of indigenous soil microbiota. The presence of the Ensifer M14 strain in the soil contributes to the increase in the number and stimulation of the activity of soil microorganisms, which interact with plants and promote their growth. Biostimulation of soil microbiota found in soil contaminated with arsenic causes an increase in the total number of (heterotrophic) microorganisms, including those capable of denitrification or decomposition of cellulose, but also chemolithoautotrophic bacteria capable of nitrification. Better condition and higher numbers also contribute to the increase in enzymatic activity measured in the soil extract - an increase in the activity of cellulases and dehydrogenases was noted. The increase in the number and activity of autochthonous soil microbiota under the influence of the activity of the M14 strain proves the improvement of the biological quality of the soil and increases its susceptibility, e.g. to self-purification processes.
Ze względu na zwiększoną oporność szczepu Ensifer M14 na inne metale ciężkie, a nie tylko arsen, nadawaną mu przez plazmid pSinB, szczep Ensifer M14 znajduje również zastosowanie w bioremediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi i/lub ich związkami.Due to the increased resistance of the Ensifer M14 strain to other heavy metals, not only arsenic, given to it by the pSinB plasmid, the Ensifer M14 strain is also used in the bioremediation of soils contaminated with heavy metals and/or their compounds.
Ze względu na zwiększanie jakości biologicznej gleby pod wpływem jej bioaugmentacji szczepem Ensifer M14, znajduje on zastosowanie w bioremediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi np. ropopochodnymi. Zwiększanie liczebności i aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej na skutek bioaugmentacji szczepem M14 przyczynia się do wzrostu wydajności degradacji związków organicznych poprzez wykorzystywanie ich przez mikroorganizmy w procesach metabolicznych np. jako źródło węgla. Zastosowanie szczepu M14 w warunkach rzeczywistych do celów bioremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem lub związkami ropopochodnymi nie stanowi zagrożenia dla środowiska, ze względu na fakt iż M14 jest szczepem naturalnym, niemodyfikowanym i wyizolowanym ze środowiska.Due to the increase in the biological quality of the soil under the influence of its bioaugmentation with the Ensifer M14 strain, it is used in the bioremediation of soils contaminated with organic compounds, e.g. petroleum derivatives. Increasing the number and activity of autochthonous soil microbiota as a result of bioaugmentation with the M14 strain contributes to an increase in the efficiency of degradation of organic compounds by using them by microorganisms in metabolic processes, e.g. as a carbon source. The use of the M14 strain in real conditions for the purpose of bioremediation of soils contaminated with arsenic or petroleum compounds does not pose a threat to the environment, due to the fact that the M14 strain is a natural, unmodified strain and isolated from the environment.
Zgłoszenie dotyczy również sposobu inokulacji gleby szczepem Ensifer M14. Bakterie dodawane są do gleby w postaci suchej lub płynnej. Inokulacja gleby przez bakterie Ensifer M14 w postaci płynnej może być prowadzona z wykorzystaniem brzeczki hodowlanej o odpowiedniej liczebności mikroorganizmów oraz zawieszenie w odpowiednim roztworze, korzystnie dopuszczonym jako nośnik w rolnictwie. Bioaugmentacja gleby powinna być także przeprowadzona w odpowiednim stosunku objętościowym hodowli do gleby oraz w odpowiednim czasie poprzedzającym inne zabiegi np. sadzenie roślin.The application also relates to a method of soil inoculation with the strain Ensifer M14. Bacteria are added to the soil in dry or liquid form. Soil inoculation by Ensifer M14 bacteria in liquid form can be carried out using a culture broth with an appropriate number of microorganisms and suspension in a suitable solution, preferably approved as a carrier in agriculture. Soil bioaugmentation should also be carried out in the appropriate volume ratio of the culture to the soil and in the right time before other treatments, e.g. planting.
Przedmiotem zgłoszenia jest nowy sposób zastosowania szczepu Ensifer M14 jako biokatalizatora przeznaczonego do poprawy jakości biologicznej gleb oraz promowania wzrostu roślin. Nowe zastosowanie szczepu M14 obejmuje wykorzystanie go do:The subject of the application is a new method of using the Ensifer M14 strain as a biocatalyst intended to improve the biological quality of soils and to promote plant growth. The new use of the M14 strain includes using it for:
- promowania wzrostu roślin rosnących na ternach niezanieczyszczonych,- promoting the growth of plants growing on unpolluted areas,
- promowania wzrostu roślin rosnących na terenach zanieczyszczonych arsenem,- promoting the growth of plants growing in areas contaminated with arsenic,
- obniżania toksyczności arsenu w glebie,- reducing the toxicity of arsenic in the soil,
- zwiększania wydajności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem,- increasing the efficiency of phytoremediation of soils contaminated with arsenic,
- poprawy jakości mikrobiologicznej gleby,- improving the microbiological quality of the soil,
- zwiększania efektywności remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi.- increasing the effectiveness of remediation of soils contaminated with organic compounds.
Przedmiotem zgłoszenia jest również sposób inokulacji gleby szczepem Ensifer M14. Obejmuje on następujące etapy:The subject of the application is also a method of soil inoculation with the Ensifer M14 strain. It includes the following stages:
a) przygotowanie hodowli mikroorganizmów o odpowiedniej liczebności,a) preparation of a culture of microorganisms with an appropriate number,
b) odwirowanie biomasy bakteryjnej,b) centrifugation of bacterial biomass,
c) zawieszenie biomasy bakteryjnej w roztworze,c) suspension of bacterial biomass in solution,
d) zachowanie odpowiedniej proporcji objętości hodowli bakteryjnej do gleby,d) maintaining the appropriate proportion of the volume of the bacterial culture to the soil,
e) inokulacja gleby w odpowiednim czasie poprzedzającym inne zabiegi np. sadzenie roślin.e) soil inoculation at an appropriate time prior to other treatments, e.g. planting.
Zastosowanie szczepu Ensifer M14 obejmuje jego stosowanie do promowania wzrostu roślin rosnących na terenach niezanieczyszczonych. Bioaugmentacja gleby szczepem M14 przyczynia się do zwiększania biomasy roślin (lucerny - Medicago sativa L.) hodowanych w glebie ogrodowej pozbawionej zanieczyszczeń. Przyrost biomasy roślin odnotowano w przypadku korzeni, który wynosił 49%. Biomasa części nadziemnych nie uległa zwiększeniu w stosunku do roślin hodowanych bez bioaugmentacji gleby szczepem M14. Obserwacje te poczyniono w trakcie 28-dniowego eksperymentu. Zastosowanie szczepu M14 zatem dotyczy promowania wzrostu roślin rosnących w glebach niezanieczyszczonych w tym np. korzeniowych roślin uprawnych.The use of the Ensifer M14 strain includes its use to promote the growth of plants growing in uncontaminated areas. Soil bioaugmentation with the M14 strain contributes to increasing the biomass of plants (alfalfa - Medicago sativa L.) grown in garden soil free of contamination. The increase in plant biomass was noted in the case of roots, which was 49%. The biomass of the above-ground parts did not increase in relation to the plants grown without soil bioaugmentation with the M14 strain. These observations were made during a 28-day experiment. The use of the M14 strain therefore relates to promoting the growth of plants growing in uncontaminated soils including, for example, root crops.
Zastosowanie szczepu M14 do promowania wzrostu roślin rosnących na terenach zanieczyszczonych arsenem. Bioaugmentacja gleby szczepem M14 przyczyniała się do zwiększania biomasy roślin (lucerny - Medicago sativa L.) hodowanych w otoczeniu arsenu. Przyrost biomasy odnotowano zarówno w przypadku korzeni jak i części nadziemnych, i wynosił on odpowiednio 47% i 51% w trakcie 28-dniowego eksperymentu.The use of the M14 strain to promote the growth of plants growing in arsenic-contaminated areas. Soil bioaugmentation with the M14 strain contributed to increasing the biomass of plants (alfalfa - Medicago sativa L.) grown in the presence of arsenic. The increase in biomass was recorded for both the roots and the above-ground parts, and it was 47% and 51%, respectively, during the 28-day experiment.
Zastosowanie szczepu M14 do obniżania toksyczności arsenu w glebie. Zdolność szczepu M14 do efektywnego utleniania arseninów do arsenianów, również w warunkach środowiskowych, zapew niona jest poprzez obecność plazmidu pSinA. Plazmid pSinA zawiera geny kodujące białka odpowiedzialne za utlenianie arseninów do arseninów. pSinA jest plazmidem o szerokim zakresie gospodarza, tak więc może przenosić się do komórek mikrobioty autochtonicznej gleb, które nabywają zdolność do utleniania arseninów. Szczep M14 jest zdolny do redukcji zawartości arseninów w glebie o 75% w ciągu 28 dni, przy początkowej zawartości As (III) równiej 75 mg/kg.Use of strain M14 to reduce arsenic toxicity in soil. The ability of the M14 strain to effectively oxidize arsenites to arsenates, also under environmental conditions, is ensured by the presence of the pSinA plasmid. The pSinA plasmid contains genes encoding proteins responsible for the oxidation of arsenites to arsenites. pSinA is a plasmid with a wide host range, so it can be transferred to cells of indigenous soil microbiota, which acquire the ability to oxidize arsenites. The M14 strain is able to reduce the arsenite content in the soil by 75% within 28 days, with an initial As(III) content of 75 mg/kg.
Zastosowanie szczepu M14 do zwiększania wydajności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem. Suplementacja gleby szczepem M14 przyczyniła się do zwiększenia efektywności usuwania arsenu z gleby za pomocą roślin. Na podstawie analizy całkowitej zawartości arsenu w glebie wykazano, że wydajność fitoremediacji gleby z dodatkiem M14 była o 11% wyższa w stosunku do gleby bez inokulacji. Taką różnicę odnotowano w trakcie 28-dniowego eksperymentu.The use of the M14 strain to increase the efficiency of phytoremediation of soils contaminated with arsenic. Soil supplementation with the M14 strain contributed to increasing the effectiveness of arsenic removal from the soil by plants. Based on the analysis of the total arsenic content in the soil, it was shown that the phytoremediation efficiency of the soil with the M14 addition was 11% higher than that of the soil without inoculation. Such a difference was noted during the 28-day experiment.
Zastosowanie szczepu M14 do poprawy jakości mikrobiologicznej gleby. Wykazano, że bioaugmentacja gleby zanieczyszczonej arsenem szczepem M14 przyczynia się do zwiększenia liczebności oraz stymulacji aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej. W glebie z dodatkiem szczepu M14 wzrosła liczebność mikroorganizmów heterotroficznych o dwa rzędy wielkością denitryfikacyjnych i nitryfikacyjnych o jeden rząd wielkości. W glebie bez inokulacji liczebności mikroorganizmów pozostała bez zmian. W przypadku bakterii celulolitycznych, ich liczebność pozostała bez zmian w glebie wzbogaconej M14,podczas gdy w glebie bez inokulacji spadła o jeden rząd wielkości.The use of the M14 strain to improve the microbiological quality of the soil. It has been shown that bioaugmentation of soil contaminated with arsenic with the M14 strain contributes to the increase in the number and stimulation of the activity of autochthonous soil microbiota. In the soil with the addition of the M14 strain, the number of heterotrophic microorganisms increased by two orders of magnitude, denitrifying and nitrifying by one order of magnitude. In the soil without inoculation, the number of microorganisms remained unchanged. In the case of cellulolytic bacteria, their abundance remained unchanged in the M14-supplemented soil, while it decreased by one order of magnitude in the non-inoculated soil.
Zastosowanie szczepu M14 do zwiększania efektywności remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi. Metody bioremediacji tego typu gleb opierają się zwykle na procesach biodegradacji związków organicznych, które mogą być wykorzystywane przez mikroorganizmy jako substraty odżywcze np. w postaci organicznego źródła węgla. Efektywność metod biodegradacji zależy bezpośrednio od liczebności i aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej. Bioaugmentacja gleby szczepem M14 sprzyja rozwojowi mikroorganizmów glebowych oraz stymuluje ich aktywność a zatem przyczynia się do zwiększenia efektywności biodegradacji zanieczyszczeń organicznych w glebie.The use of the M14 strain to increase the effectiveness of remediation of soils contaminated with organic compounds. Bioremediation methods for this type of soil are usually based on the processes of biodegradation of organic compounds that can be used by microorganisms as nutrient substrates, e.g. in the form of an organic carbon source. The effectiveness of biodegradation methods depends directly on the number and activity of autochthonous soil microbiota. Soil bioaugmentation with the M14 strain promotes the development of soil microorganisms and stimulates their activity, and thus contributes to increasing the efficiency of biodegradation of organic pollutants in the soil.
W celu przeprowadzenia inokulacji/bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14 konieczne jest namnożenie tego szczepu na odpowiednim podłożu (Etap (a)) w celu uzyskania odpowiedniej liczebności komórek, a następnie dodanie ich do gleby. Specjalista w dziedzinie będzie w stanie wybrać odpowiednie podłoże mikrobiologiczne do namnożenia komórek, przykładowo może być to podłoże płynne LB (Luria-Bertani).In order to inoculate/bioaugment the soil with Ensifer M14, it is necessary to multiply the strain in a suitable medium (Step (a)) to obtain the appropriate number of cells and then add them to the soil. The person skilled in the art will be able to select a suitable microbial medium for cell propagation, for example LB (Luria-Bertani) liquid medium.
W kolejnym etapie konieczna jest separacja biomasy bakteryjnej od pozostałej cieczy pohodowlanej (Etap(b)). Separacja może być wykonana w dowolny znany w dziedzinie sposób, na przykład poprzez wirowanie w wirówce, przykładowo z prędkością 7000 rpm przez 8 minut.In the next stage, it is necessary to separate the bacterial biomass from the remaining post-culture liquid (Step(b)). Separation may be performed in any manner known in the art, for example by centrifugation, for example at 7000 rpm for 8 minutes.
Etap zawieszania biomasy w roztworze(c) ma na celu usunięcie resztek podłoża pełnego, w którym znajdują się różne związki stanowiące pozostałość składników podłoża, a także mieszanina metabolitów bakteryjnych. Etap ten powinien być wykonany za pomocą przepłukiwania, korzystnie dwukrotnego przepłukiwania biomasy bakteryjnej roztworem soli fizjologicznej (NaCl 0,85%),korzystnie dodając jej taką samą objętość ile znajdowało się podłoża mikrobiologicznego w próbce.The stage of suspending the biomass in the solution (c) is aimed at removing the remnants of the solid medium, in which there are various compounds that are the remains of the substrate components, as well as a mixture of bacterial metabolites. This step should be performed by rinsing, preferably twice, of the bacterial biomass with a saline solution (0.85% NaCl), preferably adding to it the same volume as the microbial medium in the sample.
Etap(d) dotyczy ustalania odpowiednich proporcji mieszania odwirowanych w etapie(b) oraz zawieszonych w roztworze w etapie(c) mikroorganizmów z glebą. Etap ten wymaga dokładnego określenia gęstości optycznej hodowli. W przypadku szczepu Ensifer M14 wartość optyczna gęstości hodowli (ang. optical density) mierzona przy długości fali równej 600 nm korzystnie wynosi 0,20. Przygotowana w powyższy sposób hodowla mikroorganizmów jest dodawana do gleby, korzystnie w proporcji 0,4 L/kg suchej masy gleby. Tak przeprowadzona inokulacja gleby szczepem Ensifer M14 spowoduje, że w glebie będzie znajdowało się najkorzystniej ok. 108 jednostek tworzących kolonie/ml [JTK/ml]/g s.m. gleby.Step (d) is concerned with determining the appropriate mixing proportions of the microorganisms centrifuged in step (b) and suspended in solution in step (c) with the soil. This step requires an accurate determination of the optical density of the culture. In the case of the Ensifer M14 strain, the optical density of the culture, measured at a wavelength of 600 nm, is preferably 0.20. The culture of microorganisms prepared in the above manner is added to the soil, preferably in a proportion of 0.4 L/kg of dry weight of the soil. Soil inoculation with the Ensifer M14 strain carried out in this way will result in the most favorable amount of about 108 colony-forming units/ml [JTK/ml]/g dm of soil in the soil.
Etap(e) dotyczy inokulacji gleby szczepem Ensifer M14 z zachowaniem odpowiedniego czasu przed wykonywaniem zabiegów agrotechnicznych np. sadzenia roślin. Bioaugmentacja gleby bakteriami M14, korzystnie odbywa się 14 dni przed, korzystnie 7 dni przed, korzystnie 48 godzin przed, jeszcze korzystniej 24 godziny przed planowanymi zabiegami agrotechnicznymi w glebie.Stage(s) concerns the inoculation of the soil with the Ensifer M14 strain with the appropriate time before performing agricultural operations, e.g. planting plants. Soil bioaugmentation with M14 bacteria preferably takes place 14 days before, preferably 7 days before, preferably 48 hours before, even more preferably 24 hours before the planned agricultural operations in the soil.
OPIS FIGUR RYSUNKUDESCRIPTION OF DRAWING FIGURES
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w nieograniczających przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:For a better understanding of the invention, it is illustrated by non-limiting embodiments and the accompanying drawings, in which:
Fig. 1 przedstawia analizę suchej masy poszczególnych części roślin (liści - leaves i korzeni - roots) hodowanych w glebie niezanieczyszczonej oraz zanieczyszczonej arsenem, wzbogaconej szczepem Ensifer M14 oraz w glebie bez bioaugmentacji tym szczepem jako kontroli.Fig. 1 shows the dry weight analysis of individual parts of plants (leaves and roots) grown in uncontaminated and arsenic-contaminated soil enriched with the Ensifer M14 strain and in soil without bioaugmentation with this strain as a control.
Fig. 2 przedstawia procentowy udział arseninów (As(III)) oraz arsenianów (As(V)) w glebie zanieczyszczonej arsenem pod wpływem aktywności szczepu Ensifer M14 oraz bez jego udziału.Fig. 2 shows the percentage of arsenites (As(III)) and arsenates (As(V)) in the arsenic-contaminated soil with and without the activity of the Ensifer M14 strain.
Fig. 3 przedstawia całkowitą zawartość arsenu w poszczególnych częściach roślin (liściach - leaves i korzeniach - roots) hodowanych w glebie z dodatkiem szczepu Ensifer M14 lub bez bioaugmentacji.Fig. 3 shows the total arsenic content in individual parts of plants (leaves and roots) grown in soil with the addition of the Ensifer M14 strain or without bioaugmentation.
Fig. 4 przedstawia całkowitą zawartość arsenu w glebie, w której hodowano rośliny oraz którą poddano/nie poddano bioaugmentacji szczepem Ensifer M14.Figure 4 shows the total arsenic content of the soil grown and bioaugmented/not bioaugmented with Ensifer M14.
SZCZEGÓŁOWE OMÓWIENIE WYNALAZKUDETAILED SUMMARY OF THE INVENTION
Jeśli nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach stosowano standardowe materiały i metody znane specjalistom w dziedzinie techniki lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla podanych materiałów i metod.Unless otherwise indicated, the following examples used standard materials and methods known to those skilled in the art or followed the manufacturers' recommendations for the materials and methods given.
PRZYKŁADYEXAMPLES
Przykład 1. Promowanie wzrostu roślin hodowanych w glebie niezanieczyszczonej pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14.Example 1. Growth promotion of plants grown in uncontaminated soil by soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain.
W prezentowanym przykładzie wykorzystano glebę ogrodową, którą inokulowano szczepem Ensifer M14. W tym celu szczep M14 namnożono na podłożu LB, a następnie biomasę bakteryjną odseparowano od pozostałej cieczy poprzez wirowanie z prędkością 7000 rpm przez 8 minut. W kolejnym etapie, uzyskaną biomasę zawieszono w roztworze soli fizjologicznej (NaCl 0,85%), dodając jej taką samą objętość ile znajdowało się podłoża mikrobiologicznego w próbce. Tak przygotowane inokulum bakteryjne dodano do gleby w ilości 0,4 L/kg suchej masy gleby. Liczebność mikroorganizmów w glebie po inokulacji wynosiła ok. 108 jednostek tworzących kolonie/ml [JTK/ml]/g s.m. gleby. Odczyn gleby był lekko kwaśny i wynosił 6,85. Następny etap prac związany był z posadzeniem roślin do gleby. Do badań wykorzystano lucernę siewną (Medicago sativa L.), odmiana Tango. Rośliny, które posadzono do gleby wzbogaconej mikroorganizmami zostały uprzednio poddane hodowli wstępnej. Nasiona roślin lucerny zostały posadzone do gleby bez dodatku mikroorganizmów i były w niej inkubowane przez 21 dni. Hodowlę wstępną przeprowadzono w doniczkach zwierających po 2 kg gleby. Po tym czasie, młode rośliny zostały przesadzone do uprzednio przygotowanej gleby, którą poddano bioaugmentacji szczepem M14. Eksperyment ten prowadzono w 5 jednakowych doniczkach zawierających po 100 g gleby. W każdej z nich posadzono po 5 roślin - łącznie 25 roślin. Warianty kontrolne stanowiły hodowle roślin nie poddane bioaugmentacji szczepem M14. Hodowle prowadzono przez 28 dni, podczas których monitorowano wzrost oraz kondycję roślin. Uzyskane wyniki przedstawiono na Figurze 1.In the presented example, garden soil was used, which was inoculated with the Ensifer M14 strain. For this purpose, the M14 strain was propagated on LB medium, and then the bacterial biomass was separated from the remaining liquid by centrifugation at 7000 rpm for 8 minutes. In the next stage, the obtained biomass was suspended in a saline solution (NaCl 0.85%), adding to it the same volume as the microbial medium in the sample. The bacterial inoculum prepared in this way was added to the soil in the amount of 0.4 L/kg of dry weight of the soil. The number of microorganisms in the soil after inoculation was approximately 108 colony-forming units/ml [JTK/ml]/g DM. soil. The pH of the soil was slightly acidic and amounted to 6.85. The next stage of work was related to planting the plants in the soil. Alfalfa (Medicago sativa L.), Tango variety, was used in the study. Plants that were planted in soil enriched with microorganisms were previously precultured. Alfalfa seeds were planted in soil without the addition of microorganisms and incubated for 21 days. The preculture was carried out in pots containing 2 kg of soil. After this time, the young plants were transplanted into previously prepared soil, which was bioaugmented with the M14 strain. This experiment was carried out in 5 identical pots containing 100 g of soil each. In each of them, 5 plants were planted - a total of 25 plants. The control variants were plant cultures not bioaugmented with the M14 strain. The cultures were carried out for 28 days, during which the growth and condition of the plants were monitored. The results obtained are shown in Figure 1.
Wykazano, że bioaugmentacja gleby szczepem Ensfier M14 przyczyniła się do wzrostu ogólnej biomasy roślin względem roślin hodowanych w glebie bez dodatku tego szczepu. Wzrost biomasy zaobserwowano jedynie w przypadku korzeni i był on niemal dwukrotny. W przypadku nadziemnych części roślin takiego efektu nie odnotowano - biomasa zielonych części roślin hodowanych w obecności szczepu M14 była zbliżona do tej uzyskanej w glebie bez bioaugmentacji. Promowanie wzrostu korzeni roślin hodowanych w glebach nie zanieczyszczonych wskazuje, że bioaugmentacja gleby szczepem M14 wpływa na zwiększenie biomasy roślin, dla których rozwój korzeniowy odgrywa szczególnie istotną rolę. Przykładem takich roślin mogą być korzeniowe rośliny uprawne takie jak np. marchew, pietruszka, seler, burak, rzodkiewka, rzepa, brukiew, chrzan, ziemniaki i bataty.It was shown that soil bioaugmentation with the Ensfier M14 strain contributed to an increase in the total plant biomass compared to plants grown in soil without the addition of this strain. An increase in biomass was observed only in the case of roots and it was almost twofold. In the case of above-ground parts of plants, such an effect was not observed - the biomass of green parts of plants grown in the presence of the M14 strain was similar to that obtained in soil without bioaugmentation. Promoting the growth of roots of plants grown in uncontaminated soils indicates that soil bioaugmentation with the M14 strain increases the biomass of plants, for which root development plays a particularly important role. Examples of such plants are root crops such as, for example, carrots, parsley, celery, beets, radishes, turnips, rutabaga, horseradish, potatoes and sweet potatoes.
Przykład 2. Promowanie wzrostu roślin hodowanych w glebie zanieczyszczonej arsenem pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14.Example 2. Growth promotion of plants grown in soil contaminated with arsenic under the influence of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain.
W prezentowanym przykładzie wykorzystano glebę ogrodową, którą zanieczyszczono związkami arsenu - arseninami (Na2AsO3) o stężeniu 75 mg/kg suchej masy gleby, a także rośliny - lucernę siewną (Medicago sativa L.), odmiana Tango. Inokulację gleby szczepem Ensifer M14 przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną w Przykładzie 1. Rośliny, które posadzono do gleby zanieczyszczonej arsenem zostały uprzednio poddane wstępnej hodowli przeprowadzonej w 3 doniczkach zwierających po 2 kg gleby. Nasiona lucerny zostały zasiane do gleby zanieczyszczonej arseninami o stężeniu 10 mg/kg s.m. gleby i były w niej inkubowane przez 21 dni. Po tym czasie, młode rośliny zostały przesadzone do uprzednio przygotowanej gleby o wyższej zawartości arsenu (75 mg/kg s.m. gleby) oraz poddane bioaugmentacji szczepem M14. Wariant kontrolny stanowiła gleba zanieczyszczona arseninami ale nie wzbogacana szczepem Ensifer M14. Hodowlę roślin w tym układzie prowadzono przez 28 dni. W celu określenia wpływu bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14 na wzrost roślin, przeprowadzono analizę biomasy korzeni oraz nadziemnych części roślin na początku (TO) oraz na końcu przeprowadzonego ekskrementu (T28). Uzyskane wyniki przedstawiono na Figurze 1.In the presented example, garden soil was used, which was contaminated with arsenic compounds - arsenites (Na2AsO3) at a concentration of 75 mg/kg of dry weight of soil, as well as plants - alfalfa (Medicago sativa L.), Tango variety. Soil inoculation with the Ensifer M14 strain was performed according to the procedure described in Example 1. Plants that had been planted in arsenic-contaminated soil had previously been precultivated in 3 pots containing 2 kg of soil each. Alfalfa seeds were sown in soil contaminated with arsenites at a concentration of 10 mg/kg d.m. soil and incubated therein for 21 days. After this time, the young plants were transplanted into previously prepared soil with a higher arsenic content (75 mg/kg d.w. soil) and bioaugmented with the M14 strain. The control variant was soil contaminated with arsenites but not enriched with the Ensifer M14 strain. Plants were grown in this system for 28 days. In order to determine the effect of soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain on plant growth, an analysis of the biomass of roots and above-ground parts of plants was carried out at the beginning (TO) and at the end of the excrement (T28). The results obtained are shown in Figure 1.
Wykazano, że bioaugmentacja gleby zanieczyszczonej arsenem szczepem Ensifer M14 przyczyniła się do wzrostu biomasy zarówno korzeni jak i części nadziemnych roślin względem roślin hodowanych bez dodatku tego szczepu. W przypadku korzeni odnotowano niemal dwukrotny wzrost biomasy, natomiast w przypadku części nadziemnych był to wzrost ponad dwukrotny. Co więcej, stwierdzono, że obecność szczepu M14 w glebie spowodowała znaczące ograniczenie fitotoksyczności arsenu. Wykazano, że biomasa korzeni roślin hodowanych w glebie z dodatkiem arsenu i bioaugmentowanej szczepem M14 była niemal jednakowa, a nawet nieznacznie wyższa niż biomasa korzeni roślin rosnących w glebie bez dodatku arsenu i bez bioaugmentacji szczepem M14.It was shown that bioaugmentation of soil contaminated with arsenic with the Ensifer M14 strain contributed to an increase in the biomass of both roots and above-ground parts of plants in relation to plants grown without the addition of this strain. In the case of roots, an almost two-fold increase in biomass was noted, while in the case of above-ground parts it was more than two-fold. Moreover, the presence of the M14 strain in the soil was found to significantly reduce arsenic phytotoxicity. It was shown that the root biomass of plants grown in soil with the addition of arsenic and bioaugmented with the M14 strain was almost the same and even slightly higher than the biomass of the roots of plants growing in the soil without the addition of arsenic and without bioaugmentation with the M14 strain.
Przykład 3. Redukcja toksyczności arsenu w glebie pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14.Example 3. Reduction of arsenic toxicity in soil under the influence of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain.
W prezentowanym przykładzie wykorzystano próbki gleby uzyskane w wyniku przeprowadzenia eksperymentu opisanego w Przykładzie 2.In the presented example, soil samples obtained as a result of the experiment described in Example 2 were used.
W celu określenia toksyczności arsenu w glebie pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14 wykonano analizę specjacji tego pierwiastka w glebie. Pierwszym etapem analizy specjacji arsenu w glebie była jego chemiczna ekstrakcja. Ekstrakcję arsenu z próbki gleby przeprowadzono według następującej procedury: do 1 g gleby dodano 10 ml roztworu ekstrahującego (1M H3PO4 oraz 0.5 M kwasu askorbinowego),a następnie otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 150°C przez 3 godziny w zamkniętym układzie mikrofalowym (Milestone Ethos Plus). Po ostudzeniu, ekstrakty zostały przefiltrowane przez filtry celulozowej nadmiar ekstrahentu odparowano (72 godziny w temperaturze pokojowej). Po odparowaniu, do ekstraktów dodano 10 ml mieszaniny buforów fosforanowych (15 mM KH2PO4 i 15 mM K2HPO4) i przechowywano je w temperaturze 4°C do momentu analizy. W celu określenia specjacji arsenu w otrzymanych ekstraktach zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową (Waters, Milford, MA, USA) z kolumną Waters IC-PakTM Anion HC; 150 na 4,6 mm; wielkość porów: 10 μm i fazą ruchomą w postaci 15 mM buforu fosforanowego. Poszczególne związki arsenu oznaczono za pomocą detektora Waters Photo Diode Array Detector (W2998) przy 193 nm. Uzyskane wyniki przedstawiono na Figurze 2.In order to determine the toxicity of arsenic in soil under the influence of soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain, speciation analysis of this element in soil was performed. The first step in the analysis of arsenic speciation in the soil was its chemical extraction. Extraction of arsenic from a soil sample was carried out according to the following procedure: 10 ml of extraction solution (1M H3PO4 and 0.5 M ascorbic acid) were added to 1 g of soil, and then the resulting mixture was heated at 150°C for 3 hours in a closed microwave system (Milestone Ethos Plus ). After cooling, the extracts were filtered through cellulose filters, excess extractant was evaporated (72 hours at room temperature). After evaporation, 10 ml of a mixture of phosphate buffers (15 mM KH2PO4 and 15 mM K2HPO4) was added to the extracts and stored at 4°C until analysis. High-performance liquid chromatography (Waters, Milford, MA, USA) with a Waters IC-PakTM Anion HC column was used to determine arsenic speciation in the obtained extracts; 150 by 4.6mm; pore size: 10 μm and mobile phase in the form of 15 mM phosphate buffer. Individual arsenic compounds were determined using the Waters Photo Diode Array Detector (W2998) at 193 nm. The results obtained are shown in Figure 2.
Analiza specjacji arsenu w glebie wykazała, że szczep Ensifer M14 jest zdolny do efektywnej transformacji arseninów do arsenianów w glebie, co ma bezpośredni wpływ na obniżenie toksyczności tego pierwiastka w glebie - arseniany wykazują znacznie niższą toksyczność niż arseniny. Wykazano, że po 28 dniach eksperymentu, w glebie zawierającej początkowo ok. 75 mg As/kg, pozostało jedynie mniej niż 20% arseninów (80% stanowiły arseniany), podczas gdy na początku eksperymentu gleba zawierała arseniny w ilości sięgającej ponad 90%. W glebie kontrolnej (bez bioaugmentacji szczepem M14) zawartość arsenianów pozostała na tym samym poziomie przez cały okres prowadzenia eksperymentu i wynosiła ok. 90%.The analysis of arsenic speciation in the soil showed that the Ensifer M14 strain is capable of effectively transforming arsenites into arsenates in the soil, which has a direct impact on reducing the toxicity of this element in the soil - arsenates have a much lower toxicity than arsenites. It was shown that after 28 days of the experiment, in the soil initially containing about 75 mg As/kg, only less than 20% of arsenites remained (80% were arsenates), while at the beginning of the experiment the soil contained arsenites in amounts reaching over 90%. In the control soil (without bioaugmentation with the M14 strain), the content of arsenates remained at the same level throughout the experiment and amounted to approx. 90%.
Przykład 4. Zwiększenie efektywności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14.Example 4. Increasing the effectiveness of phytoremediation of soils contaminated with arsenic under the influence of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain.
W prezentowanym przykładzie wykorzystano próbki roślin uzyskane w wyniku przeprowadzenia eksperymentu opisanego w Przykładzie 2.In the presented example, plant samples obtained as a result of the experiment described in Example 2 were used.
Efektywność fitoremediacji gleby pod wpływem jej bioaugmentacji szczepem Ensifer M14 została określona na podstawie analizy całkowitej zawartości arsenu w poszczególnych częściach roślin - korzeniach i liściach a także w glebie. Pierwszym etapem analiz było roztwarzanie (mineralizacja) wysuszonej próbki roślinnej (0,1 g) w 69% HNO3 w temperaturze 180°C przez 30 minut w zamkniętym układzie mikrofalowym (Milestone Ethos Plus). Mineralizację próbek gleby (0,3 g) przeprowadzono stosując mieszaninę 69% HNO3 i 30% H2O2 (w stosunku 9 : 1) w tych samych warunkach temperaturowych i czasowych jak próbki roślinne. Całkowitą zawartość arsenu w próbkach roślin i gleby określono za pomocą metody atomowej spektrometrii absorpcyjnej z kuwetą grafitową (TJA Solution, SOLAAR M, Wielka Brytania). Roztwory wzorców arsenu (Merck, Darmstadt, Niemcy) przygotowano w 3% HNO3. Uzyskane wyniki przedstawiono na Figurze 3.The effectiveness of soil phytoremediation under the influence of its bioaugmentation with the Ensifer M14 strain was determined on the basis of the analysis of the total arsenic content in individual plant parts - roots and leaves, as well as in the soil. The first stage of the analysis was the digestion (mineralization) of a dried plant sample (0.1 g) in 69% HNO3 at 180°C for 30 minutes in a closed microwave system (Milestone Ethos Plus). Mineralization of soil samples (0.3 g) was carried out using a mixture of 69% HNO3 and 30% H2O2 (9:1 ratio) under the same temperature and time conditions as plant samples. The total arsenic content in the plant and soil samples was determined by atomic absorption spectrometry with a graphite cuvette (TJA Solution, SOLAAR M, UK). Arsenic standard solutions (Merck, Darmstadt, Germany) were prepared in 3% HNO3. The results obtained are shown in Figure 3.
Analiza całkowitej zawartości arsenu w poszczególnych częściach roślin wykazała, że obecność M14 w zanieczyszczonej glebie sprzyjała pobieraniu arsenu przez rośliny. Wyższą zawartość arsenu w roślinach uprawianych w glebie z dodatkiem szczepu M14 zaobserwowano zarówno w przypadku korzeni, jak i liści, w porównaniu do roślin uprawianych bez bioaugmentacji. Całkowita zawartość arsenu w korzeniach i liściach była niemal dwa razy wyższa dla roślin uprawianych na glebie bioaugmentowanej niż w roślinach hodowanych w glebie bez bioaugmentacji.Analysis of the total arsenic content in individual plant parts showed that the presence of M14 in contaminated soil favored arsenic uptake by plants. Higher arsenic content in plants grown in soil with the addition of the M14 strain was observed in both roots and leaves, compared to plants grown without bioaugmentation. Total arsenic content in roots and leaves was almost twice as high for plants grown in bioaugmented soil than in plants grown in non-bioaugmented soil.
Wykazano także znacznie wyższe stężenie arsenu w korzeniach roślin niż w liściach, niezależnie od obecności M14 w glebie. Dla obu wariantów eksperymentalnych (z bioaugmentacją i bez dodatku mikroorganizmów) całkowita zawartość arsenu w korzeniach była niemal 5-krotnie wyższa niż w liściach roślin. Wzrost wydajności pobierania arsenu przez rośliny pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem M14 przyczynił się bezpośrednio do zmniejszenia zawartości tego pierwiastka w glebie. W glebie poddanej bioaugmentacji szczepem M14 całkowita zawartość arsenu została obniżona o 31% po 28 dniach eksperymentu natomiast w glebie bez dodatku mikroorganizmów stężenie arsenu zostało obniżone jedynie o 21%.Arsenic concentrations were also significantly higher in the plant roots than in the leaves, regardless of the presence of M14 in the soil. For both experimental variants (with bioaugmentation and without the addition of microorganisms), the total arsenic content in the roots was almost 5 times higher than in the leaves of the plants. The increase in the efficiency of arsenic uptake by plants under the influence of soil bioaugmentation with the M14 strain directly contributed to the reduction of the content of this element in the soil. In the soil bioaugmented with the M14 strain, the total arsenic content was reduced by 31% after 28 days of the experiment, while in the soil without the addition of microorganisms, the concentration of arsenic was reduced by only 21%.
Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że szczep M14 nie tylko przyczynia się do zwiększenia efektywności fitoremediacji gleb zanieczyszczonych arsenem, ale także umożliwia wykorzystanie do tego celu rośliny naturalnie zasiedlające tereny zdegradowane, bez konieczności wykorzystywania/sadzenia specjalnych gatunków roślin zdolnych do hiperakumulacji arsenu w tkankach.Based on the obtained results, it can be concluded that the M14 strain not only contributes to increasing the efficiency of phytoremediation of soils contaminated with arsenic, but also allows the use of plants naturally inhabiting degraded areas for this purpose, without the need to use/plant special plant species capable of hyperaccumulating arsenic in tissues.
Przykład 5. Poprawa kondycji autochtonicznej mikrobioty zasiedlającej gleby zanieczyszczone arsenem pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14.Example 5. Improvement of the condition of the autochthonous microbiota inhabiting arsenic-contaminated soils under the influence of soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain.
W prezentowanym przykładzie wykorzystano próbki gleby naturalnie zanieczyszczonej arsenem, pobranej ze środowiska silnie zanieczyszczonego tym pierwiastkiem (okolice nieczynnej kopalni złota w Złotym Stoku, południowo-zachodnia Polska). Analiza całkowitej zawartości arsenu w tej glebie wykazała, że zawierała ona ok. 1500 mg As/kg s.m. gleby.In the presented example, soil samples naturally contaminated with arsenic were used, taken from an environment heavily contaminated with this element (near a closed gold mine in Złoty Stok, south-western Poland). The analysis of the total arsenic content in this soil showed that it contained approx. 1500 mg As/kg d.m. soil.
W niniejszym przykładzie określono wpływ bioaugmentacji gleby szczepem Ensifer M14 na kondycję oraz aktywność naturalnej mikrobioty glebowej zasiedlającej gleby zanieczyszczone arsenem. W tym celu przeprowadzono analizę liczebności mikroorganizmów w glebie, pochodzących z różnych grup metabolicznych - heterotroficznych, nitryfikacyjnych, denitryfikacyjnych i celulolitycznych. Pierwszym etapem badań było otrzymanie roztworu glebowego z mikroorganizmami, który następnie został wykorzystany jako inokulum do zaszczepienia podłoży. Roztwór glebowy otrzymano poprzez przez dodanie 2,5 g świeżej masy gleby (1 g suchej masy) do 50 ml jałowego 0,85% roztworu NaCl i wytrząsanie przez 24 godziny. W przypadku bakterii heterotroficznych roztwór glebowy został wysiany na stałe podłoże LB i na podstawie liczby kolonii na płytkach Petriego określono liczebność tych bakterii (JTK/ml). W przypadku pozostałych grup bakterii roztwór glebowy zastosowano jako inokulum do zaszczepienia płynnych podłoży selekcyjnych. Po zaszczepieniu odpowiednich podłoży przygotowano rozcieńczenia hodowli w zakresie od 10-1 do 10-10. Jako wariant kontrolny wykorzystano podłoża bez inokulacji. Hodowle bakterii denitryfikacyjnych prowadzono w warunkach beztlenowych przez 10 dni, w butelkach o objętości czynnej 80 ml w zmodyfikowanym podłożu minimalnym zawierającym: Na2SO4 x 10H2O 0,07 g/L, (NH4)2SO4 0,1 g/L, KH2PO4 0,17 g/L, KCl 0,05 g/L, MgCl2 x 6H2O 0,04 g/L, CaCl2 x 2H2O 0,05 g/L, KNO3 0,55 g/L, etanol 1%, sole Tuoviniena 2 mL/L (Tuovinen i Kelly 1973; Santini et al., 2000). pH podłoża wynosiło 8. Bakterie nitryfikacyjne hodowano przez 14 dni, w 15 ml szklanych probówkach, w końcowej objętości 5 ml. W tym celu zastosowano zmodyfikowaną pożywkę przeznaczoną do hodowli bakterii nitryfikacyjnych zgodnie ze składem przedstawionym w pracy Yang et al. (2011). W przypadku bakterii celulolitycznych zastosowano pożywkę Bushell Haas uzupełnioną karboksymetylocelulozą wg przepisu zamieszczonego w pracy Lo et al. (2009). Hodowle te prowadzono w 15 ml szklanych probówkach w końcowej objętości 5 ml przez 72 godziny. Wszystkie hodowle mikroorganizmów prowadzono w temperaturze pokojowej.In this example, the effect of soil bioaugmentation with the Ensifer M14 strain on the condition and activity of natural soil microbiota inhabiting soils contaminated with arsenic was determined. For this purpose, an analysis of the number of microorganisms in the soil, coming from different metabolic groups - heterotrophic, nitrifying, denitrifying and cellulolytic, was carried out. The first stage of the research was to obtain a soil solution with microorganisms, which was then used as an inoculum to inoculate the substrates. The soil solution was prepared by adding 2.5 g fresh soil weight (1 g dry weight) to 50 ml of sterile 0.85% NaCl solution and shaking for 24 hours. In the case of heterotrophic bacteria, the soil solution was sown on a solid LB medium and the number of colonies on Petri dishes was used to determine the number of these bacteria (JTK/ml). For the remaining groups of bacteria, the soil solution was used as the inoculum to inoculate the liquid selection media. After inoculation of the appropriate media, dilutions of the cultures ranging from 10 -1 to 10 -10 were prepared. Media without inoculation were used as a control variant. The cultures of denitrifying bacteria were carried out under anaerobic conditions for 10 days, in bottles with an active volume of 80 ml, in a modified minimal medium containing: Na2SO4 x 10H2O 0.07 g/L, (NH4)2SO4 0.1 g/L, KH2PO4 0.17 g /L, KCl 0.05 g/L, MgCl2 x 6H2O 0.04 g/L, CaCl2 x 2H2O 0.05 g/L, KNO3 0.55 g/L, ethanol 1%, Tuovinien salts 2 mL/L ( Tuovinen and Kelly 1973; Santini et al., 2000). The pH of the medium was 8. The nitrifying bacteria were cultured for 14 days in 15 ml glass tubes in a final volume of 5 ml. For this purpose, a modified medium for the cultivation of nitrifying bacteria was used, according to the composition presented in the work of Yang et al. (2011). In the case of cellulolytic bacteria, Bushell Haas medium supplemented with carboxymethylcellulose was used according to the recipe in the work of Lo et al. (2009). These cultures were grown in 15 ml glass tubes in a final volume of 5 ml for 72 hours. All cultures of microorganisms were carried out at room temperature.
Obecność określonej grupy bakterii w danych rozcieńczeniach hodowli została zweryfikowana poprzez analizę ich aktywności i zawartości produktów ich metabolizmu w hodowlach. Zawartości azotanów/azotynów, amoniaku i glukozy analizowano odpowiednio w hodowlach bakterii denitryfikacyjnych, nitryfikacyjnych i celulolitycznych. Zawarto ści związków azotu określono za pomocą zestawów Nanocolor® (Aqua Lab, Polska) zgodnie z instrukcjami podanymi przez producenta. Aktywność bakterii celulolitycznych określono na podstawie reakcji supernatantów bakteryjnych z kwasem dinitrosalicylowym (DNS) zgodnie z metodą opisaną przez Poszytek et al. (2016).The presence of a specific group of bacteria in given culture dilutions was verified by analyzing their activity and the content of their metabolism products in the cultures. Contents of nitrates/nitrites, ammonia and glucose were analyzed in cultures of denitrifying, nitrifying and cellulolytic bacteria, respectively. The content of nitrogen compounds was determined using Nanocolor® kits (Aqua Lab, Poland) in accordance with the manufacturer's instructions. The activity of cellulolytic bacteria was determined on the basis of the reaction of bacterial supernatants with dinitrosalicylic acid (DNS) according to the method described by Poszytek et al. (2016).
Badania aktywności mikroorganizmów glebowych określono na podstawie aktywności dehydrogenaz i celulaz. Aktywność dehydrogenazy badano przez ekstrakcję gleby N, N-dimetyloformamidem, zgodnie z metodą opisaną przez von Mersi i Shinner (1991). Z kolei aktywność celulazy określono zgodnie ze zmodyfikowaną metodą opisaną przez Denga i Tabatai (1994). Modyfikacja metody polegała na zwiększeniu stężenia buforu octanowego do 0,1 mM.Research on the activity of soil microorganisms was determined on the basis of the activity of dehydrogenases and cellulases. Dehydrogenase activity was tested by extracting the soil with N,N-dimethylformamide according to the method described by von Mersi and Shinner (1991). In turn, cellulase activity was determined according to a modified method described by Deng and Tabatai (1994). The modification of the method consisted in increasing the acetate buffer concentration to 0.1 mM.
Analizę liczebności poszczególnych grup mikroorganizmów, a także analizę ich aktywności wykonywano w próbkach naturalnej gleby zanieczyszczonej arsenem, pobierając je w dniu rozpoczęcia eksperymentu (TO) oraz po 30 (T30) i 60 (T60) dniach inkubacji gleby z bakteriami. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabeli 1.The analysis of the number of individual groups of microorganisms, as well as the analysis of their activity, were carried out in samples of natural soil contaminated with arsenic, collected on the day of the experiment (TO) and after 30 (T30) and 60 (T60) days of soil incubation with bacteria. The obtained results are presented in Table 1.
PL 242317 Β1PL 242317 B1
Tabela 1. Liczebność oraz aktywność mikroorganizmów z różnych grup metabolicznych w glebie zanieczyszczonej arsenem poddanej bioaugmentacji szczepem Ensifer M14 oraz bez dodatku tego szczepu.Table 1. The number and activity of microorganisms from various metabolic groups in soil contaminated with arsenic bioaugmented with the Ensifer M14 strain and without the addition of this strain.
TO T30 T60IT'S T30 T60
Analiza liczebności różnych grup mikroorganizmów w glebie wykazała, że obecność szczepu Ensifer M14 przyczyniła się do wzrostu liczebności mikroorganizmów ze wszystkich badanych grup. Po 30 dniach inkubacji gleby ze szczepem M14 liczebność bakterii heterotroficznych, denitryfikacyjnych i celulolitycznych była o około jeden rząd wielkości większa niż w glebie bez bioaugmentacji szczepem M14. W przypadku bakterii nitryfikacyjnych, nie zaobserwowano zmiany w zakresie liczebności bakterii pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem M14. Po 60 dniach eksperymentów różnice między glebą bioaugmentowaną oraz niepoddaną bioaugmentacji były jeszcze bardziej wyraźne. Liczebność bakterii heterotroficznych, denitryfikacyjnych i celulolitycznych wzrosła o dwa rzędy wielkości w porównaniu do gleby bez dodatku mikroorganizmów, natomiast po tym czasie zaobserwowano także wzrost liczebności bakterii nitryfikacyjnych. Liczebność tej grupy bakterii wzrosła o jeden rząd wielkości w stosunku do gleby bez dodatku szczepu M14.The analysis of the number of different groups of microorganisms in the soil showed that the presence of the Ensifer M14 strain contributed to the increase in the number of microorganisms from all the studied groups. After 30 days of incubation of the soil with the M14 strain, the number of heterotrophic, denitrifying and cellulolytic bacteria was about one order of magnitude higher than in the soil without M14 bioaugmentation. In the case of nitrifying bacteria, no change in the number of bacteria was observed under the influence of soil bioaugmentation with the M14 strain. After 60 days of experiments, the differences between the bioaugmented and unbioaugmented soils were even more pronounced. The number of heterotrophic, denitrifying and cellulolytic bacteria increased by two orders of magnitude compared to the soil without the addition of microorganisms, while after this time an increase in the number of nitrifying bacteria was also observed. The number of this group of bacteria increased by one order of magnitude compared to the soil without the addition of the M14 strain.
Analiza aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej pod wpływem bioaugmentacji gleby szczepem M14 wykazała, że obecność tego szczepu prowadzi do wyższych aktywności dehydrogenaz i celulaz. W glebie bioaugmentowanej szczepem M14, aktywność dehydrogenaz była o około 21% wyższa po 30 dniach inkubacji oraz ponad dwa razy wyższa po 60 dniach eksperymentów, w porównaniu z glebą niepoddaną bioaugmentacji. Aktywność celulaz również znacznie wzrosła w obecności M14 w stosunku do gleby bez inokulacji. Po 30 dniach eksperymentu aktywność celulaz była o ponad 60% wyższa niż w glebie kontrolnej, natomiast pod koniec inkubacji (T60) różnica ta była już ponad dwukrotna.The analysis of the activity of autochthonous soil microbiota under the influence of soil bioaugmentation with the M14 strain showed that the presence of this strain leads to higher activity of dehydrogenases and cellulases. In the soil bioaugmented with the M14 strain, the activity of dehydrogenases was about 21% higher after 30 days of incubation and more than twice as high after 60 days of experiments, compared to the unbioaugmented soil. Cellulase activity was also significantly increased in the presence of M14 compared to uninoculated soil. After 30 days of the experiment, the cellulase activity was over 60% higher than in the control soil, while at the end of incubation (T60) the difference was more than twofold.
Przykład 6· Zastosowanie szczepu Ensifer M14 do zwiększenia efektywności remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi.Example 6 · The use of the Ensifer M14 strain to increase the effectiveness of remediation of soils contaminated with organic compounds.
W prezentowanym przykładzie wykorzystano wyniki badań, które uzyskano w Przykładzie 5.In the presented example, the test results obtained in Example 5 were used.
Ze względu na zwiększanie liczebności oraz stymulacje aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej zasiedlającej gleby zanieczyszczone pod wpływem obecności Ensifer M14, bioaugmentacja gleby tym szczepem jest także użyteczna w kontekście zwiększania efektywności (bio)remediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi, np. związkami ropopochodnymi. Metody (bio)remediacji tego typu gleb opierają się zwykle na procesach biodegradacji związków organicznych, które mogą być wykorzystywane przez mikroorganizmy jako substraty odżywcze np. jako źródło węgla. Efektywność metod biodegradacji zależy bezpośrednio od liczebności i aktywności autochtonicznej mikrobioty glebowej. Bioaugmentacja gleby szczepem M14 sprzyja rozwojowi mikroorganizmów glebowych oraz stymuluje ich aktywność, a zatem przyczynia się do zwiększenia efektywności biodegradacji zanieczyszczeń organicznych w glebie i stanowi cenne uzupełnienie dotychczas stosowanych metod remediacji.Due to the increase in the number and stimulation of the activity of autochthonous soil microbiota inhabiting soils contaminated with Ensifer M14, soil bioaugmentation with this strain is also useful in the context of increasing the effectiveness of (bio)remediation of soils contaminated with organic compounds, e.g. petroleum compounds. Methods of (bio)remediation of this type of soil are usually based on the processes of biodegradation of organic compounds that can be used by microorganisms as nutrient substrates, e.g. as a source of carbon. The effectiveness of biodegradation methods depends directly on the number and activity of autochthonous soil microbiota. Soil bioaugmentation with the M14 strain promotes the development of soil microorganisms and stimulates their activity, and thus contributes to increasing the effectiveness of biodegradation of organic pollutants in the soil and is a valuable supplement to the remediation methods used so far.
LITERATURA:LITERATURE:
Deng, S.P., Tabatabai, M.A., 1994. Cellulase activity of soils. Soil Biology and Biochemistry 26: 1347-1354.Deng, S.P., Tabatabai, M.A., 1994. Cellulase activity of soils. Soil Biology and Biochemistry 26: 1347-1354.
Lo, Y.C., Saratale, G.D., Chen, W.M., et al, 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme Microb Technol 44:417-425.Lo, Y.C., Saratale, G.D., Chen, W.M., et al, 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme Microb Technol 44:417-425.
Mersi, W., Schinner, F., 1991. An improved and accurate method for determining the dehydrogenase activity of soils with iodonitrotetrazoilum chloride. Biology and Fertility of Soils 11:216-220.Mersi, W., Schinner, F., 1991. An improved and accurate method for determining the dehydrogenase activity of soils with iodonitrotetrazoilum chloride. Biology and Fertility of Soils 11:216-220.
Poszytek, K., Ciezkowska, M., Skłodowska, A., Drewniak, L., 2016. Microbial Consortium with High Cellulolytic Activity (MCHCA) for enhanced biogas production. Frontiers in Microbiology 7: 324.Poszytek, K., Ciezkowska, M., Skłodowska, A., Drewniak, L., 2016. Microbial Consortium with High Cellulolytic Activity (MCHCA) for enhanced biogas production. Frontiers in Microbiology 7: 324.
Tuovinen, O.H., Kelly, D.P., 1973. Studies on the growth of Thiobacillus ferrooxidans. Arch. Mikrobiol. 88 (4), 285-298.Tuovinen, O.H., Kelly, D.P., 1973. Studies on the growth of Thiobacillus ferrooxidans. arch. Microbial. 88(4), 285-298.
Santini, J., Sly, L., Schnagl, R.D., Macy, J.M., 2000. A new chemolithoautotrophic arsenite-oxidizing bacterium isolated from a gold mine: phylogenetic, physiological, and preliminary biochemical studies. Appl. Environ. Microbiol. 66, 92-97.Santini, J., Sly, L., Schnagl, R.D., Macy, J.M., 2000. A new chemolithoautotrophic arsenite-oxidizing bacterium isolated from a gold mine: phylogenetic, physiological, and preliminary biochemical studies. Appl. Environ. Microbiol. 66, 92-97.
Yang X.-P., Wang S.-M., Zhang D.-W., Zhou L.-X. (2011). Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1 Bioresour Technol 102:854-862.Yang X.-P., Wang S.-M., Zhang D.-W., Zhou L.-X. (2011). Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1 Bioresour Technol 102:854-862.
Claims (20)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433098A PL242317B1 (en) | 2020-03-02 | 2020-03-02 | Method of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain and its applications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433098A PL242317B1 (en) | 2020-03-02 | 2020-03-02 | Method of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain and its applications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL433098A1 PL433098A1 (en) | 2021-09-06 |
| PL242317B1 true PL242317B1 (en) | 2023-02-13 |
Family
ID=77662539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL433098A PL242317B1 (en) | 2020-03-02 | 2020-03-02 | Method of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain and its applications |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL242317B1 (en) |
-
2020
- 2020-03-02 PL PL433098A patent/PL242317B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL433098A1 (en) | 2021-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Improvement of cadmium uptake and accumulation in Sedum alfredii by endophytic bacteria Sphingomonas SaMR12: effects on plant growth and root exudates | |
| Calvaruso et al. | Root-associated bacteria contribute to mineral weathering and to mineral nutrition in trees: a budgeting analysis | |
| EP2324108B1 (en) | Microorganism capable of solubilizing phosphate and iron and its applications | |
| Hu et al. | Isolation of an indigenous imidacloprid-degrading bacterium and imidacloprid bioremediation under simulated in situ and ex situ conditions | |
| Lu et al. | Remediation of polychlorinated biphenyl-contaminated soil by using a combination of ryegrass, arbuscular mycorrhizal fungi and earthworms | |
| Xu et al. | Soil microbial augmentation by an EGFP-tagged Pseudomonas putida X4 to reduce phytoavailable cadmium | |
| Moradkhani et al. | Biodegradation of cyanide under alkaline conditions by a strain of Pseudomonas putida isolated from gold mine soil and optimization of process variables through response surface methodology (RSM) | |
| JP4246181B2 (en) | Pseudomonas RRj228 for supporting growth of agricultural crops and microbial preparation containing the same | |
| US10752877B2 (en) | Facultative endophytic plant growth promoting bacteria | |
| EP3659440B1 (en) | Plant growth promoting microorganism and enzymes for soil biogenic cycles | |
| CN113151038B (en) | Extracellular polysaccharide producing strain, method for producing extracellular polysaccharide by using strain and application of extracellular polysaccharide | |
| WO2020102876A1 (en) | Facultative endophytic plant growth promoting bacteria | |
| Chen et al. | Linking soil organic carbon dynamics to microbial community and enzyme activities in degraded soil remediation by reductive soil disinfestation | |
| Srinivasan et al. | Prospects of utilizing a multifarious yeast (MSD1), isolated from South Indian coast as an agricultural input | |
| CN110615722B (en) | Biochar-based multi-component fertilizer and preparation method thereof | |
| Majewska et al. | Cadmium-resistant Chryseobacterium sp. DEMBc1 strain: characteristics and potential to assist phytoremediation and promote plant growth | |
| CN107354112B (en) | Thioanal degrading bacterium and application thereof | |
| PL242317B1 (en) | Method of soil bioaugmentation with Ensifer M14 strain and its applications | |
| CN113817625B (en) | Flavobacterium acidophilus and application thereof in improvement of saline-alkali soil | |
| Pontigo et al. | Culture supernatants of the cyanobacterium Trichormus sp. promote the growth of the grass Polypogon australis Brong: Role of P and Mn | |
| KR100577717B1 (en) | 07691049 Bacillus megaterium KR076KACC91049 promoting the growth of crops and the microbial agent containing the same | |
| RU2270808C2 (en) | Biologically active composition for treatment of surface water, soil and ground from petroleum pollution | |
| Agustiyani et al. | Growth ability and denitrification activity of bacterial isolates on media containing propoxur | |
| CN113980863B (en) | Bacillus siamensis and application thereof | |
| CN116716230B (en) | Pseudomonas hunanensis MGJ-2 and application thereof in degrading nicotine |