PL233502B1 - Sposób ochrony roślin przed bakteriami - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest środek ochrony roślin przed bakteriami w postaci roztworu wodnego kofeiny o stężeniu MIC 5 - 20 mM oraz MBC 43 - 100 mM. Ponadto wynalazek ujawnia sposób ochrony roślin przed bakteriami, w którym powierzchnie warzyw i owoców pokrywa się roztworem wodnym kofeiny oraz sposób otrzymywania środka do ochrony roślin przed bakteriami, który polega na tym, że kofeinę w postaci proszku w ilości 19,41 g miesza się i rozpuszcza się w 1000 ml wody o temperaturze pokojowej otrzymując stężenie 100mM.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony roślin zwłaszcza roślin uprawnych przed bakteryjnymi patogenami roślin jak również w rolnictwie, a także do spowolnienia kiełkowania warzyw i owoców przeznaczonych na konsumpcję podczas ich okresu przechowywania, przed bakteriami Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Dickeya spp., Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris pv. Campestris, poprzez natrysk wodnym roztworem kofeiny o stężeniu 5-20 mM.

Wzrastające zainteresowanie ekologicznymi uprawami oraz zrównoważonym rolnictwem spowodowało wzrost zapotrzebowania na środki ochrony roślin spełniające warunki produkcji ekologicznej. Rosnąca świadomość społeczeństwa powoduje, że coraz ważniejsza staje się nie tylko cena, ale także skład produktu i jego pochodzenie. Zmiany te powodują skierowanie zainteresowania na środki ochrony roślin pochodzenia naturalnego.

Kofeina zalicza się do grupy alkaloidów purynowych zwanych metyloksantynami. Cząsteczka kofeiny posiada w swojej budowie atomy azotu nadające jej charakter zasadowy. Jej budowa oparta jest na pierścieniu purynowym. Nazwa chemiczna kofeiny według nomenklatury IUPAC (ang. International Union of Pure and Applied Chemistry - Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej), brzmi 1,3,7-trimetylo-3,7-dihybro-1H-puryno-2,6-dion. Związek ten jest znany także pod kilkoma innymi nazwami: m.in. jako: 1,3,7-trimetyloksantyna, teina czy guaranina. Podstawowe informacje dotyczące kofeiny zestawiono w tabeli poniżej (Tab. 1).

Przy pracy z roztworami związku kofeiny ważna jest znajomość jego rozpuszczalności. Kofeina jest substancją umiarkowanie rozpuszczalną w wodzie. W temperaturze pokojowej w roztworach wodnych maksymalne stężenie możliwe do osiągnięcia wynosi 118 mM (2,17%). Rozpuszczalność kofeiny znacząco wzrasta wraz ze wzrostem temperatury roztworu, może tak zostać zwiększona poprzez dodanie soli kwasów np.: cytrynianowego, cynamonianowego, benzoesowego, zasadowych benzoesanów lub salicylanów (Tab. 2).

Kofeina występuje naturalnie w owocach, nasionach, łupinach nasiennych, korze oraz liściach wielu roślin. Jest metabolitem wtórnym syntetyzowanym w cyklu przemian enzymatycznych z prekursora purynowego - ksantynozy.

Kofeina, będąca substancją pochodzenia naturalnego, jest powszechnie spożywana szczególnie, jako składnik napojów: kawy, herbaty, czy napojów energetyzujących.

Celem wynalazku jest zastosowanie roztworu kofeiny jako naturalnej substancji do bezpośredniego stosowania na rośliny uprawne podczas ich wegetacji w celu ich ochrony przed poniżej opisanymi bakteryjnymi patogenami roślin:

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus - bakteria ta powoduje chorobę określaną, jako bakterioza pierścieniowa ziemniaka. W świetle polskich przepisów fitosanitarnych Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus należy do organizmów szkodliwych podlegających obowiązkowi zwalczania. Wykrycie tych bakterii wiąże się z koniecznością nałożenia na gospodarstwo kwarantanny, co wymusza zmianę planów produkcyjnych i wiąże się z poważnymi stratami materialnymi.

Dickeya spp. - atakuje wiele gatunków roślin, w tym: ziemniaka, pomidora, marchew, kukurydzę. Wyizolowana została z wielu gatunków roślin uprawnych i ozdobnych z objawami czarnej nóżki i więdnięcia. Atakując rośliny ziemniaka Dickeya spp. powoduje odbarwienia i żółknięcie liści, karłowacenie oraz więdnięcie roślin.

Pectobacterium atrosepticum i Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum - oba patogeny wywołują czarną nóżkę ziemniaka, której objawem jest gnicie podstaw łodygi rośliny podczas wegetacji oraz morką zgniliznę bulw, których tkanka ulega maceracji podczas przechowywania. Co roku bakterie z rodzaju Pectobacterium powodują znaczące straty w zbiorach wielu roślin uprawnych, a także niszczą rośliny ozdobne.

Pseudomonas syringae pv. tomato - bakterie powodują choroby w roślinach: pomidora, rzodkiewnika oraz w roślinach krzyżowych. Najważniejszą z gospodarczego punktu widzenia chorobą jest bakteryjna cętkowatość pomidora.

Ralstonia solanacearum - jest groźnym patogenem roślin uprawnych. Szczególnie duże straty powoduje na polach ziemniaka powodując brunatną zgniliznę. W świetle polskich przepisów fitosanitarnych Ralstonia solanacearum należy do organizmów szkodliwych podlegających obowiązkowi zwalczania. Wykrycie tych bakterii wiąże się z koniecznością nałożenia na gospodarstwo kwarantanny.

PL 233 502 B1

Xanthomonas campestris pv. campestris - wszystkie bakterie należące do rodzaju Xanthomonas są patogenami roślin. Wiele z tych roślin to gatunki uprawiane przez człowieka, a choroby powodowane przez Xanthomonas przynoszą duże straty ekonomiczne. Xanthomonas campestris pv. campestris przyczynia się do znaczących strat w uprawach roślin krzyżowych powodując na tych roślinach czarną zgniliznę.

Przedmiotem wynalazku są określone stężenia kofeiny tzw. MIC (ang. Minimal Inhibitory Concentration - minimalne stężenie środka bakteriobójczego hamujące wzrost drobnoustrojów) i MBC (ang. Minimal Bactericidal Concentration - minimalne stężenie środka bakteriobójczego przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów) w wodnym roztworze mających wpływ na rozwój i namnażanie się bakteryjnych komórek patogenów roślin: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Dickeya spp., Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris pv. campestris (Tab. 3).

Poszczególne stężenia wodnego roztworu kofeiny można zastosować do bezpośredniego stosowania na rośliny jako zabieg oprysku po pojawieniu się pierwszych objawów chorobowych spowodowanych ww. bakteryjnymi patogenami roślin lub prewencyjnie przed pojawieniem się objawów chorobowych.

Do sporządzenia cieczy użytkowej powinno stosować się wodę o temperaturze pokojowej, czyli około 22°C. Odmierzoną ilość kofeiny powinno wymieszać się z mniejszą ilością wody, następnie uzupełnić do potrzebnej objętości i dokładnie wymieszać.

W przypadku bezpośredniego stosowania roztworu kofeiny na rośliny w okresie ich wegetacji w formie oprysków zalecane są stężenia nieprzekraczające wartości MIC dla poszczególnych gatunków bakteryjnych, a najlepiej zbliżone do stężenia 5 mM. Stosowanie roztworu kofeiny o zbyt dużych stężeniach mogłyby negatywnie oddziaływać na wzrost roślin.

Kolejnym celem wynalazku jest zastosowanie roztworu kofeiny na warzywa oraz owoce przeznaczone na konsumpcję podczas okresu przechowywania w celu ich ochrony przed porażeniem poniżej opisanymi bakteryjnymi patogenami roślin.

Poszczególne stężenia wodnego roztworu kofeiny mogą być wykorzystane do bezpośredniego stosowania na warzywa przeznaczone na konsumpcję oraz owoce podczas okresu przechowywania w formie oprysku w celu zmniejszenia się możliwości pojawiania się i rozprzestrzeniania się objawów chorobowych spowodowanych ww. bakteryjnymi patogenami roślin.

W przypadku bezpośredniego stosowania roztworu kofeiny na rośliny w okresie ich wegetacji w formie oprysków zalecane byłyby stężenia o wartościach mieszczących się w zakresie MIC i MBC dla poszczególnych gatunków bakteryjnych.

Pierwszym etapem procesu technologicznego po okresie przechowywania warzyw i owoców poddanych opryskowi roztworem kofeiny powinien być proces mycia w wodzie o temperaturze pokojowej, czyli około 22°C.

Ponadto celem wynalazku jest zastosowanie roztworu kofeiny jako naturalnej substancji do dezynfekcji magazynów i przechowalni służących do składowania materiału roślinnego oraz niektórych narzędzi rolniczych wykorzystywanych podczas zabiegów agrotechnicznych.

Poszczególne stężenia wodnego roztworu kofeiny mogą zostać wykorzystane do bezpośredniego stosowania w celu dezynfekcji powierzchni: magazynów i przechowalni, skrzynek przechowalniczych, itp., służących do składowania materiału roślinnego oraz niektórych narzędzi rolniczych wykorzystywanych podczas zabiegów agrotechnicznych.

Pomieszczenie przechowalni, po zakończeniu sezonu, kiedy materiał roślinny jest całkowicie usunięty, powinno być zamiecione, umyte wodą z dodatkiem detergentów pod ciśnieniem i odkażone poprzez zastosowanie oprysku roztworem kofeiny o odpowiednim stężeniu. W okresie poprzedzającym nowy sezon przechowalniczy należy oprysk roztworem kofeiny powtórzyć. Podwójne odkażanie zmniejszy możliwość wystąpienia zakażenia bakteryjnego.

Podobne postępowanie z niektórymi urządzeniami rolniczymi np. przyczepy ciągnikowe - oprysk roztworem kofeiny w celu dezynfekcji i zahamowania namnażania się patogenów bakteryjnych na powierzchni urządzenia. Zabiegi powinny być wykonane przy użyciu sprzętu pozwalającego na równomierne rozmieszczenie preparatu na powierzchni obiektu lub, jeśli jest to pożądane, naniesienie go dokładnie tam, gdzie ma być naniesiony w miarę możliwości dobrej praktyki produkcyjnej. Czynniki mogące wpłynąć na skuteczność (takie jak ciśnienie robocze, rodzaj dysz, głębokość wprowadzania) winny być zgodne z zaleceniami producenta urządzenia stosowanego do oprysków.

PL 233 502 B1

Kolejnym celem wynalazku jest zastosowanie roztworu kofeiny jako naturalnej substancji do zahamowania kiełkowania warzyw (np. bulw ziemniaka) przeznaczonych do wykorzystania w przemyśle przetwórczym lub na konsumpcję podczas okresu przechowywania.

Zastosowanie kofeiny w zakresie stężeń od 30 mM do 100 mM w wodnym roztworze ma wpływ na zahamowanie procesu kiełkowania warzyw podczas ich okresu przechowywania.

Wodny roztworu kofeiny mogłyby zostać wykorzystany do bezpośredniego stosowania w formie oprysków warzyw przed ich umieszczeniem w przechowalni. W razie występowania procesu kiełkowania zabieg powinien zostać powtórzony.

Pierwszym etapem procesu technologicznego po okresie przechowywania warzyw i owoców poddanych opryskowi roztworem kofeiny powinien być proces mycia w wodzie o temperaturze pokojowej, czyli około 22°C.

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony roślin przed bakteriami, gdzie powierzchnię warzyw i owoców pokrywa się poprzez bezpośredni natrysk roztworem wodnym kofeiny o stężeniu 5-20 mM w temperaturze pokojowej.

Sposób gdzie roztwór kofeiny działa na bakterie wybrane z grupy: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Dickeya spp., Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris pv. campestris.

Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

CAF - oznacza kofeinę (caffeeine)

Adiuwant - preparat zwiększający przyczepność, czyli ułatwiający cieczy użytkowej przyleganie do powierzchni agrofaga i sprawiający, że środek staje się odporny na zmywanie.

Opis tabel:

Tab. 1. Właściwości fizyczne (wg The Merck Index)

Tab. 2. Rozpuszczalność kofeiny w wodzie

Tab. 3. Wartości stężeń kofeiny powodujących zahamowanie wzrostu oraz powodujących zabicie komórek bakteryjnych

Tab. 4. Test organoleptyczny bulw ziemniaków traktowanych roztworem 100 mM CAF

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus w pożywce NCP-88.

Fig. 2 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Dickeya spp. w pożywce L.

Fig. 3 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Pectobacterium atrosepticum w pożywce LB.

Fig. 4 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Pseudomonas syringae pv. tomato w pożywce LB.

Fig. 5 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum w pożywce LB.

Fig. 6 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Ralstonia solanacearum w pożywce GF.

Fig. 7 - przedstawia wykres hodowli bakteryjnej dla gatunku Xanthomonas campestris pv. campestris w pożywce GF.

Fig. 8 - przedstawia Pomidor Betalux po 8 dniach inkubacji i traktowaniu różnymi stężeniami kofeiny.

Fig. 9 - przedstawia wykres hodowli przykładowego szczepu Pba 1043 (po okresie długotrwałego traktowania CAF o stężeniu 8 mM) wobec różnych stężeń CAF.

Fig. 10 - przedstawia testy oddziaływania różnych stężeń CAF na bakterie w uszkodzonej tkance roślinnej.

Fig. 11 - przedstawia średnie wielkości plam gnilnych wraz z naniesionymi wartościami odchylenia standardowego na liściach cykorii wywołanych bakteriami Dickeya spp.

Fig. 12 - przedstawia bulwy ziemniaków po inkubacji w torebkach foliowych.

Fig. 13 - przedstawia zdjęcia bulw ziemniaka po ukończeniu dziesięciodniowej inkubacji w temp. 27°C.

Fig. 14 - przedstawia zdjęcia bulw ziemniaków po ukończeniu dwumiesięcznej inkubacji w temp. 7°C.

PL 233 502 B1

Fig. 15 - przedstawia poziom kofeiny (CAF) w tkance ziemniaka zanurzonego przez 24 h w 100 mM roztworze kofeiny. Czerwona linia wyznacza poziom kofeiny dopuszczalny dla produktów bezkofeinowych.

Fig. 16 - przedstawia test na zabezpieczanie juty przed patogenami roztworami CAF.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania.

P r z y k ł a d 1

Sposób przygotowania roztworu kofeiny:

1. Kofeinę w postaci proszku (pochodzenia syntetycznego lub naturalnego) odważyć w ilości 19,41 g i mieszając rozpuścić w 1000 ml wody (destylowanej lub wodociągowej) o temp. pokojowej (stężenie 100 mM). W celu przyśpieszenia procesu rozpuszczania kofeiny wodę można ogrzać do temp. 30-35°C.

2. Tak przygotowany 100 mM wodny roztwór kofeiny stosować bezpośrednio lub rozcieńczyć z wodą (destylowaną lub wodociągową), aby otrzymać roztwór o odpowiednio mniejszym stężeniu molowym.

3. Wodny roztwór kofeiny o stężeniu 100 mM (lub mniejszym) przechowywać w temp. pokojowej lub niższej, w zamkniętym pojemniku szklanym lub plastikowym.

P r z y k ł a d 2

Oddziaływanie kofeiny na opisane gatunki bakteryjnych patogenów roślin:

Dla gatunków bakterii: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Dickeya spp., Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris pv. campestris przeprowadzono doświadczenia polegające na wyznaczeniu tzw. krzywej wzrostu hodowli bakteryjnej pod wpływem bezpośredniego działania kofeiny na komórki bakteryjne. Wykazano zahamowanie wzrostu powyższych gatunków bakterii poprzez działanie kofeiny w stężeniach od 1 mM do 20 mM (Fig. 1-7). Zaobserwowany spadek wzrostu był proporcjonalny do stężenia kofeiny. Charakter przebiegu hodowli bakteryjnych (wykres krzywej wzrostu hodowli bakteryjnej) dla wszystkich badanych gatunk ów był zbliżony. Na podstawie analizy wyników można stwierdzić, iż zastosowanie kofeiny już w stężeniu 1 mM powoduje zahamowanie wzrostu wszystkich opisanych powyżej gatunków bakterii będących patogenami roślin uprawnych.

Wartość MIC oraz MBC:

Wyniki wskazały, iż kofeina powoduje zahamowanie wzrostu komórek bakteryjnych w zakresie stężeń od 5 do 20 mM (Tab. 3). Najbardziej wrażliwe na działanie kofeiny były bakterie z gatunku Pseudomonas siringae pv. tomato, dla których obserwowano zahamowanie wzrostu już przy stężeniu 5 mM kofeiny. Natomiast najmniej wrażliwe z grupy badanych patogenów były bakterie reprezentujące gatunek Ralstonia solanacearum, dla których zahamowanie wzrostu obserwowano przy stężeniu 20 mM kofeiny.

Otrzymane wartości MBC dla badanej grupy patogenów roślinnych zawierały się w przedziale od 43 do 100 mM (Tab. 3). Porównując oddziaływanie kofeiny na poszczególne gatunki bakterii dla określenia wartości MBC, najbardziej wrażliwe były bakterie gatunków Ps eudomonas syringae pv. tomato oraz Ralstonia solanacearum. Natomiast najbardziej odporne na działanie kofeiny były bakterie gatunku Pectobacterium atrosepticum oraz podgatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. Do zabicia komórek tych bakterii dochodziło przy zastosowaniu stężenia 100 mM kofeiny.

P r z y k ł a d 3

Test oporności na CAP szczepów bakterii Pectobacterium atrosepticum:

Między innymi szczepy bakterii Pectobacterium atrosepticum: Pba SCRI 1043, SCRI 1055, 12A/10/2002 namnażano przez 336 h w obecności stężenia 8 mM w pożywce LB. Następnie dla badanych szczepów wyznaczono krzywą hodowli wobec stężenia kofeiny w stężeniu 0 mM, 8 mM i 20 mM (Fig. 9).

Zaobserwowano, iż pomimo długiego czasu ekspozycji komórek bakteryjnych wobec progowego stężenia CAF (MIC), szczepy nie wytworzyły mechanizmu obronnego i pozostały podatne na działanie związku CAF. Hodowle badanych bakterii miały podobny charakter jak w przypadku tych samych szczepów niepoddanych długotrwałemu działaniu CAF (Fig. 3).

Wynik wskazuje na prawdopodobny brak mechanizmów oporności na CAF w wyszególnionych w zgłoszeniu gatunków patogenów bakteryjnych.

PL 233 502 B1

P r z y k ł a d 4

W celu sprawdzenia praktycznego zastosowania CAF w ochronie roślin, przeprowadzono testy na roślinach (m.in.: cykoria, bulwy ziemniaka) i materiałach stosowanych w przechowalnictwie roślin:

Na liście cykorii nanoszono roztwory CAF i adiuwantów (mineralnych oraz organicznych) w różnych kombinacjach a następnie nacinano liście i infekowano bakteriami (m.in. Dickeya spp). Liście inkubowano w temp. 27°C, w zamkniętych workach foliowych na bibule nasączoną wodą jałową, tak aby zachować odpowiednie warunki w celu wywołania objawów chorobowych. Wyniki umieszczono na Fig. 10. Otrzymane wyniki wskazały, iż traktowanie liści cykorii roztworem CAF w wodzie ogranicza rozwój objawów chorobowych. Najniższe stężenie CAF, które powstrzymywało gnicie liści wynosiło 25 mM. W kombinacjach gdzie stosowano roztwór CAF z adiuwantem zaobserwowano mniejszy stopień ochrony CAF przed gniciem. Efekt ten może być spowodowany tym, iż adiuwant ograniczał dostęp tlenu uszkodzonym komórkom roślinnym, a tym samym naturalne procesy obronne były upośledzone, natomiast komórki bakteryjne w takich warunkach tlenowych mogły normalnie się namnażać. Stosowane adiuwanty były pochodzenia organicznego i mogły także stanowić pożywkę dla bakterii. Należy zauważyć, iż testy zostały przeprowadzone na bezpośrednio uszkodzonej tkance, a więc komórki patogena miały bardzo łatwy dostęp do zawartości komórek roślinnych, dlatego też wydaje się prawdopodobne stosowanie mniejszych stężeń niż 25 mM CAF do oprysków roślin (Fig. 10). Przykładowe wartości średnic plam gnilnych na liściach cykorii przedstawiono na Fig. 11.

W celu praktycznego zastosowania kofeiny przeprowadzono kolejny test na bulwach ziemniaka. Bulwy ziemniaka wyjałowiono celem pozbycia się większości „naturalnych” mikroorganizmów z powierzchni skórki. Tak przygotowane bulwy spryskano roztworem CAF oraz bakteriami. Bulwy umieszczono w szczelnie zamkniętych workach foliowych i inkubowano w temp. 27°C do momentu pojawienia się objawów chorobowych (około 14 dni). Bulwy nie były uszkadzane mechanicznie, a wnikanie bakterii nastąpiło poprzez naturalne otwory znajdujące się w skórce bulw. Warunki wnikania bakterii były identyczne jak podczas przechowywania bulw ziemniaka w przechowalniach. Natomiast warunki samego przechowywania zostały dobrane, tak aby był preferowany rozwój komórek bakteryjnych tj. wyższa temperatura przechowywania i ograniczony dostęp tlenu (inkubacja w workach foliowych). Ograniczony dostęp tlenu wpływa negatywnie na mechanizmy obronne tkanki roślinnej. Przykładowe wyniki przedstawiono na Fig. 12. Wyniki badań wskazały, iż w przypadku bulw inkubowanych z CAF nie stwierdzono objawów chorobowych wywoływanych przez bakterie Dickeya spp., lub były one bardzo słabe. W przypadku bulw, które miały naturalne skaleczenia lub nosiły oznaki wcześniejszego porażenia (peryderma poskaleczeniowa), także nie stwierdzono większego rozwoju procesów chorobowych. W takich przypadkach tkanka z takich miejsc była łatwa do usunięcia (miękka ale nie „lejąca się”) co obrazuje zdjęcie z ostatniego wiersza Fig. 12.

Doświadczenia powtarzano wprowadzając zmiany polegające na przygotowaniu dodatkowych prób bulw traktowanych roztworami: adiuwantu organicznego wraz z 100 mM roztworu kofeiny i samego adiuwantu. Wyniki przedstawiono w postaci zdjęć na Fig. 13.

Pomimo np. „nieefektywnego” odkażenia bulw (kontrola negatywna - użyte bulwy ziemniaka były zainfekowane wewnętrznie), w przypadku próby traktowanej wodnym roztworem 100 mM kofeiny i infekowanej bakteriami Dickeya solani 123 (próba: CAF 100 mM + 5 x 107 jtk/ml Dickeya solani 123) nie obserwowano rozwoju procesu maceracji tkanki. Także w przypadku próby bulw traktowanych 100 mM roztworem kofeiny w adiuwancie i infekowanych bakteriami (próba: Adiuwant + CAF 100 mM + 5 x 107 jtk/ml Dickeya solani 123) proces maceracji tkanki (objawów chorobowych) był bardzo słaby. W pozostałych próbach obserwowano typowe objawy gnicia wywołane przez bakterie z gatunku Dickeya solani.

P r z y k ł a d 5

Ocena wpływu roztworu kofeiny na proces maceracji bulw ziemniaka wywołanych przez glebową florę bakteryjną:

Badanie wykonano wg opisu: przygotowano dwa worki strunowe z niesterylizowanymi bulwami ziemniaka. Do pierwszego zestawu dodano 15 ml wody destylowanej, do drugiego zestawu dodano 100 mM roztworu kofeiny. Zestawy przechowywano w chłodni w temp. 7°C do czasu pojawienia się objawów gnilnych bulw w zestawie z naniesionym 100 mM roztworem kofeiny. Czas ten wyniósł dwa miesiące. Wyniki przedstawiono w postaci zdjęć (Fig. 14).

Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, iż w próbach bulw ziemniaka traktowanych 100 mM wodnym roztworem kofeiny proces maceracji tkanki był znacznie mniejszy (próba: + CAF 100 mM), niż w próbach bulw traktowanych roztworem wodnym bez kofeiny (próba: - CAF). Bulwy

PL 233 502 B1 ziemniaka z próby: + CAF 100 mM były zazwyczaj twarde, a tylko w niektórych stwierdzono rozwarstwianie się tkanki co uznano za początek procesu maceracji. Powierzchnia bulw ziemniaka z tej próby była w znacznym stopniu mniej porażona przez pleśnie. W bulwach z próby: - CAF stwierdzono rozległą macerację tkanki a ich powierzchnia była zasiedlona w znacznym stopniu przez grzyby pleśniowe, co objawiało się białym nalotem.

P r z y k ł a d 6

Ocena przenikalności roztworu kofeiny w tkance bulw ziemniaka:

Ekstrakcje kofeiny z tkanki ziemniaka inkubowanego w 100 mM roztworze kofeiny przeprowadzono wg. opisu: W czterech jednolitrowych zlewkach zawierających ok. 0,6 l 100 mM roztworu kofeiny zanurzono kostki ziemniaka (pozbawione skórki) o długości boku ok. 1-1,5 cm. W dwóch następnych zlewkach zawierających taki sam roztwór kofeiny umieszczono nieobrane bulwy ziemniaka. Jeden zestaw (kostki + bulwy) inkubowano przez 24 h w temperaturze pokojowej, drugi zestaw inkubowano przez 24 h w temp. 37°C. Po zakończeniu inkubacji od części kostek okrojono z każdej strony warstwę tkanki o grubości 0,3 mm. Następnie odkrojono kolejną warstwę o grubości 0,2 mm, pozostawiając jedynie środek kostki. Pozostałe kostki ugotowano, po czym zostały rozdzielone podobnie jak kostki nieugotowane. Bulwy ziemniaka rozdzielono na skórkę, warstwę tkanki o grubości około 1,5 cm od skórki oraz warstwę środkową. Część pozostałych bulw ugotowano razem ze skórką a następnie rozdzielono w ten sam sposób. Pozostałe bulwy zostały przed gotowaniem obrane ze skórki, a później rozdzielone na warstwę o grubości 0,5 cm od skórki oraz na środek bulwy.

Z każdej warstwy tkanki odmierzono 0,8 gramowe fragmenty, z których ekstrahowano kofeinę. Rozpuszczalnikiem użytym do ekstrakcji był DCM. W procesie ekstrakcji użyto 0,8 ml DCM. Po ukończeniu ekstrakcji uzyskano próbki o objętości 0,5 ml DCM z rozpuszczoną kofeiną. Próby poddano analizie za pomocą chromatografii gazowej. Wyniki ekstrakcji kofeiny z tkanki bulw ziemniaka przedstawiono na Fig. 15.

Wyniki badań wskazały, iż ilość kofeiny w tkance ziemniaka traktowanej 100 mM wodnym roztworem kofeiny maleje wraz z głębokością pobierania próby tkanki. Największą ilość kofeiny oznaczono w skórce bulw ziemniaka (2,62 x 10^-4g/g s.m.). W przypadku prób ziemniak poddawano działaniu 100 mM roztworu kofeiny, a następnie gotowaniu stwierdzono mniejszą zawartość kofeiny w tkance w porównaniu z próbami, których nie poddawano gotowaniu. W próbach bulw ziemniaka, które przed procesem gotowania dodatkowo usunięto skórkę obserwowano spadek zawartości kofeiny w porównaniu z próbami bulw ziemniaka, gdzie takiego zabiegu nie zastosowano.

Według norm ISO dopuszczalny poziom kofeiny w produktach bezkofeinowych wynosi 1-3 mg kofeiny w 1 g suchej masie produktu (czerwona linia na Fig. 15). Bulwy inkubowane przez 24 h w 100 mM wodnym roztworze kofeiny, które zostały ugotowane, charakteryzują się poziomem kofeiny poniżej dopuszczalnej wartości. Mogą więc być uznane za produkt bezkofeinowy.

P r z y k ł a d 7

Test organoleptyczny bulw ziemniaków traktowanych CAF:

W celu sprawdzenia czy po traktowaniu bulw ziemniaków roztworem 100 mM CAF nie zmienią one swoich walorów smakowych przeprowadzono test organoleptyczny. Bulwy ziemniaków, były traktowane roztworem kofeiny o stężeniu 100 mM a następnie pakowane do worków foliowych i przechowywane przez okres 5 dni. Co 24 h pobierane były próby bulw, następnie obierane, gotowane i poddawane testowi smakowemu. W żadnym z testów nie stwierdzono zmiany smaku bulw ziemniaków na gorzki (naturalny smak CAF) Tab. 4.

P r z y k ł a d 8

Zastosowanie CAF do ochrony materiału jutowego przed bakteriami:

Fragmenty materiału jutowego (stosowanego w produkcji worków, które mogą stanowić jedno ze źródeł infekcji bakteriami podczas okresu przechowywania) traktowano roztworami CAF 100 mM w kombinacji z adiuwantami (1, 2, 3) w formie oprysku lub moczenia. Badania przeprowadzono dla bakterii Pba lub Pst. Badany materiał wykładano na podłoża z posianymi bakteriami Pba lub Pst. Bakterie inkubowano 24 h w 27°C. Przykładowe wyniki podano na Fig. 16.

Uzyskane wyniki wskazały, iż na materiale jutowym potraktowanym roztworem CAF (niezależnie od tego czy roztwór CAF był połączony z adiuwantem) nie obserwowano wzrostu bakterii (przejaśnienia w miejscach gdzie wyłożono fragmenty juty) (Fig. 16, zdjęcia w drugiej kolumnie). Natomiast w kombinacjach bez CAF (Fig. 16, zdjęcia w trzeciej kolumnie) obserwowano wzrost bakterii. Zauważono także, iż w przypadku zastosowania adiuwantów naturalnych na bazie związków organicznych (w kombinacji bez CAF) wzrost komórek bakteryjnych był zwiększony.

PL 233 502 Β1

Przykład 9

Wpływ kofeiny na kiełkowanie:

Wykazano, iż kofeina może wpływać na zahamowanie procesu kiełkowania roślin uprawnych. Poziom hamowania kiełkowania przez kofeinę jest różny w zależności od gatunku rośliny uprawnej oraz stosowanego stężenia kofeiny. Badania przeprowadzone m.in. na nasionach pomidora bezpośrednio traktowanych roztworem kofeiny o stężeniach od 1 mM do 5 mM wskazały, iż wraz ze wzrostem stosowanego stężenia poziom kiełkowania był słabszy (Fig. 8). Kofeina w stężeniach od 30 mM do 100 mM istotnie wpływa na zahamowanie kiełkowania roślin, co może być wykorzystane w przechowalnictwie warzyw przeznaczonych na przetwórstwo i konsumpcję. Proces kiełkowania warzyw podczas przechowywania na przetwórstwo i konsumpcję jest zjawiskiem niekorzystnym powodującym obniżenie ich wartości i przydatności do powyższych celów.

Literatura

1. Kim, Y., & Sano, H. (2008). Pathogen resistance of transgenic tobacco plants producing caffeine. Phytochemistry, 69(4), 882-888.

2. Kim, Y., Uefuji, H., Ogita, S., & Sano, H. (2006). Transgenic tobacco plants producing caffeine: a potential new strategy for insect pest control. Transgenic Research, 15(6), 667-672.

3. Nathanson, J. (1984). Caffeine and related methylxanthines: possible naturally occurring pesticides. Science, 226(4671), 184-187.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ochrony roślin przed bakteriami, znamienny tym, że powierzchnię warzyw i owoców pokrywa się poprzez bezpośredni natrysk roztworem wodnym kofeiny o stężeniu 5-20 mM w temperaturze pokojowej.
2. 2. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że roztwór kofeiny działa na bakterie wybrane z grupy: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Dickeya spp., Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris pv. campestris.