PL237653B1 - Frakcja białkowo-cukrowa płynu celomatycznego dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuca - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowe, medyczne zastosowanie frakcji białkowo-cukrowej o masie powyżej 14 kDa, otrzymanej z płynu celomatycznego z dżdżownicy Dendrobaena veneta w leczeniu raka płuca.

W opisie patentowym PL 227923 oraz publikacji Fiołka wsp., Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica, 2019, ujawniono zastosowanie płynu celomatycznego z dżdżownicy Dendrobaena veneta w leczeniu raka płuca, efektywnie działającego w stosunkowo wysokich stężeniach (250 μg/ml), przechowywanego w postaci płynnej, co powoduje szybką utratę jego aktywności.

Badania w kierunku wyizolowania z płynu celomatycznego dżdżownicy Dendrobaena veneta, frakcji białkowej doprowadziły do otrzymania frakcji białkowo-cukrowej o masie powyżej 14 kDa, o dużym stopniu czystości, z możliwością liofilizowania, co ułatwia jej długotrwałe przechowywanie z zachowaniem pełnej aktywności.

Przedmiotowa frakcja białkowo-cukrowa znajduje zastosowania medyczne, wykazując działanie przeciwgrzybowe na komórki C. albicans, co opisano w zgłoszeniu patentowym P.423697, działanie antynowotworowe na komórki raka jelita grubego - zgłoszenie patentowe P.425431 oraz immunostymulacyjne do zastosowania w immunoterapii nieswoistej - zgłoszenie P.429033.

Nieoczekiwanie okazało się, że frakcja białkowo-cukrowa o masie powyżej 14 kDa z płynu celomatycznego z dżdżownicy Dendrobaena veneta, wykazuje bardzo efektywne w niskich stężeniach, działanie uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do prawidłowych komórek nabłonkowych oskrzela człowieka.

Istotą wynalazku jest więc nowe zastosowanie medyczne frakcji białkowo-cukrowej o masie powyżej 14 kDa, otrzymywanej z płynu celomatycznego dżdżownicy Dendrobaena veneta w leczeniu raka płuca.

Wynalazek został przedstawiony w poniższych przykładach wykonania.

Przykład 1. Otrzymywanie i identyfikacja frakcji z płynu celomatycznego według wynalazku

Płyn celomatyczny pobrany z jamy ciała dżdżownic Dendrobaena veneta metodą szoku elektrycznego, wirowano przez 10 minut przy prędkości 5000 obr/min., przesączono przez sączki Millipore o średnicy porów 0,22 μm i rozlano po 1 ml do probówek, które ogrzewano w temp. 70°C przez 10 minut. Zebrany z kilku probówek płyn poddano dializie w wodzie, w worku dializacyjnym o średnicy porów odcinających związki o masie powyżej 14 kDa. Dializę prowadzono przez 24 godziny w temp. 4°C. Płyn po dializie przeniesiono do probówek typu Falkon i poddano liofilizacji przez 24 godziny.

Otrzymaną frakcję związków o masie powyżej 14 kDa w postaci białego proszku poddano badaniom w celu identyfikacji składników białkowych i niebiałkowych. Analizę białek frakcji wyodrębnionej z płynu celomatycznego prowadzono metodą elektroforezy SDS/PAGE w żelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu, w warunkach natywnych oraz w warunkach denaturujących. Barwienie otrzymanych żeli dowodzi obecności w preparacie licznych białek, a także kompleksów białkowo-cukrowych, czego potwierdzeniem jest obecność na obrazach żeli, w tych samych miejscach prążków pochodzących od białek barwionych barwnikiem Coomassie Brilliant Blue R-250 i od cukrów barwionych po utlenianiu nadjodanem sodu metodą z azotanem srebra.

Na rysunku, jako figura 1, przedstawiono wybarwione prążki białkowe: A - po elektroforezie bez SDS, odpowiadające 1-10 μg i 2-40 μg białka, B - po elektroforezie z SDS, odpowiadające 1-20 μg, 2-30 μg i 3-40 μg białka wraz z prążkiem 4 odpowiadającym markerom masy, zaś jako figura 2 przedstawiono zabarwione prążki po elektroforezie SDS/PAGE w kierunku obecności cukrów i białek.

Barwienie żeli po elektroforezie i nakładanie się sygnałów pochodzących od białek i od cukrów, co zaznaczono na figurze 2 strzałkami, dowodzi obecności we frakcji płynu związków białkowo-cukrowych. Ścieżka 1 oznacza barwienie żelu w kierunku identyfikacji cukrów, ścieżka 2 w kierunku identyfikacji białek, zaś ścieżka 3 obrazuje położenie wzorców białkowych masy.

W celu identyfikacji składników cukrowych we frakcji płynu celomatycznego o masie powyżej 14 kDa, zastosowano znaną metodę przeprowadzania takich składników w lotne octany alditoli.

Do 0,5 mg zliofilizowanej frakcji płynu celomatycznego dodano 0,5 ml 2 M kwasu trifluorooctowego i poddano hydrolizie w temp. 120°C przez 2 godz. Kwas trifluorooctowy odparowano w strumieniu azotu, a pozostałość zalkalizowano 1 M NH4OH do pH = 8,0. Otrzymany preparat redukowano w temp. 4°C dodając świeżo przygotowany roztwór 10% borodeuterku sodu w wodzie apirogennej (MQ), początkowo przez 3 godz. w temp. 22°C, a potem w ciągu 1 godz. w temp. 50°C. Nadmiar odczynnika redukującego usuwano dodając kroplami lodowaty kwas octowy, aż do zaniku wydzielania pęcherzyków

PL 237 653 B1 deuteru. Próbki suszono w strumieniu azotu, a nadmiar boranu sodu usuwano przez kilkukrotne odparowanie z 10% HCl w metanolu.

Otrzymane alkohole cukrowe acetylowano dodając 0,5 ml mieszaniny bezwodnika octowego i pirydyny w stosunku objętościowym 1 : 1 przez 30 min. w temp. 95°C. Próbkę odparowywano do suchości najpierw w strumieniu azotu, a następnie z kilkoma porcjami po 100 ml wody MQ, aż do zaniku zapachu pirydyny. Próbki octanów alditoli ekstrahowano z wody chloroformem, dodając dwukrotnie porcje chloroformu z wodą MQ w stosunku objętościowym jak 1 : 1. Ekstrakt chloroformowy suszono przepuszczając przez mini kolumienki z bezwodnym siarczanem sodu.

Octany alditoli analizowano wprowadzając ekstrakt chloroformowy na kolumnę chromatograficzną kapilarną HP-5MS, 30 m x 0,25 mm, z helem jako gazem nośnym. Analizę próbek przeprowadzono przy użyciu chromatografu gazowego sprzężonego ze spektrometrem masowym, w następującym programie temperaturowym: początkowo w ciągu 5 min. w temp. 150°C, potem zwiększano temperaturę o 5°C w ciągu 1 min, aż do wartości końcowej 310°C, utrzymywanej co najmniej przez 10 min. Składniki cukrowe identyfikowano na podstawie porównania ich czasów retencji i widm masowych do czasów retencji i widm masowych standardów oraz podobieństwa widm masowych identyfikowanych składników cukrowych z widmami masowymi składników zamieszczonych w bazie danych NIST library.

Na podstawie powyższej procedury, we frakcji płynu celomatycznego, zostały zidentyfikowane alkohole cukrowe i monosacharydy takie jak: glicerol, 4 stereoizomery inozytolu, mannoza, glukoza i galaktoza w następującym procentowym stosunku molowym: 37,3 : 53,7 : 0,4 : 6,4 : 2,1 względem całkowitej zawartości związków cukrowych.

Tak otrzymaną i zidentyfikowaną frakcję płynu według wynalazku używano do dalszych badań w kierunku działania na komórki raka płuca oraz komórki prawidłowe nabłonka oskrzelowego.

P r z y k ł a d 2. Sprawdzanie obecności endotoksyn we frakcji płynu celomatycznego według wynalazku

Przedmiotem badań opisanych w poniższym przykładzie było zbadanie we frakcji płynu celomatycznego obecności endotoksyn - lipopolisacharydowych składników ścian komórkowych bakterii Gram-ujemnych, odpowiedzialnych za szok endotoksyczny organizmu gospodarza zakażonego tymi bakteriami.

Stężenie endotoksyn we frakcji płynu celomatycznego, oznaczano metodą chromogenną punktu końcowego, przy użyciu testu LAL, posługując się zestawem do kwantyfikacji p-nitroaniliny uwalnianej z białkowych kompleksów p-nitroaniliny w wyniku reakcji enzymatycznej zachodzącej w amebocytach kraba Limulus polyphemus pod wpływem endotoksyny.

W celu określenia zawartości endotoksyny w jednostkach EU, wykonano krzywą wzorcową dla standardowego preparatu lipopolisacharydu (LPS) Escherichia coli szczep O111 :B4.

Preparat wzorcowy LPS E. coli został rozpuszczony w pozbawionej endotoksyn wodzie, zgodnie z instrukcją producenta, do wyjściowego stężenia 20 EU/ml, które potem posłużyło do wykonania serii rozcieńczeń o wartościach: 1,0; 0,5; 0,25 i 0,1 EU/ml. Następnie przygotowano próbki z frakcją płynu celomatycznego, sporządzając roztwór w apirogennej wodzie o stężeniu początkowym 2 x 10^-1 mg/ml, po czym wykonano serię rozcieńczeń, aż do stężenia końcowego 2 x 10^-5. Próbki preparatu z frakcją płynu celomatycznego umieszczono w 96 dołkowych płytkach mikrotitracyjnych i po dodaniu odczynnika LAL w stosunku v/v 1 : 1, inkubowano przez 10 min w temp. 37°C. W końcowym etapie badań, do każdej próbki z frakcjami płynu celomatycznego, próbek wzorcowych oraz próbek kontrolnych w postaci apirogennej jałowej wody, dodano chromogennego substratu - białkowej pochodnej p-nitroaniliny i kontynuowano inkubację przez 6 min, po czym wszystkie procesy inkubacji zatrzymywano dodając 25% kwas octowy.

Każde stężenie wzorcowego preparatu endotoksyny i preparatów zawierających frakcje płynu celomatycznego oznaczano w trzech powtórzeniach. Absorbancję badanych roztworów frakcji płynu i wzorcowych endotoksyn mierzono przy długości fali 405 nm wobec próby kontrolnej, jaką była woda pozbawiona endotoksyn.

Zawartość endotoksyn w badanych roztworach frakcji płynu według wynalazku, wynosiła 0,09 EU/ml, co jest wartością znacznie niższą niż dopuszczalne według Farmakopei USA stężenie endotoksyn w wodzie do iniekcji, wynoszące 0,25 EU/ml.

Negatywne wyniki testu LAL w badanych próbkach frakcji płynu celomatycznego, zostały potwierdzone analizą chromatograficzną w kierunku obecności 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych będących charakterystycznymi składnikami LPS. Zamieszczona na rysunku figura 3 przedstawia:

PL 237 653 B1

- zdjęcie A - wzorcowe widmo masowe estru metylowego trimetylosililowego eteru kwasu 3-hydroksymirystynowego pochodzącego z LPS E. coli, z uwidocznionym pikiem dla jonu m/z 175 świadczącym o obecności endotoksyny,

- zdjęcie B - jonogram selektywny frakcji płynu celomatycznego według wynalazku, na którym uwidocznione są jedynie piki pochodzące od zanieczyszczeń z nośnika kolumny chromatograficznej i membrany i brak sygnału dla jonu m/z 175 charakterystycznego dla 3-hydroksykwasów.

Przykład 3. Działanie frakcji białkowo-cukrowej według wynalazku na komórki nowotworowe płuca i komórki prawidłowe nabłonka oskrzelowego

Badania prowadzono na przykładzie linii komórek nabłonkowych niedrobnokomórkowego raka płuc A549. Hodowle wszystkich komórek prowadzono w standardowych warunkach - 37°C, 5% CO2,90% wilgotności powietrza, w podłożu RPMI z dodatkiem 8% płodowej surowicy bydlęcej. Gęstość wyjściowa zawiesiny wynosiła 104 komórek w mililitrze podłoża. Założono hodowle komórek prawidłowych pochodzących z oskrzela człowieka, wśród których jedna stanowiła kontrolę (bez frakcji), a do drugiej dodano 500 μl frakcji białkowo-cukrowej płynu celomatycznego. Założono także 2 hodowle zawierające komórki raka płuca, pierwsza stanowiła kontrolę (bez badanej frakcji), a do drugiej dodano frakcję białkowo-cukrową płynu celomatycznego.

Do 1 ml hodowli dodawano frakcję białkowo-cukrową płynu celomatycznego, uzyskując stężenie białka 12,5, 25, 50 oraz 100 μg/ml w każdej z nich. Po inkubacji w czasie 24, 48 i 72 godziny, do hodowanych komórek dodawano trypsynę, celem całkowitego oderwania komórek od naczynia hodowlanego, a następnie błękit trypanu dla zabarwienia komórek martwych. Następnie liczono ilość martwych i żywych komórek nowotworowych w komorze Burkera. Badanie powtarzano trzykrotnie. Procent komórek martwych w stosunku do kontroli stanowiącej 100% komórek nowotworowych, przedstawiono jako współczynnik cytotoksyczności w tabeli 1.

Jak wykazano w tabeli 1, frakcja białkowo-cukrowa płynu celomatycznego z dżdżownicy Dendrobaena veneta wykazuje bardzo efektywne działanie uszkadzające komórki raka płuca, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności lub toksyczności na bardzo niskim poziomie - 2% w stosunku do prawidłowych komórek nabłonkowych drzewa oskrzelowego człowieka.

Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną zawierającą same komórki nowotworowe oraz hodowle komórek nowotworowych z frakcją białkowo-cukrową według wynalazku, poddano obserwacji pod skaningowym mikroskopem elektronowym.

Po utrwaleniu hodowli na szkiełkach A549 i EAS-2B przy użyciu 4% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,0, komórki inkubowano roztworem OsO4 przez 30 minut. Następnie odwadniano je stopniowo w roztworach acetonu 30, 60, 90, i 100%, i wysuszono w eksykatorze. Po 24 godzinach napylono złotem i poddano oględzinom pod skaningowym mikroskopem elektronowym. Obrazy mikroskopowe uwidaczniające deformacje i zniszczenia komórek raka płuca po inkubacji z frakcją białkowo-cukrową przedstawiono na rysunku jako fig. 4, gdzie:

- fig. 4 A1 i A2 - komórki raka płuca - kontrolne,

- fig. 4 B1 i B2 - komórki raka płuca po działaniu frakcji w stężeniach odpowiednio 50 μg/m i 100 μg/ml, zaś obrazy mikroskopowe komórek nabłonka drzewa oskrzelowego po działaniu frakcji białkowo-cukrowej według wynalazku jako fig. 5, gdzie:

- fig. 5 A1 i A2 - komórki nabłonka drzewa oskrzelowego BEAS-2B kontrolne,

- fig. 5 B1 i B2 - komórki nabłonka drzewa oskrzelowego BEAS-2B płuca po działaniu frakcji odpowiednio w stężeniach 50 i 100 μg/ml.

Po działaniu frakcji komórki nabłonka nie uległy zmianom morfologicznym. Znacznik na zdjęciach odpowiada 10 mikrometrom.

Zaletą frakcji białkowo-cukrowej wyizolowanej z płynu celomatycznego, będącej przedmiotem wynalazku jest fakt, iż działa efektywnie na komórki raka płuca w 10 x niższym stężeniu. Dla porównania frakcja samego płynu celomatycznego o stężeniu białka 250 μg/ml powodowała cytotoksyczność wobec komórek raka płuca A 5459 na poziomie 75%, natomiast frakcja białkowo-cukrowa o stężeniu białka 25 μg/ml powodowała efekt cytotoksyczności komórek rakowych na poziomie 78%.

Ponadto, frakcja według wynalazku charakteryzuje się dużym stopniem czystości albowiem w wyniku dializy płynu celomatycznego po inkubacji w 70°C, zostają usunięte fragmenty zdenaturowanych białek, a możliwość jej liofilizacji zapewnia zachowanie jej aktywności przez długi okres czasu.

PL 237 653 B1

Przykład 4. Określenie aktywności kaspaz 4, 6, 8 i 12 po działaniu frakcji białkowo-cukrowej płynu celomatycznego względem komórek prawidłowych nabłonka oskrzeli oraz nowotworowych płuca W komórkach hodowli BEAS-2B i A549 założonych i prowadzonych tak jak opisano w przykładzie 3. oznaczano aktywność kaspaz 4, 6, 8 i 12 metodą immunoenzymatyczną (ELISA).

Komórki prawidłowe oraz nowotworowe poddano działaniu dezintegrującemu przy pomocy szoku termicznego. Do tak uzyskanej zawiesiny komórek (40 μL) dodawano 10 μL przeciwciała dla określonej kaspazy oraz 50 μΕ streptawidyny HRP. Całość inkubowano w 37°C w czasie 60 minut, po tym czasie 3-krotnie płukano buforem płuczącym, a następnie dodano po 50 μL chromogenu A i B. Całość inkubowano w 37°C w ciemni przez 10 minut. W celu zakończenia reakcji dodano 50 μΕ roztworu stop, a po 15 minutach oznaczano wartości absorbancji przy długości fali 450 nm, Wyniki stężenia kaspaz w komórkach BEAS-2B i A549 po inkubacji z frakcją białkowo-cukrową według wynalazku przedstawiono w tabeli 2. Zmiany istotne statystycznie oznaczono gwiazdką.

Jak udowodniono w powyższych przykładach, frakcja biakowo-cukrowa płynu celomatycznego z dżdżownicy Dendrobaena veneta według wynalazku wykazuje bardzo efektywne, zależne od poziomu białka we frakcji, działanie zwiększające stężenie kaspaz 4, 6, 8 i 12 w komórkach raka płuca, przy jednoczesnym niższym wzroście stężenia w prawidłowych komórkach nabłonkowych drzewa oskrzelowego człowieka. Zmiany istotne statystycznie przedstawionych wartości oznaczone są gwiazdką (p < 0,05).

Uzyskane wyniki dowodzą, że otrzymana frakcja płynu celomatycznego ma działanie indukujące programowaną śmierć, czyli apoptozę komórek raka puca na drodze aktywacji kaspaz.

Claims (1)

1. Frakcja białkowo-cukrowa o masie powyżej 14 kDa, otrzymywana z płynu celomatycznego dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuca.