PL237323B1 - Sposób wytwarzania modyfikowanej celulozy bakteryjnej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania modyfikowanej celulozy bakteryjnej BC, w warunkach hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem szczepu z rodzaju Komagataeibacter, korzystnie szczepem bakterii Komagataeibacter xylinus (dawniej Gluconacetobacter xylinus) z zastosowaniem medium hodowlanego.

Celuloza jest polisacharydem zbudowanym z jednostek 3,D-glukopiranozy połączonych ze sobą wiązaniami 3-1,4-glikozydowymi. Celuloza bakteryjna (BC) należy do wysokokrystalicznych celuloz, bogatych we frakcję 1α produkowanym przez tlenowe Gram-ujemne bakterie Komagataeibacter xylinus. Proces produkcji tego materiału można podzielić na dwa etapy. Etap pierwszy polega na polimeryzacji cząsteczek glukozy w liniowy3-1,4-glukan, natomiast etap drugi - na łączeniu i krystalizacji indywidualnych łańcuchów polimerowych w większe struktury.

Obecnie istnieje wiele metod modyfikacji BC, które można podzielić na trzy główne grupy: i) manipulacje genetyczne; ii) zastosowanie odpowiednich warunków hodowlanych podczas procesu produkcji BC, w tym przede wszystkim składu medium hodowlanego, temperatury i czasu inkubacji oraz napowietrzania iii) modyfikacje wytworzonej celulozy poprzez zastosowanie czynników chemicznych i/lub enzymatycznych.

Przemysłowy proces biosyntezy BC prowadzony jest najczęściej w warunkach hodowli stacjonarnej lub mieszanej/wytrząsanej. Wybór metody hodowli zależy ściśle od dalszego przeznaczenia syntetyzowanego polimeru. W przypadku prowadzenia hodowli w warunkach statycznych wytwarzany przez bakterie K. xylinus polisacharyd syntezowany jest w postaci silnie uwodnionej i elastycznej membrany na powierzchni pożywki. Uzyskany w ten sposób materiał posiada specyficzną nanostrukturę, cechującą się mniejszym przekrojem poprzecznym włókien, wysokim stopniem krystaliczności (>60%), brakiem zanieczyszczeń (np. hemicelulozą lub ligliną), biofunkcjonalnością oraz hipoalergicznością.

Nanobiocelulozę można również produkować w różnego typu aparatach i urządzeniach. Regulując warunki procesowe można w ten sposób otrzymać produkt o pożądanych własnościach fizykochemicznych i mechanicznych. Biosyntezę BC można realizować w aparatach wyposażonych w mieszadło mechaniczne (Cheng et al., 2011, Biomacromolecules 12(3):730-736) lub w kolumnach typu air-lift (Zuo et al. 2006, Biochem. Eng. J. 29(1-2):81-90), w których cyrkulacja medium hodowlanego wywołana jest poprzez wprowadzenie do płynu strumienia gazu (powietrza). Wynikiem prowadzenia procesu w warunkach dynamicznych jest otrzymanie BC w postaci nieregularnych struktur.

Sposoby biosyntezy BC opisane są w literaturze patentowej. W opisie patentowym PL171952 przedstawiono sposób wytwarzania BC w postaci błon na drodze hodowli powierzchniowej bakterii Acetobacter xylinum P23 na podłożu agarowym opartym o glukozę. Uzyskane błony o zawartości 90-97% α-celulozy mogą być stosowane jako środek opatrunkowy w chirurgii i dermatologii. Opis patentowy PL 185337 dotyczy sposobu wytwarzania BC z zastosowaniem szczepu A. xylinum w postaci błon stosowanych jako biomateriał opatrunkowy. Prezentowana metoda jest dwustopniowa, przy czym zastosowanie tej metody pozwala na uzyskanie wysokokrystalicznej α-celulozy bakteryjnej. W opisie patentowym PL 190961 przedstawiono sposób wytwarzania modyfikowanej BC na drodze hodowli bakterii octowych na podłożu płynnym opartym na glukozie i jej pochodnych, pozwalający na wytworzenie polimeru o kontrolowanej, założonej charakterystyce cząsteczkowej i morfologicznej oraz kontrolowanym wbudowywaniu merów N-acetyloglukozoaminy w jego łańcuchy. Z opisu patentowego PL 212003 znany jest sposób otrzymywania BC w warunkach hodowli stacjonarnej z zastosowaniem szczepu A. xylinum. Przed właściwą hodowlą produkcyjną stosuje się wstępną preinkubację całej objętości podłoża w warunkach stacjonarnych w czasie 24 h w temperaturze 27-33°C, po czym po dokładnym wymieszaniu podłoża i przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach, aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,6-0,8 cm^-1, prowadzi się hodowlę produkcyjną właściwą w warunkach stacjonarnych w czasie 5-7 dni. Z opisu patentowego PL 216180 znany jest sposób wytwarzania bionanocelulozy o właściwościach opatrunku na uszkodzenia skóry, przeznaczonej do zastosowania dla wyrobów medycznych dermatologiczno-kosmetycznych w postaci czystych, wilgotnych, suszonych lub liofilizowanych z użyciem substancji czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji, który charakteryzuje się tym, że bionanocelulozę wytwarza się w drodze hodowli szczepu bakterii G. xylinus. W opisie patentowym PL 216702 przedstawiono sposób wytwarzania biomateriału przeznaczonego na implanty dla chirurgii rekonstrukcyjno-odtwórczej.

PL 237 323 B1

Otrzymany materiał cechuje się dużą wytrzymałością na zrywanie i przepalenia, jest sprężysty oraz daje się modelować do dowolnego kształtu i zachowuje nadany kształt po modyfikacji, jest biokompatybilny i niealergizujący, charakteryzuje się minimalnym stopniem wchłaniania płynów ustrojowych i nie ulega resorpcji pod działaniem tych płynów. W opisie patentowym PL 212003 opisano dwuetapowy sposób otrzymywania BC z zastosowaniem bakterii A. xylinum w warunkach stacjonarnych. Przed hodowlą właściwą stosowano preinkubację całej objętości podłoża w warunkach stacjonarnych w czasie 24 h w temperaturze 27-33°C, a następnie po wymieszaniu i przelaniu do bioreaktorów przeprowadzono stacjonarną hodowlę właściwą w czasie 5-7 dni, stosując podłoże korzystnie uzupełnione karboksymetylocelulozą. W opisie patentowym PL 214844 dotyczącym modyfikacji błon celulozowych przedstawiono metodę produkcji BC z bakterii A. xylinum w procesie podzielonym na trzy etapy. Przedstawiono również sposób użycia sproszkowanej BC w procesie kriożelowania w postaci sferycznej zawiesiny zawierającej komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae lub bakterii Bacillus subtills.

W literaturze międzynarodowej można znaleźć wiele opisów patentowych dotyczących sposobu wytwarzania BC o różnorodnych właściwościach. Z opisu europejskiego zgłoszenia patentowego nr 0200409 znany jest sposób wytwarzania BC przez szczepy z rodzaj u Acelobacter Pseudomonas i inne metodą stacjonarną w temperaturze 20-40°C w czasie od 1-20 dni, przy pH = 3-9, przy zastosowaniu jako źródła węgla w podłożu glukozy, sacharozy, maltozy czy skrobi. Otrzymana w ten sposób BC charakteryzowała się wysokim modułem sprężystości i posiadała praktyczne zastosowanie w elektronice. Znane są również z publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 86/02095 i opisu wynalazku GB 2,131,701 sposoby wytwarzania BC w drodze hodowli statycznej i dynamicznej z wykorzystywaniem bakterii A. xylinum w temperaturze 20-28°C w czasie od kilku godzin do kilkunastu dni na podłożu hodowlanym zawierającym fruktozę, glukozę, sorbitol lub mannitol jako źródło węgla. Otrzymana BC charakteryzowała się właściwościami umożliwiającymi zastosowanie tego polimeru jako opatrunku medycznego lub sztucznej skóry. W opisach wynalazków US2006/1347 i WO 2004/50986 opisano dwuetapowy proces hodowli tego biomateriału zapewniający otrzymanie błony o gramaturze 10-45 g-m^-2. W opisie wynalazku US 2009/0017506 omówiono otrzymywanie BC z zastosowaniem A. xylinum w reżimie ciągłym (bez konieczności wymiany medium hodowlanego po jednym cyklu). W tym przypadku czas fermentacji trwa 24-456 h i zapewnia gramaturę błon w zakresie 6-240 g-m^-2. Z opisu wynalazku US 2009/0220560 znany jest opatrunek celulozowy powlekany nanosrebrem, w celu zwiększenia właściwości bakteriobójczych biomateriału. W patencie US 7390499 otrzymywano BC w warunkach statycznej hodowli z zastosowaniem szczepu A. xylinum i wykazano, że stężenie tlenu ma znaczący wpływ na grubość warstwy celulozy i zawartość wody w biomateriale (optymalny poziom tlenu 5-21% na granicy faz pożywka-powietrze). Zgłoszenie patentowe WO 2007/091801 dotyczy sposobu produkcji błon celulozowych nasączonych czynnikami pomocniczymi oraz substancjami regulującymi wilgotność lub przeciwutleniającymi. Metody produkcji BC zostały opisane również w opisach wynalazków CN 101700408 (produkcja modyfikowanych, wysokokrystalicznych opatrunków hydrożel owych udziałem szczepu G. xylinus), CN 10191626 (proces produkcji błon celulozowych z zastosowaniem tolerującego niskie pH pożywki szczepu Gluconacetobacter sp. S.C.- 01 mogącego znaleźć zastosowanie w produkcji na skalę przemysłową), CN 10168167 (proces produkcji błon celulozowych z zastosowaniem tolerującego niskie temperatury szczepu Gluconacetobacter xylinus 323). Sposoby syntezy BC są podane również w następujących opisach patentowych: US 5975095, US 5962278, US 6110712, US 6429002, US 6329192, US 5144021, US 5079162, US 4863565, US 5955325, US 4788146, US 4588400, EP 0792935, WO 8602095.

W procesie produkcji błon BC mogą być również stosowane zewnętrzne czynniki fizyczne w postaci statycznego pola magnetycznego (zgłoszenie patentowe EP 0197748 i patent US 4891317) lub wirującego pola magnetycznego (patent nr PL 227860). Efektem wpływu wirującego pola magnetycznego jest uzyskanie produktu o zwiększonej absorpcji wody w postaci elastycznej membrany na powierzchni ciekłej pożywki. Uzyskany materiał ma mniejszą gęstość oraz mniejsze usieciowane mikrofibryl celulozowych w porównaniu do próbek niepoddawanych oddziaływaniom wirującego pola magnetycznego.

Pomimo niezwykle dużego potencjału aplikacyjnego i ciągłego wzrostu zapotrzebowania rynku na BC, produkcja BC na skalę przemysłową jest w dalszym ciągu stosunkowo niewielka. Związane jest to z trudnościami w wyselekcjonowaniu wysokoproduktywnych szczepów wytwarzających celulozę, z wysokimi kosztami składników podłoża hodowlanego oraz z ciągle niewystarczającą efektywnością stosowanych metod produkcyjnych. Dlatego, mimo szeregu opatentowanych sposobów produkcji BC

PL 237 323 B1 lub aparatów wykorzystywanych do biosyntezy tego materiału istnieje również konieczność ciągłej optymalizacji metod otrzymywania tego bioproduktu. Związane to jest z faktem, że istniejące metody cechują się uzyskaniem materiału cechującego się niezadawalającym uzyskiem. Należy podkreślić również, że odpowiednie dobranie warunków prowadzenia biosyntezy BC może poprawić wydajność procesu, ale często wiąże się z niekorzystnymi zmianami własności fizykochemicznych i mechanicznych. Proces biosyntezy BC jest również długotrwały, co wiąże się bezpośrednio z jego energochłonnością. Niska efektywność oraz wysoka „kosztowność energetyczna” procesu prowadzi do wniosku, że efektywność produkcji BC - zgodnie z aktualnie stosowanymi procedurami oraz stosując znane konstrukcje aparatów - jest na niezadawalającym poziomie.

Unikalne właściwości BC czynią z niej interesujący materiał oraz przewidywane przyszłe zastosowania tego typu materiału wykraczają poza obecne przeznaczenie związane z wytwarzaniem materiałów opatrunkowych oraz implantów. Nanobioceluloza jest rozpatrywana, jako potencjalny materiał do produkcji między innymi papieru elektronicznego, elektroaktywnych polimerów lub kompozytów. Dlatego też celowym jest opracowanie nowych metod produkcji, cechujących się wysoką wydajnością oraz niską kosztochłonnością.

Sposób wytwarzania modyfikowanej celulozy bakteryjnej, według wynalazku, polega na przygotowaniu inokulum poprzez zaszczepienie na podłożu płynnym Herstin-Schramm zawierającym glukozę, ekstrakt drożdżowy, pepton bakteryjny, kwas cytrynowy, Na2HPO4, MgSCrO4 · H2O, bakterii fermentacji octowej z rodzaju Komagataeibacter, korzystnie szczepem bakterii Komagataeibacter xylinus (dawniej Gluconacetobacter xylinus). Następnie wymieszaniu przez 15 minut i inkubowaniu przez 7 dni w temperaturze 28-30°C, ponownym wymieszaniu przez 5 minut, i przeniesieniu tak otrzymanego inokulum w ilości 5-20% objętościowych do podłoża produkcyjnego. Istota rozwiązania polega na tym, że hodowlę produkcyjną prowadzi się w podłożu opartym na glukozie i jej pochodnych z dodatkiem 1-2% (v/v) oleju roślinnego. Proces produkcyjny prowadzi się w warunkach stacjonarnych przy pH w zakresie 4,5-6,0, w temperaturze 25-30°C przez okres 4-20 dni.

Korzystnie jako olej roślinny stosuje się olej rzepakowy i/lub słonecznikowy i/lub lniany. W sposobie stosuje się olej rzepakowy o składzie kwas oleinowy w ilości 55-70 v/v%, kwas linolowy omega-6 w ilości 18-22 v/v%, kwas α-linolenowy omega-3 w ilości 10-15 v/v%.

Inokulum zaszczepia się świeże podłoże H-S lub inne medium hodowlane oparte na glukozie i jej pochodnych, które może być stosowane do produkcji CB, np. medium Yamanaka, Zhou, CSL, Son (publikacja Ruka DR, Simon GP, Dean KM „Altering the growth conditions of Gluconacetobacter xylinus to maximize the yield of bacterial cellulose” Carbohydrate Polymers 89 (2012) 613-622).

W celu usunięcia oleju związanego w celulozie w procesie produkcyjnym, uzyskane membrany celulozowe przenosi się do czystych pojemników, przemywa wodą destylowaną, a następnie usuwa się olej poprzez zastosowanie ekstrakcji znaną metodą Soxhleta z użyciem eteru dietylowego jako rozpuszczalnika do ekstrakcji (metoda opisana w normie ISO 3596: 2000: Tłuszcze i oleje zwierzęce i roślinne - Oznaczanie substancji niezmydlających się - Metoda z ekstrakcją eterem dietylowym). Następnie, w celu usunięcia z membran celulozowych składników medium hodowlanego oraz komórek bakteryjnych, stosuje się oczyszczanie poprzez inkubacje w 0,1 M wodnym roztworze NaOH w temperaturze 80°C przez 30 minut. Procedura oczyszczania powtarzana jest trzykrotnie. Oczyszczona celuloza płukana jest w wodzie destylowanej do momentu ustabilizowania pH na poziomie 6,5-7,5 i suszona w 60°C do ustabilizowania się wagi.

Korzystnie hodowle produkcyjne prowadzi się w pojemnikach hodowlanych (zlewkach lub kolbkach) o średnicy 10-20 cm, wyposażonych w pokrywki posiadające filtry membranowe umożliwiających wymianę gazową w warunkach sterylnych (pory o średnicy nie większej niż 0,22 gm).

Sposób produkcji BC, według wynalazku dzięki zastosowaniu dodatku oleju roślinnego pozwala na polepszenie warunków hodowlanych K. xylinus, co wpływa na znaczne zwiększenie wydajności procesu oraz pozwala na otrzymanie powtarzalnego biomateriału o wyróżniającej się jakości. Efektem zastosowania zmodyfikowanego poprzez dodatek oleju roślinnego medium hodowlanego jest znaczne, nieopisywane wcześniej w literaturze, zwiększenie uzysku (ilość suchej masy BC w stosunku do użytego medium produkcyjnego) celulozy w porównaniu do hodowli, które prowadzone były w tym samym medium, ale bez dodatku oleju. Zaletą sposobu według wynalazku jest możliwość wytworzenia BC cechującej się również zmienionymi właściwościami fizycznymi w porównaniu do celulozy wyprodukowanej w tych samych warunkach i takim samym medium, ale bez dodatku oleju. Celuloza wytworzona w medium suplementowanym olejem roślinnym charakteryzuje się przede wszystkim większą (co naj

PL 237 323 B1 mniej x3) wytrzymałością na rozciąganie i większą (co najmniej x2) wodochłonnością. Ponadto uzyskany materiał nie wykazuje efektu cytotoksycznego względem hodowli komórek eukariotycznych in vitro. Zarówno wysoki uzysk BC, jak również jej właściwości fizyczne wynikają z zastosowania medium hodowlanego suplementowanego dodatkiem oleju roślinnego.

Modyfikowana BC otrzymana sposobem według wynalazku ze względu na swe właściwości, takie jak: wysoka wytrzymałość mechaniczna na rozciąganie, zawartość α-celulozy, higroskopijność oraz biozgodność znajduje zastosowanie w papiernictwie, medycynie czy kosmetyce.

Sposób według wynalazku przedstawiony jest w przykładach wykonania oraz na rysunku, który przedstawia uzyskane maty BC wytworzonej w medium H-S z dodatkiem 1% oleju rzepakowego oraz BC uzyskanej w medium H-S bez dodatku oleju.

P r z y k ł a d 1

Przygotowano inokulum. W tym celu na podłożu H-S zaszczepiono bakterie K. xylinus. Podłoże H-S zawierało: glukozę (2 w/v%), ekstrakt drożdżowy (0,5 w/v%), pepton bakteryjny (0,5 w/v%), kwas cytrynowy (0,115 w/v%), Na2HPO4 (0,27 w/v%), MgSO4^H2O (0,05 w/v%). Podłoże było wysterylizowane oraz wzbogacone alkoholem etylowym (1 v/v%). Bakterie K. xylinus, przechowywane były na stałym podłożu o składzie: glukoza (2 w/v%), ekstrakt drożdżowy (0,5 w/v%), pepton bakteryjny (0,5 w/v%), kwas cytrynowy (0,115 w/v%), Na2HPO4 (0,27 w/v%), MgSO4 · 7H2O (0,05 w/v%) agar bakteriologiczny (2 w/v%), również wysterylizowanym i wzbogaconym alkoholem etylowym (1 v/v%). Po zaszczepieniu bakterii hodowlę mieszano na wytrząsarce laboratoryjnej przez 15 minut i inkubowano przez kolejne 7 dni w temperaturze 28-30°C. Po 7 dniach inkubacji uzyskaną hodowlę ponownie miesza się na wytrząsarce typu worteks przez 5 minut. Otrzymane w ten sposób inokulum przenosi się na świeże podłoże produkcyjne oparte na glukozie i jej pochodnych (np. medium H-S o takim samym składzie jak podano powyżej) z dodatkiem 1-2% (v/v) oleju rzepakowego, korzystnie o składzie kwas oleinowy (55-70 v/v%), kwas linolowy omega-6 (18-22 v/v%), kwas α-linolenowy omega-3 (10-15 v/v%), miesza się przez 5 minut i prowadzi się hodowlę produkcyjną. Hodowle produkcyjne prowadzono w pojemnikach hodowlanych (zlewkach i kolbkach o średnicy odpowiednio 15-18 cm), wyposażonych w pokrywki posiadające filtry membranowe umożliwiających wymianę gazową w warunkach sterylnych (pory o średnicy 0,22 gm), w temperaturze 28°C w czasie 168 godz.

Po zakończeniu hodowli uzyskany materiał zważono na wadze analitycznej oraz zmierzono grubość uzyskanej warstwy celulozy. Następnie otrzymane membrany celulozowe przenoszono do czystych pojemników i przemywano wodą destylowaną. W kolejnym etapie usunięto olej związany w celulozie poprzez zastosowanie ekstrakcji znaną metodą Soxhleta z użyciem eteru dietylowego jako rozpuszczalnika do ekstrakcji (ISO 3596: 2000: Tłuszcze i oleje zwierzęce i roślinne - Oznaczanie substancji niezmydlających się - Metoda z ekstrakcją eterem dietylowym), a następnie celulozę oczyszczono poprzez inkubacje w 0,1 M wodnym roztworze NaOH w temperaturze 80°C przez 30 minut i ponownie ważono. Oczyszczoną celulozę płukano w wodzie destylowanej do momentu ustabilizowania pH na poziomie 6,5-7,5 i suszono w 60°C do momentu, kiedy waga celulozy została ustabilizowana. Po procesie suszenia uzyskany materiał był ponownie zwarzony i zmierzony.

Identyczną procedurę przeprowadzono dla prób kontrolnych wytworzonych w medium, które nie zawierało dodatku oleju. Uzyskane wyniki świadczą, że dla prowadzonej w ten sposób hodowli uzyskuje się, w odniesieniu do prób kontrolnych, odpowiednio o ok. 540% więcej masy BC przed procesem suszenia (po odjęciu masy związanego oleju), o ponad 550% więcej masy celulozy po procesie suszenia, o ok 280% grubszą warstwę BC przed procesem suszenia i o ponad 190% grubszą warstwę BC po procesie suszenia. Świadczy to o pozytywnym wpływie dodatku oleju roślinnego do medium hodowlanego na efektywność procesu produkcji tego typu materiału w porównaniu z biosyntezą prowadzoną bez zastosowania oleju.

Ponadto otrzymana celuloza charakteryzuje się następującymi parametrami: zawartość a-celulozy (%Ia) = 45,71%, wskaźnik wtórnego pęcznienia (WRV) = 570%, wytrzymałość mechaniczna 3,1 MPa.

P r z y k ł a d 2

Sposób jak w przykładzie pierwszym, z tym, że hodowlę produkcyjną prowadzi się w medium produkcyjnym z dodatkiem oleju słonecznikowego. Uzyskane wyniki świadczą, że dla prowadzonej w ten sposób hodowli uzyskuje się, w odniesieniu do prób kontrolnych, odpowiednio o ponad 530% więcej masy BC przed procesem suszenia (po odjęciu masy związanego oleju), o ok. 540% więcej masy celulozy po procesie suszenia, o ok. 250% grubszą warstwę BC przed procesem suszenia i o 200% grubszą warstwę BC po procesie suszenia.

PL 237 323 Β1

Ponadto otrzymana celuloza charakteryzuje się następującymi parametrami: zawartość a-celulozy (%la) = 44,12%, wskaźnik wtórnego pęcznienia (WRV) = 609%, wytrzymałość mechaniczna 2,1 MPa.

P rzykład 3

Sposób jak w przykładzie pierwszym, z tym, że hodowlę produkcyjną prowadzi się w medium produkcyjnym z dodatkiem oleju lnianego. Uzyskane wyniki świadczą, że dla prowadzonej w ten sposób hodowli uzyskuje się, w odniesieniu do prób kontrolnych, odpowiednio o ponad 520% więcej masy BC przed procesem suszenia (po odjęciu masy związanego oleju), o ponad 560% więcej masy celulozy po procesie suszenia, o ponad 240% grubszą warstwę BC przed procesem suszenia i o 210% grubszą warstwę BC po procesie suszenia.

Ponadto otrzymana celuloza charakteryzuje się następującymi parametrami: zawartość a-celulozy (%la) = 44,71%, wskaźnik wtórnego pęcznienia (WRV) = 389%, wytrzymałość mechaniczna 1,9 MPa.

Claims (3)

1. Sposób wytwarzania modyfikowanej celulozy bakteryjnej polegający na przygotowaniu inokulum poprzez zaszczepienie na podłożu płynnym Herstin-Schramm zawierającym glukozę, ekstrakt drożdżowy, pepton bakteryjny, kwas cytrynowy, N32HPO4, MgSO4 · H2O, bakterii fermentacji octowej z rodzaju Komagataeibacter, korzystnie szczepem bakterii Komagataeibacter xylinus (dawniej Gluconacetobacter xylinuś), następnie wymieszaniu przez 15 minut i inkubowaniu przez 7 dni w temperaturze 28-30°C, ponownym wymieszaniu przez 5 minut, i przeniesieniu tak otrzymanego inokulum w ilości 5-20% objętościowych do podłoża produkcyjnego, znamienny tym, że hodowlę produkcyjną prowadzi się w podłożu opartym na glukozie i jej pochodnych z dodatkiem 1-2% (v/v) oleju roślinnego, przy czym proces produkcyjny prowadzi się w warunkach stacjonarnych przy pH w zakresie 4,5-6,0, w temperaturze 25-30°C przez okres 4-20 dni.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako olej roślinny stosuje się olej rzepakowy i/lub słonecznikowy i/lub lniany.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się olej rzepakowy o składzie kwas oleinowy w ilości 55-70 v/v%, kwas linolowy omega-6 w ilości 18-22 v/v%, kwas a-linolenowy omega-3 w ilości 10-15 v/v%