PL240134B1 - Sposób wykrywania zmniejszonego ryzyka raków u kobiet z mutacją w genie BRCA1 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zmniejszonego ryzyka raków u kobiet z mutacją w genie BRCA1 poprzez ocenę wieku, stanu hormonalnego oraz stężenia arsenu we krwi.

U nosicielek mutacji BRCA1 ryzyko zachorowania w ciągu życia na raka piersi wynosi około 60%, a na raka jajnika około 25% (Lubiński i wsp. 2016).

ARSEN

Bez wątpienia arsen i jego związki są jednymi z najbardziej rozpoznawalnych trucizn. Według klasyfikacji międzynarodowej agencji do badań nad rakiem (IARC, ang. International Agency for Cancer Research) arsen i jego związki zostały określone jako bezwzględne ludzkie karcynogeny - grupa 1 (http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/latest_classif.php). Różnorodność objawów klinicznych wywołanych inhalacją związkami arsenu lub jego spożyciem jest bardzo duża.

W zależności od stężenia, czasu ekspozycji i drogi zaabsorbowania skutki oddziaływania arsenu z tkankami są od stosunkowo niegroźnych na przykład hipopigmentacji, po zagrażające życiu nowotwory (WHO). W świetle istniejących danych literaturowych można stwierdzić, że wysokie stężenia arsenu mogą być przyczyną takich raków jak rak płuca (Mostafa i wsp., 2008), nerki (Hopenhayn-Rich i wsp., 1996), skóry (Karagas i wsp., 2001), pęcherza (Mostafa i wsp., 2008), czy trzustki (Liu Mares i wsp., 2013).

Istnieją też prace wskazujące odwrotną korelację - np. Lamm i wsp. stwierdzili nieistotne zmniejszenie ryzyka zachorowania na raka pęcherza moczowego wraz z rosnącym narażeniem na arsen w wodzie pitnej, w zakresie 3,0-6,0 μg/l (Lamm i wsp., 2004).

Celem wynalazku jest dostarczenie testu diagnostycznego, który pozwalałby na zróżnicowanie grupy nosicielek mutacji w genie BRCA1, a zwłaszcza wyodrębnienie grupy pacjentek, u których ryzyko zachorowania na raka jest wyjątkowo wysokie, nawet w porównaniu z innymi nosicielkami mutacji w genie BRCA1. Kolejnym celem wynalazku jest dostarczenie testu diagnostycznego, który pozwalałby na wyodrębnienie podgrupy pacjentek, u których ryzyko zachorowania na raka jest względnie niskie, w porównaniu z innymi nosicielkami mutacji genu BRCA1.

W związku z brakiem badań wiążących stężenie arsenu we krwi z ryzkiem raków w populacji polskich kobiet z mutacją w genie BRCA1, postanowiono ocenić korelację stężenia arsenu we krwi pełnej z ryzykiem raków u w/w kobiet. Nieoczekiwanie ustalono, że istnieje korelacja między stężeniem arsenu we krwi pełnej a ryzykiem raków u kobiet będących nosicielkami mutacji w genie BRCA1 w zależności od wieku oraz stosowania hormonalnej antykoncepcji. W szczególności stwierdzono, że istnieją zakresy stężeń arsenu we krwi wiążące się z istotnie zmniejszonym oraz z tendencją do znacznie obniżonego ryzyka wystąpienia nowotworów złośliwych u w/w kobiet w zależności od wieku (poniżej oraz powyżej 50 roku życia) oraz stanu hormonalnego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób określenia ryzyka raka u kobiety z mutacją w genie BRCA1 charakteryzujący się tym, że obejmuje ustalenie wieku pacjentki, stanu hormonalnego oraz ilościową ocenę stężenia arsenu we krwi pełnej w próbce pobranej od tej pacjentki, przy czym:

A. u kobiety z mutacją w genie BRCA1 niezależnie od wieku, która stosowała antykoncepcję hormonalną dłużej niż 1 rok stwierdza się znacząco obniżone ryzyko rozwoju raków w przypadku występowania wysokiego stężenia arsenu we krwi, zwłaszcza > 1,31 μg/l.

B. u kobiety z mutacją w genie BRCA1 przed 50 roku życia, która nigdy nie stosowała antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok stwierdza się znacząco obniżone ryzyko rozwoju raków w przypadku występowania niskiego stężenia arsenu we krwi, zwłaszcza < 0,85 μg/l.

Korzystnie, materiał biologiczny do oceny stężenia arsenu u osoby badanej jest pobierany z tkanki lub wydzieliny, korzystnie z krwi, moczu, włosów lub paznokci.

Korzystnie, że poziom arsenu u osoby badanej jest oznaczany przez bezpośredni pomiar stężenia w badanej próbce lub pośrednio przez ocenę poziomu metabolitu lub innego metabolitu lub produktu genowego takiego jak białko lub RNA, którego stężenie jest skorelowane ze stężeniem arsenu.

Poniżej omówiono wyniki badań, które doprowadziły do uzyskania wynalazku oraz przykład realizacji sposobu według wynalazku.

PROTOKÓŁ BADAŃ

Materiał

Grupa badana została wybrana spośród osób, których materiał znajduje się w biobanku naszego ośrodka. Pacjentki, które zgłosili się w latach 2010-2016 do Onkologicznej Poradni Genetycznej przy Szpitalu Klinicznym Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie zapraszane były do oddania

PL240 134 Β1 próbki krwi w celu biobankowania i podpisywały zgodę na przechowywanie i wykorzystywanie materiału w celach naukowych. Próbki krwi były pobierane w godzinach 8-14, a pacjentki poinformowane były o konieczności bycia na czczo przez co najmniej 4 godziny przed pobraniem. Dla większości pacjentek próbka była pobrana tylko raz, ale w niektórych przypadkach również więcej razy przy okazji kolejnych wizyt. Próbkę krwi przechowywano w temperaturze -80°C do momentu wykonania oznaczeń stężenia arsenu.

Grupa badana liczyła 575 osób, u których oznaczono stężenie arsenu we krwi pełnej a następnie poddano obserwacji przez średnio 38 miesięcy (zakres 12-78). Po upływie tego czasu powstałą kohortę prospektywną poddano analizie pod względem częstości zachorowania nowotwory złośliwe. Spośród grupy 575 wyjściowo zdrowych osób, po okresie obserwacji wyłoniono 35 kobiet z rakiem o różnej lokalizacji narządowej (rak piersi i/lub jajnika: 33, otrzewnej: 1, oraz szyjki macicy: 1). Charakterystykę obu grup przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Charakterystyka grupy badanych kobiet

śiednia ,,ύ	Cltoi λ
Wiek (zakres)	43,66 lat (24-68)	39,42 lat (18-86)
Stężenie arsenu (zakres)	1,27 pg/l (0,55-3,82)	1,40 pg/l (0,26-9,44)
Wykonany zabieg adneksektomii	6 osób (17,14%)	142 osób (26,30%)
Stosowana hormonalna antykoncepcja	11 osób (31,42%)	231 osób (42,78%)
Stosowana hormonalna terapia zastępcza	5 osób (14,29%)	108 osób (20,00%)

Materiał

Od każdej osoby włączonej do badania pobrano próbkę krwi do pomiaru stężenia arsenu.

Metoda oznaczenia arsenu we krwi pełnej

Aparat

Do określenia zawartości arsenu we krwi wykorzystana została technika spektrometrii mas ze wzbudzeniem w plazmie indukcyjnie sprzężonej. Do wykonania pomiaru wykorzystano spektrometr mas ELAN DRC-e (PerkinElmer). Wykorzystanie ICP-MS pozwala uzyskać limity detekcji < 0,1 pg/l. Podczas prowadzenia oznaczeń populacji nieeksponowanej zawodowo na metale i ich związki, czułość aparatury odgrywa kluczową rolę w trakcie prowadzenia analiz.

Przygotowanie do pomiaru

Zebrane próbki krwi zostały rozmrożone z temperatury -80°C do temperatury pokojowej w dniu wykonywania analiz, bezpośrednio przed pomiarem. Każda próbka została dokładnie wymieszana przy użyciu wstrząsarki w celu uzyskania jak największej homogenności materiału. Proces ten został powtórzony bezpośrednio przed pobraniem objętości krwi do rozcieńczeń, z uwagi na rozdzielanie się elementów morfotycznych krwi.

Próbki krwi zostały rozcieńczone w stosunku 1:30 [50 μΙ krwi: 1450 μΙ buforu]. Z uwagi na specyfikę pomiaru, do rozcieńczeń zastosowano roztwór wodorotlenku tetrametyloamonowego (TMAH). pH zasadowe zapewnia dobrą rozpuszczalność składników krwi, nie powodując tym samym precypitacji żadnej z frakcji. Dodatkowo, w celu lepszego rozproszenia rozpuszczonych składników krwi, zastosowano dodatek niejonowego surfaktantu - Trytonu Χ-100. Wykorzystanie tego związku nie tylko ułatwia rozpuszczanie m.in. białek, ale także przyczynia się do szybszego wypłukiwania próbki z układu wprowadzenia spektrometru.

Do korekcji efektu matrycy oraz dryfu aparatu użyte zostały standardy wewnętrzne - rod (¹⁰⁵Rh) i iryd (197^lr). Dla uzyskania stabilności jonów metali rozpuszczonych w roztworze zastosowany został dodatek kwasu wersenowego (EDTA). Dodatkowo, z uwagi na organiczny charakter próbki, do wszystkich roztworów dodano butanolu w celu pozbycia się negatywnego efektu związanego ze znaczną ilością węgla w badanej próbce.

Warunki pomiaru

Wszystkie oznaczenia we krwi przeprowadzono z wykorzystaniem kwadrupolowej komory reakcyjnej spektrometru, w tzw. trybie DRC (ang. Dynamie Reaction Celi) aparatu Elan DRC-e (PerkinElmer)

PL240 134 Β1 z tlenem jako gazem reakcyjnym. Tlen jest gazem z wyboru dla prowadzenia oznaczeń As. Wykorzystanie tlenu pozwala uzyskać na drodze reakcji chemicznej stabilnego produktu w postaci jonu ⁷⁵As¹⁶O⁺. Jon ten posiada masę 91, która wolna jest od interferencji spektralnych. Rozwiązanie to zapewnia osiągnięcie maksimum specyfiki pomiaru As.

Walidacja pomiarów

Do walidacji pomiarów zastosowano materiał referencyjny ClinCheck (Recipe, Niemcy), oraz materiały odniesienia: NIST 955c (National Institute of Standards and Technology, Stany Zjednoczone). Są to materiały powszechnie stosowane w spektrometrii, pozwalające na potwierdzenie czułości i specyfiki pomiaru.

Statystyka

Różnice w częstościach pomiędzy analizowanymi grupami oceniano przy pomocy testu zgodności Fishera. Za wyniki istotne statystycznie uznano te, dla których wartości p było mniejsze niż 0,05 (p < 0,05).

Wyniki

Analiza otrzymanych wyników wykazała istotną zależność między ryzykiem raków u kobiet z mutacją w genie BRCA1 a stężeniem arsenu we krwi pełnej.

Kobiety z mutacją w genie BRCA1, po stosowaniu antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok ze stężeniem arsenu we krwi > 1,31 pg/l wykazują istotne ponad 21 krotnie zmniejszone ryzyko rozwoju raka niż pozostałe kobiety z w/w mutacją. (OR = 0,04741, p = 0,0011, 95% Cl: 0,0027590,8147) [Tabela 2],

Tabela 2. Częstość występowania nowotworów w zależności od stężenia arsenu we krwi u kobiet z mutacją w genie BRCA1, po stosowaniu antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok.

Grupa	Mę/ertic V [iiy 1]	. „ Chorzy	Zduni i
I	>1,31	0	110
II	<1,31	11	120

Kobiety z mutacją w genie BRCA1 przed 50 rokiem życia, po stosowaniu antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok ze stężeniem arsenu we krwi >1,31 pg/l wykazują istotne ponad 18 krotnie zmniejszone ryzyko rozwoju raka niż pozostałe kobiety z w/w mutacją. (OR=0,05526, p=0,0027, 95%CI: 0,003193-0,9564) [Tabela 3],

Tabela 3. Częstość występowania nowotworów w zależności od stężenia arsenu we krwi u kobiet z mutacją w genie BRCA1 przed 50 rokiem życia, po stosowaniu antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok.

Grup.t	Mę/cnie V Ιμυ'Ι]	Chorzy	Zdrów i
I	>1,31	0	93
II	<1,31	10	108

Kobiety z mutacją w genie BRCA1 przed 50 rokiem życia, które nie stosowały antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok ze stężeniem arsenu we krwi < 0,85 pg/l wykazują istotne ponad 6 krotnie zmniejszone ryzyko rozwoju raka niż pozostałe kobiety z w/w mutacją. (OR=0,15, p=0,0391, 95%CI: 0,01914-1,175) [Tabela 4],

Tabela 4. Częstość występowania nowotworów w zależności od stężenia arsenu we krwi u kobiet z mutacją w genie BRCA1 przed 50 rokiem życia, które nie stosowały antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok.

(nipa	Mę/enie |pę l|	( ΙίΟΙ/Λ	Zdiowj
I	<0,85	1	80
II	>0,85	12	144

PL 240 134 B1

Literatura

1. Hopenhayn-Rich C., Biggs M.L., Fuchs A., Begoglio R., Tello E.E., Nicolli EL, Smith A.H.: Bladder cancer mortality associated with arsenic in drinking water in argentina. Epidemiology (1996); 7(2), s. 117-124.

2. http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/latest_classif.php. dostęp: 2017-10-11

3. Karagas M.R., Stukel T.A., Morris J.S., Tosteson T.D., Wei J.E., Spencer S.K., Greenberg E.R.: Skin cancer risk in relation to toenail arsenic concetration in a US population-based case-control study. Am. J. Epidemiol. (2001); 153(6), s. 559-565.

4. Lamm S.H., Engel A., Kruse M.B., Feinleib M., Byrd D.M., Lai S., Wilson R.: Arsenic in drinking water and bladder cancer mortality in the United States: an analysis based on 133 U.S. counties and 30 years of observation. J. Occup. Environ. Med. (2004); 46, s. 298-306.

5. Liu Mares W., Mackinnon J.A., Sherman R., Fleming L.E., Rocha-Lima C., Hu J.J., Lee D.J.: Pancreatic cancer clusters and arsenic-contaminated drinking water wells in Florida. BMC Cancer (2013); 13, s. 111.

6. Monografia pod redakcją Jana Lubińskiego Genetyka Kliniczna Nowotworów (2015); ISBN 978-83-61350-95-8.

7. Mostafa M.G., McDOnald J.C., Cherry N.M.: Lung cancer and exposure to arsenic in rural Bangladesh. Occup. Environ. Med. (2008); 65(11), s. 765-768.

8. World Health Organization: Arsenic. Environmental Health Criteria, (1981); 18, Geneva

Claims (2)

1. Sposób określenia ryzyka raka u kobiety z mutacją w genie BRCA1, znamienny tym, że obejmuje ustalenie wieku pacjentki, stanu hormonalnego oraz ilościową ocenę stężenia arsenu we krwi pełnej w próbce pobranej od tej pacjentki, przy czym:

A. u kobiety z mutacją w genie BRCA1 niezależnie od wieku, która stosowała antykoncepcję hormonalną dłużej niż 1 rok stwierdza się znacząco obniżone ryzyko rozwoju raków w przypadku występowania wysokiego stężenia arsenu we krwi, zwłaszcza > 1,31 μg/l.

B. u kobiety z mutacją w genie BRCA1 przed 50 roku życia, która nigdy nie stosowała antykoncepcji hormonalnej dłużej niż 1 rok stwierdza się znacząco obniżone ryzyko rozwoju raków w przypadku występowania niskiego stężenia arsenu we krwi, zwłaszcza < 0,85 μg/l.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał biologiczny do oceny stężenia arsenu u osoby badanej jest pobierany z krwi.