PL238768B1 - Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy - Google Patents

Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy Download PDF

Info

Publication number
PL238768B1
PL238768B1 PL422415A PL42241517A PL238768B1 PL 238768 B1 PL238768 B1 PL 238768B1 PL 422415 A PL422415 A PL 422415A PL 42241517 A PL42241517 A PL 42241517A PL 238768 B1 PL238768 B1 PL 238768B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleoside
formula
compound
diphosphate
ppm
Prior art date
Application number
PL422415A
Other languages
English (en)
Other versions
PL422415A1 (pl
Inventor
Joanna Romanowska
Justyna Gołębiewska
Marta Rachwalak
Tomasz Jakubowski
Aleksandra Dąbrowska
Original Assignee
Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk filed Critical Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL422415A priority Critical patent/PL238768B1/pl
Publication of PL422415A1 publication Critical patent/PL422415A1/pl
Publication of PL238768B1 publication Critical patent/PL238768B1/pl

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są nowe analogi nukleozydo difosforanów, ich zastosowanie jako środków przeciwwirusowych, oraz sposób otrzymywania tych związków. W szczególności zgłoszenie dotyczy siarkowych lub selenowych analogów nukleozydo 5'-difosfranów stanowiących nową grupę pochodnych nukleotydowych, oraz ich zastosowania jako leków antywirusowych, zwłaszcza hamujących namnażanie ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe analogi nukleozydo difosforanów, ich zastosowanie jako środków przeciwwirusowych, oraz sposób otrzymywania tych związków. W szczególności wynalazek dotyczy siarkowych lub selenowych analogów nukleozydo 5’-difosforanów stanowiących nową grupę pochodnych nukleotydowych, oraz ich zastosowania jako leków antywirusowych, zwłaszcza hamujących namnażanie ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
Z literatury znanych jest kilka pochodnych odpowiednio maskowanych nukleozydo 5’-difosfo-ranów, które w organizmie ulegają przekształceniu w aktywne biologicznie nukleotydy. Pośród pronukleotydów ukierunkowanych na zwalczanie wirusów, w tym HIV, najlepsze i najbliższe zastosowaniom terapeutycznym wyniki uzyskano w przypadku przedstawionych poniżej typów nukleotydów.
Diglicerydowe nukleozydo difosforany (Hostetler K. Y. et al., J. Biol. Chem., 1990, 265, 61126117) opisane wzorem (I),
otrzymane zostały w celu ułatwienia przenikania związku jako potencjalnego leku przez błonę komórkową. Synteza tych pochodnych zakładała utworzenie nukleozydo monofosforanu aktywowanego morfoliną, który następnie sprzęgano z monofosforanem zawierającym resztę glicerydową, jako potencjalną grupę maskującą. Badania trwałości proponowanych proleków wykazywały hydrolizę wiązania pirofosforanowego i uwolnienie monofosforanów nukleozydów antywirusowych, zamiast zakładanego odblokowanego nukleozydo 5’-difosforanu (II).
W literaturze znaleźć można również doniesienia o podobnych diglicerydowych pochodnych (III), różniących się występowaniem heteroatomu (siarki) w grupie blokującej resztę fosforanową. Metoda syntezy tych pochodnych jest analogiczna do tej opisanej dla związków (II). Wzór ogólny przykładowego analogu (III), który przedstawiono poniżej, ujawnia Hong C. I. et al., J. Med. Chem., 1996, 39, 17711777:
Bonnaffe D. et ah, Tetrahedron Letters, 1995, 36, 4, 531-534 ujawnia acylowe nukleozydo difosforany opisane wzorem (IV).
PL 238 768 Β1
Rj = R2: C=C (d4T) (IV)
W tego rodzaju pochodnych nukleotydów, grupy maskujące atom Pp, zbudowane są z długich łańcuchów kwasów tłuszczowych, które podobnie jak w przypadku struktur (I), miały zwiększać lipofilowość związku. Synteza tych analogów zakładała otrzymywanie soli amonowych acylowych pochodnych difosforanów, a następnie ich kondensację (wobec DCC) z nukleozydem o potwierdzonej aktywności antywirusowej. Podczas badań hydrolizy chemicznej oraz enzymatycznej związków typu (IV) stwierdzono szybki rozpad wiązania C-O-P, co w konsekwencji uniemożliwiało wydajny transport potencjalnych proleków przez błony komórkowe (Bonnaffe D. et al., ,J. Org. Chem., 1996, 61, 895-902).
Stosując podobną metodę syntezy do tej wspomnianej powyżej, otrzymano również pochodne alkiloalkoksy nukleozydo difosforanów, o wysokiej aktywności antywirusowej, (Ruiz J. C. et al., Antivirai Res., 2007, 75, 87-90) opisane wzorem (Va, Vb),
(Vb)
Bis-acyloksybenzylo nukleozydo difosforany opisane wzorem (VI),
określane są pronukleotydami DiPPro (Schulz T. et al., ChemMedChem, 2014, 9, 762-15 775), gdzie grupę R stanowi alkil lub alkenyl. Synteza tego typu pochodnych nukleotydów zakłada sprzęganie monofosforanu nukleozydu z amidofosforynem zawierającym lipofilową bis(acyloksybenzylową) grupę maskującą. Tak otrzymany produkt pośredni jest utleniany i utworzone zostają bis-acyloksybenzylo oraz bis-alkanoiloksybenzylowe analogi nukleozydo difosforanów opisane wzorem (V). Pronukleotydy te przekształcane są w 5’-difosforany nukleozydów na drodze hydrolizy chemicznej i/lub enzymatycznej estru karboksylowego w łańcuchu bocznym grupy maskującej //-resztę fosforanową pronukleotydu. W wyniku enzymatycznego rozpadu wiązania acyloestrowego oraz następującej po nim reakcji 1,6-eliminacji, uwolniony zostaje mono-maskowany nukleozydo 5’-difosforan. Powtórzenie tego procesu powoduje utworzenie się docelowego nukleotydu przedstawionego wzorem (VII).
PL 238 768 Β1
Wykorzystując podobne podejście syntetyczne, otrzymano pochodne analogiczne do typu (V), zawierające w swojej strukturze nieidentyczne reszty R w grupach maskujących atom P/?(Weinschenk L. et al., J. Med. Chem. 2015, 58, 6114-6130). Analogi te opisane wzorem ogólnym (VIII),
zawierają resztę R1, której zadaniem jest destabilizacja grupy blokującej oraz resztę R2 zwiększającą lipofilowość pronukleotydu. W otrzymanych nukleozydo 5’-difosforanach, rolę nukleozydu antywirusowego spełniają AZT (3’-azydo-3’deoksytymidyna) lub d4T (2’,3’-dideoksy-2’3’-didehydrotymidyna). Podobnie jak w przypadku pochodnych (VI), wykazano, po hydrolizie enzymatycznej lub/i chemicznej, uwolnienie docelowego nukleotydu (II) lub (VII).
Bis-benzyloksybenzylowe nukleozydo 5’-difosforany (Weinschenk L. et al., J. Med. Chem. 2015, 58, 6114-6130) opisane wzorem (IX), zostały zsyntezowane w podobny sposób jak pochodne (V) i (VII). W swojej strukturze zawierają, zamiast acylowej grupy alifatycznej, acylową grupę aromatyczną z podstawnikami wyciągającymi lub 5 donującymi elektrony (X = -Cl, -Me, -OMe, -CF3, -CN, -NO2). Poprzez wybór odpowiedniego podstawnika w pierścieniu aromatycznym, można znacząco wpływać na stabilność grup maskujących, a przez to, na tworzenie odblokowanego nukleozydo 5’-difosforanu typu (II) lub (VIII).
Nuci = AZT, d4T (ix)
PL 238 768 Β1
Warto również wspomnieć o pronukleotydach zawierających w swojej strukturze dwa nukleozydy o potwierdzonym działaniu antywirusowym (AZT, d4T) - dinukleozydo difosforanach (Qi S. et ah, Chin. Chem. Lett., 2014, 25, 427-430) opisanych wzorem (X),
Nukleozydy nie stanowią jednak dobrych grup odchodzących, stąd w wyniku hydrolizy wiązania pirofosforanowego, uwolnione zostają nukleozydo 5’-monofosforany.
W literaturze nie występują pronukleotydy zawierające w swojej strukturze heteroatomy, jako czynniki zwiększające lipofilowość zakładanych związków. Istnieje jednak wiele doniesień literaturowych (Misiura K. et ah, Org. Lett., 2005, 7 (11), 2217-2220; Burgess K. et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 2047-2059; Eckstein R, Ann. Rev. Biochem., 1985, 54, 367-402) opisujących różne podejścia syntetyczne w celu otrzymania nukleozydo α-tio difosforanów oraz α-tio trifosforanów typu (XI):
B = Ade, Cyt, Gua, Thy R = H, OH n=l or2 (XI)
Wykorzystując aktywację fosforanu nukleozydu imidazolem, przeprowadzono kondensację tak przygotowanego substratu z solą n-butyloamonową kwasu siarkowego i otrzymano nukleozydo fosforosulfonian (Kowalska J. et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett., 2012, 22, 3661-3664) opisany wzorem (XII):
= Ade, Cyt, Gua, Ura (XII).
WO1989011486 opisuje sposób otrzymywania pochodnych nukleotydów, posiadających przy atomie fosforu dwa atomy siarki lub atom siarki i atom azotu - odpowiednio ditiofosforanów i tiofosforoamidów. Metoda opiera się o chemię fosfin i pozwala na uzyskanie powyższych pochodnych zarówno dla serii rybo-jak i deoksyrybonukleozydów. Uzyskane substancje mogą być potencjalnie wykorzystane
PL 238 768 Β1 w leczeniu zakażeń bakteryjnych, wirusowych, chorób nowotworowych. Jeśli przyłączone zostaną substancje o właściwościach fluorescencyjnych czy przeciwciała lub antygeny, mogą posłużyć jako znaczniki w biochemii i diagnostyce medycznej.
WO1991007092 ujawnia polifosforany i ich tioanalogi posiadające w swojej strukturze łańcuchy alkilowe lub alkenylowe, działające przeciwko wirusowi HIV. Zasada działania oparta jest na terapii antysensowej. Powtarzającym się merem jest fragment fosforanowy lub tiofosforanowy z dołączonym nukleozydem, który sam nie wykazuje efektu terapeutycznego (niemodyfikowane nukleozydy). Wśród otrzymanych substancji znalazły się również analogi ditiofosforanowe. Efekt terapeutyczny został potwierdzony badaniami in vitro.
W zgłoszeniu patentowym US20030099981 ujawniono protokół syntetyczny opisujący otrzymywanie triestrówtiofosforanowych, bazujący na chemii /-/-fosfonianów, a mianowicie na reakcjach sprzęgania monoestrów /-/-fosfonianowych do diestrów i następnie ich reakcji z substancjami transferującymi siarkę. Proces jest uniwersalny zarówno dla nukleozydówjak i oligonukleotydów posiadających funkcję /-/-fosfonianową. Może być prowadzony w jednoczesnej obecności w roztworze substancji sprzęgających oraz transferujących atom siarki. Nie otrzymywano jednak tą metodą tiodifosforanów nukleozydów.
PL217694 dostarcza nowe analogi nukleotydu w postaci amido-mononofosforanów. Jest to jednak starsza generacja proleków ponieważ uzyskanie aktywnego trifosforanu wymaga dwóch etapów fosforylacji, do difosforanu a następnie do trifosforanu.
WO2016026493 zapewnia di- i trifosforany nukleozydów wykazujące mechanizm działania jako proleki oraz metodę ich syntezy. Związki te charakteryzują się obecnością grup maskujących na resztach fosforanowych, które po wejściu do komórki uwalniają odpowiednio di- lub trifosforan nukleozydu. Zadaniem grup maskujących jest umożliwienie cząsteczce di- lub trifosforanu nukleozydu przeniknięcie przez barierę biologiczną, jaką stanowi błona komórkowa. Innowacją tego pomysłu jest maskowanie tylko reszty fosforanowej β w przypadku difosforanów nukleozydów lub tylko reszty fosforanowej γ dla trifosforanów nukleozydów. Otrzymane substancje są potencjalnymi prolekami anty-HIV.
WO2016145142 zapewnia nowe kompozycje terapeutyczne zawierające nukleotydy i nukleozydy z siarką w cząsteczce zasady, do leczenia chorób wywołanych zakażeniem wirusowym, zwłaszcza wirusami RNA i DNA. Zgłoszenie zapewnia pochodne tritiofosforanów, gdzie A jest siarką, Xjest tlenem i co najmniej jeden Xjest siarką, R4 jest wodorem.
II II ,Λν
ΗΟ-Ρ“0-Ρ“Ο-Ρ-Ο-η Μ 'X
OH ÓH A'R10-< S— R 3-)--f-R6 r4r7 (XIII)
Pomimo wielu istniejących już rozwiązań wykorzystujących pochodne nukleotydowe jako związki do leczenia chorób wirusowych istnieje ciągła potrzeba uzyskania skutecznego rozwiązania umożliwiającego stworzenie kompozycji farmaceutycznych zawierających związki, które wykazywałyby udoskonalone parametry farmakokinetyczne i fizykochemiczne.
Celem wynalazku jest zapewnienie analogów nukleozydów efektywnie hamujących replikację wirusów, zwłaszcza HIV, w szczególności wykazujących wysoką aktywność przeciwwirusową i trwałość oraz posiadających wysoki stopień selektywności. Celem wynalazku jest dostarczenie pronukleotydów, które ulegają przekształceniu w komórce w aktywne biologicznie nukleotydy.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze
lub jego sól, gdzie Z stanowi N3 a B stanowi tymidyny-1-yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1-y 1,
PL 238 768 Β1
Ri i R2 stanowi alkil, aryl lub H,
X i Y stanowi O albo S, Se, przy czym gdy X stanowi O wówczas Y stanowi S lub Se, gdy X stanowi S, Se wówczas Y stanowi O.
Przedmiotem wynalazku jest również związek o wzorze
lub jego sól, gdzie Z stanowi N3 a B stanowi tymin-1-yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1-yl, Xjest S lub Se, R1 jest alkilem lub arylem, a R2jest alkilem lub H.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze
lub jego sól, gdzie Z stanowi N3 a B stanowi tymin-1 -yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1-yl, X jest S lub Se, R1 i R2 stanowi alkil.
Korzystnie, powyższy związek o wzorze XIV, XIVa albo XIVb występuje w postaci soli trietyloamoniowej.
Następnym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze XIV, XIVa albo XIVb do zastosowania jako lek.
Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca powyższy związek o wzorze XIV, XIVa albo XIVb, i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek o wzorze XIV, XIVa albo XIVb do zastosowania w leczeniu zakażeń wirusowych.
Korzystnie, zakażenie wywołane jest retrowirusem.
Korzystnie, zakażeniem wirusowym jest zakażenie wirusem HIV.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania powyższego związku opisany schematem:
[X(Va)
PL 238 768 Β1 przy czym
X stanowi O, S, Se
TMS-CI stanowi chlorek trimetylosililu
Ri, R2 stanowi alkil, aryl, H
Z stanowi N3 a B stanowi tymidyny-1-yl, albo Z stanowi H a B jest uracyl-1-ylem.
Dokładniej, przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania związku jak określono powyżej, w którym to sposobie związek o wzorze XV:
poddaje się kondensacji z chlorkiem trimetylosililu (TMS-CI) w obecności pirydyny, a następnie tak otrzymany reaktywny /-/-fosfoniano diester o wzorze XVI:
poddaje się utlenianiu w obecności elementarnego jodu z otrzymaniem związku pośredniego - adduktu pirydyniowego o wzorze XVII:
który następnie poddaje się reakcji kondensacji z obecnym w medium reakcyjnym nukleofilem a następnie hydrolizie, i gdzie nukleofil jest wybrany spośród:
a) fosforano mono- lub diestru o wzorze XVIII:
o
II
Ό---P---ORd
I or2 (XV9H) z wytworzeniem ct-S (lub Se)-nukleozydo 5’-difosforanu o wzorze XIVa:
(Xiva)
PL 238 768 Β1 albo
b) fosforanu siakowego lub selenowego o wzorze XIX:
S(Se) o—p—OR,
OR, (XIX) z wytworzeniem β-S (lub Se)-nuklezydo 5’-difosoranu o wzorze XIVb:
X stanowi O, S lub Se,
Ri, R2 stanowi alkil, aryl, H
Z stanowi N3 a B stanowi tymidyn-1-yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1-yl.
W syntezie siarkowych i selenowych nukleozydo 5’-difosforanów wykorzystano metodę, w której nukleozydo 5'-/-/-fosfoniany (lub ich tio- albo seleno- analogi) kondensują z monoestrem lub diestrem alkilo i/lub arylo fosforanu (lub odpowiednio tio- lub seleno fosforanu) w obecności jodu, tworząc odpowiednie difosforany. Powyższy sposób syntezy cechuje się wysoką wydajnością.
Syntezę siarkowych i selenowych analogów nukleozydo difosforanów opisanych wzorem XIV prowadzi się w sposób uwzględniający potrzebę uzyskania produktu posiadającego heteroatom (siarkę lub selen) przy atomie fosforu w pozycji a- (XIVa), bądź w pozycji β- (XIVb) nukleozydo difosforanu.
Synteza a- modyfikowanych heteroatomem (siarka lub selenem) nukleozydo 5’-difosforanówtypu XIVa,
Pierwszym etapem reakcji prowadzonej w pirydynie jest kondensacja /-/-tio (lub seleno) fosfonianu nukleozydu typu XV (gdzie X stanowi S lub Se) z chlorkiem trimetylosililu. Celem aktywacji jest przekształcenie /-/-fosfonianu monoestru w bardziej reaktywny i podatny na reakcję utleniania Hfosfoniano diester typu XVI. Tak powstały diester jest następnie utleniany w obecności elementarnego jodu. Wynikiem tego etapu jest powstanie wysoce reaktywnego związku pośredniego - adduktu pirydyniowego XVII, który ulega szybko reakcji z obecnym w medium reakcyjnym nukleofilem (fosforano mono- lub diestrem XVIII) z wytworzeniem α-S-nukleozydo 5’-difosforanu typu XIVa.
Synteza β- modyfikowanych heteroatomem (siarka lub selenem) nukleozydo 5’-difosforanów typu XIVb.
Schemat syntezy //-P pochodnych, różni się od powyżej opisanej procedury tym, że w pierwszym etapie używanym substratem jest tlenowy /-/-fosfonian nukleozydu typu XV (gdzie X stanowi O), który kondensowano z chlorkiem trimetylosililu w pirydynie generując /-/-fosfoniano diester typu XVI. W kolejnym etapie powstały diester poddawano reakcji oksydatywnej kondensacji wobec jodu z odpowiednim siarkowym lub selenowym fosforanem typu XIX do produktu- β-S (lub Se)-nukleozydo 5’-difosforanu typu XIVb.
Zarówno a-, jak i //-analogi tio- lub seleno difosforanów były izolowane przez chromatografię kolumnową z fazy chlorek metylenu : metanol (v:v) (80:20).
Otrzymane związki stanowią nową grupę pochodnych nukleotydowych, których indeks selektywności jest istotnie wyższy niż nukleozydów, z których się wywodzą oraz innych znanych pochodnych nukleotydowych. Również cytotoksyczność otrzymanych analogów nukleozydo difosforanów, a także ich aktywność anty-HIV jest istotnie wyższa w odniesieniu do nukleozydo difosforanów opisanych w literaturze. Otrzymane związki są nietoksyczne. Związki typu XIVb wykazują aktywność pronukleotydów, tzn. wnikają do komórek jako pochodne nukleotydów, co dowiodły analizy HPLC i wyniki aktywności antywirusowej pochodnych ddU. Związki typu XIVa charakteryzują się wysoką trwałością
PL 238 768 Β1 (>48 h) w medium hodowlanym komórek (RPMI) oraz w medium hodowlanym komórek wzbogaconym enzymami (RPMI/FBS), przy jednocześnie wysokiej aktywności anty-HIV.
Otrzymane związki są stabilne podczas przechowywania. Związki te są trwałe w buforach 1 o pH 1, a więc w roztworach o kwasowości podobnej do tej w żołądku, co czyni je dobrymi kandydatami do doustnego podawania jako leki.
Przykład 1
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo a-tio-p-benzylo-difosforanu (XX)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-tiofosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od siliło /-/-tiofofonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan benzylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XX połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 52% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XX.
Wydajność 52%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 532.0000 obliczona dla [C17H20N5O9P2S-] 532,04624 31P NMR {1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 46.06 (m), -13.46 (m).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz) : δ (ppm) 46.02 (m), -13.48 (m)
Przykład 2
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo a-tio-p-dietylo-difosforanu (XXI)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-tiofosfoniano diestru typu XVI
PL 238 768 Β1 była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od sililo-/-/-tiofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan dietylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (020%). Frakcje zawierające czysty produkt XXI połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 82% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXI.
Wydajność 82%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 498,0672 obliczona dla [C14H22N5O9P2S-] 498,06189 31P NMR {1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 46.59 (m), -13.05 (m).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz) : δ (ppm) 46.52 (m), -13.07 (m).
P rzykład 3
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo a-seleno-p-dietylodifosforanu (XXII)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-selenofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-seleno fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-48,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -57,7 ppm pochodzących odsililo-/-/-selcnofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan dietylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXII połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 45% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXII.
Wydajność 45%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 546,0098 obliczona dla [Ci4N22N5O9P2Se-] 546,00635 31P NMR{1H} (CH3CN, 121.4 Hz) : δ (ppm) 35.07, 34.94 (dd, JP,P = 11.18, 10.83 Hz).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz) : δ (ppm) 35.79 (m), -13.69 (m).
Przykład 4
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo a-tio-p-bis(2-etyloheksylo)-difosforanu (XXIII)
PL 238 768 Β1
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-tiofosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od siliło 1 i 1 silo-/-/-tiofosfonianu u AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan bis-etyloheksylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXIII połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofdizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 67% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXIII.
Wydajność 67%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 666,2520 obliczona dla [C26H46N5O9P2S-] 666,24970 31P NMR {Ή} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 46.19 (m), -12.81 (m).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz): 8 (ppm) 46.17 (m), -12.77 (m).
Przykład 5
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo a-seleno-p-bis(2-etyloheksylo)-difosforanu (XXIV)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-selenofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-seleno fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-48,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -57,5 ppm pochodzących odsililo-/-/-selenofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan bisetyloheksylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXIV połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 34% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXIV.
Wydajność 34%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 714,1985 obliczona dla [C26H46N5O9OP2Se-] 714,19415 31P NMR {Ή} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 37.92 (m), -13.34 (m).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz): δ (ppm) 37.90 (m), -13.50 (m).
PL 238 768 Β1
Przykład 6
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo-tio-p-(2-chloropirydyn-3-ylo)-difosforanu (XXV)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo H- tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo N-tiofosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od sililo-77-tiofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan 2-chloro pirydyn-3-ylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXV połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 47% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXV.
Wydajność 47%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 552,9889 obliczona dla [C15H16CIN6O9P2S-] 552,98687 31P NMR {1H} (CH3CN, 121.4 Hz) : δ (ppm) 44.95 (m), -18.93 (m).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz): δ (ppm) 45.03 (m), -18.95 (m).
P rzykład 7
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo a-tio-p-(2,2,2-trifluoroetylo)-difosforanu (XXVI)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo H-tiofosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od siliło /-/-tiofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodanofosforan 2,2,2-trifluoro etylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXVI połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 20% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXVI.
PL 238 768 Β1
Wydajność 20%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 524,0024 obliczona dla [C12H15F3N5O9P2S-] 524,00233 31PNMR{1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 44.61 (m),-13.71 (m).
31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz): δ (ppm) 44.61 (m),-13.71 (m).
Przykład 8
Synteza 3’-azydo-3,-deoksytymidyn-5’-ylo a-tio-6-dimetylo-difosforanu (XXVII)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo H- tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-tiofosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od sililo/-/-tiofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan dimetylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXVII połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 52% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXVII.
Wydajność 52%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 470,0286 obliczona dla [C12H18N5O9P2S-] 470,03059 31P NMR {Ή} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 48.75 (m), -8.75 (m).
31 P NMR (CH3CN, 121,4 Hz) : δ (ppm) 48.28 (m), -8.77 (m).
Przykład 9
Synteza 2’,3’-dideoksyurydyn-5’-ylo a-tio-p-bis(2-etyloheksylo)-difosforanu (XXVIII)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-tiofosfonianu (1 ekwiwalent molowy) pochodnej ddU odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-tiofosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (-54,8 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie -58,5 ppm pochodzących od sililo-/-/-tiofosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano fosforan bis(etyloheksylu) (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ci
PL 238 768 Β1 śnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXVIII połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produktw postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 25% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXVIII.
Wydajność 25%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 611,2320 obliczona dla [C25H45N2O9P2S-]
611,23265 31P NMR {1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 47.62 (m), -11.39 (m).
31 PNMR(CH3CN, 121,4 Hz): δ (ppm) 47.61 (m),-11.39 (m).
P rzy kład 10
Synteza 3:-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo p-dibutylo-p-tio-difosforanu (XXIX)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-fosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (~3,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie —1,5 ppm pochodzących od sililo-/-/fosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano tiofosforan dibutylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXIX połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 71% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXIX.
Wydajność 71%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 554,1233 obliczona dla [CisHsoNsOgPzS'] 554,12449 31P NMR{1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 54.84 (d, JP,P = 22.79 Hz), -13.46 (d, JP,P = 22.70 Hz). 31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz): δ (ppm) 54.82 (m), -13.47 (m).
Przykład 11
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo p-dibutylo-p-seleno-difosforanu (XXX)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-fosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV)
PL 238 768 Β1 (~3,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie —1,5 ppm pochodzących od sililo-/-/-fosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano selenofosforan dibutylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXX połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofdizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 37% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXX.
Wydajność 37%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 602,0645 obliczona dla [Ci8H30N5O9P2Se-]- 602,06895 31P NMR {1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 47.14 (m), -12.55 (m).
31P NMR (CHsCN, 121,4 Hz): δ (ppm) 54.95 (m), -13.44 (m)
Przykład 12
Synteza 3'-azydo-3'-deoksytymidyn-5’-ylo p-bis(2-etyloheksylo)-p-tio-difosforanu (XXXI)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo H- fosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (~3,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie ~-1,5 ppm pochodzących od sililo/-/-fosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano tiofosforan 25 bis(etyloheksylu) (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXXI połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 97% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXXI.
Wydajność 97%. HRMS [M-Et3NFI+]- m/z 666,2494 obliczona dla [C26H46N5O9P2S-]- 666,24970 31P NMR {1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 54.65 (d, J P,P = 21.04 Hz), -13.41 (d, J P,P = 21.15 Hz) 31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz): δ (ppm) 54.65 (m), -13.43 (m)
Przykład 13
Synteza 3’-azydo-3’-deoksytymidyn-5’-ylo p-dimetylo-p-tio-difosforanu (XXXII)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo H- fosfonianu (1 ekwiwalent molowy) odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (~3,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie ~-1,5 ppm pochodzących od sililo/-/-fosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano tiofosforan dimetylu (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), olei
PL 238 768 Β1 sta pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (0-20%). Frakcje zawierające czysty produkt XXXII połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 38% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXXII.
Wydajność 38%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 470,0308 obliczona dla [C12H18N5O9P2S-]- 470,03059 31P NMR{1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 57.27 (d, JP,P = 22.93 Hz), -13.94 (d, JP,P= 22.99 Hz). 31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz) : δ (ppm) 57.26 (m), -13.94 (m).
Przykład 14
Synteza 2’,3’-dideoksyurydyn-5’-ylo p-bis(2-etyloheksylo)-p-tio-difosforanu (XXXIII)
W celu usunięcia śladów wody, z rozpuszczonego w pirydynie nukleozyd-5’-ylo /-/-fosfonianu (1 ekwiwalent molowy) pochodnej ddU odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna). Do pozostałości rozpuszczonej w pirydynie dodano chlorek trimetylosililu (2 ekwiwalenty molowe). Po 10 minutach reakcja tworzenia nukleozydo /-/-fosfoniano diestru typu XVI była zakończona, co stwierdzono przy pomocy analizy widma 31P NMR obserwując zanik sygnału substratu (typu XV) (~3,5 ppm) i pojawienie się dwóch sygnałów (dwa diastereoizomery) w regionie ~-1,5 ppm pochodzących od sililo-/-/-fosfonianu AZT (typu XVI). Do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór jodu (1,5 ekwiwalentu molowego) w pirydynie (1 mmol/ml) i dodano tiofosforan bis(etyłoheksylu) (3 ekwiwalenty molowe). Po pięciu minutach dodano wodę (10 ekwiwalentów molowych). Nadmiar jodu rozłożono etanotiolem (do odbarwienia roztworu). Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem (wyparka rotacyjna), oleistą pozostałość rozpuszczoną w chlorku metylenu naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym SI 60 w chlorku metylenu stosując gradient wody (020%). Frakcje zawierające czysty produkt XXXIII połączono i odparowano, a pozostałość poddano liofilizacji z zamrożonej mieszaniny metanolu i benzenu. Otrzymano produkt w postaci suchego białego proszku. Uzyskano wydajność 62% otrzymanej pochodnej AZT opisanej wzorem XXXIII.
Wydajność 62%. HRMS [M-Et3NH+]- m/z 611,2345 obliczona dla [C25H45N2O9P2S-]- 611,23265 31P NMR{1H} (CH3CN, 121.4 Hz): δ (ppm) 54.65 (d, JP,P = 21.04 Hz), -13.41 (d, JP,P = 21.15 Hz). 31P NMR (CH3CN, 121,4 Hz) : δ (ppm) 54.65 (m), -13.43 (m).
P rzy kład 15
Oznaczanie cytotoksyczności, aktywności przeciwwirusowej i trwałości związków.
Oznaczanie cytotoksyczności CC50 i CC90.
Cytotoksyczność i aktywność anty-HIV związków ΧΧ-ΧΧΧΙII była badana na komórkach CEMT-4 według procedur opisanych poniżej. W celu oznaczenia cytotoksyczności związków, komórki CEM-T4 hodowano w standardowych warunkach (37°C, 5% CO2) w 96-studzienkowych płytach hodowlanych w mediach (RPMI, 10% FOS) wzbogaconych w testowane substancje. Hodowle prowadzono w mediach stanowiących szereg rozcieńczeń testowanych substancji. Kontrolę stanowią hodowle prowadzone w
PL 238 768 Β1 czystym medium (RPMI, 10% FCS). Żywotność komórek oznaczono po 7 dniach hodowli przy użyciu testu MTT (Sigma, USA). Do każdej studzienki hodowlanej dodawano 10 pL roztworu (5 mg/mL) MTT (bromek [3-(4,5-dimetyloimidazo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliny]. Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Komórki i wytworzony przez enzymy mitochondrialne produktkryształy formazanu odwirowano, usuwano medium i dodawano DMSO w celu zlizowania komórek i rozpuszczenia kryształów. Pomiar natężenia barwy fioletowej wykonano przy użyciu spektrofotometru płytkowego przy długości fali 560 nm.
Obliczenia cytotoksyczności wykonano poprzez pomiar absorbancji, gdzie wartości absorbancji dla kontroli (K) to średnia pomiarów z pięciu studzienek hodowlanych. Stanowi ona 100% żywotności komórek CEM-T4. Wartość absorbancji dla komórek hodowlanych zawierających badane związki w określonych stężeniach, wyliczano w oparciu o odczyty absorbancji z trzech powtórzeń. Uzyskane wyniki za każdym razem odnoszono do wartości kontrolnej.
Żywotność komórek (P) obliczono wg wzoru:
(A-T)x 100 p = --------K-T
W którym P oznacza przeżywalność komórek wyrażona w %%, K - wartość absorpcji dla kontroli, A - wartość absorbancji dla hodowli komórek w obecności testowanych związków, T + 0,06, stała wartość absorbancji medium RPMI/10% FCS.
Na podstawie wyliczeń sporządzono wykresy zależności przeżywałności komórek od testowanych związków w określonych stężeniach, na podstawie których wyznaczono wartości CCso i CC90.
Aktywność anty-HIV-1 (ECso i ECgo).
Komórki CEM-T4 preinkubowano 24 godz. w standardowych warunkach (37°C, 5% CO2) w medium (RPMI, 10% FCS) wzbogaconym w testowane preparaty w stężeniach 0,001-20 μΜ. Inkubacje prowadzono na płytce 96 studzienkowej płaskodennej, gdzie w studzience w 200 pL roztworu leku zawieszono tysięcy komórek. Hodowle dla każdego stężenia związku prowadzono w czterech powtórzeniach. Kontrole referencyjne, określające hamowanie replikacji HIV-1 stanowiły hodowle prowadzone w medium wzbogaconym w AZT w stężeniach 0,32 μΜ, 0,16 μΜ, 0,08 μΜ, 0,04 μΜ, 0,02 μΜ, 0,01 μΜ, 0,005 μΜ, 0,0025 μΜ, 0,0012 μΜ, 0,0006 μΜ. Kontrolę odzwierciedlającą prawdziwą replikację wirusa stanowiły hodowle prowadzone w czystym medium RPMI, 10% FCS.
Po 24 godzinnej inkubacji w medium wzbogaconym w testowane preparaty i AZT, inokulowano przez dodanie identycznej, znanej ilości wirusa HIV-1 i hodowlę prowadzono przez 8 dni. W zebranych nadsączach z ósmego dnia hodowli oznaczono białko wirusowe p24, marker wielkości replikacji wirusa. Hamowanie replikacji wirusa przedstawiono jako procentową zawartość białka p24 w hodowlach prowadzonych w mediach wzbogaconych w testowane substancje w odniesieniu do hodowli (hodowle wirusa HIV-1 w komórkach CEM-T4 w medium bez inhibitorów), przyjmując, że zmierzona ilość markera p24 w kontroli odpowiada 100% replikacji wirusa. Wszystkie hodowle dla każdego stężenia, każdej testowanej substancji prowadzone były w trzech powtórzeniach.
Cytotoksyczność (CC), aktywność anty-HIV (EC) związków wg niniejszego wynalazku oraz ich wskaźniki selektywności przedstawiono w Tabelach 1 i 2. Tabela 1 przedstawia parametry farmakokinetyczne (CC50, CC90, ECso, EC90, SI50) otrzymanych α-modyfikowanych heteroatomem tj. siarką lub selenem analogów nukleozydo 5’-difosforanów. Tabela 2 przedstawia parametry farmakokinetyczne otrzymanych β- modyfikowanych heteroatomem tj. siarką lub selenem analogów nukleozydo 5’-di-fosforanów. Tabela 3 przedstawia porównawcze parametry farmakokinetyczne znanych związków - cytotoksyczność (CCso) i aktywność anty-HIV-1 (ECso) przykładowych nukleotydówtypu VII i IX, tenofoviru oraz nukleozydo w (AZT i ddU). Związki XXVIII i XXXIII są analogami ddU. Pochodne tych związków jeśli nie są pronukleotydarni to nie wykazują żadnej aktywności antywirusowej. Fakt pojawienia się aktywności oznacza, że do komórki dostarczony został ufosforylowany nukleozyd, który ma charakter pronukleotydu. Brak aktywności świadczyłby o rozpadzie związków XXVIII i XXXIII do nukleozydu jeszcze przed wniknięciem do komórki pod wpływem działania enzymów defosforylujących. Nukleozyd, pomimo iż przenika przez błonę komórkową nie wykazuje jakkolwiek aktywności, ddU nie jest bowiem substratem dla kinaz fosforylujących go do monofosforanu (w przeciwieństwie do AZT), a następnie do di - i kolejno do tri-fosforanu, będącego aktywnym lekiem.
PL 238 768 Β1
Tabela 1
Związek CC50 [μΜ] CC90 [μΜ] EC50 [μΜ] EC9o [μΜ] SIso
XX >212 >212 0,007 0,02 30 286
XXI >250 >250 0,02 >0,5 12 500
XXIII >450 >450 0,035 >0,5 12 857
XXIV 25 88 0,005 0,03 20 000
XXV >226 >226 <0,004 0,03 56 500
XXVI >238 >238 0,025 0,19 9520
XXVII >240 >240 0,007 0,027 34 286
XXVIII 160 330 3,7 8 43
Tabela 2
Nr związku CC50 [μΜ] CC90 [μΜ] EC50 [μΜ] EC9o [μΜ] SI50
XXIX >300 »300 0,004 0,026 75 000
XXX >330 »330 0,003 0,05 110 000
XXXI >190 »190 0,02 0,2 9 500
XXXII >258 >258 0,005 0,012 51 600
XXXIII 310 >390 4,4 9,3 70
PL 238 768 Β1
Tabela 3
Lp. Związek CC50 [μΜ] EC50 [μΜ] SI50
l.a C4H9’DiPPro-AZTDP (typ vii) 60 0,011 5 455
2,a C6Hi3-DiPPro-AZTDP (typ VII) 47 0,016 2 938
3.a CII3/CF3-Ph-DiPPro-AZTDP (typ IX) 100 0,012 8 333
4.a C4H9/C1 iH23-DiPPro-AZTDP (typ IX) 36 0,013 2 769
5.a CH3/C9Hi9-DiPPro-AZTDP (typ IX) 20 0,016 1 250
6. AZT 60 0,0011 6 000
7.b ddU »250 48 >5,2
8.c tenofovir >1 000 0,55 1 818
a Weinschenk et al., J. Med. Chem. 2015, 58, 6114-6130; b Oznaczone na komórkach CEM-T4;
Baba M. i wsp., Blochem. Biophys. Res.
bCommun„ 1987, 142(1), 128-134;
c· Informacje dotyczące tenofoviru (Viread®) na stronie internetowej FDA (Food and Drug Administration).
https://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/briefmg/3792bl 01 gilead.pdf
Badanie trwałości związków
Trwałość i ścieżki rozpadu badanych związków były badane w mediach hodowlanych komórek [RPMI] i mediach hodowlanych komórek wzbogaconych enzymami (surowica z płodów bydlęcych, FBS), w tym fosfoesterazami [RPMI/FBS 9:1 (v/v)]. Próbki związków były inkubowane w 37°C a proces śledzony przy pomocy HPLC.
Analizy HPLC wykonywane były na kolumnie Lichrospher RP18-5 (5 μίτι) 25 cm x 4,6 mm, stosując system: bufor A octan trietyloamoniowy (0.01 M) i bufor B - acetonitryl/ bufor A (4:1 v/v) i gradient B w A 0-95% przez 30 min., szybkość przepływu 1 ml/min., w temp. 37°C.
Medium hodowlane komórek RPMI-1640 oraz surowica z płodów bydlęcych FBS były zakupione w Sigmie (odpowiednio R7256 i F7524).
Stosując w/w wyżej warunki, badania nad trwałością modyfikowanych siarką lub selenem analogów nukleozydo 5’-difosforanów w medium hodowlanym komórek RPMI wskazały na trwałość związków utrzymującą się przez przynajmniej 7 dni.
Badania w mediach hodowlanych komórek wzbogaconych aktywnością enzymatyczną (RPMI/FBS) obserwowano różnice w zależności, czy badane związki posiadały modyfikację heteroatomem w pozycji α-P czy β-Ρ. W przypadku tych pierwszych obserwowano trwałość związków utrzymującą się przynajmniej przez 7 dni, co przyjednocześnie atrakcyjnych parametrach antywirusowych, czyni te związki atrakcyjnymi kandydatami jako leki antywirusowe. Tabela 4 przedstawia parametry stabilności modyfikowanych heteroatomem (siarką lub selenem) analogów nukleozydo 5’-difosforanów.
W odróżnieniu, analogi posiadające modyfikacje siarką lub selenem w pozycji β-Ρ ulegają rozpadowi z czasem połowicznego rozpadu (ti/2) pomiędzy 1-50 h. W każdym przypadku produktem rozpadu jest nukleozydo 5’-monofosforan, co przy jednocześnie wysokiej aktywności antywirusowej, czyni te związki potencjalnymi pronukleotydami antywirusowymi (Tabela 4).
PL 238 768 Β1
Tabela 4
a-modyfikowane heteroatomem (siarką lub selenem) analogi nukleozydo 5 ’-difosforanów β-modyfikowane heteroatomem (siarką lub selenem) analogi nukleozydo 5 ’-difosforanów
Nr związku tl/2 Nr związku tl/2
XXI >7 dni XXIX 2h
XXII >7 dni XXX 2h
XXVIII >7 dni XXXI 50 h
XXXIII 1 h
Zastrzeżenia patentowe

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Związek o wzorze
    lub jego sól, gdzie Z stanowi N3 a B stanowi tymidyn-1-yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1-yl
    Ri i R2 stanowi alkil, aryl lub H,
    X i Y stanowi O albo S, Se, przy czym gdy X stanowi O wówczas Y stanowi S lub Se, gdy X stanowi S, Se wówczas Y stanowi O.
  2. 2. Związek o wzorze
    lub jego sól, gdzie Z stanowi N3 a B stanowi tymin-l-ył, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1 -yl, X stanowi S lub Se, R1 stanowi alkil lub aryl, a R2 stanowi alkil lub H.
    PL 238 768 Β1
  3. 3. Związek o wzorze
    lub jego sól, gdzie Z stanowi N3 a B stanowi tymin-1 -yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1 -yl, Y stanowi S lub Se, R1 i R2 stanowi alkil.
  4. 4. Związek według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że występuje w postaci soli trietyloamoniowej.
  5. 5. Związek według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3 do zastosowania jako lek.
  6. 6. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
  7. 7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 6 do zastosowania w leczeniu zakażeń wirusowych.
  8. 8. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 7, znamienna tym, że zakażenie wywołane jest retrowirusem.
  9. 9. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 8, znamienna tym, że zakażenie wywołane jest wirusem HIV.
  10. 10. Sposób otrzymywania związku jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1 do 3, w którym związek o wzorze XV:
    poddaje się kondensacji z chlorkiem trimetylosililu (TMS-CI) w obecności pirydyny, a następnie tak otrzymany reaktywny /-/-fosfoniano diester o wzorze XVI:
    poddaje się utlenianiu w obecności elementarnego jodu z otrzymaniem związku pośredniego - adduktu pirydyniowego o wzorze XVII:
    PL 238 768 Β1 który następnie poddaje się reakcji kondensacji z obecnym w medium reakcyjnym nukleofilem a następnie hydrolizie, i gdzie nukleofil jest wybrany spośród:
    a) fosforano mono- lub diestru o wzorze XVIII:
    o
    II
    Ό---P---ORi
    OR2 (XVIII) z wytworzeniem a-S (lub Se)-nukleozydo 5’-difosforanu o wzorze XIVa:
    albo
    b) fosforanu siarkowego lub selenowego o wzorze XIX:
    S(Se)
    Ό—P--OR, or2 (XIX) z wytworzeniem β-S (lub Se)-nukleozydo 5’-difosforanu o wzorze XIVb:
    przy czym w powyższych wzorach
    X stanowi O, S lub Se,
    Ri, R2 stanowi alkil, aryl, H
    Z stanowi N3 a B stanowi tymidyn-1-yl, albo Z stanowi H a B stanowi uracyl-1-yl.
PL422415A 2017-07-31 2017-07-31 Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy PL238768B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL422415A PL238768B1 (pl) 2017-07-31 2017-07-31 Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL422415A PL238768B1 (pl) 2017-07-31 2017-07-31 Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL422415A1 PL422415A1 (pl) 2019-02-11
PL238768B1 true PL238768B1 (pl) 2021-10-04

Family

ID=65270256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL422415A PL238768B1 (pl) 2017-07-31 2017-07-31 Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL238768B1 (pl)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL217694B1 (pl) * 2010-10-19 2014-08-29 Inst Chemii Bioorg Polskiej Akademii Nauk Analog nukleotydu, sposób otrzymywania analogu nukleotydu, zastosowanie analogu nukleotydu, pro-nukleotyd antywirusowy, kompozycja farmaceutyczna

Also Published As

Publication number Publication date
PL422415A1 (pl) 2019-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11559542B2 (en) Phosphoramidate derivatives of 5-fluoro-2′-deoxyuridine for use in the treatment of cancer
US6455513B1 (en) Chemical compounds
Puech et al. Intracellular delivery of nucleoside monophosphates through a reductase-mediated activation process
CA1336820C (en) Fluorinated nucleosides and process for treating retrovirus infections therewith
ES2498046T3 (es) Compuestos antivirales de éster de fosfonato
PT1628685E (pt) Análogos de fosfonatos antivirais
AU2014268040A1 (en) Phosphoric acid/phosphonic acid derivatives and medicinal uses thereof
PT98720B (pt) Processo para a preparacao de derivados de fosfolipidos de nucleosidos e de composicoes farmaceuticas que os contem
PT707591E (pt) Esteres de acido metilfosfonico, processo para a sua preparacao e sua utilizacao
US6686462B2 (en) Antiviral compounds and methods of administration
BRPI0210746B1 (pt) derivados de 6-&#39;2-(fosfonometóxi)alcóxi-pirimidina e seu método de preparação
JPH01501864A (ja) 抗ウイルス剤
Okruszek et al. The synthesis of nucleoside 5'-O-(1, 1-dithiotriphosphates)
US5153180A (en) Fluorinated nucleosides and process for treating retrovirus infections therewith
PL238768B1 (pl) Nowy analog nukleozydo difosforanu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca analog nukleozydo difosforanu, jego zastosowanie i sposób syntezy
Villard et al. An original pronucleotide strategy for the simultaneous delivery of two bioactive drugs
Kim et al. Phosphonate Isosteres of 2′, 3′-Didehydro-2, 3-dideoxynucleoside Monophosphates: Synthesis and Anti-HIV Activity
Jia et al. Membrane-permeable tenofovir-di-and monophosphate analogues
EP1334108B1 (en) ARYL PHOSPHATE DERIVATIVES OF d4T
EP4356928A1 (en) Nucleoside diphosphate or diphosphonate prodrugs, or nucleoside analogue diphosphate or diphosphonate prodrugs
Guga et al. Nucleotides and nucleic acids: mononucleotides
JPH08512040A (ja) デオキシヌクレオシドのリポヌクレオチド、それらの製造方法および抗ウイルス薬としてのそれらの用途
PL217694B1 (pl) Analog nukleotydu, sposób otrzymywania analogu nukleotydu, zastosowanie analogu nukleotydu, pro-nukleotyd antywirusowy, kompozycja farmaceutyczna