PL236589B1 - Zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych w enzymologii - Google Patents
Zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych w enzymologii Download PDFInfo
- Publication number
- PL236589B1 PL236589B1 PL420446A PL42044617A PL236589B1 PL 236589 B1 PL236589 B1 PL 236589B1 PL 420446 A PL420446 A PL 420446A PL 42044617 A PL42044617 A PL 42044617A PL 236589 B1 PL236589 B1 PL 236589B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- imidazolium
- optically active
- concentration
- saccharates
- methyl
- Prior art date
Links
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-O Imidazolium Chemical compound C1=C[NH+]=CN1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-O 0.000 title claims description 77
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 title 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 claims description 44
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 claims description 44
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 claims description 44
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 36
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 36
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 36
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 36
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 35
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 27
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 27
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N (-)-Menthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@H]1O NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N 0.000 claims description 10
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 9
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 6
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003139 biocide Substances 0.000 claims description 3
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 claims description 2
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 83
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-M 1,1-dioxo-1,2-benzothiazol-3-olate Chemical class C1=CC=C2C([O-])=NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 39
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 18
- 150000004693 imidazolium salts Chemical class 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 16
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 14
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 13
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 11
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 9
- 241000293770 Cerrena unicolor Species 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- -1 pyridinium imides Chemical class 0.000 description 7
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 6
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 4
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JBFYUZGYRGXSFL-UHFFFAOYSA-N imidazolide Chemical compound C1=C[N-]C=N1 JBFYUZGYRGXSFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 229960001867 guaiacol Drugs 0.000 description 2
- IYVYLVCVXXCYRI-UHFFFAOYSA-O hydron;1-propylimidazole Chemical compound CCCN1C=C[NH+]=C1 IYVYLVCVXXCYRI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 2
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- BBERJYHBIYXBBP-UHFFFAOYSA-N (3-propylimidazol-1-ium-1-yl)methanol Chemical compound CCCN1C=C[N+](CO)=C1 BBERJYHBIYXBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXMGHDIOOHOAAE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trifluoro-n-(trifluoromethylsulfonyl)methanesulfonamide Chemical compound FC(F)(F)S(=O)(=O)NS(=O)(=O)C(F)(F)F ZXMGHDIOOHOAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical group [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCWDRMKPLNYFEA-UHFFFAOYSA-O 3-nonyl-1h-imidazol-3-ium Chemical compound CCCCCCCCC[N+]=1C=CNC=1 KCWDRMKPLNYFEA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000675278 Candida albicans SC5314 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N N-α-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=C([N+]([O-])=O)C=CC=1NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1=CC=CC=C1 DEOKFPFLXFNAON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M Sodium salicylate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C([O-])=O ABBQHOQBGMUPJH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000002599 biostatic effect Effects 0.000 description 1
- DFPPJSMVBKJBPQ-UHFFFAOYSA-N butanedioic acid;1h-imidazole Chemical compound C1=CNC=N1.C1=CNC=N1.OC(=O)CCC(O)=O DFPPJSMVBKJBPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229960004025 sodium salicylate Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych, zawierających pochodną chiralnego (1R,2S,5R)-(-)-mentolu i łańcuch alkilowy w enzymologii w szczególności do aktywacji i stabilizacji enzymów z grupy oksydoreduktaz i hydrolaz oraz jako środka biobójczego.
Z polskiego zgłoszenia patentowego nr P412243 A1 znane jest zastosowanie chiralnych chlorkowych cieczy jonowych zawierających pochodną (1R ,2 S ,5 R)-(-)-mentolu do wytwarzania środka lub preparatu do leczenia lub profilaktyki infekcji grzybicznych w szczególności wywołanych przez Candida albicans. Do badań nad aktywnością przeciwgrzybiczną w zgłoszeniu wybrano trzy szczepy C. albicans: (i) C. albicans SC5314 (izolat kliniczny), (ii) C. albicans CAF2-1 (Δura3::imm434/URA3), (iii) C. albicans CAF4-2 ((Δura3::imm434/(Δura3::imm434). Czyste hodowle badanych szczepów utrzymywano do doświadczeń na podłożu stałym YPD w 4°C i przesiewano co 2 tygodnie.
W literaturze światowej znane są doniesienia dotyczące zastosowania soli jonowych o różnej strukturze kationowo-anionowej do aktywacji i stabilizacji enzymów, np.: wzrost aktywności i stabilności lakazy z Cerrena unicolor z wykorzystaniem bis(trifluorometylosulfonylo)imidków amoniowych, imidazoliowych oraz pirydyniowych z komponentem terpenowym - aktywny składnik: J. FederKubis, J. Bryjak “Laccase activity and stability in the presence of menthol-based ionic liquids” Acta Biochim. Pol., 60, 741-745 (2013). Innym doniesieniem jest zgłoszenie patentowe nr P416691 A1, w którym ujawniono chiralne ciecze jonowe z podstawnikiem alkoholu monocyklicznego terpenowego oraz z anionem salicylanowym, wykazujące zastosowanie do aktywacji i stabilizacji lipazy oraz o właściwościach przeciwmikrobiologicznych, których wytwarzanie polega na tym, że odpowiedni chiralny prekursor, wybrany z grupy chlorków 3-alkilo-1-[(1 R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowych, poddaje się reakcji wymiany z salicylanem sodu w stosunku bliskim równomolowemu, korzystnie równym od 0,95 do 1,85, w temperaturze od 273 do 373 K, w obecności rozpuszczalnika organicznego lub w wodzie.
Z doniesienia konferencyjnego pt. „Chiralne ciecze jonowe zawierające słodki anion aromatyczny” zaprezentowanego na VIII Sympozjum Czwartorzędowe Sole Amoniowe i Obszary ich Zastosowania Poznań 1-3 lipca, 2013 roku (książka streszczeń, s. 77) znane są chiralne ciecze jonowe zawierające kation alkiloimidazoliowy z komponentem (1R ,2 S ,5 R)-(-)-mentolu jednocześnie z anionem sacharynianowym, o wzorze ogólnym: [ImRMentol]+Sach-, w którym R oznacza grupę alkilową CnH2n+1, gdzie n wynosi 1-12.
Natomiast w polskim zgłoszeniu patentowym nr P408755 A1 opisana została powyższa grupa słodkich cieczy jonowych zawierających komponent (1R,2S,5R)-(-)-mentolu oraz organiczny anion sacharynianowy {o wzorze ogólnym [ImRMentol]+Sach-, w którym R oznacza grupę alkilową CnH2n+1, gdzie n wynosi 1-12} jako materiały luminescencyjne. Właściwości luminescencyjne sprawdzono wykonując pomiary widm emisji, wzbudzenia oraz wyznaczenie wydajności kwantowej badanej substancji.
Istotą wynalazku jest zastosowanie optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych zawierających pochodną optycznie czynnego (1R,2S,5R)-(-)-mentolu, o wzorze ogólnym [R-Im-CH2OMentol]+Sach-, w którym R oznacza grupę alkilową CnH2n+1, gdzie n wynosi 1,3, 6, 9, 12 oraz 14, do aktywacji i stabilizacji enzymów z grupy oksydoreduktaz i hydrolaz, w szczególności lakazy, lipazy lub trypsyny w roztworach białkowych.
Korzystnie do aktywacji lakazy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej o długości łańcucha alkilowego od metylowego do nonylowego w stężeniu 2,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od metylowego do heksylowego w stężeniu 8,0-51,1 mM.
Korzystnie do aktywacji lipazy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej o długości łańcucha alkilowego od propylowego do dodecylowego w stężeniu 2,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od metylowego do nonylowego w stężeniu 5,8-55,9 mM.
Korzystnie do aktywacji trypsyny stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej o długości łańcucha alkilowego od heksylowego do tetradecylowego w stężeniu 0,5 mM.
Korzystnie do stabilizacji lipazy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej o długości łańcucha alkilowego od metylowego do tetradecylowego w stężeniu 2,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od heksylowego do tetradecylowego w stężeniu 2,5-7,8 mM.
PL 236 589 B1
Korzystnie do stabilizacji trypsyny stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od metylowego do dodecylowego w stężeniu 0,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od metylowego do tetradecylowego w stężeniu 0,9-50,4 mM.
Istotą wynalazku jest również zastosowanie optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych zawierających pochodną optycznie czynnego (1R ,2 S ,5 R)-(-)-mentolu o wzorze ogólnym [R-Im-CH2OMentol]+Sach-, w którym R oznacza grupę alkilową CnH2n+1, gdzie n wynosi 1, 3, 6, 9, 12 oraz 14 jako środków biobójczych, obejmujących działanie bakterio- i grzybobójcze oraz bakterio- i grzybostatyczne.
Korzystnie jako środek grzybobójczy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej o długości łańcucha alkilowego od metylowego do nonylowego w stężeniu 2,5-55,9 mM.
Korzystnie jako środek bakteriobójczy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej o długości łańcucha alkilowego od metylowego do heksylowego w stężeniu 6,8-55,9 mM.
Korzystnie jako środek bakterio- i grzybostatyczny stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone powyżej w stężeniu 0,5 mM.
Optycznie czynne sole imidazoliowe, zawierające pochodną chiralnego (1R ,2 S ,5 R)-(-)-mentolu i łańcuch alkilowy, stosowane w rozwiązaniu to związki zawierające w anionie komponent popularnego słodzika: sacharyny - substancji powszechnie stosowanej w przemyśle spożywczym [U. Świerczek, A. Borowiecka, J. Feder-Kubis „Struktura, właściwości i przykłady zastosowań syntetycznych substancji słodzących” Żywność. Nauka. Technologia. Jakość 4, 15-25 (2016)]. Optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe to związki silnie hydrofobowe o gęstościach mieszczących się w zakresie 1,21:1,09 [g/cm3]. Lepkość kinematyczna badanych soli jonowych zawiera się w zakresie 512:689 [mm2/s]. Omawiane optycznie czynne pochodne sacharyny mogą efektywnie konwertować promieniowanie ultrafioletowe. Wydajności kwantowe wyznaczone dla chiralnych soli sacharynianowych wahają się w zakresie od 20 do 40% w zależności od badanej substancji.
Stężenie zastosowanych soli [R-Im-CH2OMentol]+Sach- w roztworach użytkowych zostało wyznaczone poprzez pomiar spektrofotometryczny przy 270 nm (sygnał pochodzący od anionu sacharynianowego) i obliczone na podstawie krzywej standardowej wykonanej dla sacharynianu sodu.
Optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe, przedstawione wzorem [R-Im-CH2OMentol]+Sach-, według wynalazku, wykazują zdolność do modulacji reaktywności enzymów. Cechę tę sprawdzono określając wpływ otrzymanych sacharynianów imidazoliowych na aktywność oraz stabilność lakazy z Cerrena unicolor, lipazy z Pseudomonas cepacia oraz trypsyny z trzustki bydlęcej podczas inkubacji z roztworem użytkowym o danym stężeniu sacharynianu imidazoliowego. Aktywność lakazy wyznaczono w roztworze użytkowym dla gwajakolu, trypsyny w roztworze użytkowym dla BAPNA (a-N-benzoilo-L-arginylo-4-nitroanilidu) jako substratu poprzez pomiar spektrofotometryczny, a dla lipazy w reakcji hydrolizy tributyryny, przez miareczkowanie roztworem NaOH. Aktywność enzymu w poszczególnych roztworach sacharynianów imidazoliowych była liczona jako aktywność procentowa względem próby kontrolnej, czyli buforu nie zawierającego soli imidazoliowej, przyjętej jako 100% aktywności. Stabilność enzymów w obecności sacharynianu imidazoliowego wyznaczono przez pomiary aktywności w trakcie 6-dniowej inkubacji w 30°C. Wpływ soli imidazoliowej na stabilność enzymu liczono dla 6 dnia inkubacji względem próby kontrolnej, czyli enzymu inkubowanego w buforze nie zawierającym soli imidazoliowej, przyjętej jako 100% stabilności.
Optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe, przedstawione wzorem [R-Im-CH2OMentol]+Sach-, według wynalazku, wykazują właściwości biobójcze o szerokim spektrum działania. Cechę tę sprawdzono poprzez wykonanie posiewu mikrobiologicznego mieszanin cieczy użytkowej i enzymu lub enzymu w buforze bez soli imidazoliowej, jako próbie kontrolnej, na standardowych pożywkach dla bakterii oraz grzybów po 6-dniowej inkubacji w 30°C w warunkach niesterylnych. Aktywność biostatyczną i biobójczą roztworów soli imidazoliowych wobec kolonii grzybowych i bakteryjnych określano jako procentowy stosunek liczby kolonii mikroorganizmów zliczonych w posiewach z mieszanin cieczy użytkowych i enzymu do liczby kolonii obecnych w posiewie kontrolnym buforu, nie zawierającym soli imidazoliowej.
Dzięki rozwiązaniu według wynalazku uzyskano roztwory użytkowe o różnych stężeniach soli imidazoliowych: 0,5 oraz 2,5 mM o właściwościach bakterio- i grzybostatycznych, które mogą być stosowane jako środowisko do prowadzenia biotransformacji (zwiększają stabilność enzymu oraz znacząco ograniczają wzrost mikroorganizmów) oraz 6,8-55,9 mM o aktywności antymikrobiologicznej, co wskazuje na zastosowanie optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych z łańcuchem alkilowym o długości od metylowego do heksylowego jako dezynfektantów.
PL 236 589 Β1
Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach realizacji opisujących dodatek sacharynianów imidazoliowych jako modulatorów aktywności i stabilności enzymów oraz środków ograniczających lub hamujących zanieczyszczenie mikrobiologiczne w roztworach białkowych.
Przykład 1
Aktywność lakazy z Cerrena unicolor, lipazy z Pseudomonas cepacia w roztworach użytkowych zawierających substancję aktywną w stężeniu 2,5 mM oraz trypsyny z trzustki bydlęcej w roztworach użytkowych zawierających substancję aktywną w stężeniu 0,5 mM.
Sporządzono 18 roztworów użytkowych: 12 roztworów o stężeniu 2,5 mM i objętości 20 mL poprzez rozpuszczenie w 30°C 21,7 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-metyloimidazoliowego w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2 oraz 50 mM buforze fosforanowym pH 8, 23,1 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-propyloimidazoliowego w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2 oraz 50 mM buforze fosforanowym pH 8, 25,2 mg sacharynianu 3-heksylo-1-(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowego w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2 oraz 50 mM buforze fosforanowym pH 8, 27,3 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-nonyloimidazoliowego w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2 oraz 50 mM buforze fosforanowym pH 8, 29,4 mg sacharynianu 3-dodecylo-1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowego w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2 oraz 50 mM buforze fosforanowym pH 8, 30,8 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowego w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2 oraz 50 mM buforze fosforanowym pH 8, a także 6 roztworów o stężeniu 0,5 mM poprzez rozpuszczenie w 30°C 4,3 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-metyloimidazoliowego w 50 mM buforze boranowym pH 8,0, 4,6 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-propyloimidazoliowego w 50 mM buforze boranowym pH 8,0, 5 mg sacharynianu 3-heksylo-1-[(1R,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowego w 50 mM buforze boranowym pH 8,0, 5,5 mg sacharynianu 1 -[(1 R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-nonyloimidazoliowego w 50 mM buforze boranowym pH 8,0, 5,88 mg sacharynianu 3-dodecylo-1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowego w 50 mM buforze boranowym pH 8,0, oraz 6,2 mg sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowego w 50 mM buforze boranowym pH 8,0.
Uzyskane roztwory użytkowe wykorzystano do pomiaru aktywności lakazy z Cerrena unicolor (pH 5,2) lipazy z Pseudomonas cepacia (pH 8) oraz trypsyny z trzustki bydlęcej (pH 8). Do 1 mL uzyskanych roztworów użytkowych o pH 5,2 dodano 10 gL 150 mM gwajakolu i 5 gL lakazy (aktywność właściwa 30 U/mg) i oznaczono aktywność enzymatyczną w 30°C poprzez pomiar spektrofotometryczny przy 525 nm. Do 1 mL uzyskanych roztworów użytkowych o pH 8 dodano 50 gL tributyryny i 5 gL lipazy (aktywność właściwa 93 U/mg) i oznaczono aktywność enzymatyczną w 37°C poprzez miareczkowanie powstałego kwasu masłowego 0,01 M alkoholowym roztworem NaOH. Do 1 mL uzyskanych roztworów użytkowych buforu boranowego o pH 8 dodano 5 gL 80 mM ΒΑΡΝΑ i 5 gL trypsyny (aktywność właściwa 2 U/mg) i oznaczono aktywność enzymatyczną w 30°C poprzez pomiar spektrofotometryczny przy 405 nm. W Tabeli 1 przedstawiono wyniki wyrażone jako procentowa wartość aktywności w odniesieniu do prób kontrolnych nie zawierających soli imidazoliowych, dla których wartość aktywności oznaczono jako 100.
Tabela 1
Procentowa aktywność lakazy i lipazy w roztworach użytkowych zawierających 2,5 mM optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych oraz procentowa aktywność trypsyny w roztworach użytkowych zawierających 0,5 mM optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych, w odniesieniu do prób kontrolnych (za 100% przyjęto wyniki uzyskane dla roztworów bez soli imidazoliowej).
| Optycznie czynny sacharynian iinidazoliowy [R-Im-CHzOMentolTSach' | Aktywność lakazy, pH5.2 [%] | Aktywność lipazy, pH 8,0 [%] | Aktywność tiypsyny, pH 8,0 [%] |
| sachary nian 1 -[(1Λ ,2S, 5R) -(-)-mentoksy mety lo] -3 mety loimidazoliowy [CH5-Im-CH2OMeiitol]+Sach | 119,4 | 77,4 | 99,4 |
PL 236 589 Β1
| sacharynian l-[(l/t2S.5R)-(-)-mcntoksymctylo|-3“ propyloimidazoliowy [CjHidm-CHiOMentol] Sacir | 134,4 | 102.9 | 99,7 |
| sacharynian 3-liekjylo-1 -{( mciitoksvmctylo]imidazoliowv [CtHu-lniCHiOMentol] 'Sacir | 126,4 | 150.3 | 105,4 |
| sacharynian l-[(l/?,2S.5/i)-(—)-mentok$yinetylo|-3nonyloimidazoliowy [CeHw-Ini-CHiOMentol]Sacir | 116,6 | 110.7 | 112,6 |
| sachaiy niań 3 -dodecylo-l -| (1 R,2S,5R) mcntoksrmctylojimidazoliowy ICuH^-lm- CHiOMentol] 'Sacir | 91,7 | 101.6 | 112,3 |
| sacharynian 1 -[ (1 R.2S,SR)-(-)-inenloksy inely lo| - 3tetradecyloimidazcliowy [CuHis-Ini-CHiOMentoll +Sacłr | 87,3 | 79.6 | 104,5 |
Dodatek optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych z podstawnikiem alkilowym od metylowego do nonylowego w stężeniu 2,5 mM w roztworze użytkowym o pH 5,2 powoduje wzrost aktywności lakazy. 2,5 mM stężenie sacharynianu 3-dodecylo-1-[(1R,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowego i sacharynianu 1-[(1/?,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowego w roztworach użytkowych o pH 5,2 powoduje niewielki spadek aktywności tego enzymu. Korzystne jest stosowanie 2,5 mM stężenia sacharynianów imidazoliowych z podstawnikiem alkilowym od propylowego do dodecylowego w roztworach użytkowych o pH 8 do aktywacji lipazy. Sacharynian 1 -[(1 R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-metyloimidazoliowy oraz sacharynian 1 -[(1 R,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowy w podanym stężeniu powodują niewielki spadek aktywności lipazy. Korzystne jest stosowanie 0,5 mM stężenia sacharynianów imidazoliowych {[R-lm-CHDOMentol]+Sach } do stabilizacji trypsyny. 0,5 mM stężenie sacharynianów imidazoliowych z podstawnikiem od heksylowego do tetradecylowego powoduje wzrost aktywności tego enzymu.
Przykład 2
Stabilność lakazy z Cerrena unicolor, lipazy z Pseudomonas cepacia oraz trypsyny z trzustki bydlęcej w roztworach użytkowych zawierających substancję aktywną w stężeniu 2,5 mM (dla lakazy i lipazy) oraz 0,5 mM (dla trypsyny) oraz czystość mikrobiologiczna roztworów użytkowych z enzymem po 144 h inkubacji.
Roztwory użytkowe o stężeniu 2,5 mM oraz 0,5 mM uzyskano poprzez rozpuszczenie w 30°C odpowiednich naważek optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych, analogicznie jak w Przykładzie 1, w 50 mM buforze fosforanowo-cytrynianowym pH 5,2, 50 mM buforze fosforanowym pH 8 oraz 50 mM buforze boranowym wykorzystano do oznaczenia stabilności i czystości mikrobiologicznej roztworów enzymatycznych. Do 3 mL uzyskanych roztworów użytkowych o pH 5,2 dodano 100 μί lakazy (aktywność właściwa 170 U/mg), do 3 mL uzyskanych roztworów użytkowych o pH 8 (lipaza) dodano 100 μί lipazy (aktywność właściwa 830 U/mg), a także do 3 mL uzyskanych roztworów użytkowych o pH 8 (trypsyna) dodano 100 μί trypsyny (aktywność właściwa 15 U/mg). Mieszaniny inkubowano przez 144 godziny w 30°C i oznaczano aktywność enzymów w ustalonych odstępach czasowych. Po 6 dniach inkubacji w warunkach niesterylnych, pobierano 100 μί enzymu w przygotowanych roztworach użytkowych o pH 5,2 lub pH 8, rozcieńczano 1, 10, 100, 1000, 10 000 razy sterylnym płynem fizjologicznym i wysiewano 50 μί próbki na standardowych stałych pożywkach odpowiednich do wzrostu bakterii (LB Agar) lub grzybów (Potato Dextrose Agar). Hodowle inkubowano w 30°C, po 2 dniach zliczono liczbę kolonii bakteryjnych, a po 4 dniach liczbę kolonii grzybiczych. W Tabeli 2 przedstawiono wyniki wyrażone jako procentowe wartości badanych parametrów w odniesieniu do prób kontrolnych nie zawierających soli imidazoliowych.
PL 236 589 Β1
Tabela 2
Procentowa stabilność lakazy, lipazy, trypsyny oraz liczba kolonii bakteryjnych i grzybiczych po 6 dniach inkubacji w 30°C w roztworach użytkowych o pH 5,2 i pH 8 zawierających optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe w stężeniu 2,5 mM oraz 0,5 mM dla trypsyny w odniesieniu do prób kontrolnych (za 100% przyjęto wyniki uzyskane dla roztworów bez soli imidazoliowej).
| Optycznie czynny sacharynian imidaznliowy [R-IrnCH;OMei:tol]Saclf | Lakaza (pH 5,2) | Lipaza (pH 8.0) | Trypsyiia (pH 8 | 0) | |||||
| Stabilność enzymu [%] | Liczba kolonii bakteiyjnych (%| | Liczba kolonii grzybiczych [%] | Stabilność enzymu [%] | Liczba kolonii bakteryjnych [%| | Liczba kolonii grzybiCzych [%] | Stabilność enzymu [%] | Liczba kolonii bakteryjnych |%| | Liczba kolonii grzybiczych r%i | |
| sacharynian 1 - inentoksy mety lo] -3 metyloitnidazoliowy [CHj-Im- CH.OMcrtoirSaclr | 61.7 | 0,0003 | brak | 103,4 | 9,7522 | brak | 135,7 | 10,8056 | 3,2677 |
| sachatynian 1- |(l«,2Ś,5/?)-(-)mentoksymetylo]-3propy loimidazoliowy [C3H7-ItnCHiOMentoirSach- | 51.9 | brak | brak | 106,2 | 1.1900 | brak | 121,8 | 7.1988 | 2.7606 |
| sacharynian 3 -heksyΙοί -l(’l ^,25.5^)-(-)mentoksymetylojimida zoliowy [CtHu-ImCH2OMentol]+Sach- | 65,8 | brak | brak | 98,6 | brak | brak | 129,8 | brak | brak |
| sacharynian 1[(17?.2Ś,5«)-HmcntoksymetyloJ-3nonyloimidazoliowy [CSH,9-ImCHiOMentol]1 Sach | 66,4 | 0,0003 | brak | 98,8 | 0.6729 | brak | 133,5 | brak | brak |
| sachatynian 3dodecylo-1[(1Λ,25,Μ)-(-)mentoksymetylo] imida zoliowy [CnHii-ImCH.OMcrtollSach | 44,5 | 0,0054 | 0,0288 | 106,4 | 3,2053 | 0,0066 | 163,6 | 0,0063 | 0,02817 |
| sachatynian 1- [(1Λ,25,5Λ)-(-)mentoksymetylo]-3 tetradecyloimidazoliowy [C ląHj^-ImCH7OMentol|+Sach- | 75,2 | 2,2315 | 0,2304 | 105,6 | 9,0452 | 0,2354 | 95,5 | 0,0009 | 0,0352 |
Zastosowanie roztworów użytkowych o pH 5,2 o 2,5 mM stężeniu sacharynianów imidazoliowych powoduje spadek stabilności lakazy, ale znacząco ogranicza wzrost mikroorganizmów podczas długoterminowej inkubacji w 30°C. Roztwory użytkowe o pH 8 powodują stabilizację lipazy oraz ograniczają wzrost mikroorganizmów w roztworze enzymatycznym, co sprawia, że sacharynianowe sole imidazoliowe z podstawnikiem alkilowym od metylowego do tetradecylowego mogą być wykorzystywane jako stabilizator podczas długoterminowych biotransformacji z wykorzystaniem lipazy. Zastosowanie roztworów użytkowych sacharynianów imidazoliowych z podstawnikiem alkilowym od metylowego do dodecylowego o stężeniu 0,5 mM powoduje znaczący wzrost stabilności trypsyny, natomiast obecność sacharynianu 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowego w roztworze, jej nieznaczny spadek w czasie 144 h inkubacji w porównaniu do roztworu, który nie zawierał soli imidazoliowej. Roztwory te ograniczają wzrost mikroorganizmów w roztworze enzymatycznym, co sugeruje na ich właściwości bakterio- i grzybostatyczne w przypadku związków: [CH3-lm-CH2OMentol]+Sach·, [C3H7-lm-CH2OMentol]+Sach·, [Ci2H25-lm-CH2OMentol]+Sacfr oraz [Ci4H29-lm-CH2OMentol]+Sach·, a także biobójczych związków zawierających heksylowy {[C6Hi3-lm-CH2OMentol]+Sach} i nonylowy {[C9Hi9-lm-CH2OMentol]+Sach} łańcuch alifatyczny, pozwalających zachować sterylność układu. W niespecyficznych testach mikrobiologicznych, czyli przy braku sterylności podczas długoterminowej inkubacji roztworów użytkowych o pH 5,2 i pH 8 oraz 0,5 i 2,5 mM stężeniu sacharynianowych soli
PL 236 589 Β1 z podstawnikiem alkilowym od metylowego do nonylowego, wykazano ich pełną grzybobójczość, co wskazuje na zastosowanie tych związków jako środka przeciwgrzybiczego o szerokim spektrum działania już w stężeniu 0,5 mM. W niespecyficznych testach mikrobiologicznych wykazano bakteriostatyczne działanie roztworów użytkowych o pH 5,2 i pH 8 zawierających badane sacharyniany w stężeniu 2,5 mM, a sacharynian 3-heksylo-1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowy {[CgHi3-lm-CH2OMentol]+Sach } w tym stężeniu wykazał działanie bakteriobójcze. Sacharynian z łańcuchem alifatycznym zawierającym 6 atomów węgla {[C6Hi3-lm-CH2OMentol]+Sach} w stężeniu 2,5 mM w roztworach użytkowych o pH 5,2 i pH 8 oraz 0,5 mM o pH 8 może mieć zastosowanie jako dezynfektant o szerokim spektrum działania, a w roztworze użytkowym o pH 8 jako stabilizator lipazy oraz trypsyny podczas długoterminowych biotransformacji.
Przykład 3
Aktywność lakazy z Cerrena unicolor i lipazy z Pseudomonas cepacia w roztworach użytkowych nasyconych substancjami aktywnymi: [R-lm-ChLOMentoipSacIr.
Roztwory użytkowe nasycone sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-metyloimidazoliowym uzyskano inkubując w 30°C przez 72 godziny w 10mL50 mM buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 5,2 i w 10 mL 50 mM buforu fosforanowego o pH 8, 250 mg sacharynianu z podstawnikiem metylowym. Roztwory użytkowe nasycone sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-propyloimidazoliowym uzyskano inkubując w 30°C przez 72 godziny w 10 mL 50 mM buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 5,2 i w 10 mL 50 mM buforu fosforanowego o pH 8, 110 mg sacharynianu z podstawnikiem propylowym. Roztwory użytkowe nasycone sacharynianem 3-heksylo-1-[(1R,2S,5/?)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowym, sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-nonyloimidazoliowym, sacharynianem 3-dodecylo-1 -[(1 R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowym oraz sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowym uzyskano kontaktując w 30°C 50 mM bufor fosforanowo-cytrynianowy o pH 5,2 i 50 mM bufor fosforanowy o pH 8 z sacharynianami z podstawnikami heksylowym, nonylowym, dodecylowym i tetradecylowym w stosunku objętościowym 1:1, całość 5-krotnie intensywnie mieszano w ciągu pierwszej doby i pozostawiono na kolejnych 48 godzin. Po 72 godzinach inkubacji wszystkie otrzymane mieszaniny odwirowano przez 10 min przy 8000 rpm, uzyskując roztwory użytkowe o stężeniach optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych podanych w Tabeli 3.
Tabela 3
Procentowa aktywność lakazy i lipazy w roztworach użytkowych nasyconych optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi, [R-lm-CH2OMentol]+Sach', w odniesieniu do prób kontrolnych (za 100% przyjęto wyniki uzyskane dla roztworów bez soli imidazoliowej).
| Optycznie czynny sacharynian imidazoliowy [R-Ini-CHiOMeiitoirSaclr | Lakaza (pH 5,2) | Lipaza (pH 8,0) | ||
| Stężenie sacharynianu iinidazoliowcgo w roztworze użytkowym [mM] | Aktywność enzymu [%] | Stężenie sacliaiynianu iinidazoliowcgo w roztworze użytkowym ’[mM] | Aktywność enzymu [%] | |
| sacharynian 1-((17^,2^,57^)-(-)mentoksy metylo] -3 metyloimidazoliowy [CH34m-CH:OMenloirSach- | 51,1 | 138,2 | 55.9 | 147,4 |
| sacharynian 1 -[(1A.2S'. 5/()-(-)mentoksy metylo] -3 propy lorrnrdazoliowy |C5H7-Im-CH2OMentoirSach- | 22,5 | 145,8 | 23,2 | 155,9 |
| sacharynian 3-heksylo-l[(1Λ,25,5Λ)-(-)inentoksymeiylo]iniidazoliowv [C6Hn -Im-CHjOMentoll +Sach‘ | 8,0 | 175,4 | 6,8 | 167,6 |
| sacharynian 1-((12(,25,5/()-(-)rnentoksy metylo] -3 nonyloimidazoliowy [ C,H lę-Iin-CH iOMentol] +Sach' | 3,8 | 97,6 | 5,8 | 104,7 |
| sacharynian 3-dodecylo-l[(1/(,25,5/()-(-)mentoksy mety lo |irnidazoliowy [C uHM-Im-CH jOMento 1 ] *Sach | 2.5 | 94,5 | 2.5 | 98,0 |
| sacharynian 1-((1/(,25,5/()-(-)mentoksy metylo] -3 tctradccyloimidazoliowy [ C HHii-Im-CHrOMentol] łSadr | 4,5 | 78,0 | 7,8 | 74,1 |
PL 236 589 Β1
Uzyskane roztwory użytkowe o pH 5,2 i pH 8 nasycone optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi z łańcuchami alkilowymi od metylowego do dodecylowego zwiększały aktywność enzymów nawet o 75% w przypadku lakazy i 68% dla lipazy w przypadku sacharynianu 3-heksylo-1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowego {[C6Hi3-lm-CH2OMentol]+Sach} w stężeniu 8 mM. Sacharynian 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowy {[Ci4H29-lm-CH2OMentol]+Sach } w stężeniu 4,5 mM w roztworze użytkowym o pH 5,2 i 7,8 mM w roztworze użytkowym o pH 8 powoduje niewielki spadek aktywności obu badanych enzymów.
Przykład 4
Stabilność lakazy z Cerrena unicolor, lipazy z Pseudomonas cepacia i trypsyny z trzustki bydlęcej w roztworach użytkowych nasyconych substancjami aktywnymi, [R-lm-CH2OMentol]+Sacfr, oraz czystość mikrobiologiczna roztworów użytkowych z enzymem po 144 h inkubacji.
Roztwory użytkowe nasycone sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-metyloimidazoliowym uzyskano inkubując w 30°C przez 72 godziny w 10mL50 mM buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 5,2 i w 10 mL 50 mM buforu fosforanowego o pH 8, 250 mg sacharynianu z podstawnikiem metylowym, a także 10 mL 50 mM buforu boranowego o pH 8 z 220 mg sacharyniau z podstawnikiem metylowym. Roztwory użytkowe nasycone sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-propyloimidazoliowym uzyskano inkubując w 30°C przez 72 godziny w 10 mL 50 mM buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 5,2 i w 10 mL 50 mM buforu fosforanowego o pH 8, 110 mg sacharynianu z podstawnikiem propylowym, a także 10 mL 50 mM buforu boranowego o pH 8 z 100 mg sacharynianu z podstawnikiem propylowym. Roztwory użytkowe nasycone sacharynianem 3-heksylo-1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowym, sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-nonyloimidazoliowym, sacharynianem 3-dodecylo-1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]imidazoliowym oraz sacharynianem 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-tetradecyloimidazoliowym uzyskano kontaktując w 30°C 50 mM bufor fosforanowo-cytrynianowy o pH 5,2, 50 mM bufor fosforanowy o pH 8 oraz 50 mM bufor boranowy o pH 8 z sacharynianami z podstawnikami heksylowym, nonylowym, dodecylowym i tetradecylowym w stosunku objętościowym 1:1, całość 5-krotnie intensywnie mieszano w ciągu pierwszej doby i pozostawiono na kolejnych 48 godzin. Po 72 godzinach inkubacji wszystkie otrzymane mieszaniny odwirowano przez 10 min przy 8000 rpm, uzyskując roztwory użytkowe o stężeniach sacharynianów imidazoliowych podanych w Tabeli 4.
Tabela 4
Procentowa stabilność lakazy i lipazy po 6 dniach inkubacji w 30°C w roztworach użytkowych o pH 5,2 i pH 8 nasyconych optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi, [R-lm-CH2OMentol]+Sach', w odniesieniu do prób kontrolnych (za 100% przyjęto wyniki uzyskane dla roztworów bez soli imidazoliowej).
| Optycznie czynny sacharynian imidazoliowy |R-lmCBjOMentcl]+Sach· | Lakaza (pH 5,2) | Lipaza (pH 8,0) | Trypsyna (pH 8.0) | |||
| Stężenie sacharynianu imidazoliowego w roztworze użytkowym [mM] | Stabilność enzymu [%] | Stężenie sacharynianu imidazoliowego w roztworze użytku wyru [mM] | Stabilność enzymu [%] | Stężenie sacharynianu imidazoliowego w roztworze użytkowym [mM] | Stabilność enzymu [%] | |
| sacharynian 1[(1Λ2$,5Λ)-(-)nientoksymetylo] -3 me ty loimidazoliowy [CHj-ImCHjOMentolTSach' | 51,1 | 18.0 | 55.9 | 22,3 | 50,4 | 158,0 |
| sacharynian 1[(12?,2S,5i)-(-)mentoksy metylo] -3 propy loimidazoliowy ’ [C3H7-Im- CHiOMentcirSach’ | 22,5 | 38,3 | 23,2 | 46,2 | 21,6 | 113,6 |
| sacharynian 3-heksvlo-l[(1Λ.2Χ,5Λ)-(-)- nientoksymetylojimidazoliowy [CeHu-ImCILOMetilciySach | 8,0 | 60.5 | 6,8 | 102,2 | 5,1 | 154,5 |
| sacharvnian 1- [(1Λ.2ίΐ.5Λ)-(-)mentoksymetylo] -3 nony loimidazoliowy [C»Hi9-IinCH;OMentcirSach- | 3,8 | 35,7 | 5,8 | 107,5 | 1,2 | 211.1 |
PL 236 589 Β1
| sacharynian 3-dodccylol-[(12i,2S,5/i)-(-)mentoksymetylo]imidazoliowy [CizHh-IuiCHiOMcntcl PSach | 2,5 | 50.4 | 2,5 | 108.5 | 0,5 | 175,2 |
| sacharynian 1[(lR,2S,5A)-(-)mcntoksy metylo]-3Ictradccj· loimidazoliowy [CiłHjg-linCIWMentolTSach- | 4,5 | 77.8 | 7,8 | 125,8 | 0,9 | 160,7 |
Do 3 mL każdego z uzyskanych roztworów użytkowych o pH 5,2 dodano 100 μί lakazy (aktywność właściwa 170 U/mg), do 3 mL uzyskanych roztworów użytkowych buforu fosforanowego o pH 8 dodano 100 μί lipazy (aktywność właściwa 830 U/mg), a do 3 mL uzyskanych roztworów użytkowych buforu boranowego pH 8 dodano 100 μί trypsyny (aktywność właściwa 15 U/mg). Mieszaniny inkubowano przez 144 godziny w 30°C i oznaczano aktywność obu enzymów w ustalonych odstępach czasowych. Po 6 dniach inkubacji w warunkach niesterylnych, pobierano 100 μί enzymu w przygotowanych roztworach użytkowych o pH 5,2 lub pH 8, rozcieńczano 1, 10, 100, 1000, 10 000 razy sterylnym płynem fizjologicznym i wysiewano 50 μί próbki na standardowych stałych pożywkach odpowiednich do wzrostu bakterii (LB Agar) lub grzybów (Potato Dextrose Agar). Hodowle inkubowano w 30°C, po 2 dniach zliczono liczbę kolonii bakteryjnych, a po 4 dniach liczbę kolonii grzybiczych. W Tabelach 4 i 5 przedstawiono wyniki wyrażone jako procentowe wartości badanych parametrów w odniesieniu do prób kontrolnych nie zawierających soli imidazoliowych.
Tabela 5
Procentowa liczba kolonii bakteryjnych i grzybiczych po 6 dniach inkubacji w 30°C lakazy i lipazy w roztworach użytkowych o pH 5,2 i pH 8 nasyconych optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi, [R-lm-CH2OMentol]+Sach', w odniesieniu do prób kontrolnych (za 100% przyjęto wyniki uzyskane dla roztworów bez soli imidazoliowej).
| Optycznie czynny sacharynian imidazoliowy (R-ImCH2OMentolj+Sach' | Lakaza (pH 5,2) | Lipaza (pH 8.0) | Trypsyna (pH 8,0) | ||||||
| Stężenie sachatynianu imidazoliowego fmM] | Liczba kolonii bakteryjnych [%] | Liczba kolonii grzybiczych |%] | Stężenie sacbaryniann imidazoliowcgo [mM] | Liczba kolonii bakteryjnych |%] | Liczba kolonii grzybiczych [%] | Stężenie sacharyniann iinidazoliowcgo [mM] | Liczba kolonii bakteryjnych [%] | Liczba kolonii grzybiczych l%] | |
| sacharynian 1- [(1Λ,25,5Λ)-(-)mentoksy metylo| -3 mctyloimidazoliowy ' [CHrlmCHjOMentol PSach | 51,1 | brak | brak | 55.9 | brak | brak | 50,4 | brak | brak |
| sacharynian 1[(1Λ.25,5Λ)-Ηmentoksy metylol -3 propyloimidazoliowy [CjH-lmCHzOMetitolTSactr | 22.5 | brak | brak | 23,2 | brak | brak | 21,6 | brak | brak |
| sacharynian 3heksvlo-l- [(lfi,2S,5fi)-( ) mentoksymetylo]imidazoliowy [CtHn-Im- CH?OMctilol]+Saclr | 8,0 | brak | brak | 6,8 | brak | brak | 5,1 | brak | brak |
| sacharynian 1[(lfl,2S,57?)-(-)mentoksy metylo] -3 nonyloi midazoliowy ' |C,H19-Im- CHzOMentolpSach- | 3,8 | 0,002 | brak | 5,8 | 0.359 | brak | 1,2 | brak | 0,025 |
| sacharynian 3dodecvlo-l](1K,2.<5W)-Mmentoksymetylojimidazoliowy [CnHjs-ImCH2OMentol]+Sach | 2,5 | 0,018 | 0,014 | 2,5 | 3.003 | 0,003 | 0,5 | 0,029 | 1,070 |
PL 236 589 Β1
| sacharynian 1[C menloks.ytnclylo|-3tctradccyloiuiidazo liowy | C uHjfł-Ini- CHjOMcntollSaclr | 4,5 | 0,291 | 0,043 | 7.8 | 6,097 | 0.017 | 0.9 | 0.005 | 0,013 |
Uzyskane roztwory użytkowe o pH 5,2 nasycone optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi w stężeniach 2,5-51,1 mM powodują spadek stabilności lakazy w przypadku każdego związku {[R-lm-CH2OMentol]+Sach }, co wyklucza ich stosowanie jako stabilizatorów lakazy podczas biotechnologicznych procesów długoterminowych. Sacharynian 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-metyloimidazoliowy w stężeniu 55,9 mM oraz sacharynian 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-propyloimidazoliowy w stężeniu 23,2 mM w roztworach użytkowych o pH 8 powodują znaczny spadek stabilności lipazy względem enzymu inkubowanego w roztworze bez soli imidazoliowej. Roztwory użytkowe o pH 8 nasycone optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi z podstawnikami alkilowymi od heksylowego do tetradecylowego powodują wzrost stabilności lipazy do 126% po 6 dniach inkubacji w 30°C względem enzymu inkubowanego w tym samym czasie bez dodatku substancji aktywnej, stąd nasycone roztwory użytkowe z powyższymi sacharynianami mogą mieć zastosowanie podczas długoterminowych biotransformacji z wykorzystaniem lipaz. Roztwory użytkowe nasycone optycznie czynnymi sacharynianami imidazoliowymi {[R-lm-CH2OMentol]+Sach} powodują znaczący wzrost stabilności trypsyny. Sacharynian 1-[(1R,2S,5R)-(-)-mentoksymetylo]-3-nonyloimidazoliowy powoduje wzrost stabilności trypsyny do 211% w stężeniu 1,2 mM oraz działa bakteriobójczo i grzybostatycznie, co wskazuje na jego zastosowanie jako stabilizatora trypsyny podczas biotechnologicznych procesów długoterminowych. W niespecyficznych testach mikrobiologicznych, czyli przy braku sterylności podczas długoterminowej inkubacji roztworów użytkowych o pH 5,2 i pH 8 wykazano pełną bakterioi grzybobójczość soli imidazoliowych z podstawnikiem alkilowym od metylowego do heksylowego w stężeniach 5,1-55,9 mM, dlatego związki te mogą mieć zastosowanie jako dezynfektanty. Optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy 9 {[C9Hi9-lm-CH2OMentol]+Sach}, 12 {[Ci2H25-lm-CH2OMentol]+Sach } i 14 {[Ci4H29-lm-CH2OMentol]+Sach } węglowy wykazują działanie bakteriostatyczne i grzybostatyczne w roztworach użytkowych o pH 5,2 i pH 8, dzięki czemu znacząco ograniczają wzrost mikroorganizmów podczas długoterminowych procesów i mogą być stosowane jako stabilizator lipazy oraz trypsyny o pH 8.
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zastosowanie optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych zawierających pochodną optycznie czynnego (1R,2S,5R)-(-)-mentolu, o wzorze ogólnym [R-lm-ChLOMentoIpSaclr, w którym R oznacza grupę alkilową CnH2n+i, gdzie n wynosi 1,3, 6, 9, 12 oraz 14 do aktywacji i stabilizacji enzymów z grupy oksydoreduktaz oraz hydrolaz w szczególności lakazy, lipazy lub trypsyny w roztworach białkowych.
- 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do aktywacji lakazy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od metylowego do nonylowego w stężeniu 2,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od metylowego do heksylowego w stężeniu 8,0-51,1 mM.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do aktywacji lipazy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od propylowego do dodecylowego w stężeniu 2,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od metylowego do nonylowego w stężeniu 5,8-55,9 mM.
- 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do aktywacji trypsyny stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od heksylowego do tetradecylowego w stężeniu 0,5 mM.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do stabilizacji lipazy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od metylowego do tetradecylowego w stężeniu 2,5 mM oraz optycznie czynne sacharynianyPL 236 589 Β1 imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od heksylowego do tetradecylowego w stężeniu 2,5-7,8 mM.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że do stabilizacji trypsyny stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od metylowego do dodecylowego w stężeniu 0,5 mM oraz optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe zawierające łańcuch alkilowy od metylowego do tetradecylowego w stężeniu 0,9-50,4 mM.
- 7. Zastosowanie optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych zawierających pochodną optycznie czynnego (1R,2S,5R)-(-)-mentolu o wzorze ogólnym [R-lm-ChLOMentoipSaclr, w którym R oznacza grupę alkilową CnH2n+i, gdzie n wynosi 1,3, 6, 9, 12 oraz 14, jako środków biobójczych, obejmujących działanie bakterio- i grzybobójcze oraz bakterio- i grzybostatyczne.
- 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że jako środek grzybobójczy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od metylowego do nonylowego w stężeniu 2,5-55,9 mM.
- 9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że jako środek bakteriobójczy stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 o długości łańcucha alkilowego od metylowego do heksylowego w stężeniu 6,8-55,9 mM.
- 10. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że jako środek bakterio- i grzybostatyczny stosuje się optycznie czynne sacharyniany imidazoliowe określone w zastrz. 1 w stężeniu 0,5 mM.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL420446A PL236589B1 (pl) | 2017-02-10 | 2017-02-10 | Zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych w enzymologii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL420446A PL236589B1 (pl) | 2017-02-10 | 2017-02-10 | Zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych w enzymologii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL420446A1 PL420446A1 (pl) | 2017-12-04 |
| PL236589B1 true PL236589B1 (pl) | 2021-01-25 |
Family
ID=60473223
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL420446A PL236589B1 (pl) | 2017-02-10 | 2017-02-10 | Zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych w enzymologii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236589B1 (pl) |
-
2017
- 2017-02-10 PL PL420446A patent/PL236589B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL420446A1 (pl) | 2017-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wen et al. | Assessing the toxicity and biodegradability of deep eutectic solvents | |
| Caillier et al. | Polymerizable semi-fluorinated gemini surfactants designed for antimicrobial materials | |
| Kanazawa et al. | Synthesis and antimicrobial activity of dimethyl-and trimethyl-substituted phosphonium salts with alkyl chains of various lengths | |
| Schaffran et al. | Toxicity of N, N, N-trialkylammoniododecaborates as new anions of ionic liquids in cellular, liposomal and enzymatic test systems | |
| Lukáč et al. | Synthesis and antimicrobial activity of a series of optically active quaternary ammonium salts derived from phenylalanine | |
| WO2008092688A1 (en) | Disinfectant formulations containing quaternary ammonium compounds and hydrogen peroxide | |
| Vera et al. | Comparative effects of technical-grade and a commercial formulation of glyphosate on the pigment content of periphytic algae | |
| US4166122A (en) | Bis-(5,5-dimethyl-1,3-oxazolidin-3-yl) methane as an antimicrobial agent | |
| EP0900015B1 (en) | Fungicide salts | |
| PL236589B1 (pl) | Zastosowania optycznie czynnych sacharynianów imidazoliowych w enzymologii | |
| AU2010266055B2 (en) | Use of monochlorourea to treat industrial waters | |
| NO171591B (no) | Forbindelse, biocid blanding og anvendelse | |
| Swiontek Brzezinska et al. | The influence of polyhexamethylene guanidine derivatives introduced into polyhydroxybutyrate on biofilm formation and the activity of bacterial enzymes | |
| US20100144877A1 (en) | Synergistic Enhancement of Calcium Propionate | |
| Thebault et al. | Surface and antimicrobial properties of semi-fluorinated quaternary ammonium thiol surfactants potentially usable for self-assembled monolayers | |
| CN104619688B (zh) | 抗微生物化合物 | |
| US20130261148A1 (en) | Protected antimicrobial compounds for high temperature applications | |
| PT99043B (pt) | Processo para a preparacao de composicoes biocidas contendo derivados de 4,5-polimetileno-4-isotiazolin-3-onas | |
| JP2020129976A (ja) | Ａｈｌラクトナーゼ活性測定方法及び水処理方法 | |
| RU2793332C2 (ru) | Дезинфицирующее средство на основе четвертичного аммониевого соединения "изобак" | |
| PL229834B1 (pl) | Chiralne ciecze jonowe z anionem salicylanowym, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie | |
| US9617278B2 (en) | Antimicrobial compounds | |
| Kusumahastuti et al. | Antibacterial Activity of 24 L-Phenylalanine Derived Surface-Active Ionic Liquids (SAILs) Towards Two Clinically Relevant Pathogens | |
| RU2748418C1 (ru) | Борорганические производные моноэтаноламина, обладающие антимикробной активностью | |
| Fait et al. | Green Molecules on Red Alert: Amino Acid‐Based Surfactants as Sustainable Antimicrobials Against Biofilms |