PL231361B1 - Sposób i urządzenie do wytwarzania trójwymiarowych form celulozy bakteryjnej - Google Patents

Abstract

Wynalazek ujawnia zagadnienia opracowania sposobu i urządzenia do wytwarzania trójwymiarowych form celulozy bakteryjnej na drodze hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem bakterii fermentacji octowej, przepuszczanego pod podwyższonym ciśnieniem przez przepuszczalne dla powietrza, a nieprzepuszczalne dla cieczy matryce.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób i urządzenie do wytwarzania trójwymiarowych form celulozy bakteryjnej.

Celuloza bakteryjna wytwarzana jest przez bakterie fermentacji octowej z rodzaju Gluconoacetobacter (dawniej Acetobacter), które są typowymi mezofilnymi tlenowcami. Są to bakterie gram- ujemne o kształcie pałeczki, wyposażone w enzym - syntazę celulozową, który katalizuje reakcję polimeryzacji cząsteczek glukozy, zawartych w podłożu hodowlanym, w liniowy polisacharyd - celulozę- gromadzący się poza komórką. Z takich łańcuchów łączących się w procesie krystalizacji w mikrofibryle, zbudowana jest struktura celulozy bakteryjnej. Mikrofibryle celulozy bakteryjnej są 100 razy mniejsze niż w celulozie roślinnej, z czym wiąże się duża zdolność przywierania do innych materiałów. W warunkach hodowli stacjonarnej wytwarzana celuloza bakteryjna gromadzi się na powierzchni pożywki w formie sprężystej i elastycznej membrany. Membrana ta stanowi czystą celulozę nie zawierającą ligniny ani hemicelulozy. Odpowiednio formując powierzchnię, na której tworzona jest membrana, można np. uzyskać rurki o dowolnej średnicy i długości, które są doskonałymi implantami naczyń krwionośnych nie są przy tym przyczyną powstawania zakrzepów. Po odpowiedniej modyfikacji chemicznej, rurki takie uzyskują większą sztywność, mogą być stosowane jako osłonki zerwanych włókien nerwowych. Uzyskane w ten sposób naczynia krwionośne lub osłonki włókien nerwowych mają wysoki stopień biokompatybilności. Oznacza to, że nie są traktowane przez organizm jako ciało obce i przezeń odrzucane.

Celuloza bakteryjna jest również pierwszym materiałem spełniający wymagania stawiane nowoczesnym opatrunkom, który jest wytwarzany na drodze biotechnologicznej. Oprócz medycyny polimer ten, ze względu na swoją wysoką czystość i jednolitą strukturę, znalazł zastosowanie m.in. w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, papierniczym, ochronie środowiska, akustyce, produkcji żywności dietetycznej.

Znane sposoby formowania celulozy mikrobiologicznej w formy rurek polegają na wykorzystaniu jako matrycy do kształtowania celulozy bakteryjnej materiałów półprzepuszczalnych (przepuszczalnych dla gazu, a nie przepuszczalnych dla cieczy) np. silikonu. Znane są doniesienia o metodzie formowania form cylindrycznych z celulozy bakteryjnej z wykorzystaniem rurek silikonowych, gdzie pożywka w sterylnych warunkach wlewana jest do środka rurki, a następnie zaszczepiane są bakterie. Takie metody bazują na mechanizmie dyfuzji gazu przez przegrodę jaką jest ścianka rurki.

Metoda otrzymywania modyfikowanej celulozy bakteryjnej w formie rurek, bezpośrednio w procesie biosyntezy z udziałem bakterii rodzaju Acetobacter, opisana została w artykule: „Biosynteza modyfikowanej celulozy bakteryjnej w formie rurek, Ciechańska Danuta, Wietecha Justyna, Kaźmierczak Dorota, Kazimierczak Janusz, Fibresand Textiles in Eastern Europe, nr 5 (82) /2010, strony 98-104. Proces prowadzono z udziałem szczepu bakterii Acetobactersp. (CCM 2360) z kolekcji Mikroorganizmów w Czechach na Uniwersytecie Masaryk w Brnie, w środowisku modyfikowanym oligomerami chitozanu. Rolę matrycy pełniła rurka silikonowa. Stosowano rurki o średnicy 10 i 16 mm. Hodowlę prowadzono przez 7 dni w termostatowanej komorze przy temperaturze 30°C i wymuszonym przepływie powietrza na podłożu Hestrin-Schramm zawierającym w 1000 cm³ roztworu: 20 g glukozy, 5,0 g ekstraktu drożdży, 5,0 g peptonu sojowego, 2,7 g fosforanu disodowego, 1,2 g kwasu octowego, 20 cmetanolu i 2,0 g oligomerów chitozanu.

Z patentu EP186495 znany jest sposób wytwarzania celulozy mikrobiologicznej, w którym zaszczepioną bakteriami Acetobacter xylinum pożywkę wprowadza się do odpowiednio ukształtowanej matrycy przepuszczalnej dla gazów, a nieprzepuszczalnej dla wypełniającej ją pożywki i zawartych w niej mikroorganizmów. Matryca może być wykonana z takich materiałów jak: polichlorek winylu, celuloza, pochodne celulozy, kauczuk silikonowy, kauczuk silikonowy zmieszany z krzemionką, kopolimery silikonu z poliwęglanem, polialkilosulfon, politereftalan etylenu lub silikon. Mikrobiologiczna celuloza produkowana jest wewnątrz matrycy i przybiera jej kształt. Możliwe jest również rozwiązanie odwrotne, w którym wnętrze matrycy wypełnione jest gazem, a matryca zanurzona jest w płynnej hodowli. Proces przebiega z wykorzystaniem podłoża Schramm-Hestrin. Zawiera ono 8% objętościowych octu, 5% objętościowych etanolu i 4% wagowych ekstraktu słodowego. Podłoże ma pH pomiędzy 3,5 a 5,0.

Patent EP396344 opisuje sposób wytwarzania celulozy mikrobiologicznej w postaci rurek. Celuloza wytwarzana jest na jednej lub po obu stronach przepuszczalnego rurowego nośnika. Nośnik ten może być celofanem, teflonem, silikonem, ceramiką, włókniną lub płótnem. Pożywka wybrana jest

PL 231 361 B1 z grupy obejmującej poliole, polisacharydy, proteiny, naturalne syntetyczne substancje wysoce spolimeryzowane, korzystnie glicerynę. Wytwarzane rurki wykorzystywane są jako sztuczne naczynia krwionośne.

Również patent EP199408981 opisuje sposób i urządzenie do wytwarzania celulozy w formie rurek. Celuloza wytwarzana jest wewnątrz formy utworzonej z dwóch szklanych półrurek połączonych pierścieniami w ten sposób, że połączone półrurki nie przylegają ściśle do siebie, a oddzielone są, przebiegającymi wzdłuż nich, szczelinami. Wnętrze formy zajmuje okrągły szklany pręt. Pożywka ze szczepami bakterii dostaje się do środka formy przez szczelinę dolną, a powietrze dopływa przez szczelinę górną. Powstająca celuloza zaczyna wypełniać formę od dołu, po czym stopniowo ją wypełnia w całości. W momencie, gdy celuloza zaczyna wydostawać się przez górną szczelinę, formę otwiera się i wytworzona celuloza może być usunięta. Po wyjęciu z formy wytworzona celuloza gotowana jest przez 10 minut w 0,1 n roztworze NaOH celem usunięcia pozostałych bakterii. Hodowla prowadzona jest z pomocą szczepu bakterii Acetobacterxylinus przez 7 dni. Jako pożywkę stosowano roztwór składający się z 20 g glukozy, 5 g wyciągu z drożdży, 5 g baktopeptonu, 2,7 g Na3PO4, 1,15 g kwasu cytrynowego przy pH 6.

Istotą rozwiązania według wynalazku jest sposób wytwarzania trójwymiarowych form celu lozy bakteryjnej na drodze hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem bakterii fermentacji octowej i półprzepuszczalnych matryc. Sposób polega na tym, że matryce zanurza się w sterylnej pożywce, p rzez matryce przepuszcza powietrze pod zwiększonym ciśnieniem, 1-10 barów przy prędkości przepływu 1-200 l/min., które na zewnętrznej powierzchni matrycy tworzy strefę napowietrzonego medium, w której następuje wzrost bakterii wytwarzających biopolymer. Hodowlę prowadzi się w obecności nietoksycznych cieczy niemieszających się z wodą o niskim napięciu powierzchniowym, wybranych z grupy obejmującej oleje silikonowe, oleje roślinne, silikony, siloksany, olej parafinowy, olej mineralny, niskotopliwe syntetyczne woski i estry hydrofobowe, korzystnie siloksany, silikony, olej mineralny, a szczególnie korzystnie cyclopentasiloksan.

Poziom płynu w naczyniu ustawia się tak, aby warstwa płynnej pożywki była o 3-4 cm powyżej górnej krawędzi matryc. Jako półprzepuszczalne matryce wykorzystuje się matryce wybrane z grupy obejmującej silikon, kauczuk silikonowy, kauczuk silikonowy zmieszany z krzemionką, kopolimery silikonu z poliwęglanem, politetrafluoroetylen, polichlorek winylu, politereftalan etylenu, celulozę. Jako materiał biologiczny wykorzystuje się bakterie rodzaju Gluconoacetobacter. Jako sterylną pożywkę stosuje się pożywkę mikrobiologiczną na bazie podłoża Hestrin-Schrama zawierającą: 1-15% glukozy, 0,2-5% peptonu, 0,2-5% ekstraktu drożdżowego, 0,1-1,0% wodorofosforanu disodowego, 0,05-0,15% kwasu cytrynowego, 0,1-0,5% siarczanu magnezu.

Istotą rozwiązania jest również urządzenie do wytwarzania trójwymiarowych form celulozy bakteryjnej na drodze hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem bakterii fermentacji octowej i półprzepuszczalnych matryc, które składa się z umieszczonych w naczyniu połączonych suwliwie półprzepuszczalnych matryc osadzonych w króćcach, zanurzonych w płynnej pożywce i podłączonych do przyłączy gazu za pośrednictwem króćców. Materiał na matryce wybrany jest z grupy obejmującej silikon, kauczuk silikonowy, kauczuk silikonowy zmieszany z krzemionką, kopolimery silikonu z poliwęglanem, politetrafluoroetylen, polichlorek winylu, politereftalan etylenu, celulozę.

Zastosowane materiały półprzepuszczalne stanowią jednocześnie filtr mikrobiologiczny, dzięki czemu nie ma konieczności używania gazów sterylnych, bądź systemów filtrujących.

Wynalazek objaśniono w przykładach wykonania i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia półwidok - półprzekrój z boku proponowanego rozwiązania, fig. 2 - przekrój z góry proponowanego rozwiązania.

Przykłady te w żaden sposób nie ograniczają zakresu ochrony wynikającego z zastrzeżeń patentowych.

P r z y k ł a d 1. Całość opisanych czynności wykonywana jest w warunkach sterylnych, tj. w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do naczynia 3 montuje się króćce 1, prostą dwuczęściową matrycę w postaci rurki silikonowej 2 i przyłącza gazu. Całość sterylizuje się promieniowaniem UV, a następnie wlewa sterylną pożywkę mikrobiologiczną na bazie podłoża Hestrina-Schrama o pH 5,5 zawierającą: 5% glukozy, 5% peptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,5% wodorofosforanu disodowego, 0,07% kwasu cytrynowego, 0,1% siarczanu magnezu. Poziom płynu w naczyniu ustawia się tak, aby warstwa płynu w naczyniu była o 3 cm powyżej górnej krawędzi silikonowej rurki 2 stanowiącej rusztowanie do tworzenia trójwymiarowej struktury z celulozy. Następnie do naczynia dodawane jest inokulum z bakteriami Gluconoacetobacter w ilości 10%(V/V) o gęstości 10⁵ komórek/ml, a następnie

PL 231 361 B1 sterylna ciecz w postaci cyclopentasiloxanu. Naczynie hodowlane zamyka się i przenosi do komory klimatycznej z możliwością przyłączenia sprężonego powietrza. Do króćców 1 w naczyniu hodowlanym podłączane jest sprężone powietrze przepływające z szybkością 1 l/min w nadciśnieniu 10 barów. Całość inkubuje się w 30°C przez okres 7 dni. Po zakończeniu procesu ciecz hodowlana jest usuwana, a po zdjęciu rurki silikonowej 2 z króćców 1 usuwa się z jej powierzchni wytworzoną przez bakterię celulozę, uzyskując trójwymiarową strukturę o kształcie zastosowanej matrycy.

P r z y k ł a d 2 - wytwarzanie prostych rurek z celulozy bakteryjnej przy wykorzystaniu matrycy z polichlorku winylu.

Całość opisanych czynności wykonywana jest w warunkach sterylnych, tj. w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do naczynia 3 montuje się króćce 1, prostą dwuczęściową rurkę z polichlorku winylu 2 przyłącza gazu. Całość sterylizuje się promieniowaniem UV, a następnie wlewa sterylną pożywkę o pH 5,5 zawierającą: 10% glukozy, 0,5% peptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,5% wodorofosforanu disodowego, 0,07% kwasu cytrynowego, 0,1% siarczanu magnezu. Poziom płynu w naczyniu ustawia się tak, aby warstwa płynu była o 4 cm powyżej górnej krawędzi rurki z polichlorku winylu stanowiącej rusztowanie do tworzenia trójwymiarowych struktur z celulozy. Następnie do naczynia dodawane jest inokulum z bakteriami Gluconoacetobacter w ilości 10% (v/v) o gęstości 10⁷ komórek/ml, a następnie sterylna ciecz w postaci silikonu. Naczynie hodowlane zamyka się i przenosi do komory klimatycznej z możliwością przyłączenia sprężonego powietrza. Do króćców 1 w naczyniu hodowlanym podłączane jest sprężone powietrze o szybkości przepływu 100 l/min w nadciśnieniu 1,5 bara. Całość inkubuje się w 30°C przez okres 7 dni. Po zakończeniu hodowli ciecz hodowlana jest usuwana, a po zdjęciu rurki 2 z króćców 1 usuwa się z jej powierzchni wytworzoną przez bakterie celulozę, uzyskując trójwymiarową strukturę o kształcie zastosowanej matrycy.

P r z y k ł a d 3 - wytwarzanie rozgałęzionej rurki z celulozy przy wykorzystaniu matrycy z politetrafluoroetylenu.

Całość opisanych czynności wykonywana jest w warunkach sterylnych, tj. w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do naczynia montuje się króćce 1, trzyczęściową rurkę 2 z politetrafluoroetylenu w kształcie litery Y, przyłącza gazu, a następnie całość sterylizuje promieniowaniem UV, po czym wlewa się sterylną pożywkę o pH 6,2 zawierającą: 10% glukozy, 0,3% peptonu, 0,2% ekstraktu drożdżowego, 0,5% wodorofosforanu disodowego, 0,15% kwasu cytrynowego, 0,5% siarczanu magnezu, tak aby warstwa płynu była 3,5 cm powyżej górnej krawędzi rurki 2 I dodaje inokulum z bakteriami Gluconoacetobacter w ilości 10% (v/v) o gęstości 10⁹ komórek/ml oraz olej mineralny. Naczynie hodowlane zamyka się i przenosi do komory klimatycznej z możliwością przyłączenia sprężonego powietrza. Do króćców 1 w naczyniu hodowlanym podłączane jest sprężone powietrze o szybkości przepływu 200 l/min w nadciśnieniu 0,2 bara. Całość inkubuje się w 30°C przez okres 7 dni. Po zakończeniu hodowli ciecz hodowlana jest usuwana, a po zdjęciu rozgałęzionej rurki politetrafluoroetylenowej 2 z króćców 1, usuwa się z niej wytworzoną przez bakterie celulozę uzyskując trójwymiarową strukturę o kształcie zastosowanej matrycy.

Dzięki rozłącznej, korzystnie suwliwej, konstrukcji połączenia rurek półprzepuszczaln ych wytworzona bakteryjna celuloza może być zdjęta z matrycy bez konieczności jej rozcinania.

Zaletą sposobu według wynalazku w stosunku do rozwiązań opisanych wcześniej jest to, że zwiększone ciśnienie gazu w układzie sprzyja jego przenikaniu przez ścianki matrycy do pożywki, dzięki czemu możliwy jest szybszy wzrost komórek bakterii, które są bezwzględnymi tlenowcami (nie mogą rosnąć bez tlenu). W układzie ma miejsce stały przepływ gazu, przez co niezbędny do wzrostu komórek tlen dostarczany jest w sposób nieprzerwany.

- Stosowany jest przepływ powietrza w zakresie od 1 do 200 l/min., w nadciśnieniu w zakresie od 1 do 10 barów.

Jednym z kluczowych czynników decydujących o wzroście bakterii rodzaju Gluconoacetobacter jest obecność tlenu. Jego brak hamuje wzrost komórek. W przypadku gdy hodowla trójwymiarowych form odbywa się w podłożu bez dodatku substancji niemieszającej się z wodą, duża część pożywki wykorzystana jest na produkcję biofilmu z celulozy na powierzchni naczynia, gdzie stężenie tlenu jest wysokie. Po nałożeniu na powierzchnię pożywki cieczy niemieszającej się następuje odcięcie dostępu tlenu. Dzięki temu składniki pożywki wykorzystywane są głównie przez komórki zasiedlające okolice półprzepuszczalnej matrycy.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania trójwymiarowych form celulozy bakteryjnej na drodze hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem bakterii fermentacji octowej i półprzepuszczalnych matryc, znamienny tym, że matryce zanurza się w sterylnej pożywce, przez matryce przepuszcza powietrze pod zwiększonym ciśnieniem od 1-10 barów przy prędkości przepływu 1-200 l/min., przy czym hodowlę prowadzi się w obecności nietoksycznych cieczy niemieszających się z wodą o niskim napięciu powierzchniowym, wybranych z grupy obejmującej oleje silikonowe, oleje roślinne, oleje silikonowe, silikony, siloksany, olej parafinowy, olej mineralny, niskotopliwe syntetyczne woski i estry hydrofobowe.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ciecz niemieszającą się z wodą stosuje się siloksany, silikony, olej mineralny.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako ciecz niemieszającą się z wodą stosuje się cyclopentasiloksan.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poziom płynu w naczyniu ustawia się tak, aby warstwa płynnej pożywki była o 3-4 cm powyżej górnej krawędzi matryc (2).
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako półprzepuszczalne matryce wykorzystuje się matryce wybrane z grupy obejmującej silikon, kauczuk silikonowy, kauczuk silikonowy zmieszany z krzemionką, kopolimery silikonu z poliwęglanem, politetrafluoroetylen, polichlorek winylu, politereftalan etylenu, celulozę.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bakterie wykorzystuje się bakterie rodzaju Gluconoacetobacter.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sterylną pożywkę stosuje się pożywkę mikrobiologiczną na bazie podłoża Hestrina-Schrama zawierającą: 1-15% glukozy, 0,2-5% peptonu, 0,2-5% ekstraktu drożdżowego, 0,1-1,0% wodorofosforanu disodowego, 0,05-0,15% kwasu cytrynowego, 0,1-0,5% siarczanu magnezu.
8. 8. Urządzenie do wytwarzania trójwymiarowych form celulozy bakteryjnej na drodze hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem bakterii fermentacji octowej i półprzepuszczalnych matryc, znamienne tym, że składa się z umieszczonych w naczyniu (3) połączonych półprzepuszczalnych matryc (2), zanurzonych w płynnej pożywce i podłączonych do przyłączy gazu za pośrednictwem króćców (1).
9. 9. Urządzenie według zastrz. 8, znamienne tym, że materiał na matryce (2) wybrany jest z grupy obejmującej silikon, kauczuk silikonowy, kauczuk silikonowy zmieszany z krzemionką, kopolimery silikonu z poliwęglanem, politetrafluoroetylen, polichlorek winylu, politereftalan etylenu, celulozę.