PL230800B1 - Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw2 i sposób identyfikacji molekularnej genu Dw2 warunkującego dominującą karłowatość żyta (Secale cereale L.) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta, o sekwencjach: Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA. Zgłoszenie obejmuje też sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA, przy czym stosuje się marker Rye3353164pp2.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw2 i sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta przy wykorzystaniu pary oligonukleotydowych starterów i reakcji łańcuchowej polimerazy.

Gen karłowatości o dominującym dziedziczeniu występuje w populacji K10028 zdeponowanej w Banku Genów IPK Gatersleben, Niemcy (Accession nr. R1378). Ze źródłowej populacji wyprowadzono linię wsobną stanowiącą materiał badawczy.

Odporność na wylęganie to jedna z ważniejszych cech selekcyjnych oceniana w programach hodowlanych wielu roślin uprawnych, w tym żyta. Cecha ta jest wyraźnie skorelowana z wysokością roślin. Im niższe rośliny tym odporność na wylęganie wzrasta. Wystąpienie tego zjawiska wpływa na problemy podczas mechanicznego zbioru oraz na gorsze wykształcenie ziarna, zmniejszenie liczby kłosów produkcyjnych, liczby ziaren z rośliny i masy 1000 ziaren, co przekłada się bezpośrednio na spadek plonu. Szacuje się, że problem ten, w latach o przeciętnym układzie warunków pogodowych, dotyczy około 5-10% plantacji, a w przypadku niekorzystnych warunków pogodowych (duże opady i silny wiatr w fazie od kwitnienia do dojrzałości pełnej) straty w plonie mogą sięgać 50%, i więcej, co przyczynia się do znacznych strat finansowych. Najlepszym rozwiązaniem byłoby wprowadzenie do odmian żyta źródła karłowatości, które pozwoli wyhodować formy odporne na wylęganie i wysoko plonujące.

Spośród 17 genów warunkujących niski pokrój roślin zidentyfikowanych dotychczas w życie, większość przypisano do chromosomów (Bórner A., Korzun V. 1998. A consensus linkage map of rye (Secale cereale L.) including 374 RFLPs, 24 isozymes and 15 gene loci. Theor. Appl. Genet. 97: 1279 -1288 oraz Bórner A., Gale M.D., Appleford N.E.J., Lenton J.R. 1993. Gibberelin status and responsiveness in shoots oftall and dwarf genotypes of diploid rye (Secale cereale). Physiol. Plant. 89: 309 -314 oraz Bórner A., Plaschke J., Korzun V., Worland A.J. 1996. The relationships between the dwarfing genes of wheat and rye. Euphytica 89: 69-75 oraz Kubicka H., Kubicki B. 1990. Two types of dwarfness in winter rye (Secale cereale L.). Gen. Pol. 81: 9-19 oraz Melz G., Schlegel R., Sybenga J. 1988. Identification of the chromosomes in the “Esto” set of trisomics. Plant Breed. 100: 169-172). Trzy z tych genów warunkują karłowatość dominującą, pozostałe są recesywne. Wśród dominujących genów w praktycznej hodowli żyta zastosowanie znalazł jedynie Dw1 (syn. Ddw1, HI). Gen Dw), wywodzi się z najlepiej poznanego źródła żytniej karłowatości - mutanta EM1 (Kobyljanski V.D. 1972. K genetike dominantnogo faktora korotkosteblnosti rżi. Genetika 8(2): 12-17). Gen ten zmapowano na końcowym odcinku długiego ramienia chromosomu 5R (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173 oraz Bórner A., Korzun V., Voylokov A.V., Weber W.E. 1999. Detection of quantitative trait loci on chromosome 5R of rye (Secale cereale L.). Theor. Appl. Genet. 98: 1087-1090). Drugi dominujący gen karłowatości Dw2 (DdW2) zlokalizowano wstępnie na chromosomie 7R (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173). Źródłem tego genu jest karłowa forma żyta pochodząca z Bułgarii (K10028). Trzeci gen warunkujący karłowatość dominującą został sklasyfikowany jako odrębny od Dw) i DW2, i opisany w publikacji Stojałowski S., Myśków B., Hanek M., 2012. Phenotypic effect and chromosomal localization of DdW3, the dominant dwarfing gene in rye (Secale cereale L.). Euphytica, Vol. 201, 1: 43-52 jako Dw3.

Poza przedstawionymi 3 genami dominującymi w populacjach żyta obecnych jest kilkanaście genów recesywnych. Poza znanymi i opisanymi w literaturze genami karłowatości żyta mogą się pojawić spontanicznie nowe mutanty, w których obecne są inne geny powodujące skrócenie roślin a nie znane dotychczas. Identyfikacja nowych genów karłowatości wymagałaby wykonania osobnych krzyżowań tego źródła z formami posiadającymi wszystkie znane geny. Prace takie są nie tylko długotrwałe (wyniki po ok. 3 latach) ale i problematyczne gdyż do niektórych źródeł karłowatości nie ma już dostępu.

Celem wynalazku było znalezienie takich markerów, które nie tylko odróżniałyby formy karłowe od wysokich, ale również pozwalały potwierdzić źródło karłowatości (tu gen DW2).

Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta, według wynalazku, o sekwencjach:

Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC

Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA

Sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta, według wynalazku, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach:

PL 230 800 Β1

Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC

Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA przy czym stosuje się marker Rye3353164pp2 (Wzór 1- prążek markera Rye3353164pp2 związany z cechą karłowatości genu Dw2).

Wynalazek jest bliżej w przykładzie wykonania i na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia elektroforegramy, na których pokazano segregację markera Rye3353164pp2 w populacji mapującej F2 mieszańca pomiędzy karłową linią K10028 a linią o normalnym wzroście (541) (Wzór 1 zaznaczono strzałką). Wskazany marker posiada długość 182 nt. Figura 2 przedstawia elektroforegram, na którym pokazano segregację markera Rye3353164pp2 wśród niespokrewnionych linii wsobnych (A1-A48). Pełnymi nazwami wyróżniono linie posiadające gen Dw2: K10028_1 i K10028_2.

W pierwszym etapie wytworzono populację mapującą F2 mieszańca linii 541 (linia wysoka) i K10028 (linia karłowa) składającą się z 94 osobników. Każdy z osobników populacji mapującej został oznaczony fenotypowo: „k” (karłowy) lub „w” (wysoki). W trakcie badań opracowano dominujący marker Rye3353164pp2, który w prosty i szybki sposób identyfikuje rośliny żyta posiadające gen Dw2 zarówno wśród genotypów populacji mapującej (Fig. 1) jak i w grupie genotypów niespokrewnionych (Fig. 2).

Przeprowadzone przez Zgłaszającego badania markera Rye3353164pp2 wykazały, że jest on znacznikiem genu Dw2 w życie.

Metoda identyfikacji markera Rye3353164pp2

Materiał - DNA izolowane z liści żyta jest znanymi metodami przy wykorzystaniu komercyjnie dostępnych zestawów.

Startery do amplifikacji markera Rye3353164pp2 zaprojektowano na podstawie sekwencji własnych.

Sekwencje starterów:

Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC

Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA

Startery projektowano przy użyciu programu Geneious (Biomatters Ltd).

Skład mieszaniny reakcji PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy):

DNA	10-100 ng
10 x Taq bufor (200 mM Tris-HCl, 200 mM KC1, 50 mM (NH4)2SO4	1 x
dNTP	0,2 mM
MgCh	1 -3 mM
Polimcraza Taq	0,5-1,5 u
spermidyna	0,04 mM
Starter F	0,1 - 1 μΜ
Starter R	0,1 - 1 μΜ
H2O	W zależności od objętości końcowej mieszaniny PCR

Warunki amplifikacji DNA

Reakcję PCR przeprowadzano w termocyklerach: GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) lub T Professional gradient Thermocycler (Biometra).

Parametry PCR: 95°C - 1-3 min, 7 cykli (95°C - 45s, 67-1/cykl°C - 45s, 72°C - 45s), 28 cykli (95°C - 45s, 60°C - 45s, 72°C - 45s), 72°C - 5-10 min.

PL 230 800 Β1

Identyfikacja markera Rye3353164pp2

Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzano w 1,5% żelu agarozowym, bufor 1xTBE pH=8.5 przy napięciu 100 V przez 1,5 h z dodatkiem bromku edytyny (2-10¹⁰ %). Jako wzorzec długości fragmentów DNA użyto GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas). Wizualizacji wyników dokonano przy użyciu systemu ChemiDoc™ MP System (Biorad).

Wyniki

Testowanie markera Rye3353164pp2 na osobnikach populacji mapującej mieszańca 541 xK10028 wykazało 97% zgodność segregacji markera z karłowatością (Fig. 1).

Uzyskany dla kolekcji 48 linii wsobnych żyta, w tym 2 genotypów posiadających gen Dw2, wynik identyfikacji z zastosowaniem markera Rye3353164pp2 i metody stanowiącej przedmiot wynalazku zaprezentowano na Fig. 2. Elektroforegram przedstawia zmienność amplifikowanych fragmentów DNA po włączeniu do analizy pary starterów F i R. Poza prążkiem markera Rye3353164pp2 stwierdzonym w liniach K10028_1 i K10028_2 oraz w linii A23, obserwowano również obecność dodatkowego produktu (dwa prążki) w liniach A10 i A21, nie związanych z karłowatością. Skuteczność zastosowanego markera Rye3353164pp2 i metody identyfikacji genu Dw2 w niespokrewnionych genotypach żyta wynosi 96%.

Zastosowanie testu molekularnego

Zastosowanie markera Rye3353164pp2 może być przydatne do identyfikacji genu Dw2 obecnego w materiałach hodowlanych żyta.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta o sekwencjach:

   Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC

   Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA
2. 2. Sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw2 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach:

   Rye3353164pp2F ACACTCGGCCTGTCAATAGC

   Rye3353164pp2R CTGAAGCGGGGAGGTTTCAA przy czym stosuje się marker Rye3353164pp2 (Wzór 1).