PL237657B1

PL237657B1 - Modyfikowany polimer termoplastyczny o właściwościach przeciwzapalnych oraz sposób jego otrzymywania

Info

Publication number: PL237657B1
Application number: PL429938A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Swinarew; Jadwiga Gabor; Stanisław Boryczka; Urszula Mazurek; Krzysztof Jasik; Joanna Gola; Jarosław Paluch
Original assignee: Slaski Univ Medyczny W Katowicach; Univ Slaski
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2021-05-17
Also published as: PL429938A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest modyfikowany polimer termoplastyczny o właściwościach przeciwzapalnych oraz sposób jego otrzymywania.

Betulina [lup-20(29)-en-33,28-diol] jest powszechnie występującym w przyrodzie triterpenem pentacyklicznym typu lupanu. Duże jej ilości znajdują się w zewnętrznej warstwie kory białych gatunków brzozy (zawartość 25-30%), stąd też kora stanowi łatwo dostępny surowiec, jako produkt uboczny w fabrykach papieru, do otrzymywania betuliny w procesie ekstrakcji, nie wymagającym wielkich nakładów finansowych, nawet na skalę przemysłową (patent US6392070B1). Betulina i łatwo otrzymywane z niej pochodne wykazują szerokie spektrum aktywności biologicznej, takie jak: przeciwnowotworowe, przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwzapalne, hepatoochronne, przeciwkamicze i inne, które pojawiają się już przy bardzo niskich stężeniach, przy braku toksyczności zarówno in vitro jak i in vivo (T.G. Tolstikova, I.V. Sorokina, G.A. Tolstikov, O.B. Flekhter, Russ. J. Bioorg. Chem., 2006, 32, 37-49; T.G. Tolstikova, I.V. Sorokina, G.A. Tolstikov, O.B. Flekhter, Russ. J. Bioorg. Chem., 2006, 32, 261-276; S. Alakurtti, T. Makela, S. Koskimies, J. Yli-Kauhaluoma, Eur. J. Pharm. Sci., 2006, 29, 1-13). Dzięki tym cechom betulina przedstawiona wzorem 1, znana od ponad 200 lat, posiadająca interesującą strukturę z dwoma grupami hydroksylowymi, to jest przy C-3 i C-28 oraz grupę izopropenylową przy C-19, stanowi dogodny materiał wyjściowy do wielu modyfikacji chemicznych, w tym również do syntezy polimerów, jako bifunkcyjny monomer pochodzenia naturalnego.

Pomimo że betulina i jej syntetycznie zmodyfikowane pochodne posiadają interesujące właściwości farmakologiczne o szerokim spektrum działania, istnieje tylko kilka rozwiązań proponujących zastosowanie tej grupy związków do otrzymywania materiałów polimerowych oraz kompozytów.

Znane jest wykorzystanie pochodnej (3,28-diakryloilo)betuliny jako bifunkcyjnego monomeru w reakcji kopolimeryzacji z olejem sojowym modyfikowanym dwoma dodatkowymi funkcjami: akryloilową i epoksydową. Polimeryzacja przeprowadzona w warunkach reakcji wolnorodnikowej pod wpływem UV doprowadziła do otrzymania usieciowanego polimeru charakteryzującego się znacznie lepszą trwałością termiczną [N. Auclair, A. Kaboorani, B. Riedl, V. Landry, Ind. Crops Prod., 2015, 76, 530-537].

Kolejny znany opis literaturowy: [M.N. Gorbunova, G.F. Krainova, I.A. Tolmacheva, V.V. Grishko, Russ. J. Appl. Chem., 2012, 85, 1137-1141] dotyczy syntezy kopolimerów betuliny w oparciu o reakcję maleinianu-28-O-betuliny z N-winylo-2-pirolidonem lub octanem winylu lub akrylonitrylem. Pomimo że maleinian betuliny praktycznie nie ulega homopolimeryzacji, to łatwo wchodzi w reakcję kopolimeryzacji z N-winylo-2-pirolidonem, octanem winylu i akrylonitrylem w obecności wolnorodnikowego inicjatora azobis(izobutyronitrylu) (AIBN) z wytworzeniem liniowych kopolimerów. Otrzymane produkty są rozpuszczalne w chloroformie, DMSO, DMF, THF, benzenie, acetonie i innych rozpuszczalnikach organicznych, natomiast nie rozpuszczają się w wodzie. Ocena aktywności cytotoksycznej in vitro otrzymanych kopolimerów wykazała ich znaczne działanie w kierunku hamowania rozwoju komórek nowotworowych rhabdomyosarcoma (RD TE32), co wskazuje na możliwość ich wykorzystania w medycynie i biotechnologii.

Podobny opis [M.N. Gorbunova, G.F. Krainova, D.M. Kisel’kov, V.O. Nebogatikov, Russ. J. Appl. Chem., 2016, 89, 439-446] obejmuje syntezę kopolimerów betuliny na drodze reakcji winylooctanu-28-O-betuliny lub 4-winylobenzoesanu-28-O-betuliny z winylo-2-pirolidonem lub akrylonitrylem w obecności wolnorodnikowego inicjatora azobis(izobutyronitrylu) (AIBN). Dodatkowo otrzymane kopolimery zmodyfikowano poprzez dodanie nanosrebra w ilości 7%. Otrzymane produkty są rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, natomiast ich zaletą jest znaczna rozpuszczalność w wodzie. Test toksyczności in vivo, przy podaniu doustnym, wykazał wartość LD50 >> 3 g/kg mc. Najwyższą aktywność cytotoksyczną in vitro, oznaczoną wobec linii komórek nowotworowych rhabdomyosarcoma (RD), płuc (A549) i czerniaka (MS), posiadają kopolimery zawierające nanosrebro.

Polimeryzacja alliloamidów kwasu betulonowego lub 2-hydroksyiminobetulonowego z akrylonitrylem lub N-winylopirolidonem w warunkach reakcji wolnorodnikowej (w obecności AIBN) prowadzi do powstania odpowiednich liniowych kopolimerów, wykazujących znaczną aktywność cytotoksyczną wobec linii komórek nowotworowych czerniaka (MS) i płuc (A549) [M.N. Gorbunova, G.F. Krainova, I.A. Tolmacheva, V.V. Grishko, Russ. J. Bioorg. Chem., 2015, 41,732-738].

Możliwe jest także uzyskiwanie z betuliny materiałów zbliżonych do poliuretanów stosując aromatyczne diizocyjaniany i difunkcyjne chlorki kwasowe jako środki sieciujące [V. Era, T. Jaaskelainen, P. Ukkonen, Angew. Makromol. Chem., 1980, 88, 79-88]. Znane są publikacje zawierające informacje dotyczące otrzymywania poliakrylanów betuliny w warunkach wolnorodnikowej polimeryzacji. Istniejące

PL 237 657 B1 metody wykorzystują metakrylany lub akrylany betuliny jako jeden z monomerów [V. Era, T. Mustonen, T. Jaaskelainen, Makromol. Chem. Rapid. Commun., 1981,2, 283-286].

W efekcie poszukiwań nowych mikroporowatych materiałów mogących znaleźć zastosowanie w procesach rozdziału/magazynowania gazów, katalizie czy jako sorbenty opisano reakcje betuliny z tri- lub difunkcyjnymi komonomerami [J. Jeromenok, W. Bohlmann, M. Antonietti, J. Weber, Macromol. Rapid Commun., 2011, 32, 1846-1851]. W pierwszym przypadku wykorzystano trifunkcyjny chlorek kwasowy, taki jak trichlorek 1,3,5-benzenotrikarbonylowy otrzymując rozpuszczalny polimer o budowie rozgałęzionej, w drugiej reakcji, kiedy zastosowano dichlorek tereftaloilowy lub izoftaloilowy, powstał rozpuszczalny, porowaty polimer o budowie liniowej.

Ostatnie doniesienia literaturowe dotyczą syntezy i właściwości polietero-poliuretano-betulin na drodze jedno- lub dwuetapowej reakcji polimeryzacji z udziałem betuliny, diizocyjanianów i tlenku etylenu [Y. Chen, Q. Song, J. Zhao, X. Gong, H, Schlaad, G. Zhang, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10, 6593-6600].

Otrzymywanie polimerów termoplastycznych na bazie betuliny przedstawia opis patentowy RU2167892. Proces zachodzi na drodze polikondensacji betuliny z kwasami dikarboksylowymi, takimi jak: pimelinowy lub azelainowy lub sebacynowy, w stosunku molowym 1 : (1,01 -1,04), w temperaturze 256-260°C.

Metodę aktywowania powierzchni materiałów polimerowych przy użyciu betuliny pod wpływem działania promieni UV opisuje patent RU2009139626. Otrzymane materiały wykazują znaczną aktywność przeciwbakteryjną i mogą być stosowane w procesie pakowania materiałów spożywczych.

Amerykański opis patentowy US2002/0119935A1 przedstawia triterpeny, w tym betulinę i jej pochodne mogące mieć zastosowanie w leczeniu infekcji bakteryjnych i hamowaniu wzrostu bakterii.

Z polskiego zgłoszenia patentowego P.422095 znany jest modyfikowany kopolimer termoplastyczny o właściwościach przeciwbakteryjnych i przeciwzapalnych, który zawiera w swej strukturze modyfikator w postaci betuliny o czystości >75%, przy czym stosunek wagowy kopolimeru bazowego do betuliny wynosi od 5 : 1 do 100 000 : 1. Z tego samego zgłoszenia znany jest również sposób otrzymywania tego kopolimeru, który polega na tym, że do reaktora wprowadza się termoplastyczny kopolimer bazowy w postaci granulatu lub kruszywa, lub przemiału oraz betulinę o czystości >75% w postaci oczyszczonego proszku lub zawiesiny w alkoholanach, w stosunku wagowym od 5 : 1 do 100 000 : 1, całość miesza się w czasie od 10 do 90 minut, do uzyskania jednolitego pokrycia powierzchni kopolimeru, a następnie suszy się w czasie co najmniej 1 h, w temperaturze od 10 do 110°C zależnej od parametrów technologicznych, to jest od struktury i temperatur przetwórstwa użytego kopolimeru.

Ponadto, z polskiego zgłoszenia patentowego P.422092 znany jest modyfikowany polimer termoplastyczny o właściwościach przeciwbakteryjnych i przeciwzapalnych, który zawiera w swej strukturze modyfikator w postaci betuliny o czystości >75%, przy czym stosunek wagowy polimeru bazowego do betuliny wynosi od 5 : 1 do 100 000 : 1. Z tego samego zgłoszenia znany jest również sposób otrzymywania tego polimeru, który polega na tym, że do reaktora wprowadza się termoplastyczny polimer bazowy w postaci granulatu lub kruszywa, lub przemiału oraz betulinę o czystości >75% w postaci oczyszczonego proszku lub zawiesiny w alkoholanach, w stosunku wagowym od 5 : 1 do 100 000 : 1, całość miesza się w czasie od 10 do 90 minut, do uzyskania jednolitego pokrycia powierzchni polimeru, a następnie suszy się w czasie co najmniej 1 h, w temperaturze od 10 do 110°C zależnej od parametrów technologicznych, to jest od struktury i temperatur przetwórstwa użytego polimeru.

Rozwiązania P.422095 oraz P.422092 nie zapewniały możliwości uzyskania odpowiednio kopolimeru i polimeru o wysokich stężeniach domieszki betulinowej, ze względu na brak kompatybilności pomiędzy polimerem osnowy a domieszką betulinową, oraz tworzenie się niskoenergetycznych aglomeratów zdyspergowanych w kopolimerze/polimerze bazowym, które pogarszały jednorodność materiału, jak również powodowały znaczące obniżenie jego wytrzymałości poprzez tworzenie się ognisk naprężeń i anizotropii w całym materiale. Wyżej wymienione właściwości materiału przy wysokim stężeniu domieszki betulinowej powodowały, że nie nadawał się on jako materiał funkcjonalny (to jest o funkcjach/właściwościach innych niż konstrukcyjne), a uwalnianie betuliny z materiału było znacząco ograniczone, jak również zdywersyfikowane względem aglomeratu, bowiem w przypadku gdy betulina aglomeryzuje, to w tych miejscach uwalnia się w innym tempie niż w innych. Powodem powyższych niedogodności jest fakt, że przy zawartości betuliny powyżej 5% występują niejednorodności w mieszaninie.

Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie takiego sposobu syntezy polimeru modyfikowanego betuliną, który umożliwia całkowite wyeliminowanie niejednorodności mieszaniny (brak

PL 237 657 B1 aglomeratów) i uzyskanie materiału jednorodnego w całej strukturze, w pełnym przewidzianym wynalazkiem zakresie stężeń.

Istotę wynalazku stanowi modyfikowany polimer termoplastyczny o właściwościach przeciwzapalnych, charakteryzujący się tym, że zawiera w swej strukturze modyfikator w postaci betuliny o czystości >75%, korzystnie 99,9%, stabilizowanej alkoholanem, korzystnie cukrolem, albo polieterolem, korzystnie propoksylatem cyklicznego heksameru glicydolanu potasu jako czynnikiem chelatującym, przy czym stosunek wagowy stabilizatora do betuliny wynosi od 0,5 : 1 do 100 : 1, korzystnie od 20 : 1 do 50 : 1, a stosunek wagowy polimeru bazowego do betuliny wynosi od 1 : 1 do 100 : 1.

Korzystnie, modyfikator stanowi betulina uzyskana z kory brzozy.

Korzystnie, polimer bazowy stanowi poliwęglan (PC) albo polilaktyd (PLA) albo polichlorek winylu (PVC) albo polietylen wysokociśnieniowy (PEw) albo polipropylen (PP).

Istotę wynalazku stanowi również sposób otrzymywania modyfikowanego polimeru termoplastycznego o właściwościach przeciwzapalnych polegający na tym, że do reaktora wprowadza się termoplastyczny polimer bazowy w postaci granulatu lub kruszywa, lub przemiału oraz betulinę o czystości >75%, korzystnie 99,9%, zawieszoną w stabilizatorze w postaci alkoholanu, korzystnie cukrolu, albo w postaci polieterolu, korzystnie propoksylatu cyklicznego heksameru glicydolanu potasu jako czynniku chelatującym, przy czym stosunek wagowy stabilizatora do betuliny wynosi od 0,5 : 1 do 100 : 1, korzystnie od 20 : 1 do 50 : 1, a stosunek wagowy polimeru bazowego do betuliny wynosi od 1 : 1 do 100 : 1, całość miesza się w czasie co najmniej 10 minut, do uzyskania jednolitego pokrycia powierzchni polimeru, a następnie suszy się w czasie co najmniej 1 h, w temperaturze od 10 do 180°C zależnej od parametrów technologicznych, to jest od struktury i temperatur przetwórstwa użytego polimeru (granulatu lub kruszywa, lub przemiału). Następnie ze stabilizowanej i wysuszonej mieszanki polimeru z betuliną wytłacza się na wytłaczarce strunę, którą poddaje się regranulacji, a z otrzymanego granulatu ponownie wytłacza się strunę, a proces powtarza się aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny bez niskoenergetycznych aglomeratów betuliny, to jest - w zależności od użytego polimeru bazowego - dwa do pięciu razy, korzystnie dwa razy, przy czym moment ten określa się jedną ze znanych metod, korzystnie z wykorzystaniem spektrofluorymetru. Po ostatnim procesie wytłaczania strunę chłodzi się, korzystnie w temperaturze pokojowej, w czasie od 5 do 30 sekund, aż do uzyskania właściwej sztywności, to jest przejścia ze stanu plastycznego w stan szklisty, co nie pozwala na jej deformacje, a następnie wygrzewa w temperaturze od 40 do 150°C, korzystnie 80°C, przez czas >10 minut, korzystnie 30 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych.

Korzystnie, proces wytłaczania stabilizowanej i wysuszonej mieszanki polimer-betulina prowadzi się za pomocą wytłaczarki ślimakowej, korzystnie o ślimaku 32 l/d, przy zastosowaniu temperatur malejących kaskadowo w przedziale od 270-110°C, i prędkości wytłoku o wartości od 10 do 200, korzystnie 60 rpm, przy czym drugi i ewentualne kolejne procesy wytłaczania prowadzi się w temperaturach podwyższonych w stosunku do temperatur pierwszego wytłaczania, ale nie przekraczających temperatury granicznej. Temperatura w pierwszym cyklu wytłaczania jest obniżona w celu niedopuszczenia do degradacji materiału.

Najkorzystniej proces wytłaczania stabilizowanej i wysuszonej mieszanki polimer-betulina prowadzi się za pomocą wytłaczarki jednoślimakowej, czterostrefowej, przy zastosowaniu czterech stref grzejnych: w pierwszym procesie wytłaczania na głowicy 250°C i w kolejnych trzech strefach odpowiednio 210°C, 200°C i 130°C, a w drugim procesie wytłaczania na głowicy 265°C i w kolejnych trzech strefach odpowiednio 230°C, 210°C i 160°C.

Korzystnie, jako modyfikator stosuje się betulinę uzyskaną z kory brzozy.

Korzystnie, jako reaktor stosuje się mieszalnik ze stali nierdzewnej lub szkła, wyposażony w system odprowadzania ładunku elektrycznego.

Korzystnie, jako polimer bazowy stosuje się poliwęglan (PC) albo polilaktyd (PLA), albo polichlorek winylu (PVC), albo polietylen wysokociśnieniowy (PEw), albo polipropylen (PP).

Korzystnie, mieszaninę polimeru bazowego z betuliną suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem, najkorzystniej w 10 mmHg.

Sposób prowadzony według wynalazku wpływa znacząco na poprawę w stosunku do rozwiązań znanych wcześniej - jednorodności w całej objętości otrzymywanego materiału. Dzięki temu uzyskuje się anizotropię właściwości, to jest jednolite uwalnianie betuliny we wszystkich wektorach, co istotnie polepsza jego właściwości biologiczne.

W efekcie zastosowania sposobu według wynalazku uzyskuje się materiał o znacznie wyższej aktywności przeciwzapalnej w porównaniu do materiałów znanych ze zgłoszeń patentowych

PL 237 657 B1 nr P.422095 oraz P.422092, jak i w porównaniu do substancji wzorcowej, jaką jest deksametazon powszechnie stosowany jako środek o udowodnionym działaniu przeciwzapalnym.

Zastosowanie jako alkoholanu cyklicznego heksameru glicydolanu potasu gwarantuje równomierne uwalnianie betuliny w czasie eksploatacji produktu, co pozwala na wykorzystanie go w sposób zaplanowany, to jest z przewidywalnym efektem.

Do dodatkowych zalet sposobu według wynalazku należą:

- wykorzystanie dostępnych w handlu materiałów polimerowych, takich jak: poliwęglan, polilaktyd, polipropylen, polichlorek winylu, polietylen wysokociśnieniowy,

- prowadzenie procesu w łagodnych warunkach, co wynika z tego, że przedmieszkę przygotowuje się w temperaturze pokojowej (nie trzeba stosować podgrzewania czy chłodzenia), bez konieczności użycia rozpuszczalników, z wykorzystaniem oddziaływań elektrostatycznych,

- prowadzenie procesu z wysokimi wydajnościami (powyżej 90%) przejawiającą się w braku odpadów i dużej sprawności procesu,

- użycie jako modyfikatora przeciwzapalnej betuliny, substancji nietoksycznej, którą w prosty sposób można otrzymać, bez większych nakładów finansowych, na przykład z kory brzozy lub stanowiącej odpad przy produkcji papieru.

Otrzymana sposobem według wynalazku mieszanina betuliny z odpowiednim materiałem polimerowym ma postać blendy, z której w następstwie dalszej przeróbki plastycznej prowadzonej znanym sposobem otrzymuje się granulat lub filament, o zabarwieniu neutralnym. Tak przygotowany materiał, po poddaniu odpowiedniej obróbce termicznej jest chemicznie odporny na działanie warunków atmosferycznych, co zostało potwierdzone z wykorzystaniem komory xenotest zgodnie z normą PN-EN ISO 4892-1:2016-06.

Z tych względów modyfikowany polimer termoplastyczny według wynalazku stanowi doskonały zamiennik dla fluoropolimerów, co wiąże się ze znacznymi oszczędnościami kosztów materiałowych dla przetwórcy. W praktyce istnieje również możliwość dodatkowego wzmocnienia materiału nanowłóknami, na przykład celulozowymi lub dodania do niego organicznych modyfikatorów właściwości i przetwórstwa oraz stabilizatorów UV.

Budowa polimerów została potwierdzona w oparciu o spektroskopię 1H NMR, ¹³C NMR oraz IR.

Rozwiązanie według wynalazku, przedstawione jest dokładniej na poniższych przykładach wykonania nie ograniczających w żadnym stopniu jego zakresu.

Przykład 1

Do reaktora w postaci mieszalnika ze stali nierdzewnej o pojemności 3000 cm 3, zaopatrzonego w system odprowadzania ładunku elektrycznego wprowadzono poliwęglan (800 g) oraz betulinę (czystość >98%) (8 g) zawieszoną w stabilizatorze w postaci propoksylatu cyklicznego heksameru glicydolanu potasu, w proporcji wagowej betuliny do stabilizatora 1 : 1. Całość mieszano z wykorzystaniem mieszadła teflonowego o łopatach zgarniających przez 30 minut, z prędkością 50 rpm, po czym mieszaninę suszono aerostatycznie w 100°C przez 24 h. Suchą mieszaninę poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 250°C, 210°C, 200°C i 130°C i prędkości wytłoku 60 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i granulowana.

Suchy granulat ponownie poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 265°C, 230°C, 210°C i 160°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem w temperaturze pokojowej przez 10 sekund, następnie nawinięta na bębny struna była wygrzewana w temperaturze 80°C w czasie 45 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych. Otrzymany filament został przeznaczony do wydruków modeli 3D.

Przykład 2

Do reaktora w postaci mieszalnika ze stali nierdzewnej o pojemności 3000 cm³, zaopatrzonego w system odprowadzania ładunku elektrycznego wprowadzono polilaktyd (200 g) oraz betulinę (czystość >98%) (10 g) zawieszoną w stabilizatorze w postaci cukrolu, w proporcji wagowej betuliny do cukrolu 1 : 10. Całość mieszano z wykorzystaniem mieszadła teflonowego o łopatach zgarniających przez 30 minut, z prędkością 30 rpm, po czym mieszaninę suszono aerostatycznie w 80°C przez 24 h. Suchą mieszaninę poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio

PL 237 657 B1 na głowicy i kolejnych trzech strefach 210°C, 180°C, 140°C i 110°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem na odcinku trzech metrów, następnie granulowana.

Suchy granulat ponownie poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 220°C, 200°C, 170°C i 130°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem w temperaturze pokojowej przez 10 sekund, następnie nawinięta na bębny struna była wygrzewana w temperaturze 80°C w czasie 45 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych. Otrzymany filament został przeznaczony do wydruków modeli 3D.

Przykład 3

Do reaktora w postaci mieszalnika ze stali nierdzewnej o pojemności 3000 cm³, zaopatrzonego w system odprowadzania ładunku elektrycznego wprowadzono polipropylen (200 g) oraz betulinę (czystość >98%) (20 g) zawieszoną w stabilizatorze w postaci propoksylatu cyklicznego heksameru glicydolanu potasu w proporcji wagowej betuliny do stabilizatora 1 : 5. Całość mieszano z wykorzystaniem mieszadła teflonowego o łopatach zgarniających przez 90 minut, z prędkością 50 rpm, po czym mieszaninę suszono aerostatycznie w 60°C przez 24 h pod zmniejszonym ciśnieniem. Suchą mieszaninę poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 195°C, 170°C, 130°C i 105°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem na odcinku trzech metrów, następnie granulowana.

Suchy granulat ponownie poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 220°C, 200°C, 170°C i 130°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem w temperaturze pokojowej przez 5 sekund, następnie nawinięta na bębny struna była wygrzewana w temperaturze 80°C w czasie 30 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych. Otrzymany filament został przeznaczony do wydruków modeli 3D.

Przykład 4

Do reaktora w postaci mieszalnika ze stali nierdzewnej o pojemności 3000 cm³, zaopatrzonego w system odprowadzania ładunku elektrycznego wprowadzono polichlorek winylu (200 g) oraz betulinę (czystość >98%) (30 g) zawieszoną w stabilizatorze w postaci cukrolu, w proporcji wagowej betuliny do cukrolu 0,5 : 1. Całość mieszano z wykorzystaniem mieszadła teflonowego o łopatach zgarniających przez 45 minut, z prędkością 50 rpm, po czym mieszaninę suszono aerostatycznie w 85°C przez 24 h. Suchą mieszaninę poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 200°C, 185°C, 150°C i 110°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem na odcinku trzech metrów, następnie granulowana. Suchy granulat ponownie poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 220°C, 200°C, 170°C i 130°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem w temperaturze pokojowej przez 25 sekund, następnie nawinięta na bębny struna była wygrzewana w temperaturze 80°C w czasie 30 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych. Otrzymany filament został przeznaczony do wydruków modeli 3D.

Przykład 5

Do reaktora w postaci mieszalnika ze stali nierdzewnej o pojemności 3000 cm³, zaopatrzonego w system odprowadzania ładunku elektrycznego wprowadzono polietylen wysokociśnieniowy (200 g) oraz betulinę (40 g) (czystość >98%) zawieszoną w stabilizatorze w postaci cyklicznego heksameru glicydolanu potasu, w proporcji wagowej betuliny do stabilizatora 1 : 1. Całość mieszano z wykorzystaniem mieszadła teflonowego o łopatach zgarniających przez 50 minut, z prędkością 50 rpm, po czym mieszaninę suszono aerostatycznie w 80°C przez 30 h. Suchą mieszaninę poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 205°C, 185°C, 150°C i 110°C i prędkości wytłoku 90 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem na odcinku trzech metrów, następnie granulowana.

PL 237 657 B1

Suchy granulat ponownie poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 220°C, 200°C, 170°C i 130°C i prędkości wytłoku 90 rpm.

Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem w temperaturze pokojowej przez 20 sekund, następnie nawinięta na bębny struna była wygrzewana w temperaturze 80°C w czasie 30 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych. Otrzymany filament został przeznaczony do wydruków modeli 3D.

Przykład 6

Do reaktora w postaci mieszalnika ze stali nierdzewnej o pojemności 3000 cm³, zaopatrzonego w system odprowadzania ładunku elektrycznego wprowadzono poliwęglan (200 g) oraz betulinę (czystość >98%) (20 g) zawieszoną w stabilizatorze w postaci cukrolu, w proporcji wagowej betuliny do cukrolu 1 : 100. Całość mieszano z wykorzystaniem mieszadła teflonowego o łopatach zgarniających przez 30 minut, z prędkością 50 rpm, po czym mieszaninę suszono aerostatycznie w 100°C przez 24 h. Suchą mieszaninę poddano wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 245°C, 220°C, 200°C i 140°C i prędkości wytłoku 60 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem na odcinku trzech metrów, następnie granulowana. Suchy granulat poddano ponownie wytłaczaniu za pomocą jednoślimakowej, czterostrefowej wytłaczarki ślimakowej o ślimaku 32 l/d przy zastosowaniu temperatur poszczególnych stref grzejnych odpowiednio na głowicy i kolejnych trzech strefach 265°C, 230°C, 210°C i 160°C i prędkości wytłoku 60 rpm. Uzyskana w ten sposób struna była odbierana na podajnik taśmowy i chłodzona powietrzem w temperaturze pokojowej przez 15 sekund, następnie nawinięta na bębny struna była wygrzewana w temperaturze 80°C w czasie 45 minut celem usunięcia powstałych naprężeń wewnętrznych. Otrzymany filament został przeznaczony do wydruków modeli 3D.

Ocena cytotoksyczności i aktywności przeciwzapalnej

Ocenę cytotoksyczności i aktywności przeciwzapalnej płytek polimerowych domieszkowanych betuliną przeprowadzono dla eluatów płytek. Elucję prowadzono w medium hodowlanym w objętości 25 ml, w 37°C, z 5% wysyceniem atmosfery CO2. Po upływie 24 h medium elucyjne zebrano i poddano filtracji z zastosowaniem jałowego filtra membranowego 0,2 μm z membraną z celulozy octanowej (CA) (Cronus Sartorius).

Ocena cytotoksyczności

Ocenę cytotoksyczności in vitro wykonano w oparciu o normę ISO 10993-5 względem mysich fibroblastów linii L-929 (NCTC klon 929: nr kat. CCL 1, Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych [ATCC]), z zastosowaniem testów oceny żywotności komórek na podstawie aktywności enzymów mitochondrialnych - testy MTT (Cell Proliferation Kit II (XTT); Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), XTT (In vitro Toxicology Assay Kit, MTT based; Sigma-Aldrich) oraz z zastosowaniem testu oceny żywotności komórek na podstawie całkowitej masy białka -test SRB (In vitro Toxicology Assay Kit, Sulforhodamine B based; Sigma-Aldrich). Wszystkie testy wykonano zgodnie z protokołem producenta. Pomiary absorbancji wykonano przy użyciu czytnika mikropłytek Wallac Victor 2 (Perkin Elmer, Massachusetts, USA). Żywotność komórek przedstawiono jako procent żywych komórek w poszczególnych grupach badanych w odniesieniu do komórek kontrolnych (K). Żywotność powyżej 70% świadczy o braku działania cytotoksycznego.

Badania wykazały, że betulina domieszkowana w stężeniach 1%, 5% i 10% nie wykazuje działania cytotoksycznego względem mysich fibroblastów linii L-929 (fig. 1, tab. 1). Płytka polimerowa i płytka polimerowa z chelatorem wykazują aktywność biologiczną. Betulina domieszkowana w stężeniach 1%, 5% i 10% neutralizuje aktywność biologiczną pozostałych składowych uwalnianych z płytki polimerowej oraz płytki z dodatkiem chelatora. Im wyższe stężenie betuliny tym silniejsze obniżenie aktywności biologicznej płytki z chelatorem - najsilniejszy efekt neutralizujący wykazuje betulina domieszkowana w stężeniu 10%.

Ocena aktywności przeciwzapalnej

Ocenę działania przeciwzapalnego wykonano dla linii ludzkich fibroblastów skóry (NHDF - Normal Human Dermal Fibroblasts, Lonza nr kat. CC-2511, nr lot: 0000268030), stymulowanych lipopolisacharydem bakteryjnym (LPS; Sigma-Aldrich), na podstawie liczby kopii mRNA genu kodującego IL-6 wyznaczonej techniką RT-qPCR w czasie rzeczywistym. Liczbę kopii mRNA genu kodującego IL-6 wyznaczono z wykorzystaniem detektora sekwencji Opticon™ DNA Engine Continuous Fluorescence de

PL 237 657 Β1 tector (MJ Research, Watertown, MA) oraz zestawu odczynników SYBR Green I (SYBR Green Ouantitect RT-PCR Kit, Qiagen, Valencia, Ca, USA) i pary specyficznych starterów (Kimsa M. i wsp., 2013). Kontrolę pozytywną w ocenie aktywności przeciwzapalnej stanowiły komórki traktowane deksametazonem (Sigma-Aldrich). Stężenie deksametazonu wybrano na podstawie Shoda T. i wsp. 2014. Stężenie LPS wybrano na podstawie Kimsa M. i wsp., 2013. Liczba kopii mRNA genu kodującego IL-6 została przeliczona na μg całkowitego komórkowego RNA. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą programu Statistica v.13.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). Normalność rozkładu zbadano testem Shapiro-Wilka. Na podstawie wyniku analizy normalności rozkładu porównanie liczby kopii między grupami przeprowadzono za pomocą testu t.

Stwierdzono statystycznie istotny wzrost liczby kopii mRNA genu kodującego IL-6 w następujących grupach badanych w odniesieniu do kontroli: komórki traktowane LPS (p < 0,0001), komórki traktowane deksametazonem (p = 0,0102), komórki traktowane eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 10% (p = 0,0011), komórki traktowane eluatem z płytki bez betuliny (p = 0,0032), komórki traktowane eluatem z płytki z chelatorem bez betuliny (p = 0,0447) (fig. 2, tab. 2). W odniesieniu do komórek traktowanych LPS stwierdzono statystycznie istotny spadek liczby kopii mRNA genu kodującego IL-6 w następujących grupach badanych: komórki traktowane LPS i deksametazonem (p = 0,0157), komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 1% (p = 0,0192), komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 5% (p = 0,0006) (fig. 3, tab. 2). Ponadto, stwierdzono statystycznie istotny spadek liczby kopii mRNA genu kodującego IL-6 w komórkach traktowanych LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 5% w porównaniu do komórek traktowanych LPS i deksametazonem (p = 0,0274) oraz w porównaniu do komórek traktowanych LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 1% (p = 0,0180).

Wyniki wskazują na potencjalną aktywność przeciwzapalną betuliny domieszkowanej w stężeniu 1% i 5%, przy czym najsilniejsze działanie wykazuje betuliną domieszkowana w stężeniu 5%.

j MTT 24h ί 120% uoo% [ 80% ; óo% j 40% I 20% | 0%

SRB 24h

PC PO BI B5 B10 K

I 120% | 100% I 80% j 60% j 40% j 20% ί 0% i

ί______________________._____C

Fig. 1. Wykres przedstawiający żywotność komórek jako procent żywych komórek w odniesieniu do kontroli (K) w poszczególnych grupach badanych. Żywotność komórek powyżej 70% świadczy o braku działania cytotoksycznego. B1 - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem domieszkowanej betuliną w stężeniu 1%, B5 - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem domieszkowanej betuliną w stężeniu 5%, B10 - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem domieszkowanej betuliną w stężeniu 10%, PC - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej bez betuliny, PO - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej bez betuliny z chelatorem; A - wynik testu MTT, B - wynik testu ΧΤΤ, C - wynik testu SRB

PL 237 657 Β1

Tabela 1

Wyniki oceny cytotoksyczności eluatów płytek polimerowych domieszkowanych betuliną przeprowadzonej z zastosowaniem testów oceny żywotności komórek na podstawie aktywności enzymów mitochondrialnych testy MTT i ΧΤΤ oraz z zastosowaniem testu oceny żywotności komórek na podstawie całkowitej masy białka test SRB. Wyniki zostały przedstawione jako procent żywych komórek w odniesieniu do kontroli (K) w poszczególnych grupach badanych. Żywotność komórek powyżej 70% świadczy o braku działania cytotoksycznego. B1 komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem domieszkowanej betuliną w stężeniu 1%, B5 komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem domieszkowanej betuliną w stężeniu 5%, B10 komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem domieszkowanej betuliną w stężeniu 10%, PC komórki traktowane eluatem płytki polimerowej bez betuliny, PO - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej bez betuliny z chelatorem

	PC	PO	B1	B5	B10	K
Test MTT	101%	112%	112%	97%	87%	100%
Test ΧΤΤ	205%	138%	161%	143%	99%	100%
Test SRB	78%	76%	93%	98%	101%	100%

Fig. 2. Wykresy przedstawiające liczbę kopii mRNA genu kodującego IL-6 przeliczoną na gg całkowitego komórkowego RNA w poszczególnych grupach badanych w odniesieniu do kontroli (K); DEX - komórki traktowane deksametazonem; B1 - komórki traktowane eluatem z płytki polimerowej z betuliną w stężeniu 1 %; B5 - komórki traktowane eluatem z płytki polimerowej z betuliną w stężeniu 5%; B10 - komórki traktowane eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 10%; PC - komórki traktowane eluatem z płytki bez betuliny; PO - komórki traktowane eluatem z płytki z chelatorem bez betuliny; * p < 0,05 w porównaniu do kontroli

PL 237 657 Β1

Fig. 3. Wykresy przedstawiające liczbę kopii mRNA genu kodującego IL-6 przeliczoną na μg całkowitego komórkowego RNA w poszczególnych grupach badanych w odniesieniu do komórek traktowanych LPS (K_L); DEX_L - komórki traktowane LPS i deksametazonem; B1_L - komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 1 %; B5_L - komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 5%; B10_L - komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 10% * p < 0,05 w porównaniu do kontroli; ^Λ p<0,05 w porównaniu do komórek traktowanych LPS i deksametazonem; # p<0,05 w porównaniu do komórek traktowanych LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 1%

Tabela 2

Wyniki oceny działania przeciwzapalnego eluatów płytek polimerowych domieszkowanych betuliną względem komórek NHDF, na podstawie liczby kopii mRNA genu kodującego IL-6, wyznaczonej techniką RT-qPCR w czasie rzeczywistym. Liczba kopii mRNA genu kodującego IL-6 została przeliczona na pg całkowitego komórkowego RNA; K - komórki kontrolne; K_L - komórki traktowane LPS; DEX - komórki traktowane deksametazonem;

B10 - komórki traktowane eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 10%; PC - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem bez betuliny; PO - komórki traktowane eluatem płytki polimerowej z chelatorem bez betuliny; DEX_L - komórki traktowane LPS i deksametazonem; B1_L - komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 1%; B5_L - komórki traktowane LPS i eluatem z płytki z betuliną w stężeniu 5%

Porównywane grupy (1 vs 2)	Średnia wartość liczby kopii mRNA (grupa 1)	Średnia wartość liczby kopii mRNA (grupa 2)	P
K_L vs K	36 386,67	4 097,50	<0,0001
DEX vs K	6 647,71	4 097,50	0,0102
B10 vs K	8 818,00	4 097,50	0,0011
PC vs K	8 727,33	4 097,50	0,0032
PO vs K	9 587,17	4 097,50	0,0447
DEX_L vs K_L	22 559,11	36 386,67	0,0157
B1_LvsK_L	23 253,33	36 386,67	0,0192
B5_L vs K_L	13 345,33	36 386,67	0,0006
B5_L vs DEX_L	13 345,33	22 559,11	0,0274
B5_LvsB1_L	13 345,33	23 253,33	0,0180

Przygotowane sposobem według wynalazku modyfikowane polimery, w szczególności poliwęglan, można obrabiać na konwencjonalnych maszynach do najmniejszych tolerancji, stosować bezpośrednio jako filament w druku przestrzennym. Tworzywo szczególnie polecane jest w takich dziedzinach jak technika lotnicza, elektronika, technika medyczna, budowa maszyn i przemysł samochodowy, szeroko pojęte prototypowanie.

Polimery według wynalazku wykazują znaczną aktywność przeciwzapalną. Ze względu na osiąganą aktywność polimery te mogą być korzystnie stosowane w medycynie i biotechnologii.

PL 237 657 B1

Materiał otrzymany sposobem według wynalazku wykazuje właściwości, dzięki którym może znaleźć szczególne zastosowanie również jako przeciwzapalny filament do druku przestrzennego 3D. Takie wnioski wyciągnięto w oparciu o analizę parametrów przetwórczych oraz empirycznie w procesie modelowania z wykorzystaniem technologii przyrostowych.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Modyfikowany polimer termoplastyczny o właściwościach przeciwzapalnych, znamienny tym, że zawiera w swej strukturze modyfikator w postaci betuliny o czystości >75%, korzystnie 99,9%, stabilizowanej alkoholanem, korzystnie cukrolem, albo polieterolem, korzystnie propoksylatem cyklicznego heksameru glicydolanu potasu jako czynnikiem chelatującym, przy czym stosunek wagowy stabilizatora do betuliny wynosi od 0,5 : 1 do 100 : 1, korzystnie od 20 : 1 do 50 : 1, a stosunek wagowy polimeru bazowego do betuliny wynosi od 1 : 1 do 100 : 1.
2. Modyfikowany polimer według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikator stanowi betulina uzyskana z kory brzozy.
3. Modyfikowany polimer według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer bazowy stanowi poliwęglan (PC).
4. Modyfikowany polimer według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer bazowy stanowi polilaktyd (PLA).
5. Modyfikowany polimer według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer bazowy stanowi polichlorek winylu (PVC).
6. Modyfikowany polimer według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer bazowy stanowi polietylen wysokociśnieniowy (PEw).
7. Modyfikowany polimer według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer bazowy stanowi polipropylen (PP).
8. Sposób otrzymywania modyfikowanego polimeru termoplastycznego o właściwościach przeciwzapalnych, znamienny tym, że do reaktora wprowadza się termoplastyczny polimer bazowy w postaci granulatu lub kruszywa lub przemiału oraz betulinę o czystości >75%, korzystnie 99,9%, zawieszoną w stabilizatorze w postaci alkoholanu, korzystnie cukrolu, albo w postaci polieterolu, korzystnie propoksylatu cyklicznego heksameru glicydolanu potasu jako czynniku chelatującym, przy czym stosunek wagowy stabilizatora do betuliny wynosi od 0,5 : 1 do 100 : 1, korzystnie od 20 : 1 do 50 : 1, a stosunek wagowy polimeru bazowego do betuliny wynosi od 1 : 1 do 100 : 1, całość miesza się w czasie co najmniej 10 minut, do uzyskania jednolitego pokrycia powierzchni polimeru, a następnie suszy się w czasie co najmniej 1 h, w temperaturze od 10 do 180°C zależnej od parametrów technologicznych, to jest od struktury i temperatur przetwórstwa użytego polimeru (granulatu lub kruszywa, lub przemiału), następnie ze stabilizowanej i wysuszonej mieszanki polimeru z betuliną wytłacza się na wytłaczarce strunę, którą poddaje się regranulacji, a z otrzymanego granulatu ponownie wytłacza się strunę, a proces powtarza się aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny bez niskoenergetycznych aglomeratów betuliny, to jest - w zależności od użytego polimeru bazowego - dwa do pięciu razy, korzystnie dwa razy, przy czym moment ten określa się jedną ze znanych metod, korzystnie z wykorzystaniem spektrofluorymetru, a po ostatnim procesie wytłaczania strunę chłodzi się, korzystnie w temperaturze pokojowej, w czasie od 5 do 30 sekund, aż do uzyskania właściwej sztywności, to jest przejścia ze stanu plastycznego w stan szklisty, a następnie wygrzewa w temperaturze od 40 do 150°C, korzystnie 80°C, przez czas >10 minut, korzystnie 30 minut.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że proces wytłaczania stabilizowanej i wysuszonej mieszanki polimer-betulina prowadzi się za pomocą wytłaczarki ślimakowej, korzystnie o ślimaku 32 l/d, przy zastosowaniu temperatur malejących kaskadowo w przedziale od 270-110°C, i prędkości wytłoku o wartości od 10 do 200, korzystnie 60 rpm, przy czym drugi i ewentualne kolejne procesy wytłaczania prowadzi się w temperaturach podwyższonych w stosunku do temperatur pierwszego wytłaczania, ale nie przekraczających temperatury granicznej.
10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że proces wytłaczania stabilizowanej i wysuszonej mieszanki polimer-betulina prowadzi się za pomocą wytłaczarki jednoślimakowej, czterostrefowej, przy zastosowaniu czterech stref grzejnych: w pierwszym procesie wytłaczania na głowicy

PL 237 657 B1

250°C i w kolejnych trzech strefach odpowiednio 210°C, 200°C i 130°C, a w drugim procesie wytłaczania na głowicy 265°C i w kolejnych trzech strefach odpowiednio 230°C, 210°C i 160°C.
11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako modyfikator stosuje się betulinę uzyskaną z kory brzozy.
12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako reaktor stosuje się mieszalnik ze stali nierdzewnej lub szkła, wyposażony w system odprowadzania ładunku elektrycznego.
13. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polimer bazowy stosuje się poliwęglan (PC).
14. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polimer bazowy stosuje się polilaktyd (PLA).
15. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polimer bazowy stosuje się polichlorek winylu (PVC).
16. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polimer bazowy stosuje się polietylen wysokociśnieniowy (PEw).
17. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polimer bazowy stosuje się polipropylen (PP).
18. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że mieszaninę polimeru bazowego z betuliną suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem, najkorzystniej w 10 mm Hg.