PL238767B1 - Zasobnik do pozyskiwania biofilmu do analizy mikroskopii elektronowej SEM - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zasobnik do pozyskiwania biofilmu w warunkach in vitro, przeznaczony do hodowli mikrobiologicznej w przypadku konieczności zapewnienia odpowiedniego środowiska wzrostu drobnoustrojów tworzących biofilm, z zastosowaniem do badań mikroskopii elektronowej (SEM, Scannin Electron Microscopy). Dzielony zasobnik dwukompartmentowy z separowanym nośnikiem umożliwia bezurazowe pozyskanie biofilmu biologicznego m.in. na konduktywnej matrycy krążka węglowego do zastosowania podczas analizy mikroskopowej SEM. Matryca węglowa przewodząca elektrony zapobiega uszkodzeniu próbki biofilmu przez strumień elektronów emitera SEM.

Kompozycja i struktura uzyskanego biofilmu zależy m.in. od podłoża wzrostu. W pomiarze mikroskopowym SEM, w odróżnieniu od klasycznej mikroskopii optycznej, stosowane jest wysokoenergetyczne działo elektronowe, które w przypadku próbek organicznych (biofilm) może wywoływać istotny efekt urazowy. W związku z tym istotne jest zapewnienie nośnika organicznego materiału do badań mikrobiologicznych podczas pomiaru SEM, który stanowi dobry przewodnik elektronów, zapobiegając kumulacji energii na powierzchni próbki wpływającej negatywnie na strukturę biofilmu.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 7871791 B2 znany jest sposób uzyskiwania biofilmu do celów jego wizualizacji za pomocą technik mikroskopowych. Z publikacji międzynarodowych zgłoszeń patentowych nr U.S. Patent 6,051,423; U.S. Patent 6,326,190; U.S. Patent 6,410,256; U.S. Patent 6,596,505; U.S. Patent 6,599,696; U.S. Patent 6,599,714 nr US 4,974,243 znany jest system o nazwie The MBEC High-throughput (HTP) Assay (lnnovotech) hodowli mikrobiologicznej wykorzystujący podłoża bulionowe do oceny wrażliwości bakterii z oznaczeniem wartości MIC.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5,943,387 znany jest system sekwencyjny do detekcji tworzenia biofilmu w warunkach laboratoryjnych, przeznaczony do oceny stopnia swobody przemieszczania cząstek w hodowli bakteryjnej in vitro, który w konstrukcji wyposażone jest w zasobniki z medium oraz źródło wywołujące efekt elektryczny, magnetyczny lub magnetyczny w zawiesinie drobnoustrojów.

Inne rozwiązanie w konstrukcji urządzenia do hodowli biofilmu posiada możliwość detekcji drobnoustrojów w warunkach in situ do celów analizy za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM).

Celem wynalazku jest opracowanie takiej konstrukcji urządzenia do pozyskiwania biofilmu na nośniku węglowym w środowisku podłoża mikrobiologicznego do hodowli, która umożliwi i zapewni niezakłócony pomiar w trakcie analizy próbki biofilmu poddanej badaniu mikroskopowemu SEM, z możliwością wykorzystania zasobnika jako rezerwuaru dla pożywki płynnej lub półpłynnej oraz możliwością jej wymiany. Innym celem jest zaprojektowanie zintegrowanego systemu wspomagającego hodowlę biofilmu do jego analizy jakościowo-ilościowej w zakresie badania drobnoustrojów tworzących biofilm o różnych wymaganiach wzrostu, który zapewnia uniwersalne zastosowanie w różnych dziedzinach mikrobiologii klinicznej i eksperymentalnej.

Zasobnik do pozyskiwania biofilmu do analizy mikroskopii elektronowej SEM według wynalazku charakteryzuje się tym, że posiada konstrukcję pionową w kształcie walca z szerszą podstawą oraz standardowe zamknięcie korkowe. Walec zawiera dwa kompartmenty dolny oraz górny połączone rozłącznie tuleją z przewodzącym pierścieniem stabilizującym na krążek węglowy umieszczonym na wysokości górnej krawędzi kompartmentu dolnego i posiadającym co najmniej cztery wsporniki na powierzchni bocznej, przy czym w dolny kompartment wbudowany jest zawór.

Korzystnie wsporniki na powierzchni bocznej pierścienia stabilizującego rozlokowane są symetrycznie naprzeciwległe co 90 stopni.

Korzystnie pierścień stabilizujący posiada średnicę mniejszą niż średnica zasobnika o co najmniej 1 mm i zintegrowany jest z wewnętrzną ścianą kompartmentu dolnego rozłącznie.

Korzystnie proporcja średnicy pierścienia stabilizującego do średnicy zasobnika wynosi co najmniej 1:1,2.

Korzystnie średnica zasobnika wynosi 10 do 15 mm, a maksymalna średnica pierścienia stabilizującego 8 do 13 mm.

Korzystnie proporcja wysokości kompartmentów dolnego i górnego wynosi co najmniej 0,5 do 1,0

Korzystnie wysokość kompartmentu dolnego nie jest mniejsza niż 20 mm, a górnego 40 mm.

Korzystnie materiał tworzący tuleję łączącą stanowi tworzywo sztuczne.

Korzystnie materiał tworzący tuleję łączącą stanowi tworzywo silikonowe lub kauczukowe.

Korzystnie materiał tworzący kompartmenty stanowi tworzywo sztuczne lub szkło.

PL 238 767 B1

Przedmiot wynalazku uwidoczniony został w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schematycznie składowe części zasobnika w widoku z boku i z góry.

W przykładzie wykonania kompartmentowy zasobnik do hodowli drobnoustrojów i pozyskania biofilmu dla analizy SEM posiada konstrukcję pionową w kształcie walca, z szerszą podstawą 1 zapewniającą jego stabilne pozycjonowanie w pionie, zamykany od góry korkiem 9. Zasobnik złożony jest z dwóch kompartmentów, dolnego 3 oraz górnego 8, połączonych rozłącznie tuleją 7 z pierściniem stabilizującym 4 na krążek węglowy 6 do hodowli biofilmu. Pierścień stabilizujący 4, z uwagi na fakt konieczności transferu elektronów z emitera SEM, jest pierścieniem przewodzącym. Na powierzchni bocznej pierścienia stabilizującego 4 znajdują się wsporniki 5, umożliwiające jego zaklinowanie w świetle dolnego kompartmentu 3 zasobnika. Kompartment górny 8 i dolny 3 zasobnika stanowią zasadniczo środowisko dla substancji płynnej (podłoże mikrobiologiczne). W dolny kompartment 3 wbudowany jest zawór 2 z przeznaczeniem do usuwania podłoża płynnego. Zawór 2 umieszczony jest maksymalnie 2 mm powyżej podstawy kompartmentu dolnego 3 zasobnika. Średnica zasobnika wynosi od 10 do 15 mm, a maksymalna średnica pierścienia stabilizującego od 8 do 13 mm. Krążek węglowy 6 posiada średnicę nie większą niż 10 mm. Proporcja wysokości kompartmentów 3 i 8 wynosi co najmniej 0,5:1, z zaznaczeniem, że wysokość kompartmentu dolnego 3 nie powinna być mniejsza niż 20 mm, a górnego 40 mm.

Materiał tworzący zasobnik stanowi tworzywo sztuczne lub szkło. Materiał tworzący tuleję łączącą stanowi tworzywo sztuczne, polimerowe, np. silikonowe lub kauczukowe.

Taki układ zapewnia stabilną kultywację formy biofilmowej w warunkach in vitro.

Rozwiązanie według wynalazku zapewnia użycie dowolnego podłoża płynnego jako środowiska wzrostu drobnoustrojów, zapewniając jednocześnie ułatwioną separację kompartmentu dolnego oraz biofilmu na nośniku węglowym, bez względu na skład jakościowo-ilościowy biofilmu. Jako uniwersalne rozwiązanie może zostać wykorzystane dla badania biofilmu bakteryjnego oraz wytwarzanego przez grzyby. Zastosowanie nośnika węglowego w zasobniku umożliwia wzrost zróżnicowanego typu biofilmu w przypadku użycia specyficznego podłoża do hodowli.

Zaletą rozwiązania jest zredukowanie całkowitego czasu przeznaczonego na procedurę przygotowania próbki biofilmu badanej w SEM, ograniczenie czynności przygotowawczych wykonywanych przez personel, atraumatyczne przygotowanie próbki oraz eliminacja niebezpieczeństwa uszkodzenia próbki biofilmu wynikająca ze wzrostu drobnoustrojów na podłożu wysokoprzewodzącym.

Z uwagi na fakt, że wymiar średnicy zasobnika o przekroju okrągłym wynosi optymalnie od 10 mm do 20 mm oraz biorąc pod uwagę wymaganą objętość substancji płynnej do hodowli gromadzonej w zasobniku, minimalna wysokość całego zasobnika według wynalazku powinna wynosić w zakresie od 70 mm do 80 mm w zależności od rodzaju hodowli mikrobiologicznej i przeznaczenia zasobnika. Korzystnym jest, gdy średnica zasobnika wynosi od 10 mm do 15 mm, a maksymalna średnica pierścienia od 8 do 13 mm.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zasobnik do pozyskiwania biofilmu do analizy mikroskopii elektronowej SEM o pionowej konstrukcji w kształcie walca, znamienny tym, że podstawa walca jest szersza, walec zawiera dwa kompartmenty dolny (3) oraz górny (8) połączone rozłącznie tuleją (7) z przewodzącym pierścieniem stabilizującym (4) na krążek węglowy (6) umieszczonym na wysokości górnej krawędzi kompartmentu dolnego (3) i posiadającym co najmniej cztery wsporniki (5) na powierzchni bocznej, przy czym w dolny kompartment (3) wbudowany jest zawór (2).
2. 2. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wsporniki (5) na powierzchni bocznej pierścienia stabilizującego (4) rozlokowane są symetrycznie naprzeciwległe co 90 stopni.
3. 3. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że pierścień stabilizujący (4) posiada średnicę mniejszą niż średnica zasobnika o co najmniej 1 mm i zintegrowany jest z wewnętrzną ścianą kompartmentu dolnego (3) rozłącznie.
4. 4. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że proporcja średnicy pierścienia stabilizującego (4) do średnicy zasobnika wynosi co najmniej 1:1,2.
5. 5. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że średnica zasobnika wynosi 10 do 15 mm, a maksymalna średnica pierścienia stabilizującego 8 do 13 mm.

   PL 238 767 Β1
6. 6. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że proporcja wysokości kompartmentów dolnego (3) i górnego (8) wynosi co najmniej 0,5 do 1,0.
7. 7. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wysokość kompartmentu dolnego (3) nie jest mniejsza niż 20 mm, a górnego (8) 40 mm.
8. 8. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał tworzący tuleję łączącą (7) stanowi tworzywo sztuczne.
9. 9. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał tworzący tuleję łączącą (7) stanowi tworzywo silikonowe lub kauczukowe.
10. 10. Zasobnik według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał tworzący kompartmenty stanowi tworzywo sztuczne lub szkło.