PL241599B1

PL241599B1 - Szczep Lactobacillus fermentum PL9 i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL241599B1
Application number: PL431722A
Authority: PL
Inventors: Piotr Heczko; Magdalena Strus
Original assignee: Sanprobi Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2022-11-07
Also published as: EP3818985B1; PL431722A1; EP3818985A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus fermentum PL9 i jego zastosowanie do ochrony przed czynnikami patogennymi i wytwarzania środka poprawiającego funkcje bariery jelitowej i zapobiegania zakażeniom.

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczep Lactobacillus fermentum PL9 i jego zastosowanie do ochrony przed czynnikami patogennymi i zwiększenia wytwarzania białek połączeń ścisłych nabłonka jelitowego i zapobiegania zakażeniom.

Zdrowie człowieka jest w silnym stopniu uzależnione od prawidłowego składu mikrobioty jelitowej i jej funkcjonowania w ścisłym powiązaniu z komórkami nabłonka jelita i lokalnym układem immunologicznym. Takie powiązanie zapewnia homeostazę całego organizmu. Bakterie tworzące mikrobiotę jelitową adherują do komórek nabłonka jelitowego wiążąc się z mucynami śluzu i kolonizują powierzchnię błony śluzowej konkurując z czynnikami patogennymi wnikającymi z zewnątrz do przewodu pokarmowego i współdziałając z czynnikami i komórkami nieswoistego i swoistego układu immunologicznego, który, następnie chroni organizm przed chorobami poprzez identyfikację i likwidowanie patogenów. Na prawidłowe działanie układu immunologicznego ma więc znaczny wpływ skład flory bakteryjnej w układzie pokarmowym. Bakterie zaadherowane do błony śluzowej posiadają też wiele funkcji regulacyjnych, wpływając na funkcjonowanie komórek śluzówki jelita i wielu innych. Między innymi, wpływają na wytwarzanie białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami i przez te komórki. Błona śluzowa jelita zapewnia wchłanianie wody, elektrolitów, składników spożywczych. Jej integralność jest zapewniana przede wszystkim przez tzw. połączenia ścisłe, składające się z różnych białek. Połączenia ścisłe także chronią przewód pokarmowy i organizm przed wnikaniem wirulentnych czynników patogennych: bakterii, wirusów i grzybów do przestrzeni podśluzówkowej i układu limfatycznego jelita, co może prowadzić do uogólnionego zakażenia.

Tak więc zaburzenia składu mikrobioty jelitowej mają liczne groźne konsekwencje dla funkcjonowania jelita i całego organizmu. Wiele czynników, ale przede wszystkim czynniki chorobotwórcze: bakterie, wirusy i grzyby, antybiotykoterapia, niewłaściwa dieta są przyczynami zaburzenia składu mikrobioty przewodu pokarmowego. Istnieje wiele dowodów, także klinicznych, że stosowanie odpowiednich bakterii probiotycznych prowadzi do korygowania składu tej mikrobioty i poprawy stanu zdrowia.

Znana jest z polskiego opisu patentowego Pat.210465 kompozycja zawierająca w składzie Lactobacillus fermentum 57A, który wykazuje bardzo dobre powinowactwo do nabłonka jelitowego i posiada zdolność do przylegania do tego nabłonka.

Znany jest z polskiego opisu patentowego Pat.204931 środek przeciwalergiczny, który jako aktywny składnik zawiera szczepy z rodzaju Lactobacillus w tym należące do gatunku Lactobacillus fermentum . Zgodnie z wynalazkiem środek zawiera w składzie Lactobacillus fermentum CP34. Zastosowanie środka według wynalazku przyczynia się do zmniejszenia we krwi poziomu przeciwciał IgE.

Znany jest z opisu patentowego WO 2019103198 nowy szczep Lactobacillus fermentum KBL375 wyizolowany z ludzkiego przewodu pokarmowego. Szczep ten posiada zdolności immunoregulacyjne i wpływa na uszczelnienie ścian jelita.

Znana jest z opisu patentowego CA 3018035 kompozycja farmaceutyczna, zawierająca szczep Lactobacillus fermentum LF05 zdeponowany pod numerem DSM 32277, przeznaczona do leczenia zakażeń pochwy. Zgłaszający wybrał szczep z gatunku Lactobacillus fermentum, który okazał się aktywny i skuteczny wobec patogenów Candida albicans i Gardnerella vaginalis.

Znana jest z opisu patentowego KR 101452234 grupa szczepów z gatunku Lactobacillus fermentum wyizolowanych od ludzi zamieszkujących koreańską wioskę długowieczności. Szczepy te charakteryzują się doskonałymi siłami adhezji do komórek nabłonka żołądka, wysoką opornością na kwasy żołądkowe i opornością na żółć.

Celem wynalazku było wyselekcjonowanie z kolekcji szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus nowego szczepu, który oprócz cech charakterystycznych dla tego rodzaju i właściwości probiotycznych posiadałby w stopniu wysokim zdolność do stymulacji wytwarzania białek połączeń ścisłych na przykładzie okludyny, jednocześnie wykazując bardzo wysokie powinowactwo do śluzu pokrywającego błonę śluzową jelita i związaną z tym zdolność do kolonizacji przez tworzenie biofilmu. Taki szczep mógłby znaleźć zastosowanie do korygowania składu mikrobioty i regulowania przepuszczalności nabłonka, a tym samym do wygaszania stanów zapalnych w przewodzie pokarmowym.

Istotą wynalazku jest szczep Lactobacillus fermentum oznaczony symbolem PL9, który został zdeponowany zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12). Szczep Lactobacillus fermentum PL9 został zdeponowany w dniu 13 sierpnia 2018 roku i otrzymał numer B/00163.

PL 241 599 Β1

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 został wyizolowany od zdrowej osoby z prawidłową mikrobiotą jelitową, z polskiej populacji. Z uwagi na ludzkie pochodzenie, szczep Lactobacillus fermentum PL9 posiada wybitne właściwości adherencyjne do nabłonka jelitowego u człowieka.

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 spełnia kryteria WHO/FAO określające przynależność szczepów bakterii do probiotyków i posiada status GRAS (Generally Recognized as Safe), i został szczegółowo przebadany pod kątem oporności na antybiotyki. Wykazano, iż szczep ten wykazuje zakres oporność na antybiotyki typowy dla rodzaju oraz gatunku. Ponieważ nie posiada mechanizmów oporności na antybiotyki, a więc nie stanowi rezerwuaru genów lekooporności w naturalnym mikrobiomie to może być bezpiecznie stosowany u ludzi.

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 posiada zdolność w stopniu wysokim do stymulacji produkcji okludyny przez komórki jelitowe.

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 posiada zdolność do tworzenia biofilmu.

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 posiada zdolność przywierania do mucyn.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepu Lactobacillus fermentum PL9 zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00163 do zastosowania w poprawianiu funkcji bariery jelitowej.

Niniejszy wynalazek przedstawiono na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia wynik testu API 50 CH,

Fig. 2 przedstawia zdjęcie z reakcji PCR w kierunku Lactobacillus fermentum - Ścieżki: 1 - szczep Lactobacillus fermentum PL9; 2 - kontrola negatywna; 3 - kontrola pozytywna (szczep Lactobacillus fermentum ATCC 9338), M - marker wielkości,

Fig. 3 przedstawia oporność szczepu Lactobacillus fermentum PL9 na sole żółci w stężeniach 1.2,5.10.20 g/l,

Fig. 4 przedstawia adherencje szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do linii nabłonka jelitowego Caco-2,

Fig. 5 przedstawia stymulację produkcji białek połączeń ścisłych (okludyny) w nabłonku jelitowym przez szczep Lactobacillus fermentum PL9,

Fig. 6 przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus fermentum PL9 wobec wybranych gatunków bakterii i grzybów chorobotwórczych,

Fig. 7 przedstawia zdolność szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do produkcji biofilmu,

Fig. 8 przedstawia obraz (w mikroskopie skaningowo-elektronowym) biofilmu produkowanego przez szczep Lactobacillus fermentum PL9 w trakcie 48 godzinnej hodowli.

I. Fenotypowa identyfikacja szczepu PL9 z wykorzystaniem zestawu API®50 CH firmy bioMerieux.

Identyfikację fenotypowa przeprowadzono za pomocą zestawu API 50 CH zgodnie z zaleceniami producenta. Jest to wystandaryzowany zestaw zawierający 50 testów biochemicznych do badania sposobu metabolizmu węglowodanów przez drobnoustroje. Test API 50 CH firmy bioMerieux wykorzystuje się do identyfikacji bakterii z rodzaju Lactobacillus i rodzajów spokrewnionych w połączeniu z podłożem API 50 CHL Medium (bioMerieux; Francja).

Wynik testu API 50 CH dla badanego szczepu z rodzaju Lactobacillus przedstawia Tab. 1 i Fig. 1.

Tab. 1. Wynik testu API 50 CH dla szczepu PL9.

Probówka	TEST	Wynik
Szczep PL9
0	KONTROLA	-
1	Glicerol	-
2	Erytrotol
3	D-arabinoza	-
4	L-arabinoza	-
5	D-ryboza	+

PL 241 599 Β1

6	D-ksyloza	+
7	L-ksyloza	-
8	D-adonitol	-
9	Metylo-βΟksylopiranozyd	-
10	D-galaktoza	+
11	D-glukoza	+
12	D-fruktoza	+
13	D-mannoza	-
14	L-sorboza	-
15	L-ramnoza	-
16	Dulcytol	-
17	Inozytol	-
18	D-mannitol	-
19	D-sorbitol	-
20	Metyle-aDmannopiranozyd	-
21	Metylo-aDglukopiranozyd	-
22	N-acetylo-glukozamina	-
23	Amigdalina	-
24	Arbutyna	-
25	Eskulina Cytrynian żelaza	-
26	Salicyna	-
27	D-celobioza	-
28	D-maltoza	+
29	D-laktoza (wołowa)	+
30	D-melibioza	+
31	D-sacharoza	+

PL 241 599 Β1

32	D-trehaloza	-
33	Inulina	-
34	D-melezytoza	-
35	D-rafinoza	+
36	Skrobia	-
37	Glikogen	-
38	Ksylitol	-
39	Gencjobioza	-
40	D-turanoza	-
41	D-liksoza	-
42	D-tagatoza	-
43	D-fukoza	-
44	L-fukoza
45	D-arabitol
46	L-arabitol	-
47	Glukonian potasu	+
48	2-ketoglukonian potasu	-
49	5-ketoglukonian potasu	⁺

Wynik testu API 50 CH dla szczepu PL9.

Na podstawie otrzymanego profilu biochemicznego program apiWeb zidentyfikował szczep PL9 jako Lactobacillus fermentum.

II. Identyfikacja szczepu Lactobacillus fermentum PL9 z wykorzystaniem metody PCR (ang. Polymerase Chain Reaction)

II. 1. Izolacja genomowego DNA bakterii:

Do izolacji genomowego DNA zastosowano zestaw DNA GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit (EURx) wykorzystujący zdolność wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Procedura izolacji DNA przebiegała w następujący sposób:

1. 24-godzinną hodowlę komórek bakteryjnych prowadzoną w płynnym podłożu MRS (Oxoid) odwirowywano w objętości 1 ml (2 min., 12 000 rpm).

2. Supernatant usuwano, a osad dokładnie zawieszano w 250 μΙ buforu do zawieszania Celi R (w zestawie) z dodatkiem 200 μΙ niebieskiego buforu lizującego Lysis Blue (w zestawie), aż do uzyskania jednolitej, niebieskiej zawiesiny.

3. Do zawiesiny komórek dodawano 350 μΙ buforu neutralizującego Neutral B (w zestawie). Dokładnie i powoli mieszano zawartość probówek przez kilkukrotne odwracanie, aż do całkowitego zaniku niebieskiej barwy zawiesiny.

4. Po zakończeniu lizy mieszaninę odwirowywano (7 min., 12 000 rpm), a przesącz nakładano na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym i ponownie wirowano (1 min., 12 000 rpm).

5. Złoże dwukrotnie przepłukiwano: najpierw 500 μΙ buforu płuczącego Wash UX1, a następnie 650 pL buforu płuczącego Wash UX2 (w zestawie).

6. Oczyszczone DNA eluowano ze złoża za pomocą 50 μΙ buforu Elution (w zestawie), ogrzanego do temperatury 80°C.

PL 241 599 Β1

7. Wyizolowane DNA przechowywano w probówce typu Eppendorf w temperaturze 4°C do czasu dalszych analiz.

II. 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR):

W Tabeli 2 przedstawiono sekwencje użytych starterów oraz wielkość poszczególnych amplikonów.

Tab. 2. Sekwencje starterów i wielkość amplikonów poszukiwanego gatunku bakterii.

Starter	Sekwencja 5’—>3’	Gatunek	Wielkość amplikonu
Lfpr Fermll	GCC GCC TAA GGT GGG ACA GAT CTG ATC GTA GAT CAG TCA AG	L. fermentum	300pz i 500pz

Program amplifikacji dla gatunku Lactobacillus fermentum prowadzony był w termocyklerze S 1000 (BioRad) i przedstawiał się następująco:

1.92°C-	2 min
2. 95°C-	30 sek -
3. 55°C -	30 sck ” 30x
4. 72°C -	30 sek
5. 72°C -	1 min

Amplifikację prowadzono zgodnie z metodą Walter i wsp. (Walter J, Tannock GW, Tilsala-Timisjarvi A, Rodtong S, Loach DM, Munro K, Alatossava T. Detection and Identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers. Appl Environ Microbiol. 2000;66(1 ):297-303). Z publikacji tej pochodzą również użyte sekwencje starterów.

Po skończonej reakcji PCR produkty amplifikacji były analizowane w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Próbki nakładano do kieszonek żelu w objętości 7 μΙ z dodatkiem 3 μΙ buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzono w buforze TBE o stężeniu 0,5x, przez 1,5 godziny, pod napięciem 80V, w aparacie do elektroforezy (BioRad).

Obraz żelu oglądano przy użyciu systemu GelDoc XR + (BioRad), w skład którego wchodził transiluminator UV, kamera zbierająca obraz oraz program komputerowy do dokumentacji i analizy obrazu Image Lab (BioRad).

Obecność produktu PCR o odpowiedniej ilości par zasad uznawany była za pozytywny wynik reakcji. Na każdym żelu umieszczano ponadto kontrolę negatywną, którą stanowiła woda destylowana dodawana do buforu reakcyjnego zamiast genomowego DNA bakterii oraz kontrolę pozytywną, jaką był produkt amplifikacji otrzymany z użyciem DNA szczepu wzorcowego oraz marker wielkości prążków (GeneRuler 100bp, Axygen).

Fig. 2 przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR w kierunku Lactobacillus fermentum; ścieżki: 1 - (szczep PL9); 2 - kontrola negatywna; 3 - kontrola pozytywna (szczep Lactobacillus fermentum ATCC 9338); M - marker wielkości.

III. Identyfikacja szczepu Lactobacillus fermentum PL9 z wykorzystaniem sekwencjonowania 16S rRNA.

Amplikony DNA uzyskane w reakcji PCR rozdzielono za pomocą elektroforezy w obecności barwników oraz wzorca wielkości DNA. Wyniki zwizualizowano za pomocą archiwizatora. Amplikony poddano sekwencjonowaniu DNA, uzyskane sekwencje przeanalizowano in silico z wykorzystaniem narzędzi NCBI Blast. Poprawność odczytanych sekwencji zweryfikowano na podstawie inspekcji wizualnej oraz analizy zasobów bazy danych NCBI Genbank.

PL 241 599 Β1

Tab. 3. Tabelaryczne zestawienie sekwencji DNA uzyskanych dla badanego szczepu PL9 z użyciem literaturowych oligonukleotydów, umożliwiających identyfikację gatunkową szczepów bakterii.

Nazwa szczepu	PL9
Sekwencja DNA 5’-3’ startery 1	GCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTG AYGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCG CCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACAC GTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACA ACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATA ACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAA AGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGA CCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTA AYGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCG AGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGA CTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGC AAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTG

PL 241 599 Β1

AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTT GTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACT GTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAA GTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGA TTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGT TTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTT AACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATA ACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACT CCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATAT GGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTAC CTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAA AGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCT AGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGC CGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGA AGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGC CAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGG AACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAG TTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGA GACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG GGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAC GGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGC AAGCAAATCTCTTAAAACCGTrCTCAGTTC GGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGA

PL 241 599 Β1

AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC ATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTT GTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTT TAGGAGCCAGCCGCCTAAGG

Sekwencja DNA 5’-3’ startery 2

GGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCG TGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAG CTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGA GTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACC AGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTA TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCA GGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCT TCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAA CTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGT GGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTA GATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGC GGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGAC TCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGA TA

Na podstawie otrzymanych sekwencji DNA oraz analizy zasobów bazy danych NCBI Genbank zidentyfikowano szczep PL9 jako Lactobacillus fermentum.

IV. Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki szczepu Lactobacillus fermentum PL9.

a. Oporność na antybiotyki badana za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej.

W celu zbadania lekooporności szczepu L. fermentum PL9 metodą dyfuzyjno-krążkową, zawiesinę hodowli (OD= 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę naniesiono za pomocą jałowej pesety krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Inkubację prowadzono w warunkach beztlenowych, przez 24 h w temp. 37°C. Po inkubacji zmierzono strefy zahamowanego wzrostu szczepu bakteryjnego wokół krążka z antybiotykiem (w mm). Interpretacji lekooporności różnicującej szczep L. fermentum PL9 na wrażliwy i oporny na badane antybiotyki dokonano zgodnie z EUCAST. W doświadczeniu wykorzystano następujące antybiotyki: penicylina, ciprofloksacyna, cefaklor, doksycyklina, oksacylina, kotrymoksazol, erytromycyna, ampicylina, klindamycyna, wankomycyna, gentamycyna, metronidazol (Oxoid).

PL 241 599 Β1

Tab. 4. Wielkość stref zahamowania wzrostu otrzymanych dla badanego szczepu L. fermentum PL9 oraz szczepu wzorcowego L. fermentum ATCC 9338.

Antybiotyk Stężenie	L. fermentum PL9	L. fermentum ATCC 9338
Penicylina (P) 1 pg	15 mm	14 mm
Ciprofloksacyna (CIP) 5 Pg	14 mm	11 mm
Cefaklor (CEC) 30 Pg	6 mm	6 mm
Doksycyklina (DO) 30 pg	27 mm	30 mm
Oksacylina (OX) 1 Pg	6 mm	6 mm
Kotrymoksazol (SXT) 25 pg	6 mm	8 mm
Erytromycyna (E) 15 pg	35 mm	30 mm
Ampicylina (AMP) 2 pg	16 mm	11 mm
Klindamycyna (DA) 2 Pg	35 mm	29 mm
Gentamycyna (CN) 30 pg	16 mm	15 mm
Wankomycyna (VA) 30 pg	6 mm	6 mm
Metronidazol (MTZ) 5 pg	6 mm	6 mm

Metodą jakościową wykazano, że oporność/wrażliwość szczepu PL9 na antybiotyki jest zgodna z wzorcem gatunku.

b. Oporność na antybiotyki oznaczona metodą ilościową zgodnie z danymi interpretacyjnymi EFSA za pomocą E-testów.

W celu zbadania lekooporności szczepów probiotycznych metodą E-testów, zawiesinę hodowli (OD= 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę naniesiono za pomocą jałowej pesety paski E-test nasączone antybiotykami w różnych stężeniach. Inkubację płytek prowadzono w warunkach beztlenowych, przez

PL 241 599 Β1 h w temp. 37°C. Po inkubacji dokonywano odczytu wartości MIC (mg/L). W doświadczeniu wykorzystano następujące antybiotyki: ampicylina, gentamycyna, tetracyklina, klindamycyna, erytromycyna, chloramfenikol, wankomycyna, kanamycyna, streptomycyna (Oxoid).

Tab. 5. Wrażliwość szczepu PL9 badana ilościowo zgodnie z rekomendacjami EFSA. Legenda: wartość MIC wyrażona w mg/L i jej interpretacja:

W - wrażliwy, O - oporny, n.w. - nie wymagane.

Antybiotyk
	L.fermentum PL9
Ampicylina	0,12 W
Gentamycyna	16 W
Tetracyklina	4 W
Klindamycyna	0,03 W
Erytromycyna	0,12 W
Chloramfenikol	4 W
Wankomycyna	>32 n.w.
Kanamycyna	1,5 W
Streptomycyna	64 W

Metodą ilościową potwierdzono, że szczep Lactobacillus fermentum PL9 wykazuje wrażliwość na podstawowe antybiotyki zgodną z danymi interpretacyjnymi EFSA (European Food Safety Authority).

PL 241 599 Β1

Oporność szczepów probiotycznych na leki przeciwbakteryjne jest przedmiotem szczegółowych badań ze względów bezpieczeństwa przyszłych preparatów leczniczych. Szczep Lactobacillus fermentum PL9 wykazuje oporność nie odbiegającą od typowej dla tego gatunku. Oznacza to, że może być bezpiecznie stosowany w preparatach probiotycznych, gdyż nie posiada cech oporności nabytych na drodze mutacji lub wymiany materiału genetycznego, a co za tym idzie nie istnieje zagrożenie przekazania genów oporności na inne bakterie jelitowe, jak np. enterokoki, które są naturalnym rezerwuarem takich genów.

IV. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus fermentum PL9 na sztuczny sok żołądkowy.

Celem badania było oznaczenie przeżywalności w sztucznym soku żołądkowym nowego szczepu Lactobacillus fermentum PL9. W celu oznaczenia stopnia oporności bakterii z rodzaju Lactobacillus na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, iż zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o pH równym 1.2 według następującego przepisu: 2.0 g NaCI, 3.2 g pepsyny w 7 ml 36% HCI o pH 1.2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Jałowy (po przesączeniu) sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 1 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej z nich kolejno dodawano po 100 μΙ świeżej (24 godzinnej) hodowli szczepu Lactobacillus fermentum PL9 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 30 min. w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych. Po upływie wyznaczonego czasu mieszaninę starannie mieszano i wykonywano posiew dziesiętny w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej.

Tab. 5. Przeżywalność szczepu Lactobacillus fermentum PL9 w sztucznym soku żołądkowym.

Gęstość bakterii probiotycznych podana w j.t.k./ml

Nazwa szczepu	Czas wyjściowy	Po 30 min. inkubacji w sztucznym soku żołądkowym o pH 1.2
Lactobacillusfermentum PL9	1,3 x 10⁸	3,2x10⁷

Szczep PL9 wykazuje dużą oporność na niskie pH i działanie sztucznego soku żołądkowego, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panujących w ludzkim przewodzie pokarmowym. Oznacza to, że szczep ten podczas pasażu przez układ pokarmowy nie będzie podlegał hamowaniu wzrostu przez sok żołądkowy.

VI. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus fermentum PL9 na sole żółci.

Celem badania było oznaczenie oporności na sole żółci nowego szczepu Lactobacillus fermentum PL9. Oporność na sole żółci wyznaczono w oparciu o metodę Dashkevicz’a i Feighner’a (Dashkevicz M.P., Feighner S.D. 1989. Development of a differential medium for bile salt hydrolaseactive Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 55(1), 1-16). Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS lub BL barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej (POCH) w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci (OXGAL, Difco) w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane stałe podłoża posiewano metodą redukcyjną po 100 μΙ hodowli szczepu Lactobacillus fermentum PL9, który następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte. Intensywność wzrostu badanego szczepu i zabarwienia podłoża na kolor żółty oceniono w skali półilościowej od - do +++.

PL 241 599 Β1

Tab. 6. Oporność szczepu Lactobacillus fermentum PL9 na sole żółci w stężeniach: 1,2, 5, 10, 20 g/l.

Stężenie soli żółci	L.fermentum PL9
1 g/i	ΊΊ—F
2 g/l	4—ii
5 g/l	4—1—b
10 g/i	4—1—I^-
20 g/l	++

Oporność szczepu Lactobacillus fermentum PL9 na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 g/l. przedstawiono na Fig. 3.

Szczep PL9 wykazuje dużą oporność na działanie soli żółci, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panujących w ludzkim przewodzie pokarmowym. Oznacza to, że szczep ten podczas pasażu przez układ pokarmowy nie będzie podlegał hamowaniu wzrostu przez sole żółci, więc może być stosowany w preparatach doustnych.

VII. Oznaczenie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do ludzkiej linii tkankowej Caco-2.

Właściwości adherencyjne szczepu Lactobacillus fermentum PL9 zostały przeprowadzone w odniesieniu do ludzkiej linii komórkowej nabłonka jelitowego Caco-2. W celu zbadania adherencji badanego szczepu, hodowlę tkanki nabłonkowej jelita (Caco-2) prowadzono w atmosferze zawierającej 10% CO2 oraz w temperaturze 37°C, w podłożu hodowlanym DMEM (Gibco) z dodatkiem 10% surowicy wołowej (FBS, Sigma-Aldrich). Czas hodowli wyniósł 15 dni. Płyny hodowlane wymieniano regularnie co 48 godzin. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu, czyli tzw. „monolayeru”, komórki pasażowano stosując 0,25% Trypsynę (Sigma-Aldrich), które następnie przesiewano na płytki 24-dołkowe (TPP, Switzerland) doprowadzając je do gęstości 5 x 10⁵ komórek na dołek. Hodowlę tkankową linii Caco-2 prowadzono dalej na powierzchni jałowych szkiełek podstawowych umieszczonych na dnie 24-dołkowych płytek przez kolejne 3 dni do osiągnięcia na powierzchni szkiełek podstawowych zlewnego wzrostu. Następnie komórki przepłukiwano PBS bez jonów Ca²⁺ i Mg²⁺ (IITD PAN; Wrocław) i dodawano do kolejnych dołków po 600 μΙ odpowiednio przygotowanej próbki. Szczep Lactobacillus fermentum PL9 hodowano w 10 ml płynnego podłoża MRS (Oxoid) przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, sprawdzano gęstość hodowli za pomocą rozcieńczeń dziesiętnych. Do każdego dołka zawierającego wyhodowaną tkankę dodawano po 100 μΙ płynnej hodowli bakterii probiotycznych i uzupełniano 900 μΙ świeżego podłoża DMEM. Końcowa gęstość populacji badanej bakterii wynosiła w 1 ml około 1 x10⁸ j.t.k. Następnie komórki linii tkankowych wraz z badanym szczepem inkubowano w temp. 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności i przy 10% zawartości CO2 przez okres 2 godzin. Po tym czasie komórki przepłukiwano PBS w celu usunięcia nie przywartych bakterii, a następnie całość utrwalano 3.7% paraformaldehydem w temperaturze 4°C przez okres 3 godzin. Następnie szkiełka płukano PBS i przeprowadzono ich barwienie metodą Grama. Preparat był oceniany w mikroskopie świetlnym pod powiększeniem 1000x. Komórki badanego szczepu Lactobacillus fermentum PL9, które zaadherowały do linii tkankowej były zliczane w 5 polach widzenia preparatu, a następnie

PL 241 599 Β1 wyliczano wynik średni, któremu przyporządkowano odpowiedni stopień adherencji zgodnie z zakresem podanym w literaturze (Tuomola E.M., Salminen S.J. 1998. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 celi cultures. Int J Food Microbiol. 41,45-51):

+++ bardzo wysoki stopień adherencji (powyżej 80 komórek bakteryjnych w polu widzenia) ++ wysoki stopień adherencji (od 60 do 80 komórek bakteryjnych w polu widzenia) + średni stopień adherencji (od 40 do 60 komórek bakteryjnych w polu widzenia)

- słaby stopień adherencji (poniżej 40 komórek bakteryjnych w polu widzenia).

Tab. 7. Wyniki adherencji szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do ludzkiej linii tkankowej Caco-2.

Nazwa szczepu	Stopień adherencji	Średnia liczba komórek bakteryjnych w polu widzenia
L.fermentum PL9	++	60-80

Nr powtórzenia	Lactobacillus fermentum PL9
liczba komórek bakterii w polu widzenia	średnia z 5 pól widzenia
I powtórzenie	60	62
60
60
60
70
II powtórzenie	60	62
70
60
60
60
III powtórzenie	50	64 ++

Adherencję szczepu Lactobacillus fermentum PL9, do linii nabłonka jelitowego Caco-2 przedstawia Fig. 4.

PL 241 599 Β1

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 wykazał wysoki stopień adherencji do ludzkiego nabłonka jelitowego a tym samym ma zdolność do skutecznego przywierania, a w dalszej konsekwencji kolonizacji przewodu pokarmowego.

Aby szczepy probiotyczne mogły wywierać korzystny wpływ na zdrowie gospodarza muszą ulec adherencji, która następuje poprzez ich łączenie się z odpowiednimi receptorami zlokalizowanymi na powierzchni komórek gospodarza. Adherencja do tkanki umożliwia rozwój i namnażanie się bakterii probiotycznych, a kolonizacja tkanek znacząco obniża ryzyko zasiedlenia skolonizowanych powierzchni przez mikroorganizmy patogenne.

VIII. Oznaczenie zdolności szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do stymulacji produkcji białek połączeń ścisłych na przykładzie okludyny.

Badania przeprowadzono na linii tkankowej Caco-2. Hodowlę tkanki prowadzono przez okres 20 dni w podłożu DMEM (IITD, Wrocław) z dodatkiem 10% płodowej surowicy wołowej (FBS, SigmaAldrich) na płytkach hodowlanych, 24 dołkowych (TPP, Switzerland) w atmosferze o zwiększonej wilgotności, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 i w temperaturze 37°C. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu jednowarstwowego („monolayer”), komórki przepłukiwano dwukrotnie PBS (IITD, Wrocław) i przeprowadzono badanie tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami badanej linii. Do każdego dołka zawierającego wyhodowaną tkankę o średniej gęstości 1x10⁶ komórek/ml dodawano po 900 μΙ świeżego podłoża DMEM bez antybiotyku oraz 100 μΙ odpowiednio przygotowanej hodowli badanego szczepu probiotycznego (z dodatkiem 5% agar MRS). Dzięki zawartości 5% agar MRS badany szczep probiotyczny ściśle przylegał do powierzchni hodowli tkankowej Caco-2. Całość ponownie inkubowano przez 24 godzin w atmosferze o zwiększonej wilgotności, wzbogaconej 10% CO2 i w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu hodowlę tkankową przepłukiwano 3x buforem PBS i utrwalano metanolem w temp. -20°C przez 2 min. Następnie na powierzchnię każdego szkiełka podstawowego (umieszczonego w dołku hodowlanym) nanoszono po 100 μΙ monoklonalnych przeciwciał znakowanych FITC wykrywających białka połączeń ścisłych tj. okludynę (lnvitrogen-Corporation). Dzięki temu, iż przeciwciała łączące się z białkami połączeń ścisłych były wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym FITC, istniała możliwość obserwowania intensywności świecenia tych połączeń w mikroskopie fluorescencyjnym OLYMPUS ΒΧ51 przy długości fali wzb.494-emi. 520 nm. pod powiększeniem 400x. Intensywność świecenia oceniano w skali półilościowej. Ocenę przeprowadzono z pięciu pól widzenia i wynik uśredniono.

Intensywność świecenia oceniono według skali półilościowej:

- brak świecenia (brak tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami) + słabe świecenie (niski poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) ++ silne świecenie (wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) +++ bardzo silne świecenie (bardzo wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych).

Tab. 8. Stymulacja produkcji okludyny wytwarzanej pomiędzy komórkami linii tkankowej Caco-2 po stymulacji przez szczep Lactobacillus fermentum PL9.

Nazwa szczepu	Stymulacja produkcji okludyny
L.fermentum PL9	-4—\|-

Produkcję białek połączeń ścisłych (okludyny) przez nabłonek po stymulacji przez szczep probiotyczny Lactobacillus fermentum PL9 przedstawia Fig. 5.

Szczep Lactobacillus fermentum PL9 wykazuje silne działanie na komórki nabłonka jelitowego, stymulując je do produkcji okludyny, będącej przykładem białek połączeń ścisłych. Zatem szczep PL9 może wpływać na zmniejszenia przepuszczalności nabłonka jelitowego zapobiegając m.in. zakażeniom.

IX. Badanie właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus fermentum PL9 wobec czynników etiologicznych zakażeń przewodu pokarmowego.

W celu określenia aktywności badanego szczepu L. fermentum PL9, do 900 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli szczepu probiotycznego o średniej gęstości 1x10⁸ j.t.k/ml, dodawano po 100 mikrolitrów 24-godzinnych hodowli badanych szczepów czynników etiologicznych zakażeń przewodu pokarmowego o średniej gęstości 1 x10⁶ j.t.k/ml, przygotowanych przez zawieszanie jednego oczka ezy w 10 ml bulionu TSB (Biocorp) dla bakterii tlenowych: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterilidisMCC 13076; 10 ml bulionu Sabouraud (Biocorp) dla grzybów drożdżopodobnych: Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ATCC 15126; 10 ml bulionu Schaedler (Biocorp) dla bakterii beztlenowych:

PL 241 599 Β1

Campylobacter fetus PCM 2632, Clostridium difficile ATCC 17857. Całość inkubowano odpowiednio w warunkach tlenowych, mikroaerofilnych i beztlenowych, w temperaturach 37°C i 41.5°C. W czasie 0 h oraz po upływie 8 i 24 godzin inkubacji z każdej z mieszanin wykonano rozcieńczenia dziesiętne, wysiewając kolejno po 100 mikrolitrów mieszaniny na podłoże Columbia Agar (Biocorp) dla szczepu Staphylococcus aureus ATCC 25923; MacKonkey Agar (Biocorp) dla szczepów: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076; Sabouraud Agar (Biocorp) dla szczepów: Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ATCC 15126; Schaedler Agar (Biocorp): Campylobacter fetus PCM 2632, Clostridium difficile ATCC 17857. Obliczono liczbę kolonii bakterii badanych szczepów patogennych, a wyniki podano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k/ml).

Tab. 9. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus fermentum PL9 wobec czynników etiologicznych powodujących zakażenia przewodu pokarmowego w oparciu o metodę ilościową.

Szczep	O godz j.t.k./ml	8 godz j.t.k./ml	24 godz j.t.k./ml
Staphylococcus aureus ATCC 25923	1,8x10⁶	0	0
Escherichia coli ATCC 25922	1,0x10⁶	0	0
Salmonella enteritidis ATCC 13076	1,0x10⁶	0	0
Campylobacter fetus PCM 2632	2,0x10⁶	0	0
Clostridium difficile ATCC 17857	1,0x10⁶	5,6xl0⁴	0
Candida albicans ATCC 10231	1,0x10⁵	5,0x10⁵	0
Candida glabrata ATCC 15126	2,0x10⁶	3,0x10⁵	6,0x10³
Kontrola hodowli L.fermentum PL9	6,4x10’	6,0x10’	5,0x10’
Kontrola hodowli Staphylococcus aureus ATCC 25923	l,8xl0⁶	1,0x10⁵	2,0x10^s

PL 241 599 Β1

Kontrola hodowli Escherichia coli ATCC 25922	1,0x10⁶	1,2x10⁶	1,5x10®
Kontrola hodowli Salmonella enteritidis ATCC 13076	1,0x10⁶	l,lxl0^s	Ι,ΟχΙΟ⁵
Kontrola hodowli Campylobacter fetus PCM 2632	2,0x10⁶	1,0x10*	5,0x10⁷
Kontrola hodowli Clostridiwn difficile ATCC 17857	1,0x10⁶	Ι,ΟχΙΟ⁶	5,0xl0⁷
Kontrola hodowli Candida albicans ATCC 10231	1,0x10⁶	6,0xl0⁷	5,0xl0⁷
Kontrola hodowli Candida glabrata ATCC 15126	2,0x10⁶	3,0x10⁶	8,0xl0⁵

Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus fermentum PL9 wobec wybranych gatunków bakterii i grzybów chorobotwórczych przedstawiono na Fig. 6.

Szczep PL9 wykazuje wybitnie działanie antagonistyczne wobec wszystkich najczęstszych bakteryjnych i grzybiczych czynników patogennych zakażeń jelitowych, za wyjątkiem C. glabrata. Zatem może korzystnie wpływać na ich eliminację z mikrobioty jelitowej.

X. Badanie zdolności szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do tworzenia biofilmu.

Do hodowli biofilmu szczepu Lactobacillus fermentum PL9 wykorzystano 96-dołkowe, polistyrenowe mikropłytki z powierzchnią adherencyjną (Greiner Bio-One, USA). Do każdego dołka dodawano po 180 μΙ świeżego podłoża hodowlanego MRS Broth (Oxoid) oraz 20 μΙ zawiesiny szczepu probiotycznego w soli fizjologicznej o gęstości 0,5 McFarlanda. Płytki wirowano (10 minut, 2000 rpm) w celu osadzenia bakterii na dnie studzienek, a następnie umieszczano w warunkach beztlenowych, w temp. 37°C. Hodowlę biofilmu prowadzono przez 48 godzin. W odpowiednich punktach czasowych tj. po upływie 8, 24 i 48 godzin inkubacji, dokonywano pomiarów liczebności bakterii metodą rozcieńczeń dziesięciokrotnych oraz pomiarów ilościowych biofilmu. Pomiary biofilmu prowadzono metodą kolorymetryczną, po uprzednim wybarwieniu zawartości dołków czerwienią Kongo zgodnie z metodyką ilościową opisaną przez Reutera i wsp. (Reuter M., Mallett A., Pearson B.M., Van Vilet H.M. 2010. Biofilm formation by

PL 241 599 Β1

Campylobacter jejuni is increased under aerobic conditions. Appl. Environ. Microbiol. 76, 2122-2128). Odczyt wartości absorbancji w dołkach prowadzono przy długości fali równej 492 nm za pomocą spektrofotometru Awarness Technology INC (USA). Wyniki pomiarów liczebności bakterii w danym punkcie czasowym prezentuje Tab. 11. Wyniki produkcji biofilmu przez szczep L. fermentum PL9 prezentuje Fig. 7.

Tab. 10. Wyniki pomiarów liczebności bakterii L. fermentum PL9 w biofilmie.

Nazwa szczepu	0 godz j.t.k./ml	8 godz j.t.k./ml	24 godz j.t.k./ml	48 godz j.t.k./ml
L.fermentum PL9	9,5x10⁷	3,9x10⁸	4,0x10⁸	6,0xl0⁸

XI. Badanie zdolności szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do adhezji do mucyny.

Badanie zdolności szczepu Lactobacillus fermentum PL9 do adhezji do mucyny przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną przez Tallon i wsp. (Tallon R., Arias S., Bressollier P., Urdaci M.C. 2006. Strain- and matrix-dependent adhesion of Lactobacillus plantarum is mediated by proteinaceous bacterial compounds. Journal of Applied Microbiology. 102, 442-451). W tym celu mucynę (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w buforowanej soli fizjologicznej (PBS, IITD, Wrocław), tak aby otrzymać końcowe stężenie 10 mg/ml. 100 μΙ przygotowanego w ten sposób roztworu mucyny dodawano do mikrotitracyjnych płytek polisterynowych (Greiner Bio-One, USA) i immobilizowano przez noc w temperaturze 4°C. Dołki płukano następnie dwukrotnie 200 μΙ PBS (Sigma-Aldrich) i dodawano 2% roztwór surowiczej albuminy wołowej (BSA, Sigma-Aldrich) na 4 godziny (temperatura 4°C). Po inkubacji dołki ponownie płukano dwukrotnie 200 μΙ PBS (Sigma-Aldrich). Szczep Lactobacillus fermentum PL9 hodowano przez 16 h w bulionie MRS (Oxoid), w temperaturze 37°C. Po okresie inkubacji, 1 ml hodowli wirowano (6000 x g przez 5 minut). Supernatant usuwano, a pozostały na dnie osad komórkowy przepłukiwano dwukrotnie 1 ml PBS (Sigma-Aldrich) i doprowadzono do gęstości optycznej (OD) (600 nm) 0,1 - 0,01. 100 μΙ przygotowanej w ten sposób zawiesiny bakterii dodawano do dołków i pozostawiano na 1 h w temp. 37°C. Dołki płukano następnie 12 razy 200 μΙ PBS (Sigma-Aldrich) w celu usunięcia niezwiązanych bakterii i traktowano 200 μΙ 0,5% roztworu Triton-X (Sigma-Aldrich) celem usunięcia przywartych do dna dołków bakterii Lactobacillus fermentum PL9. Płytki inkubowano dalej przez 2 h w temp, pokojowej na wytrząsarce orbitralnej. 100 μΙ zawiesiny bakterii usuwano z dołków i posiewano na podłoże MRS Agar (Oxoid). Podłoża inkubowano następnie w warunkach beztlenowych, temperatura 37°C przez 24 godziny. Po inkubacji obliczano liczbę kolonii bakterii, a wyniki podano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k/ml).

Tab. 11. Wyniki adhezji do mucyny szczepu Lactobacillus fermentum PL9.

Nazwa szczepu	Liczebność bakterii (j.t.k./ml)
Wyjściowa 0 godz.	Po 1 godz. inkubacji z mucyną
L.fermentum PL9	1,0 x 10⁸	3,3 x 10⁵
L.phamnosus GG	1,2 x 10⁸	5,6 x 10³

Wykazano, że nowy szczep Lactobacillus fermentum PL9 wykazuje wysoką zdolność do stymulacji produkcji okludyny przez komórki nabłonka: białka, które jest wskaźnikiem dla całej rodziny podobnych białek połączeń ścisłych, które łączą komórki i uszczelniają przestrzeń międzykomórkową nabłonka jelitowego, dzięki czemu w znacznym stopniu kontrolowany jest proces swobodnego przemiesz

PL 241 599 B1 czania się substancji pomiędzy światłem jelita, a komórkami nabłonka i tkankami leżącymi, co tym samym zapobiega przepuszczalności jelit, a przede wszystkim zapobiega przedostawaniu się czynników patogennych do krwiobiegu.

Ponadto nowy szczep Lactobacillus fermentum PL9 posiada wybitną zdolność do tworzenia biofilmu, dzięki czemu wpływa na wzmocnienie bariery jelitowej i jej funkcje dotyczące obrony przez drobnoustrojami chorobotwórczymi polegające na inicjacji tworzenia na powierzchni nabłonka jelitowego ochronnej warstwy bakterii, zapobiegającej zasiedlaniu nabłonka jelitowego przez mikroorganizmy patogenne oraz pełniącej istotną rolę w uszczelnianiu jelit. Wykazane mechanizmy posiadane przez szczep Lactobacillus fermentum PL9 pośredniczące w tworzeniu biofilmu to: tworzenie warstwy egzopolisacharydu na powierzchni komórek bakterii tego szczepu oraz zdolność do skutecznego przywierania do mucyn w przewodzie pokarmowym.

Nowy szczep Lactobacillus fermentum PL9 wykazuje dużą oporność na niskie pH i działanie sztucznego soku żołądkowego i soli żółciowych, co może świadczyć o jego doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających dla bakterii warunków panującym w górnych piętrach ludzkiego przewodu pokarmowego.

Nowy szczep Lactobacillus fermentum PL9 posiada silną aktywność antybakteryjną i przeciwgrzybiczą wobec patogennych grzybów i bakterii (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Campylobacter fetus, Clostridium difficile, Candida albicans, a zatem może być wykorzystany jako składnik czynny środka hamującego rozwój i/lub ograniczającego wzrost populacji patogennych grzybów i bakterii w przewodzie pokarmowym człowieka.

Claims

1. Szczep Lactobacillus fermentum oznaczony symbolem PL9, zdeponowany zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu pod numerem depozytowym B/00163.

2. Szczep Lactobacillus fermentum PL9 według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada wysoką zdolność do stymulacji produkcji okludyny przez komórki jelitowe.

3. Szczep Lactobacillus fermentum PL9 według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada wybitną zdolność do tworzenia biofilmu.

4. Szczep Lactobacillus fermentum PL9 według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada zdolność przywierania do mucyn śluzu jelitowego.

5. Szczep Lactobacillus fermentum PL9 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem B/00163 do zastosowania w poprawianiu funkcji bariery jelitowej.