PL236218B1 - Zastosowanie kompozycji probiotycznej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji probiotycznej do wspomagania leczenia zapalenia jelit.

Wrzodziejące zapalenie jelit, zwane również WZJ, jest przewlekłym procesem zapalnym błony śluzowej jelita o nieustalonej etiologii. Przypuszcza się, że wspólny wpływ na rozwój schorzenia mają czynniki genetyczne, środowiskowe i immunologiczne. Obserwując odpowiedź immunologiczną osób chorych na wrzodziejące zapalenie jelit, zauważono, że dominuje u nich populacja limfocytów Th2 produkujących różne interleukiny IL-4,IL-5,IL-6,IL-10. U tych osób poziomy cytokin prozapalnych TNF-α, IL- 1β, IL-8J, IL-12 przeważają nad poziomami cytokin o działaniu przeciwzapalnym IL1ra, IL-4, IL-10, IL-13.

Zauważono także, że mikroflora bakteryjna (mikrobiota) jelita u osób chorych na wrzodziejące zapalenie jelit różni się jakościowo i ilościowo od flory bakteryjnej osób zdrowych.

W leczeniu chorych z wrzodziejącym zapaleniem jelit stosuje się cztery grupy leków:

- leki należące do grupy aminosalicylanów, takie jak mesalazyna, wykazują one działania niepożądane takie jak bóle brzucha, nudności, objawy alergiczne,

- glikokortykosteridy, leki z tej grupy nie zawsze powodują poprawę stanu pacjenta, a mogą prowadzić do steroidozależności,

- leki immunosupresyjne, mogą wywoływać zaburzenia hematologiczne,

- ostatnio wprowadzono do leczenia WZJ tzw. leki biologiczne, czyli przeciwciała monoklonalne przeciwko cytokinom prozapalnym.

Znana jest z polskiego opisu patentowego pat. 209430 kompozycja probiotyczna i zastosowanie kompozycji probiotycznej.

Opis patentowy nr 209430 ujawnia kompozycję probiotyczną zawierającą co najmniej dwa szczepy bakterii kwasu mlekowego wybrane z grupy • składającej się z Lactobacillusrhamnosus KL 53A PCM B/00011, Lactobacillus plantarum PL02 PCM B/00012 i Bifidobacterium longum PL03 PCM B/00013. Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji probiotycznej zawierającej co najmniej dwa szczepy bakterii kwasu mlekowego wybrane z grupy składającej się z Lactobacillus rhamnosus KL 53A, Lactobacillus plantarum PL02 i Bifidobacterium longum PL03, do wytwarzania preparatu użytecznego w profilaktyce i leczeniu patologicznych stanów przewodu pokarmowego będącego wynikiem braku właściwej flory bakteryjnej.

Bakterie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium wchodzące w skład kompozycji pochodzą z przewodu pokarmowego zdrowych noworodków karmionych mlekiem matki. Szczepy zostały zdeponowane zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk, 53-114 Wrocław, ul Rudolfa Weigla 12. Depozyty złożono w dniu 16.06.2005 r. Depozytom nadano numery:

Lactobacillus rhamnosus KL53A - numer depozytu - B/00011,

Lactobacillus plantarum PL02 - numer depozytu - B/00012, Bifidobacterium longum PL03 - numer depozytu - B/00013.

Szczepy ujawnione w tej kompozycji zastosowano w suplementach diety dla poprawienia składu flory bakteryjnej przewodu pokarmowego.

Prowadząc dalsze badania kompozycji będącej przedmiotem patentu nieoczekiwanie wykryto w badaniach klinicznych, że kompozycja zawierająca opisane szczepy podawana doustnie chorym z aktywną postacią wrzodziejącego zapalenia jelit powodowała złagodzenie objawów choroby w obserwacjach klinicznych oraz zmniejszenie stanu zapalnego śluzówki jelita stwierdzane w obrazach anatomopatologicznych wycinków jelita. Nieoczekiwanie stwierdzono, że szczepy wchodzące w skład kompozycji probiotycznej nie tylko przywracają właściwą florę bakteryjną ale wpływają na odpowiedź immunologiczną w szczególności na profil cytokinowy.

Istotą wynalazku jest zastosowanie kompozycji probiotycznej, zawierającej trzy szczepy bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus KL 53A, Lactobacillus plantarum PL02 i Bifidobacterium longum PL03, wykazującej zdolność wpływania na profil cytokinowy do wytwarzania preparatu użytecznego w profilaktyce i leczeniu stanu zapalnego jelit.

Opis szczepów wchodzących w skład mieszaniny.

I. Badania zdolności produkcji enzymów antyoksydacyjnych o charakterze przeciwzapalnym przez szczepy probiotyczne.

PL 236 218 Β1

W celu wykazania działania antyoksydacyjnego badanych szczepów bakterii probiotycznych, najpierw przeprowadzono doświadczenia nad produkcją przez nie aktywnych form tlenu na przykładzie nadtlenku wodoru, a następnie nad wykazaniem ich zdolności do jego rozkładu.

1.1 . Pomiar produkcji nadtlenku wodoru przez wybrane szczepy probiotyczne.

Do pomiaru produkcji nadtlenku wodoru przez badane szczepy probiotyczne wykorzystano testy paskowe firmy Merck, które zmieniały intensywność zabarwienia w zależności od ilości nadtlenku wodoru uwalnianego do płynnych hodowli tych bakterii. Barwę porównywano z odpowiednią skalą kolorymetryczną pozwalającą jednocześnie na wyliczenie przybliżonej wartości wyprodukowanego nadtlenku wodoru. Wynik podano w Tabeli 1.

Tabela 1. Produkcja nadtlenku wodoru (mg/l) przez szczepy probiotyczne z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium.

Szczepy	Po 4 godzinach inkubacji	Po 24 godzinach inkubacji
Lactobacillus rhamnosus KL53 A	0	0
Lactobacillus plantarum PL02	0	0
Bifidobacterium longum PL03	0	0
Kontrola ujemna - bulion MRS	0	0

W oparciu o powyższe wyniki wykazano, iż badane szczepy probiotyczne nie produkowały nadtlenku wodoru.

I.2 Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru.

Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru został przeprowadzony za pomocą dwóch metod tj. w oparciu o test paskowy firmy Merck (test kolorymetryczny zmieniający intensywność zabarwienia w zależności od ilości H2O2) oraz z wykorzystaniem odczynnika Amplex® Red Catalase Assay Kit firmy Molecular Probes (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), który w obecności nadtlenku wodoru przechodzi w formę utlenioną. Forma utleniona barwnika pod wpływem światła fluorescencyjnego o długości 590 nm uwalnia światło, którego intensywność jest mierzona za pomocą odpowiedniego czytnika fluorescencyjnego.

Tabela 2. Oznaczenie kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przez badane szczepy Lactobacillus i Bifidobacterium w oparciu o metodę paskową.

Badane szczepy	0 min.	30 min.	60 min.	90 min.	120 min.	150 min.	180 min.	210 min.	24 godz.
Ilość nadtlenku wodoru (mg/l)
Lactobacillus rhamnosus KL53A	30	10	10	3	0	0	0	0	0
Lactobacillus plantarum PL02	30	30	30	10	0	0	0	0	0
Bifidobacterum longum PL03	30	30	30	30	30	30	30	30	0
Kontrola bulion MRS	30	30	30	30	30	30	30	30	30
Kontrola bulion BL	30	30	30	30	30	30	30	10	0

Tabela 3. Pomiar kinetyki rozkładu H2O2 przez szczepy z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium poprzez oznaczanie aktywności katalazy.

Szczepy	Kinetyka rozkładu H2O2 Test Amplex Red; intensywność fluorescencji przy długości fali 590nm po czasie inkubacji:
1 godz.	4 godz.	20 godz.
Bifidobacterium longum PL03	5 774	12 741	45 935
Lactobacillus rhmnosus KL53A	24 233	48 213	34 132
Lactobacillus plantarum PL02	17 546	39 808	2 934

PL 236 218 Β1

Tabela 4. Wyniki pomiaru kinetyki rozkładu H2O2 dla najbardziej aktywnego szczepu probiotycznego Lactobacillus plantarum PL02 poprzez oznaczanie aktywności katalazy.

Szczep	Wynik pomiaru fluorescencji w czasie początkowym badania (odczyt A)	Wynik pomiaru fluorescencji w czasie końcowym badania (odczyt B)	Spadek intensywności fluorescencji pomiędzy czasem początkowym a końcowym Stosunek A: B
Lactobacillus plantarum PL02	17 546	2 934	5.98

Na podstawie pomiarów kinetyki rozkładu wodoru w oparciu o test paskowy oraz z wykorzystaniem zestawu Amplex® Red, można stwierdzić, iż szczególną zdolność rozkładu nadtlenku wodoru posiada szczep Lactobacillus plantarum PL02. Badany szczep z rodzaju Bifidobacterium nie wykazał zdolności do rozkładu chemicznie czystego nadtlenku wodoru.

II. Badanie wpływu wybranych szczepów probiotycznych na poprawę funkcji bariery jelitowej poprzez stymulację produkcji białek połączeń ścisłych (tight junctions), w szczególności okludyny oraz zonuliny (ZO-1).

Badania przeprowadzono na następujących szczepach bakterii probiotycznych: Lactobacillus plantarum PL02, Lactobacillus rhamnosus KL53A, Bifidobacterium longum PL03 przy zastosowaniu przeciwciał anty-okludyna i anty-zonulina znakowanych fluoresceiną. Badane szczepy inkubowano z komórkami jelitowych linii tkankowych. Intensywność świecenia była obserwowana w mikroskopie fluorescencyjnym przy długości fali: wzb. 494 nm - emi. 520 nm., pod powiększeniem 400x, a intensywność świecenia oceniano w skali półilościowej. Wyniki badań umieszono w Tabeli 5.

Tabela 5. Zestawienie wyników oddziaływania wybranych szczepów probiotycznych na stymulację produkcji białek połączeń ścisłych okludyny i zonuliny (ZO-1) wytwarzanych pomiędzy komórkami linii tkankowych Caco-2 i HT-29.

Badane szczepy	Tkanka Caco-2	Tkanka HT-29
Okludyna	Zonulina ZO-1	Okludyna	Zonulina ZO-1
L. rhamnosus KL53A	+++	++/+++	+-H-	+
L. plantarum PL02	+++	++	+	-
B. longum PL03	++	+	+	-
Kontrola ujemna: Enteropatogenny szczep E.coli (EPEC)	-	-	-	-

Intensywność świecenia oceniana w skali półilościowej:

- brak świecenia (brak tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami) + słabe świecenie (niski poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) ++ silne świecenie (wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) +++ bardzo silne świecenie (bardzo wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych)

Wykazano wybitne działanie szczepu L. rhamnosus KL53 A stymulujące produkcję białek połączeń ścisłych przez komórki linii nabłonkowych jelita i nieco słabsze działanie pozostałych dwóch szczepów wchodzących w skład kompozycji.

III. Badania produkcji wybranych cytokin przez komórki nabłonka stymulowane przez bakterie probiotyczne.

Badano szczepy bakteryjne: Lactobacillus plantarum PL 02, Lactobacillus rhamnosus KL 53A, Bifidobacterium longum PL 03. Kontrolę dla produkcji cytokin przez komórki nabłonkowe stanowiły bakterie Gram-ujemne: enteropatogenny szczep Escherichia coli 545/00/2B EPEC. Wybrane bakterie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium były hodowane w 10 ml płynnego podłoża MRS przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, liczba komórek w hodowlach

PL 236 218 B1 szczepów została sprawdzona za pomocą metody rozcieńczeń dziesiętnych. Szczep E.coli hodowano na bulionie Mueller-Hintona w warunkach tlenowych przez 24 godziny w temp. 37°C, a następnie mierzono gęstość hodowli metodą seryjnych rozcieńczeń na tym samym podłożu.

Badane komórki.

Hodowlę komórek linii Caco-2 prowadzono przez okres 15 dni w podłożu DMEM (IITD, Wrocław) z dodatkiem 10% płodowej surowicy wołowej (FBS, Sigma) na płytkach hodowlanych 24-dołkowych (TPP, Switzerland) w atmosferze o zwiększonej wilgotności, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 i w temperaturze 37°C. Płyn hodowlany wymieniano co 48 godzin. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu jednowarstwowego komórki dwukrotnie przepłukiwano PBS (IITD, Wrocław), przesiewano i następnie poddawano kontaktowi z badanymi bakteriami. Osobno przeprowadzano obliczenie gęstości komórek. W tym celu tkanka w dwóch dołkach została poddana trawieniu trypsyną przez 10 min. w temperaturze pokojowej. Następnie zawiesinę komórek przenoszono do probówek i wirowano 10 min. przy 5000 obr/min. Komórki zawieszano w podłożu hodowlanym. W celu barwienia komórek mieszano zawiesinę z błękitem trypanu w stosunku objętości 1:10, a następnie komórki zliczano w komorze Burkera. Gęstość komórek stosowanych w badaniach wynosiła 1x106 CFU/ml.

III.1 Stymulacja komórek przez badane bakterie.

Szczepy bakterii Lactobacillus i Bifidobacterium po ustaleniu liczby ich komórek w ml (c.f.u./ml) były dwukrotnie przepłukiwane PBS o pH 7,4 i zawieszane w PBS o gęstości 108 CFU/ml. Szczep kontrolny E. coli został przygotowany w formie zawiesiny o takiej samej gęstości. Ponadto przygotowano zawiesiny tych samych bakterii o gęstości 107 i 108 CFU/ml, które zabijano przez tyndalizację poddając je dwukrotnej inaktywacji ciepłem w łaźni wodnej o temperaturze 65°C przez 2 godziny. W badaniach stosowano 108 martwych bakterii. Do czasu przeprowadzenia doświadczeń nad produkcją cytokin, bakterie były przechowywane w temp. -70°C w stanie zamrożenia. Komórki linii Caco-2 były poddawane stymulacji badanymi bakteriami przez 24 godziny. Po tym czasie uzyskiwano supernatanty hodowli stymulowanych komórek Caco-2 i kontrolnych komórek nie stymulowanych bakteriami przez wirowanie przy 5000 obr/min przez 25 minut i odciągnięcie płynu znad osadu.

III. 2 Pomiar poziomu uwalniania cytokin przez komórki Caco-2 pod wpływem bakterii.

Supernatanty hodowli zebrane znad komórek Caco-2 po kontakcie z badanymi bakteriami przechowywano w temperaturze -80°C do czasu wykonania pomiarów. Po rozmrożeniu próbki wirowano (5000 obr/min. przez 5 min., 4°C) i poddawano analizie. W celu przeprowadzenia oznaczenia użyto komercyjnych zestawów do testu ELISA dla ludzkich cytokin:

- TNF-α (BD OptElA™ Set Human - Cat. No. 555212),

- IL-6 (BD OptElA™ Set Human - Cat. No. 555220),

- IL-8 (BD OptElA™ Set Human - Cat. No. 555244),

- IL-10 (BD OptElA™ Set Human - Cat. No. 555157).

Test ELISA przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Płytki 96-dołkowe opłaszczano przeciwciałami przeciwko ludzkim: TNF-α, IL-6, IL-8 i IL-10 rozcieńczonymi w stosunku 1: 250 w buforze opłaszczającym (0,1M węglan sodu, pH 9.5) po 100 μl na dołek. Płytki inkubowano w temperaturze 4°C przez noc, a następnie płukano trzykrotnie (300 μl na dołek) buforem płuczącym (PBS 1x, 0,05% Tween 20). Następnie dodawano po 200 μl bufora blokującego na dołek (PBS 1x, 10%FBS) i inkubowano w temperaturze pokojowej, przez okres 1 godziny. Po ponownym, trzykrotnym płukaniu buforem płuczącym, na płytkę nakładano po 100 μl badanych pożywek oraz próbek standardowych zawierających cytokiny o znanym stężeniu:

- TNF-α (7,8 pg/ml- 500 pg/ml),

- IL-6 (4,7 pg/ml- 300 pg/ml),

- IL-8 (3,1 pg/ml- 200 pg/ml),

- IL-10 (7,8 pg/ml- 500 pg/ml).

Po dwu godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej, płytkę płukano pięciokrotnie buforem płuczącym. W następnym etapie dodawano zawieszone w buforze blokującym biotynylowane przeciwciała rozpoznające ludzkie cytokiny w odpowiednim stężeniu:

- TNF-α 1:250,

- IL-6 1:250,

- IL-8 1:500,

PL 236 218 Β1

-IL-10 1:500, oraz roztworów koniugatu streptawidyny z enzymem peroksydazą chrzanową (w rozcieńczeniu 1:250). Inkubacja trwała 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Ostatecznie, po siedmiokrotnym płukaniu płytki buforem płuczącym, do każdego dołka dodawano po 100 μΙ roztworu substratu dla peroksydazy chrzanowej (BD OptElA™ TMB Substrate Reagent Set). Inkubacja przeprowadzana była w ciemności przez 30 minut. Reakcję zatrzymywano poprzez dodawanie do każdej studzienki po 50 μΙ 2M kwasu siarkowego. Absorbancję mierzono przy dwóch długościach fali, właściwej 450 nm oraz korekcyjnej 570 nm.

Wyniki przedstawiono w postaci rycin i tabel.

Wyniki oznaczeń bakterii żywych w dawce 10⁸ CFU/ml przedstawiono na Fig. 1 do Fig. 4.

K— kontrola ujemna

E. c - Escherichia coli

KL53A - Lactobacillus rhamnosus KL 53A

PL02 - Lactobacillus plantarum PL 02

PL03 - Bifidobacterum longum PL 03 w porównaniu do 8 innych szczepów bakterii probiotycznych: KL57A, KL57B, KL57C, 78B, PB01, PB02, PB03, PB04.

Rycina 111/1. Wyniki oznaczania cytokiny IL-8

Rycina III/2. Wyniki oznaczania cytokiny IL-6

Rycina III/3. Wyniki oznaczania cytokiny IL-10

Rycina III/4. Wyniki oznaczania cytokiny TNF-a

Wyniki oznaczeń bakterii martwych w dawce 10⁸/ml przedstawiono na Fig. 5 do Fig. 8.

Rycina III/5. Wyniki oznaczania cytokiny IL-8

Rycina III/6. Wyniki oznaczania cytokiny IL-6

Rycina III/7. Wyniki oznaczania cytokiny IL-10

Rycina III/8. Wyniki oznaczania cytokiny TNF-a

Tabela 6. Analiza proporcji pomiędzy poziomem cytokiny anty-zapalnej IL-10, a poziomami cytokin pro-zapalnych po stymulacji komórek szczepami badanych bakterii uzyskanych w badaniach nad bakteriami żywymi.

Szczepy/Cytokiny	IL-10/TNF	IL-10/1 L-6
Kontrola	0	0
Escherichia coli	0	0,094
L.fermentum 57A	0	0,057
L.plantarum 57B	0	0,83
L.gasseri 57C	0	0,46
L.rhamnosus KL53A	14,74	3,52
L.plantarum PL02	0	0
L.plantarum 78B	0	0,58
L.plantarum PB01	0	1,92
B.longum PL03	0	1,66
L.plantarum PB02	0	0,13
B.breve PB03	8,26	1,73
B.breve PB04	0	2,98

Uwaga: brak proporcji (wartość = 0) oznacza, że jedna z badanych cytokin nie była stymulowana przez analizowany szczep bakterii.

III. 3 Podsumowanie wyników badań.

1. Komórki ludzkiej linii nabłonka jelitowego reagowały na kontakt z bakteriami probiotycznymi z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium, czego efektem była mierzalna produkcja cytokin.

PL 236 218 B1

2. Bakterie żywe stymulowały produkcję cytokin wyraźniej, niż te same szczepy bakterii zabitych. Można przypuszczać, że podczas kontaktu komórek linii nabłonka jelitowego Caco-2 z żywymi bakteriami, dochodziło do namnażania tych bakterii, a to mogło wpływać na uzyskany sygnał.

3. Spośród badanych szczepów probiotycznych wchodzących w skład mieszaniny odpowiedź przeciwzapalną indukowały szczepy:

- Lactobacillus rhamnosus KL 53A, który dawał wyraźną odpowiedź komórek linii nabłonka jelitowego Caco-2,

- Bifidobacterium longum PL 03, który wykazywał działanie indukujące produkcję cytokin antyzapalnych.

IV. Przykład zastosowania.

Wynalazek zobrazowano poprzez opisanie badania klinicznego, w którym chorym z wrzodziejącym zapaleniem jelit podawano kompozycję probiotyczną.

IV.1 Opis badań klinicznych nad zastosowaniem mieszaniny szczepów.

Badania kliniczne przeprowadzono w latach 2008-2011 na grupie 67 chorych, w wieku powyżej 18 roku życia, leczonych w Klinice Gastroenterologii i Hepatologii Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. W oparciu o kryteria kliniczne do grupy badawczej wybrano 51 osób z rozpoznanym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (WZJG). Grupę kontrolną stanowiło 16 chorych z biegunkową postacią zespołu jelita nadwrażliwego. Pacjenci zostali szczegółowo poinformowani o celu i konsekwencjach badania i wyrazili na nie pisemną zgodę. Przed rozpoczęciem badania, protokół kliniczny uzyskał akceptację Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego - opinia nr KBET/5/B/2007.

IV.2 Kryteria włączenia chorych do badania.

Do badania włączeni zostali chorzy, którzy zgłosili się do Poradni Oddziału Klinicznego Kliniki Gastroenterologii i Hepatologii Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie z powodu bólów brzucha, biegunki, niekiedy z domieszką krwi, bądź też, byli wzywani na wizytę kontrolną. U chorych zostały wykonane zabiegi kolonoskopii, na początku i na końcu obserwacji. Przez okres trzech miesięcy przed zabiegiem kolonoskopii wykonywanym na początku obserwacji, pacjenci nie byli poddawani antybiotykoterapii.

IV.3 Kryteria wykluczające chorych z badania.

Z badania wykluczeni zostali: chorzy na cukrzycę, choroby autoimmunologiczne, ciężkie choroby układowe, nadużywający alkoholu, pacjenci uczuleni na białko mleka krowiego, a także przyjmujący niesteroidowe leki przeciwzapalne.

IV.4 Protokół badania.

W celu określenia aktywności WZJG u chorych objętych programem, wykonano badania, które obejmowały: przeprowadzenie wywiadu chorobowego z pacjentem ze szczególnym uwzględnieniem aktualnych objawów choroby, czasu trwania WZJG oraz liczby nawrotów objawów klinicznych w ciągu roku. Na podstawie zebranych informacji oraz oceny zmian endoskopowych w jelicie grubym, dokonanej podczas kolonoskopii, określano aktywność choroby, za pomocą wskaźnika aktywności choroby: Indeksu Kliniki Mayo (The Mayo Clinic Disease Activity Index). Zakres możliwych do uzyskania punktów wahał się od 0 do 12. Większa liczba punktów odpowiadała wyższej aktywności WZJG. Zgodnie z tą klasyfikacją za remisję kliniczną przyjmowano stan, gdy całkowity Indeks Kliniki Mayo nie przekraczał 3 punktów. Natomiast zaostrzenie objawów WZJG było definiowane wartością całkowitą Indeksu Kliniki Mayo, wynoszącą 4 punkty lub więcej.

IV. 5 Klasyfikacja chorych do poszczególnych grup badawczych w ramach wizyty kwalifikacyjnej.

Na podstawie kryteriów oceny, opisanych w protokole badania, przeprowadzonej w czasie wizyty kwalifikacyjnej, chorych przypisano do następujących grup badawczych:

Grupa I - chorzy z WZJG w stanie remisji choroby, u których wskaźnik indeksu aktywności wynosił od 0 do 3 punktów (n=21)

Grupa II - chorzy z WZJG w stanie zaostrzenia choroby, u których wskaźnik indeksu aktywności przekroczył 4 punkty (n=30)

PL 236 218 B1

Grupę III - grupa kontrolna - pacjenci z biegunkową postacią zespołu jelita nadwrażliwego (n=16).

Pacjenci zgłaszający się na badania w ramach wizyty kwalifikacyjnej, przez okres poprzedzających trzech miesięcy, nie byli poddawani antybiotykoterapii.

IV.6 Klasyfikacja chorych do poszczególnych podgrup badawczych, ze względu na podawanie preparatu probiotycznego zawierającego mieszaninę szczepów.

Jednym z założeń badania było sprawdzenie, czy podawanie preparatu probiotycznego, zawierającego mieszaninę szczepów bakterii Lactobacillus rhamnosus KL 53A PCM B/00011, Lactobacillus plantarum PL02 PCM B/00012 i Bifidobacterium longum PL03 PCM B/00013, wpływa na zmiany w mikroflorze jelita grubego w kierunku przywracania jej prawidłowego składu. Na podstawie wywiadu chorobowego oraz wszystkich przeprowadzonych badań w ramach wizyty kwalifikacyjnej, w tym kolonoskopii, pacjenci z WZJG, przypisani do grup I i II, zostali dodatkowo podzieleni na dwie podgrupy: a i b. W podgrupach a - stosowano leczenie ciprofloksacyną podawaną dożylnie, 0,2 g/dobę, 10 dni oraz mesalazyną w standardowej dawce 3,0 g/dobę w fazie aktywnej, oraz 1,5 g/ dobę w fazie nieaktywnej choroby. W podgrupach b - do leczenia takiego jak w podgrupach a, została dołączona mieszanina szczepów probiotycznych.

Pacjenci w podgrupach b, zobligowani byli do przyjmowania preparatu probiotycznego jeden raz na dobę przez okres, co najmniej 2 miesięcy. W ten sposób sprawdzono, czy przewlekłe stosowanie mieszaniny szczepów probiotycznych wpływa na przebieg WZJG czyli na nasilenie objawów oraz stan zapalny jelita. Pacjenci przypisani do grupy kontrolnej nie dostawali mieszaniny szczepów probiotycznych.

Uczestnicy badania, w przypadku których została podjęta decyzja o włączeniu do leczenia preparatu probiotycznego, zostali szczegółowo poinstruowani o sposobie i czasie przyjmowania mieszaniny szczepów probiotycznych. Na wyznaczoną kolejną wizytę, po okresie co najmniej 2 miesięcy codziennego przyjmowania mieszaniny szczepów probiotycznych, do poradni ponownie zgłosiło się 31 chorych z poszczególnych podgrup badawczych:

Podgrupa I a - chorzy w fazie remisji nieprzyjmujący probiotyku (n=6)

Podgrupa I b - chorzy w fazie remisji przyjmujący probiotyk (n=8)

Podgrupa II a - chorzy w fazie zaostrzenia nieprzyjmujący probiotyku (n=8)

Podgrupa II b - chorzy w fazie zaostrzenia przyjmujący probiotyk (n=8)

Ze wszystkimi pacjentami przeprowadzono wywiad chorobowy, ze szczególnym uwzględnieniem aktualnych objawów choroby oraz dokonano oceny zmian endoskopowych w jelicie grubym, podczas zabiegu kolonoskopii. Na tej podstawie ponownie określono aktywność choroby za pomocą wskaźnika aktywności choroby według Indeksu Kliniki Mayo.

IV.7 Wpływ podawanej mieszaniny szczepów probiotycznych na poprawę stanu zdrowia chorych z WZJG.

Porównanie przeprowadzono pomiędzy wynikami uzyskanymi na wizytach kwalifikacyjnych, tzn. przed podaniem probiotyku oraz na wizytach kontrolnych, tzn. po co najmniej dwumiesięcznym okresie przyjmowania mieszaniny szczepów probiotycznych. Dla każdej z podgrup pacjentów, wyliczono średni spadek wartości Indeksu Skali Mayo (Tabela 7). W grupach pacjentów będących w fazie zaostrzenia WZJG, zarówno w podgrupie II a, jak i II b, zanotowano istotny spadek wartości Indeksu Skali Mayo. Wynik taki świadczy o tym, że pacjenci będący w fazie zaostrzenia WZJG na wizycie kwalifikującej, wykazywali poprawę stanu zdrowia na wizycie kontrolnej. Wykazano jednakże w osobnej analizie, że podawanie mieszaniny szczepów probiotycznych, miało znamienny wpływ na polepszenie stanu zdrowia pacjentów z grupy II b (przyjmujących mieszaninę szczepów probiotycznych) w porównaniu do pacjentów z grupy II a (nieprzyjmującej mieszaninę szczepów probiotycznych). Różnica pomiędzy tymi grupami była znamienna statystycznie (p=0,07). Wyniki te przedstawiono na Fig. 9, gdzie wykres obrazuje korelację pomiędzy poprawą stanu zdrowia pacjentów z podgrup II a i Il b mierzoną za pomocą Indeksu Kliniki Mayo.

PL 236 218 Β1

Tabela 7. Porównanie średniego spadku wartości Indeksu Kliniki Mayo w poszczególnych podgrupach pacjentów.

Podgrupa chorych	Średnie wartości indeksu skali Mayo	Średni spadek wartości indeksu skali Mayo
Wizyta kwalifikująca	Wizyta kontrolna
Podgrupa 1 a — chorzy w fazie remisji nieprzyjmujący probiotyku (n=>6)	2,5	2,16	0,34
Podgrupa 1 b —chorzy w fazie remisji przyjmujący probiotyk (n=8j	2,25	1,5	0,75
Podgrupa II a — chorzy w fazie zaostrzenia nieprzyjmujący probiotyku (n=8)	7	4	3
Podgrupa II b — chorzy w fazie zaostrzenia przyjmujący probiotyk (n=8)	7,87	3	4,87

IV. 8 Potwierdzenie kolonizacji nabłonka jelita przez szczepy zawarte w podawanej mieszaninie szczepów bakterii probiotycznych przez wykazanie ich obecności w materiałach tkankowych pobranych od chorych z WZJG przyjmujących tę mieszaninę.

W podgrupie I b liczącej 8 chorych w fazie remisji otrzymujących mieszaninę szczepów bakterii probiotycznych, u 4 osób potwierdzono kolonizację co najmniej jednym ze szczepów, występujących w podawanej mieszaninie na podstawie badania identyczności przeprowadzonego metodami molekularnymi. Natomiast w podgrupie II b liczącej 8 chorych w fazie zaostrzenia choroby przyjmującej probiotyk, kolonizację co najmniej jednym z trzech szczepów zawartych w mieszaninie, potwierdzono u 6 osób.

IV.9 Przykład wykonania nieograniczający wynalazku.

Postać preparatu farmaceutycznego.

Kompozycja może mieć rozmaite postacie farmaceutyczne, takie jak: proszki, tabletki, kapsułki, łącznie z farmaceutycznie dopuszczalnymi dodatkami. Preparat zawiera substancję aktywną: 10 mld. bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus KL 53A, Lactobacillus plantarum PL02 i Bifidobacterium longum PL03 oraz substancje pomocnicze: maltodekstrynę, inozytol i kwas askorbinowy.

Wnioski.

W trakcie przeprowadzonych badań wykazano statystycznie potwierdzoną korelację pomiędzy stopniem poprawy stanu zdrowia pacjentów z aktywną fazą WZJ, a przyjmowaniem mieszaniny szczepów bakterii probiotycznych. Ponadto wykazano, że przyjmowanie mieszaniny powodowało u większości chorych kolonizację jelita podanymi szczepami probiotycznymi.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Zastosowanie kompozycji probiotycznej, zawierającej trzy szczepy bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus rhamnosus KL 53A, Lactobacillus plantarum PL02 i Bifidobacterium longum PL03, wykazującej zdolność wpływania na profil cytokinowy do wytwarzania preparatu użytecznego w profilaktyce i leczeniu stanu zapalnego jelit.