PL236445B1 - Mieszanina szczepów bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440, Serratia rubidaea szczep H469 i zastosowanie do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya - Google Patents
Mieszanina szczepów bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440, Serratia rubidaea szczep H469 i zastosowanie do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya Download PDFInfo
- Publication number
- PL236445B1 PL236445B1 PL423806A PL42380617A PL236445B1 PL 236445 B1 PL236445 B1 PL 236445B1 PL 423806 A PL423806 A PL 423806A PL 42380617 A PL42380617 A PL 42380617A PL 236445 B1 PL236445 B1 PL 236445B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strain
- bacteria
- strains
- mixture
- serratia
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/425—Serratia
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakterii antagonistycznych w mieszaninie, jej zastosowanie do ochrony zdrowych roślin przed zakażeniem lub roślin wykazujących symptomy chorobowe - ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie i Dickeya. W szczególności wynalazek opisuje biologiczną ochronę roślin przed pektynolitycznymi patogenami roślin, zwłaszcza z rodzaju Pectobacterium i Dickeya, które na przykład na ziemniaku powodują takie choroby jak mokra zgnilizna, czarna nóżka, a na innych roślinach mokrą zgniliznę.
Rośliny uprawne są podatne na zakażenia patogenami, co w skali globalnej prowadzi do ogromnych strat ekonomicznych w produkcji żywności, pasz dla zwierząt oraz w przemyśle. Metody stosowane do ochrony roślin uprawnych przed patogenami to, między innymi, aplikowanie chemicznych środków ochrony roślin, niedopuszczanie do przeniesienia i namnażania bakterii na roślinach zdrowych, inspekcja pól uprawnych w celu określenia czy materiał roślinny jest wolny od patogenów.
Powszechnie stosowane chemiczne metody ochrony roślin (np. pestycydy chemiczne) przed patogenami nie tylko nie są wystarczająco skuteczne dla ochrony roślin, ale przede wszystkim ich stosowanie prowadzi do ciągle wzrastającego zanieczyszczenia środowiska naturalnego związkami chemicznymi niebezpiecznymi dla zdrowia ludzi i zwierząt i wyjaławiania naturalnej mikroflory gleby. Co warto podkreślić, patogeny roślin w krótkim czasie mogą uodpornić się na działanie pestycydów chemicznych, co dodatkowo uzasadnia konieczność poszukiwania nowych, alternatywnych metod ochrony roślin przed patogenami.
Biologiczna ochrona roślin (biologiczna kontrola patogenów roślin) polega na wykorzystaniu organizmu lub organizmów antagonistycznych względem patogenu, który/które powodują obniżenie jego liczebności, zahamowanie rozwoju symptomów chorobowych przez niego powodowanych albo zniszczenie patogenu. Mechanizm biologicznej kontroli może być zróżnicowany i polegać między innymi na produkcji antybiotyków, współzawodnictwie o zasoby środowiska (np. kompetycja o jony żelaza - produkcja sideroforów), pasożytowaniu na organizmie patogennym albo na indukowaniu odpowiedzi obronnej rośliny (np. przez produkcję fitohormonów).
Oszacowana światowa wartość rynku pestycydów rolniczych wynosi ponad 30 miliardów dolarów amerykańskich, z czego tylko około 1% przypada na preparaty biologicznej ochrony roślin. Prawie wszystkie biopreparaty stosowane w rolnictwie oparte są na wykorzystaniu tylko kilku gatunków/rodzajów bakterii (np. Bacillus spp., Pseudomonas spp. Pantoea spp., Agrobacterium radiobacter). W Europie na początku XXI wieku wartość sprzedaży biologicznych środków ochrony roślin wynosiła około 100 milionów USD z czego 20 milionów USD przypadało na preparaty mikrobiologiczne (Sobiczewski, 2010). Sobiczewski i współautorzy podają, że w 2009 roku w Europie tylko 35 przedsiębiorstw produkowało i sprzedawało preparaty mikrobiologiczne do ochrony roślin.
Zastosowanie biologicznej ochrony roślin, bezpiecznej dla ludzi i zwierząt, jest w zgodzie z polityką Unii Europejskiej i jej dyrektywą (91/414/EEC), która wymaga traktowania „priorytetowego ochrony zdrowia ludzi i zwierząt w stosunku do celu, jakim jest poprawa produkcji rolnej”. W zgodzie z dyrektywą unijną w 2013 roku Polska przyjęła ustawę o środkach ochrony roślin (Dz. U. z 2013 r., poz. 455), która wprowadziła od 1 stycznia 2014 roku obowiązek stosowania środków ochrony roślin wyłącznie zgodnie z zasadami integrowanej ochrony roślin. Wymagania integrowanej ochrony roślin zostały określone przez Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi w postaci rozporządzenia (Dz. U. z 2013, poz. 505), którego głównym założeniem jest ograniczenie stosowania chemicznej ochrony roślin do niezbędnego minimum. Rozporządzenie zakłada ponadto, że w celu ochrony roślin przed organizmami szkodliwymi w pierwszej kolejności należy stosować metody biologicznej ochrony i prewencji w celu niedopuszczenia do zakażenia.
Polityka Unii Europejskiej i Polski stwarza ogromne zapotrzebowanie na przyjazne środowisku preparaty mikrobiologiczne i formulacje mikroorganizmów, takie jak środki mikrobiologiczne, niezbędne do ograniczenia ochrony chemicznej i zapewnienia stałej jakości i ilości plonów. Wzrastająca świadomość ekologiczna konsumentów produktów rolnych spowodowała w Polsce w latach 2002-2009 ponad 10-krotny wzrost powierzchni ekologicznych upraw rolnych. Przyjmuje się, że taki trend będzie się utrzymywał.
Bakterie antagonistyczne to bakterie które bytują na roślinach, w ich tkankach (endofity) albo w sąsiedztwie korzeni (ryzosfera) oraz na powierzchni liści (ryzosfera). Bakterie te potrafią w sposób aktywny chronić roślinę poprzez wspomaganie pobierania związków mineralnych z gleby, hamowanie
PL 236 445 B1 rozwoju chorób oraz produkcję fitohormonów. Bakterie antagonistyczne wchodzą w bezpośrednie i pośrednie interakcje z wieloma (patogennymi) organizmami egzystującymi w/na roślinach i w ich sąsiedztwie, w związku z czym, odgrywają rolę czynników biologicznej ochrony roślin.
Zastosowanie biologicznej ochrony roślin opartej o bakterie antagonistyczne stanowi bardzo atrakcyjną alternatywę tradycyjnej ochrony roślin, ponieważ ich działanie opiera się na naturalnych antagonizmach, a nie na działaniu środków chemicznych, często toksycznych także dla ludzi i zwierząt. Stosowanie bakterii antagonistycznych nie wprowadza do środowiska naturalnego żadnego obcego czynnika, który mógłby być toksyczny dla ludzi i zwierząt i akumulowany na kolejnych piętrach piramidy ekologicznej.
Co więcej, większość stosowanych obecnie komercyjnych preparatów służących do biologicznej ochrony roślin ma postać żywych komórek bakterii lub ich przetrwalników, które jako naturalnie występujące w środowisku glebowym nie stanowią zagrożenia. Stosowanie środków biologicznej ochrony może dotyczyć okresu wegetacji lub zbierania i przechowywania plonów przy jednoczesnym zachowaniu bezpieczeństwa tych ostatnich dla środowiska naturalnego, ludzi oraz zwierząt.
Bakterie pektynolityczne powodują powstawanie symptomów chorobowych na ekonomicznie istotnych roślinach uprawnych takich jak, między innymi: ziemniak, pomidor, marchew, cebula, czosnek, ogórek, papryka i roślinach ozdobnych takich jak, między innymi: cyklamen, hiacynt, tulipan, storczyk, chryzantema.
W przykładach potwierdzających urzeczywistnienie zaobserwowanego działania bakterii antagonistycznych będących przedmiotem niniejszego wniosku wykorzystano tkanki bulw ziemniaka. Ziemniak (Solanum tuberosum L.) jest jedną z najważniejszych roślin uprawnych zarówno ze względu na zajmowany obszar upraw jak i całkowitą produkcję bulw. Pod względem ważności dla rolnictwa światowego stanowi on czwartą rośliną uprawną po ryżu, kukurydzy i pszenicy. Intensywna uprawa i produkcja ziemniaka w Europie (monokultury upraw), a także międzynarodowy obrót materiałem roślinnym przyczynia się do zwiększenia ryzyka rozprzestrzeniania się chorób. Wszystkie choroby ziemniaka przyczyniają się do dużych strat plonu i jego jakości. Choroby powodują straty na każdym etapie uprawy/produkcji ziemniaka i dotyczą korzeni, części nadziemnych łodyg, a przede wszystkim i najczęściej bulw.
Istotnym problemem w uprawie/przechowywaniu roślin są zakażenia powodowane przez bakterie pektynolityczne z rodzaju Pectobacterium i Dickeya, powodujące mokrą zgniliznę w okresie przechowywania na ziemniakach, pomidorach, marchwi, cebuli, czosnku, ogórkach, papryce i roślinach ozdobnych takich jak, cyklamen, hiacynt, tulipan, storczyk, chryzantema, także gnicie pędów ziemniaka (tzw. czarną nóżkę) w okresie jego wegetacji.
W przypadku zakażeń ziemniaków, powszechnie uważa się, że głównym źródłem zakażenia nowych roślin bakteriami pektynolitycznymi z rodzaju Pectobacterium i Dickeya są latentnie (bezobjawowo) zainfekowane bulwy sadzeniaków, które w czasie wzrostu roślin na polu uwalniają bakterie do środowiska i rozprzestrzeniają infekcję na nowe rośliny, bulwy potomne, na inne uprawy zlokalizowane na tych samych albo sąsiednich polach, a także pomiędzy uprawami. Z tego względu produkcja sadzeniaków wolnych od patogenów jest najważniejszym elementem ograniczenia możliwości zakażenia zdrowych roślin bakteriami pektynolitycznymi.
Typowe symptomy na bulwach (mokra zgnilizna bulw ziemniaka) to gnicie, które rozpoczyna się w oczkach, zakończeniach stolonów albo w ranach powstałych w czasie zbioru bulw. Obecność bakterii prowadzi do maceracji tkanek, które gnijąc przyjmują kremową barwę i wodnistą konsystencję, czernieją na powietrzu i zostają zainfekowane przez inne (oportunistyczne) mikroorganizmy, które mogą powodować wtórne symptomy chorobowe.
Jedna zainfekowana bulwa w czasie przechowywania, szczególnie w warunkach niewystarczającej kontroli temperatury i wilgotności (wysoka temperatura, wysoka wilgotność), może być przyczyną zakażenia nawet stu następnych (zdrowych) bulw sąsiadujących z zakażoną.
Dla przykładu, w chwili obecnej kontrola bakterii z rodzaju Pectobacterium i Dickeya na uprawach ziemniaka polega tylko i wyłącznie na:
1. użyciu materiału siewnego pochodzącego z upraw ziemniaka in vitro, wolnego od patogenów
2. inspekcji pól i okazjonalnych testach laboratoryjnych, przeprowadzanych, aby stwierdzić czy materiał siewny jest wolny od zakażeń
3. stosowaniu procedur prewencyjnych: dezynfekcji maszyn używanych na polu, pomieszczeń służących do przechowywania bulw i niedopuszczeniu do przenoszenia inokulum bakteryjnego na zdrowe rośliny w czasie całego okresu wzrostu.
PL 236 445 B1
W przypadku ziemniaka, żadna z powyższych metod kontroli ani ich kombinacja nie pozwala na stuprocentową ochronę roślin i bulw ziemniaka przed zakażeniem, a jedynie przyczynia się do częściowego obniżenia strat plonów. Metody kontroli bakterii pektynolitycznych na ziemniaku są niewystarczające, co obserwuje się szczególnie w latach, w których pogoda w czasie sezonu wegetacyjnego ziemniaka (od kwietnia do września) sprzyja rozwojowi symptomów chorobowych (duże opady, wysoka temperatura).
Jednym z największych problemów z bakteriami pektynolitycznymi jest to, że w trakcie infekcji znajdują się one w miejscach trudno dostępnych dla środków antybakteryjnych. Bakterie pektynolityczne przebywają wewnątrz bulw i łodyg, natomiast chemiczne czy fizyczne środki ochrony działają na powierzchni roślin i nie wnikają do wnętrza tkanek.
Nie istnieją obecnie komercyjnie dostępne systemiczne środki ochrony roślin, które mogą przeniknąć do roślin uprawnych przez korzenie lub liście i rozprzestrzenić się po wszystkich jej tkankach, zapewniając ochronę. Dlatego też istnieje ciągła potrzeba doskonalenia dostępnych środków ochrony roślin i opracowywania nowych, zwłaszcza w kierunku ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya. Wszystkie stosowane obecnie metody ochrony materiału siewnego (m.in. sadzeniaków ziemniaka) przed bakteriami pektynolitycznymi mogą co najwyżej przyczynić się do obniżenia poziomu infekcji, ale nie do całkowitego usunięcia bakterii z zakażonych roślin i do zapewnienia ochrony roślinom zdrowym.
Taka sytuacja jest wynikiem braku możliwości wniknięcia związków chemicznych i czynników fizycznych do wnętrza roślin i ich dotarcia do miejsc, gdzie zlokalizowane są najliczniejsze populacje bakterii w czasie infekcji. Bakterie z rodzaju Pectobacterium i Dickeya są patogenami zasiedlającymi wiązki przewodzące roślin, natomiast używane w rolnictwie antybakteryjne związki chemiczne działają tylko powierzchniowo i nie wnikają do wnętrza tkanek. Podobnie czynniki fizyczne jak promieniowanie UV i promieniowanie słoneczne nie mogą penetrować do wnętrza bulw i łodyg. Promieniowanie gamma, które przenika do wnętrza tkanek i inkubacja w gorącej wodzie, która podgrzewa tkanki wewnętrzne bulw, sprzyja uszkodzeniu sadzeniaków (brak albo ograniczenie wschodów plonów na polu), a co za tym idzie nie jest używane w praktyce.
Jedyną metodą częściowej kontroli zakażeń bakteriami pektynolitycznymi jest prewencja polegająca na niedopuszczaniu do zakażeń nowych roślin w warunkach poi owych poprzez stosowanie chemicznych środków czyszczących sprzęt mechaniczny stosowany do zbioru plonów, stosowanie odmian roślin bardziej odpornych i eliminacja roślin zakażonych w trakcie wzrostu. W praktyce rolnicy mogą stosować także środki ochrony roślin aplikowane podczas wysadzania bulw na polu albo aplikowane w czasie wzrostu roślin w sezonie wegetacyjnym.
Szacowane straty w produkcji ziemniaka w Europie spowodowane przez bakterie pektynolityczne są wysokie (utrata około 10%-20% plonów) i wynoszą obecnie około 250 milionów Euro rocznie. Z tego względu bakterie z rodzaju Pectobacterium spp. i Dickeya spp. należą do pięciu najważniejszych (przynoszących największe straty) bakteryjnych patogenów roślin. Z uwagi na to zasadne jest zastosowanie preparatu mikrobiologicznego, przyjaznego dla człowieka i środowiska, konkurencyjnego w odniesieniu do metod stosowanych obecnie.
Z opisu wynalazku US 5552315 A znane są bakterie antagonistyczne, które mają zastosowanie w zwalczaniu choroby ziemniaka spowodowanej przez grzyby. Podobnie w opisie US 8623390 A ujawniono antagonistyczne bakterie w zastosowaniu do chorób ziemniaka. W innym opisie US 8278246 A ujawniono kompozycje bakterii antagonistycznych służących hamowaniu chorób ziemniaków spowodowanych przez grzyby.
Niniejszy wynalazek wskazuje, że możliwe jest zastosowanie biologicznych metod ochrony (biologicznych metod kontroli patogenów) do ograniczania symptomów chorobowych, powodowanych przez bakterie pektynolityczne (bakterie patogenne z rodzaju Pectobacterium i Dickeya) co udowodniono na przykładzie ochrony bulw ziemniaka. Przedmiotowy wynalazek polega na zastosowaniu mieszaniny tj. kompozycji wyselekcjonowanych szczepów bakterii antagonistycznych. Z perspektywy aplikacyjnego zastosowania ważny jest fakt, że wyselekcjonowane i testowane szczepy bakterii antagonistycznych naturalnie bytują na roślinach, w ich tkankach (endofity) albo w sąsiedztwie korzeni (ryzosfera) i na powierzchni liści (ryzosfera), zatem jest to ich typowe środowisko życia, co dodatkowo będzie wpływać pozytywnie na długość ich przeżycia i stabilność ich populacji po aplikacji.
PL 236 445 B1
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowego, efektywniejszego sposobu ochrony roślin przed zainfekowaniem przez bakterie pektynolityczne (bakterie patogenne) z rodzaju Pectobacterium i Dickeya z wykorzystaniem unikalnej mieszaniny bakterii antagonistycznych. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest nowa mieszanina bakterii antagonistycznych do ochrony roślin, która zawiera pięć szczepów:
- Serratia plymuthica szczep A294, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00143, w dniu 1 grudnia 2017 roku,
- Enterobacter amnigenus szczep A167, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00145, w dniu 1 grudnia 2017 roku,
- Rahnella aquatilis szczep H145, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00144, w dniu 1 grudnia 2017 roku,
- Serratia rubidaea szczepy H440, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00141, w dniu 1 grudnia 2017 roku, i
- Serratia rubidaea szczep H469, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00142, w dniu 1 grudnia 2017 roku. Mieszanina jest przeznaczona do ochrony roślin przed zakażeniami bakteriami pektynolitycznymi, korzystnie bakteriami Pectobacterium i Dickeya.
Korzystnie, szczepy są w równych proporcjach względem siebie.
Korzystnie, liczba komórek każdego ze szczepów w kompozycji wynosi przynajmniej 108 cfu/ml, korzystnie 108 cfu/ml.
Korzystnie, mieszanina jest w postaci zliofilizowanej i/lub w zawiesinie.
Korzystnie, szczepy bakteryjne są aktywne metabolicznie.
Mieszaninę nanosi się poprzez oprysk, zamgławianie, obsypywanie roślin, zamaczanie roślin w warunkach przechowywania, w warunkach szklarniowych, polowych, hydroponicznych, gdzie bakterie antagonistyczne hamują symptomy chorobowe spowodowane przez bakterie pektynolityczne w zakresie temperatur od 7°C do 40°C. Miejscem aplikacji mieszaniny jest powierzchnia rośliny, kompost, gleba, piasek albo inny nośnik w którym mogą być uprawiane rośliny w warunkach polowych, szklarniowych i w kulturach in vitro.
Bakterie antagonistyczne hamują symptomy chorobowe poprzez produkcję związków chelatujących jony żelaza ze środowiska (produkcja sideroforów), poprzez zakłócanie sygnalizacji komórkowej bakterii pektynolitycznych.
Zakłócanie sygnalizacji komórkowej następuje poprzez degradacje cząsteczek sygnałowych (zakłócanie sygnalizatora zagęszczenia - ang. quorum quenching).
Twórcy przedmiotowego zgłoszenia patentowego pokazali, że mieszanina pięciu szczepów bakterii takie gatunki bakterii jak: Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i szczep H469, jest efektywną mieszaniną bakterii antagonistycznych i wykazuje antagonizm względem bakterii z rodzaju Pectobacterium i Dickeya.
Szczepy wchodzące w skład mieszaniny wykazują antagonizm względem bakterii z rodzaju Pectobacterium i Dickeya, a podłożem tego obserwowanego antagonizmu jest:
- Serratia plymuthica szczep A294 - produkcja hormonów roślinnych, stymulujących wzrost roślin, produkcja antybiotyków przeciwko bakteriom z rodzaju Pectobacterium i Dickeya.
- Enterobacter amnigenus szczep A167 - produkcja czynników zakłócających komunikację bakterii patogennych w środowisku poprzez degradowanie cząstek sygnałowych (tzw. zakłócanie sygnalizatora zagęszczenia - ang. quorum quenching)
- Rahnella aquatilis szczep H145 - produkcja sideroforów, chelatujących jony żelaza ze środowiska i produkcja antybiotyków przeciwko bakteriom z rodzaju Pectobacterium i Dickeya
PL 236 445 B1
- Serratia rubidaea szczep H440 - produkcja sideroforów, chelatujących jony żelaza ze środowiska i produkcja czynników zakłócających komunikację bakterii patogennych w środowisku poprzez degradowanie cząstek sygnałowych (tzw. zakłócanie sygnalizatora zagęszczenia - ang. quorum quenching)
- Serratia rubidaea szczep H469 - produkcja sideroforów, chelatujących jony żelaza ze środowiska i produkcja antybiotyków przeciwko bakteriom z rodzaju Pectobacterium i Dickeya.
Twórcy potwierdzili, że mieszanina bakterii jest szczególnie efektywna, kiedy składowe mieszaniny są zmieszane ze sobą w zasadniczo równych proporcjach.
Twórcy potwierdzili, że mieszanina bakterii antagonistycznych jest efektywna przeciwko pojedynczym gatunkom bakterii pektynolitycznych i jest efektywna przeciwko mieszaninie gatunków bakterii pektynolitycznych.
Twórcy na przykładzie tkanki bulw ziemniaka dowiedli także, że zastosowanie tej mieszaniny bakterii antagonistycznych ochrania przed wystąpieniem symptomów chorobowych powo dowanych obecnością bakterii z rodzaju Pectobacterium i Dickeya u roślin. Twórcy na przykładzie tkanek ziemniaka wykazali, że bakterie antagonistyczne wchodzące w skład mieszaniny są zdolne do przeżycia w szerokim zakresie warunków temperaturowych i są w stanie przeżywać na powierzchni roślin
Innymi roślinami co do których można stosować mieszaninę będąca przedmiotem wynalazku, poza ziemniakiem, jest marchew, pomidor, cebula, papryka, czosnek, ogórek, cyklamen, hiacynt, tulipan, storczyk lub chryzantema.
Mieszanina ta ma zastosowanie w warunkach przechowywania roślin, warunkach polowych, uprawach hydroponicznych, uprawach szklarniowych, uprawach in vitro.
Mieszaninę można nanosić poprzez oprysk, zamgławianie, obsypywanie roślin, zamaczanie roślin w warunkach przechowywania, w warunkach szklarniowych, polowych, hydroponicznych. Docelowym miejscem aplikacji mieszaniny jest powierzchnia rośliny, kompost, gleba, piasek albo inny nośnik w którym mogą być uprawiane rośliny w warunkach polowych, szklarniowych i w kulturach in vitro.
Określenia stosowane w tym opisie zgłoszenia patentowego mają następujące znaczenie:
Oddziaływania antagonistyczne - rodzaj zależności międzygatunkowych między różnymi populacjami bakterii, uznawany za niekorzystny dla jednej z populacji zajmujących to samo środowisko
Bakterie antagonistyczne - bakterie wykazujące odziaływania antagonistyczne przeciwko bakteriom z rodzaju Pectobacterium i Dickeya, synonim: bakterie ochronne
Bakterie pektynolityczne - bakterie z rodzaju Pectobacterium i Dickeya, powodujące występowanie symptomów chorobowych na roślinach, w tym na roślinach ziemniaka, powodujące czarną nóżkę i mokrą zgniliznę, synonim: bakterie patogenne
CFU - „colony forming units” co oznacza zamiennie jtk , czyli „jednostki tworzące kolonie” - jednostka wyrażająca liczbę żywych komórek bakterii, np. na ml zawiesiny (CFU/ml).
Mieszanina - na potrzeby niniejszego wynalazku zamiennie oznacza również „kompozycję”.
V /V - volume/volume oznacza stosunek objętości owo/objętościowy
Wynalazek przedstawiono w przykładzie, a efekty pokazano na rysunku.
Fig. 1. - przedstawia wybór 5 najlepszych szczepów antagonistycznych, chroniących tkankę bulw ziemniaka przed symptomami chorobowymi powodowanymi przez bakterie pektynolityczne; a) efekt ochronny aplikacji bakterii antagonistycznych jako % średnicy mokrej zgnilizny względem kontroli (redukcja promienia mokrej zgnilizny bulw w stosunku do kontroli zawierającej tylko bakterie patogenne z rodzaju Pectobacterium spp. i Dickeya spp.), b) efekt ochronny aplikacji bakterii antagonistycznych jako redukcja masy mokrej zgnilizny w stosunku do kontroli zawierającej tylko bakterie patogenne z rodzaju Pectobacterium spp. i Dickeya spp.
X - oznacza szczep antagoni styczny nieujawiony w tym zgłoszeniu patentowym.
Wybrane szczepy: Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469 wykazywały najlepszy efekt ochronny.
Fig. 2. - przedstawia wzrost bakterii Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469 w temperaturze 7°C.
Fig. 3.- przedstawia wzrost bakterii Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter_amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469 i ich rifampicyno-opornych mutantów.
PL 236 445 B1
Legenda do Fig. 3: wt - szczep typu dzikiego, niezmodyfikowany genetycznie, rif - szczep genetycznie zmodyfikowany z opornością na antybiotyk rifampicynę.
Fig. 4. - przedstawia przeżywalność szczepów antagonistycznych w mieszaninie szczepów antagonistycznych. Obserwacje prowadzono w pożywce PDB (potato dextrose broth); pH 7,0 o początkowej gęstości optycznej 3 McF. Wzrost bakterii w czasie wyrażono w cfu/ml, a czas w godzinach. Przedstawiono dane uśrednione z trzech powtórzeń.
Fig. 5. - przedstawia antagonistyczną interakcję wybranych szczepów antagonistycznych w mieszaninie szczepów antagonistycznych. Na wykresie przedstawiono zdolność wybranych szczepów do wzajemnego hamowania wzrostu na podłożu PDA (pH=7,0). Grubość linii jest proporcjonalna do promienia strefy zahamowania wzrostu. Linią przerywaną zaznaczono (nie w skali) wytwarzanie strefy spowolnionego wzrostu (przejaśnienie). Na figurze średnice zielonych kół dla każdego szczepu są proporcjonalne do liczby szczepów hamowanych przez dany szczep.
Fig. 6. - przedstawia skalę rozwoju symptomów chorobowych na bulwach ziemniaka.
Numery 0-5 oznaczają skalę rozwoju symptomów chorobowych, litery A-C - powtórzenie techniczne. Przedstawione są reprezentatywne wyniki.
Fig. 7. - przedstawia porównanie średniej masy zgniłej tkanki ziemniaka i mediany ocen skali rozwoju symptomów chorobowych w opracowanej skali 6-stopniowej.
Fig. 8. - przedstawia efekt ochronny obecności bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469.
Każdy szczep ochronny przetestowano osobno. Przetestowano także mieszaninę 5 szczepów antagonistycznych razem (WP) w obecności patogenów. K(-) - kontrola negatywna - bulwy ziemniaka nieinokulowane ani bakteriami ochronnymi ani patogennymi, K(+) - kontrola pozytywna, tj. bulwy ziemniaka inokulowane wyłącznie bakteriami patogennymi.
P r z y k ł a d y
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia. Specjalista zrozumie, że choć podane przykłady według wynalazku, działania szczepów bakterii antagonistycznych na rośliny dotyczą głównie ziemniaka to szczepy według wynalazku mogą być wykorzystane do ochrony innych gatunków roślin przed chorobami powodowanymi przez bakterie pektynolityczne, w szczególności przez bakterie z rodzaju Pectobacterium i Dickeya. W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej, postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
P r z y k ł a d 1
- WYBÓR SZCZEPÓW BAKTERII ANTAGONISTYCZNYCH DO MIESZANINY
Przygotowano 15 mieszanin zawierających bakterie antagonistyczne posiadające różne mechanizmy antagonistycznego działania przeciwko patogenom ziemniaka z rodzaju Pectobacterium i Dickeya.
Mieszaniny zostały przygotowane w ten sposób, aby w każdej z mieszanin występowało do 5 szczepów bakterii antagonistycznych o różnym mechanizmie antagonistycznego działania względem bakterii pektynolitycznych.
Na podstawie aktywności 15 mieszanin (Tabela 1) wytypowano, poprzez porównawczą analizę ich składu, te szczepy (komponenty mieszanin), które zapewniały efekt ochronny przeciwko patogenom z rodzaju Pectobacterium i Dickeya, a następnie potwierdzono ich skuteczność w testach laboratoryjnych na plastrach ziemniaka (Fig. 1); były to szczepy: Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469 (Tabela 1).
Mieszanina bakterii antagonistycznych może być aplikowana w postaci zliofilizowanej i/lub w zawiesinie.
Tabela 1. - przedstawia skład zaproponowanych 15 mieszanin bakterii antagonistycznych.
legenda: Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469, X - oznacza inne szczepy bakterii, nieujawnione w tym zgłoszeniu patentowym
PL 236 445 Β1
Tabela 1.
| Mieszanina | Składnik 1 | Składniki | Składnik 3 | Składnik 4 | Składnik 5 |
| 1 | X | X | H440 | X | X |
| 2 | X | H145 | H469 | X | X |
| 3 | X | X | A294 | X | X |
| 4 | X | X | H440 | Al 67 | X |
| 5 | X | A294 | X | X | A167 |
| 6 | X | X | H145 | X | X |
| 7 | X | X | X | X | H440 |
| 8 | X | X | X | X | X |
| 9 | X | H145 | X | X | X |
| 10 | X | X | X | X | X |
| 11 | X | X | X | X | X |
| 12 | A167 | X | H469 | X | X |
| 13 | H440 | X | X | X | X |
| 14 | X | X | A294 | H145 | H469 |
| 15 | X | X | X | X | X |
Przykład 2
- POTWIERDZENIE PRZYNALEŻNOŚCI GATUNKOWEJ WYBRANYCH BAKTERII ANTAGONISTYCZNYCH
W celu szczegółowego określenia przynależności rodzajowej i gatunkowej wyselekcjonowanych szczepów antagonistycznych przeprowadzono identyfikację na podstawie analizy podobieństwa sekwencji genu kodującego 16S rRNA do, dostępnych w publicznych bazach danych (np. GenBank), sekwencji dla innych mikroorganizmów. Przeprowadzono amplifikację bardzo długiego (>1400 nukleotydów) fragmentu genu 16S rRNA, umożliwiając tym samym precyzyjną identyfikację przynależności gatunkowej badanych szczepów. Wyniki identyfikacji gatunkowej otrzymane na podstawie sekwencjonowania niemal kompletnego genu 16S rRNA przedstawia Tabela 2.
Tabela 2. - przedstawia szczepy antagonistyczne o największym potencjale ochronnym i ich przynależność gatunkową, określoną na podstawie analizy filogenetycznej sekwencji genu 16S rRNA o długości około 1500 nukleotydów.
Tabela 2.
| Szczep | Przynależność gatunkowa określona na podstawie kompletnej sekwencji 16S rRNA |
| A294 | Serralia plymuthica |
| A167 | Enterohacter amnigemis |
| H145 | Rahnella aąuatilis |
| H440 | Serraiia rubidaea |
| H469 | Serratia ruhidaea |
Wszystkie wyselekcjonowane szczepy zostały zidentyfikowane do poziomu gatunku.
Przykład 3
- OKREŚLENIE ZDOLNOŚCI BAKTERII ANTAGONISTYCZNYCH DO WZROSTU W TEMPERATURZE PRZECHOWYWANIA BULW (7°C) I INNYCH TEMPERATURACH (10°C, 28°C i 40°C)
Z uwagi na fakt, że efektywna mieszanina bakterii antagonistycznych powinna działać w szerokim zakresie temperatur, które mogą wystąpić podczas wykorzystania mieszaniny na roślinach uprawnych, ważne stało się określenie zdolności mikroorganizmów potencjalnie stanowiących komponenty preparatu ochronnego do przeżycia i wzrostu w różnych temperaturach. W trakcie badań określono zdolność
PL 236 445 Β1 badanych szczepów antagonistycznych do wzrostu w 7°C, 10°C, 28°C i 40°C, na podłożach stałych i płynnych (nośniki) (poniżej). Poniżej podano wyniki dla pięciu szczepów wybranych na podstawie eksperymentów z zakresu efektywności ochronnej na tkance bulw.
Hodowlę w 7°C prowadzono w pożywce TSB (Oxoid) (nośnik płynny) w płytkach 24-dołkowych (Falcon), z wytrząsaniem. Pożywkę inokulowano badanymi bakteriami poprzez dodanie hodowli nocnych (1:50, volume/volume, v/v). Jako kontrolę zastosowano psychrotolerancyjny szczep Bacillus weihenstephanensis CCM 4872 (=DSM 11821T). Dla każdej z prób wykonano 6 powtórzeń technicznych. Pomiar gęstości hodowli komórek bakteryjnych (λ=600 nm) prowadzono co 24 h przez 7 dni z wykorzystaniem czytnika płytek 1420 Multible Counter Victor (Wallac) (Fig. 2).
Hodowlę na podłożu stałym prowadzono w 7°C, 10°C, 28°C i 40°C na podłożu TSA (Oxoid) (nośnik stały) w płytkach 24-dołkowych (800 μΙ pożywki/studzienkę). Na każdą z „mikropłytek” nanoszono 2pl zawiesiny bakteryjnej, stanowiącej odmłodzoną (50:1, v/v) hodowlę nocną badanych szczepów. Jako kontrolę zastosowano psychrotolerancyjny szczep B. weihenstephanensis CCM 4872 (=DSM 11821T). Dla każdej z temperatur wykonano 2 powtórzenia techniczne. Wzrost bakterii oceniano co 24 h w skali umownej („+” - wzrost, ,- brak wzrostu). Obserwację prowadzono przez 7 dni (Tabela 3).
Tabela 3. - przedstawia wzrost bakterii Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczep H440 i Serratia rubidaea szczep H469 w temperaturze 7, 10, 28 i 40°C.
Tabela 3.
| Temperatura wzrostu | Czas hodowli | A294 | Al 67 | H145 | H440 | H469 |
| 7 °C | 24 h | — | — | — | — | — |
| 48 h | — | — | — | — | — | |
| 72 h | + | + | + | + | + | |
| 96 h | + | + | + | + | + | |
| 10 °C | 24 h | — | — | — | — | — |
| 48 h | + | + | + | — | — | |
| 72 h | + | + | + | + | + | |
| 96 h | + | + | + | + | + | |
| 28 °C | 24 h | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 48 h | + | + | + | + | + | |
| 72 h | + | + | + | + | + | |
| 96 h | + | + | + | + | + | |
| 40 °C | 24 h | + | + | + | + | + |
| 48 h | + | + | + | + | + | |
| 72 h | + | + | + | + | + | |
| 96 h | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Legenda | ||||||
| + | Obserwowany wzrost | |||||
| — | Brak wzrostu |
Z wybranych pięciu szczepów antagonistycznych wszystkie zdolne są do wzrostu w badanym zakresie temperatur, to znaczy w temperaturze 7, 10, 28 i 40°C.
Przykład 4
- PRZEŻYWALNOŚĆ SZCZEPÓW BAKTERII ANTAGONISTYCZNYCH W MIESZANINIE BAKTERII ANTAGONISTYCZNYCH
Aby oszacować przeżywalność szczepów bakterii antagonistycznych w mieszaninie ochronnej uzyskano, na drodze selekcji mutantów spontanicznych (wysiewanie na podłoże z antybiotykiem i pasażowanie kultur bakterii w obecności antybiotyku), rifampicynooporne mutanty bakterii Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczep H440 i Serratia rubidaea szczep H469. Wzrost mutantów rifampicynoopornych został
PL 236 445 B1 następnie porównany ze wzrostem szczepów typu dzikiego (niezmutowanych) w celu określenia czy mutanty antybiotykoodporne wykazują podobny czas generacji.
W celu ustalenia czy uzyskane mutanty wykazują takie same tempo wzrostu, sporządzono dla nich krzywe wzrostu i zestawiono je z krzywymi wzrostu dla szczepów typu dzikiego (Fig. 3).
Następnie, wykorzystując pozyskane mutanty rifampicynoopome (antybiotykooporne), osobno dla każdego mutanta szczepu antagonistycznego sprawdzono przeżywalność w mieszaninie czterech innych szczepów antagonistycznych typu dzikiego. Każdą z mieszanin bakterii wykonano przez dodanie w jednakowych proporcjach poszczególnych szczepów o określonej gęstości optycznej (3 McF). W każdej mieszaninie jeden szczep był wyznakowany (oporny na rifampicynę), pozostałe nie. Tak wykonane mieszaniny hodowano z wytrząsaniem w hodowlach płynnych (PDB - potato dextrose broth) (nośnik płynny) i wysiewano na podłoże z rifampicyną w celu zliczenia żywych komórek bakterii (Fig. 4). Wszystkie szczepy bakterii antagonistycznych przeżywały w mieszaninie zawierającej inne szczepy antagonistyczne, co oznacza, że szczepy bakterii antagonistycznych w mieszaninie nie ograniczają wzajemnie swojego wzrostu.
P r z y k ł a d 5
- OKREŚLENIE POTENCJALNEGO WZAJEMNEGO ANTAGONIZMU SZCZEPÓW ANTAGONISTYCZNYCH
Szczepy antagonistyczne mogą nie tylko hamować wzrost szczepów patogennych z rodzaju Pectobacterium i Dickeya (efekt pożądany), ale także wpływać negatywnie na inne szczepy antagonistyczne obecne w mieszaninie/formulacji ochronnej (efekt negatywny), dlatego zasadna była analiza potencjału hamowania wzrostu szczepów antagonistycznych przez inne szczepy ochronne. W ramach eksperymentów przetestowano wzajemny antagonizm pomiędzy szczepami Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469.
Płytki z pożywką PDA (nośnik) (zawierającą w składzie ekstrakt z ziemniaka) inokulowano, w formie murawy, jednym z puli badanych szczepów ochronnych. Następnie na preinokulowane podłoże nanoszono punktowo po 2 μl zawiesin pozostałych szczepów.
Największą zdolność hamowania wzrostu czterech innych testowanych szczepów antagonistycznych posiada szczep Rahnella aquatilis szczep H145. Natomiast brak zdolności hamowania wzrostu innych szczepów antagonistycznych wykazuje Enterobacter amnigenus szczep A167 (Fig. 5).
P r z y k ł a d 6
- EFEKT OCHRONNY APLIKACJI SZCZEPÓW ANTAGONISTYCZNYCH I ICH MIESZANINY PRZECIWKO BAKTERIOM Z RODZAJU PECTOBACTERIUM I DICKEYA NA CAŁYCH (NIEZRANIONYCH) BULWACH ZIEMNIAKA
Przeanalizowano potencjał 5 szczepów ochronnych: Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469, do ograniczania rozwoju symptomów chorobowych powodowanych przez bakterie z rodzaju Pectobacterium i Dickeya. Każdy z badanych izolatów ochronnych przetestowano zarówno pojedynczo jak i w mieszaninie z pozostałymi szczepami (mieszanina 5 szczepów antagoni stycznych została oznaczona jako WP) na bulwach ziemniaka w obecności patogenów.
Mieszanina WP zawiera szczepy: Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440 i Serratia rubidaea szczep H469 w zasadniczo równych proporcjach.
W tym celu opracowano szczegółowy protokół, przedstawiony poniżej:
• Na 24 godziny przed planowanym eksperymentem bulwy ziemniaków należy przełożyć z warunków chłodniczych do temperatury pokojowej (około 20-22°C) celem wyrównania temperatury w bulwach • Przygotowanie bulw ziemniaka do testu. Ziemniaki wypłukać w wodzie kranowej, wyjałowić powierzchniowo poprzez inkubację 20 min w 5% roztworze podchlorynu sodu. Wypłukać 2 razy w wodzie kranowej i wysuszyć w ciągu powietrza w komorze laminarnej (czas około 10-15 minut).
• Przygotowanie zawiesin bakterii antagonistycznych. Przygotować zawiesiny bakterii antagonistycznych (każdą osobno) w wodzie kranowej (nośnik) do uzyskania jednolitej konsystencji mieszaniny aby stężenie końcowe wynosiło 108 cfu/ml (colony forming units/ /ml). W przypadku testowania pojedynczego szczepu ochronnego, mętność zawiesiny
PL 236 445 B1 powinna wynosić 3 jednostki w skali McFarlanda (McF). W przypadku testowania mieszaniny szczepów, mętność powinna wynosić „n” x 3 McF, gdzie „n” to liczba szczepów w docelowej mieszaninie (przy założeniu mieszaniny, która zawiera 5 szczepów antagonistycznych, n=5, przy założeniu mieszaniny, która zawiera 4 szczepy antagonistyczne, n=4, itd.). W przypadku testowania mieszanin zlać zawiesiny wszystkich składników (szczepów) w jednakowych proporcjach objętościowo/objętościowych (v:v) tuż przed rozpoczęciem eksperymentu.
• Przygotowanie mieszanin bakterii antagonistycznych. Mieszaninę antagonistów (bakterii ochronnych, bakterii antagonistycznych) przygotowuje się tuż przed rozpoczęciem eksperymentu poprzez zlanie wszystkich składników mieszaniny (bakterii antagonistycznych) w równych proporcjach objętościowo/objętościowych (v/v).
Mieszanina bakterii antagonistycznych może być aplikowana w postaci zliofilizowanej i/lub w zawiesinie.
• Przygotowanie zawiesin szczepów patogennych. Przygotować zawiesiny bakterii pektynolitycznych (bakterii patogennych), dla każdego szczepu z osobna, w wodzie do uzyskania jednolitej konsystencji mieszaniny aby stężenie końcowe wynosiło 106 cfu/ml (colony forming units / ml). W tym celu gęstość mieszaniny zmierzyć w densytometrze i doprowadzić do wartości 0,03 w skali McF. Sugerowane przygotowanie zawiesin 10 krotnie stężonych 0,3 McF i rozcieńczanie do wymaganego stężenia. Zawiesiny patogenów zmieszać bezpośrednio przed infiltracją (w jednakowych proporcjach objętości owo/objętości owych (v/v)).
Przetestowane zostały dwie metody, w których to wykonano:
1) inokulacje bulw ziemniaka szczepami patogennymi a następnie szczepami ochronnymi (bakteriami antagonistycznymi)
2) inokulacje bulw ziemniaka szczepami ochronnymi (bakteriami antagonistycznymi) a następnie szczepami patogennymi
Przy czym metoda druga okazała się skuteczniejsza i dlatego ta jest preferowana, niemniej obie są możliwe do zastosowania w większej skali (np. półtechniczna, techniczna itp.). Prezentowany protokół został opracowany dla laboratoryjnej skali eksperymentalnej, ale skala eksperymentu może zostać dowolnie zwiększona, jeżeli zajdzie taka potrzeba, poprzez zwiększenie liczby bulw ziemniaków i objętości i stężeń poszczególnych składników i populacji bakterii antagonistycznych):
• Inokulacja bulw - mieszaniny szczepów ochronnych (bakterii antagonistycznych). Ziemniaki po 10 sztuk włożyć do plastikowej, 2-litrowej zlewki i zalać przygotowanymi zawiesinami bakterii ochronnych (bakterii antagonistycznych) (potrzeba około 1,2 litra mieszaniny ma jeden szczep, aby przykryć ziemniaki w zlewce) lub wodą kranową w przypadku prób kontrolnych. Zlewki umieścić w eksykatorze o średnicy 60 cm. Zamknąć eksykator i włączyć pompę próżniową. Po osiągnięciu podciśnienia -65 bar nastawić zegar czasowy na 10 minut. Przez ten czas podciśnienie wzrośnie do około -80 bar i będzie utrzymywane do końca inkubacji. Następnie należy otworzyć zawór eksykatora (zniwelować próżnię) i odczekać 10 minut bez wyjmowania ziemniaków z zawiesiny bakterii. Następnie ziemniaki wyjąć z zawiesiny, umieścić w plastikowych ażurowych pojemnikach (koszykach) (o wymiarach np. 35x25x14 cm) i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (20°C ± 2°C) przez 16-24 godzin (na wolnym powietrzu).
• Inokulacja bulw - mieszaniny szczepów patogennych (bakterie pektynolityczne). Ziemniaki (wcześniej inokulowane zawiesiną szczepów ochronnych (bakterii antagonistycznych) lub nieinokulowane) po 10 włożyć do zlewek plastikowych zalać przygotowaną zawiesiną szczepów patogennych i umieścić w eksykatorze. Zlewki umieścić w eksykatorze o średnicy 60 cm. Zamknąć eksykator i włączyć pompę próżniową. Po osiągnięciu podciśnienia -65 bar nastawić zegar czasowy na 10 minut. Przez ten czas podciśnienie wynosi około -80 bar. Następnie należy otworzyć zawór eksykatora (zniwelować próżnię) i odczekać 10 minut bez wyjmowania ziemniaków z zawiesiny bakterii.
PL 236 445 B1 • Przygotowanie bulw po inokulacji i inkubacja bulw w celu określenia skali symptomów chorobowych. Zainfekowane bulwy wyjąć ze zlewek i pozostawić do wyschnięcia na wolnym powietrzu przez 70 minut po zainfekowaniu. Bulwy po 10 sztuk umieścić w pudełkach plastikowych w których znajdują się metalowe kratki uniemożliwiające bezpośredni kontakt zainokulowanych bulw z dnem pudełka. Na dnie umieszczona jest lignina zalana 130 ml wody destylowanej (stworzenie warunków podwyższonej wilgotności - wilgotność względna około 85-90%). Przygotowane tak bulwy należy inkubować przez 5 dni w 28°C w zamkniętych pojemnikach, a po tym czasie przeprowadzić ewaluacje symptomów chorobowych na każdej zainfekowanej bulwie (ocena symptomów w skali 6-stopniowej, opracowanej na potrzeby testu znajduje się poniżej).
Opis 6-stopniowej skali oceny rozwoju symptomów chorobowych na bulwach ziemniaka, wykorzystanej do określania efektu ochronnego preparatów ochronnych:
• ocena 0 - brak jakichkolwiek symptomów chorobowych na bulwach, • ocena 1 - bulwa zepsuta na powierzchni w jednym lub więcej punktów, ale o ograniczonym obszarze (sumarycznie mniej niż 25% całkowitej powierzchni bulwy), • ocena 2 - symptomy jak w ocenie 1, ale obszar zepsucia 25%-50% powierzchni bulwy ocena 3 - symptomy jak w ocenie 1 i 2, ale dodatkowo pojawia się odwarstwienie skórki bulwy, obszar zepsucia 50%-90% całkowitej powierzchni bulwy, • ocena 4 - symptomy jak w ocenie 3, obszar zepsucia powyżej 90% całkowitej powierzchni bulwy, rdzeń bulwy niezepsuty, • ocena 5 - bulwa całkowicie zmacerowana (100% maceracja tkanek bulwy).
Zdjęcia poglądowe ilustrujące wyżej opisaną skalę nasilenia symptomów chorobowych znajdują się na Fig. 6.
Na potrzeby ewaluacji przyjętej skali symptomów chorobowych na bulwach ziemniaka porównano średnią i medianę ocen, uzyskaną dla danej próby, z uzyskaną dla tej samej próby masą mokrej zgnilizny. Masę mokrej zgnilizny otrzymano porównując wyjściową masę ziemniaków w danej próbie z masą pozostałą po opłukaniu zmacerowanej tkanki (Fig. 7). Otrzymane wyniki pokazały, że ocena w zaproponowanej 6-stopniowej skali jest dobrym miernikiem rozwoju symptomów mokrej zgnilizny, a z uwagi na mniejszą pracochłonność oceny w zaproponowanej skali w odniesieniu do konieczności ważenia zgniłej tkanki, stanowi lepsze rozwiązanie przy eksperymentach na większą skalę.
W zaproponowanych warunkach eksperymentalnych, wszystkie szczepy antagonistyczne były w stanie, w sposób statystycznie istotny, ograniczyć rozwój symptomów chorobowych na bulwach ziemniaka powodowanych przez bakterie z rodzaju Pectobacterium i Dickeya (Fig. 8).
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Mieszanina bakterii antagonistycznych do ochrony roślin lub leczenia roślin znamienna tym, że zawiera- szczep Serratia plymuthica szczep A294, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00143, w dniu 1 grudnia 2017 roku, i- szczep Enterobacter amnigenus szczep A167, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00145, w dniu 1 grudnia 2017 roku, i- szczep Rahnella aquatilis szczep H145, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00144, w dniu 1 grudnia 2017 roku, i- szczep Serratia rubidaea szczepy H440, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00141, w dniu 1 grudnia 2017 roku, iPL 236 445 B1- szczep Serratia rubidaea szczep H469, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00142, w dniu 1 grudnia 2017 roku.
- 2. Mieszanina według zastrz. 1, znamienna tym, że każdy szczep w mieszaninie jest w równej liczbie komórek względem siebie.
- 3. Mieszanina według zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że liczba komórek każdego ze szczepów w mieszaninie wynosi przynajmniej 101 komórek w mililitrze (cfu/ml), korzystnie 108 cfu/ml.
- 4. Mieszanina według zastrz. 1, znamienna tym, że jest w postaci zliofilizowanej i/lub w zawiesinie.
- 5. Mieszanina według zastrz. 1, znamienna tym, że szczepy bakteryjne są aktywne metabolicznie.
- 6. Zastosowanie mieszaniny opisanej w którymkolwiek z zastrz. 1-5 jako środek do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL423806A PL236445B1 (pl) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Mieszanina szczepów bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440, Serratia rubidaea szczep H469 i zastosowanie do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya |
| EP18210901.7A EP3495510B1 (en) | 2017-12-08 | 2018-12-06 | Antagonistic bacterial strains, compositions thereof and use for plant protection |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL423806A PL236445B1 (pl) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Mieszanina szczepów bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440, Serratia rubidaea szczep H469 i zastosowanie do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL423806A1 PL423806A1 (pl) | 2019-06-17 |
| PL236445B1 true PL236445B1 (pl) | 2021-01-11 |
Family
ID=65717692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL423806A PL236445B1 (pl) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Mieszanina szczepów bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440, Serratia rubidaea szczep H469 i zastosowanie do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3495510B1 (pl) |
| PL (1) | PL236445B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4311856A2 (en) | 2022-07-25 | 2024-01-31 | Instytut Ogrodnictwa - Panstwowy Instytut Badawczy | Strains of the genus pantoea spp. and the use of strains of the genus pantoea spp. in plant protection |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110564644B (zh) * | 2019-09-17 | 2021-04-02 | 山东农业大学 | 一种具有促生效果的深红沙雷氏菌及其应用 |
| CN111269859B (zh) * | 2020-03-06 | 2022-05-10 | 中国农业大学 | 一株溶磷、促生、适应性强的玉米根际促生菌及其应用 |
| KR102564694B1 (ko) * | 2021-03-16 | 2023-08-08 | 전남대학교산학협력단 | 세라치아 프리무티카 c-1 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 세균병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 세균병 방제 방법 |
| CN113881593B (zh) * | 2021-09-30 | 2023-06-27 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一株具有生防潜力的槭树拉恩氏菌及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201100427D0 (en) * | 2011-01-11 | 2011-02-23 | Stichting Dienst Landbouwkundi | Agents for biological control of bacterial plant pathogens |
| RU2595405C1 (ru) * | 2015-11-19 | 2016-08-27 | Акционерное общество "Щёлково Агрохим" | ШТАММЫ БАКТЕРИЙ РОДОВ Bacillus, Pseudomonas, Rahnella, Serratia, ОБЛАДАЮЩИЕ ФИТОПРОТЕКТОРНОЙ И РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ ЭТИХ ШТАММОВ |
-
2017
- 2017-12-08 PL PL423806A patent/PL236445B1/pl unknown
-
2018
- 2018-12-06 EP EP18210901.7A patent/EP3495510B1/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4311856A2 (en) | 2022-07-25 | 2024-01-31 | Instytut Ogrodnictwa - Panstwowy Instytut Badawczy | Strains of the genus pantoea spp. and the use of strains of the genus pantoea spp. in plant protection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3495510A1 (en) | 2019-06-12 |
| EP3495510B1 (en) | 2021-07-21 |
| PL423806A1 (pl) | 2019-06-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Beuchat | Vectors and conditions for preharvest contamination of fruits and vegetables with pathogens capable of causing enteric diseases | |
| PL236445B1 (pl) | Mieszanina szczepów bakterii antagonistycznych Serratia plymuthica szczep A294, Enterobacter amnigenus szczep A167, Rahnella aquatilis szczep H145, Serratia rubidaea szczepy H440, Serratia rubidaea szczep H469 i zastosowanie do ochrony lub leczenia zakażeń roślin powodowanych przez bakterie Pectobacterium i Dickeya | |
| KR101624628B1 (ko) | 작물의 생육촉진 및 내한성 증강효과를 갖는 신규한 바실러스 발리스모티스 ｂｓ０７ｍ 균주 및 이를 포함하는 미생물제제 | |
| Wahab et al. | Effects of some plant extracts, bioagents, and organic compounds on Botrytis and Sclerotinia molds | |
| Bisutti et al. | Field assessment on the influence of RhizoVital® 42 fl. and Trichostar® on strawberries in the presence of soil-borne diseases | |
| O’Sullivan et al. | Developing actinobacterial endophytes as biocontrol products for fusarium pseudograminearum in wheat | |
| Singh et al. | In vitro evaluation of antibacterial chemicals and bioagents against Ralstonia solanacearum infecting bacterial wilt in ginger | |
| Jahan et al. | Characterization of crown rot disease of banana fruit and eco-friendly quality improvement approach during storage | |
| KR20150069594A (ko) | 스트렙토마이세스 속 kr-oo4 균주 및 이의 용도 | |
| AU2018233513A1 (en) | Preparation containing at least fludioxonil and a mixture containing Aureobasidium pullulans strains | |
| Chiuraise et al. | Seed treatment with Trichoderma harzianum strain kd formulation reduced aflatoxin contamination in groundnuts | |
| Kareem et al. | Evaluation of Trichoderma harzianum biological control against Fusarium oxysporum f. sp. melongenae | |
| Alharbi et al. | Impact of some Bacillus spp., inducer resistant chemicals and cow’s skim milk on management of pepper powdery mildew disease in Saudi Arabia | |
| PL234499B1 (pl) | Kompozycja zawierająca wyizolowane szczepy saprofitycznych bakterii glebowych, biopreparat zawierający taką kompozycję wykorzystywane do zwalczania patogenów roślin w glebie, użyźniania gleby i przywracania naturalnej równowagi biologicznej mikroflory oraz biostymulacji rozwoju i wzrostu roślin w sposobach i zastosowaniach je wykorzystujących | |
| KR101759521B1 (ko) | 식물저장병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물저장병 방제방법 | |
| Ghazanfar et al. | Suppressiveness of late blight and fusarium wilt of tomato with Trichoderma fortified composts. | |
| Saharan et al. | Disease Management | |
| EP4311856A2 (en) | Strains of the genus pantoea spp. and the use of strains of the genus pantoea spp. in plant protection | |
| NOUR et al. | Determination of the efficacies of different phosphites in the management of tomato bacterial speck disease caused by Pseudomonas syringae pv. tomato | |
| Lee | Bio-control of the soil-borne pathogen Rhizoctonia solani of radish (Raphanus sativus L.) by Trichoderma species | |
| Mihajlović et al. | Effects of fungicides and biofungicides on Rhizoctonia solani, a pathogen of pepper | |
| Minchinton et al. | Identification of IPM strategies for Pythium induced root rots in Apiaceae vegetable crops | |
| Khalil et al. | Efficacy of some biocontrol organisms, animal manures and fungicides on controlling of potato black scurf and stem canker disease | |
| Zhang | Chemical And Non-Chemical Control Of Potato Pink Rot | |
| Ranjan et al. | Postharvest Diseases of Potato and Their Management |