PL230793B1 - Dwie pary oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości dw9 i sposób wykrywania recesywnego genu karłowatości dw9 w roślinach żyta (Secale cereale L.) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są dwie pary oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości dw9 w roślinach żyta o sekwencjach: BK344_F3 CTCTGGCTCGTAGTCACC BK344_R3 CTCCGCGGGGAGCAC oraz BK488_F4 ACCGTTGTGCTCGACCTG BK488_R4 GGGTGGAGAGAGGCTACC. Przedmiotem zgłoszenia jest również sposób wykrywania obecności genu karłowatości dw9 w roślinach żyta.

Description

Jednym z głównych celów hodowli żyta jest poprawa odporności odmian uprawnych na wylęganie, czyli przewracanie, uginanie i nadłamywanie roślin związane z działaniem czynników atmosferycznych takich jak burze, silne wiatry czy grad. Zjawisko to ma negatywny wpływ na wegetację roślin, gdyż wpływa na zmniejszenie natężenia fotosyntezy oraz słabsze pobieranie składników pokarmowych i wody z gleby. Konsekwencją jest wolniejsze dojrzewanie i słabsze wypełnienie kłosów ziarnem, co przekłada się na obniżenie wartości parametrów plonu takich jak liczba kłosów z poletka, liczba kłosów produkcyjnych, liczba ziaren z rośliny i masa tysiąca ziarniaków. W skrajnych przypadkach, gdy wylęganie wystąpi przed kwitnieniem, może dojść nawet do 60% redukcji plonu, a utrudniony zbiór wylęgniętych łanów generuje dodatkowe koszty.

Odporność na wylęganie jest istotnie skorelowana z wysokością roślin - wraz z jej obniżaniem rośnie odporność roślin na wylęganie. Najskuteczniejszym i najbardziej ekologicznym sposobem redukcji wysokości roślin jest wprowadzanie do odmian uprawnych genów karłowatości.

U żyta zidentyfikowano dotąd 3 dominujące geny karłowatości oraz 17 genów recesywnych i w przypadku większości z nich znana jest ich lokalizacja chromosomowa (Bórner A., Korzun V. 1998. A consensus linkage map of rye (Secale cereale L.) including 374 RFLPs, 24 isozymes and 15 gene loci. Theor. Appl. Genet. 97: 1279-1288 oraz Bórner A., Gale M.D., Appleford N.E.J., Lenton J.R. 1993. Gibberelin status and responsiveness in shoots of tali and dwarf genotypes of diploid rye (Secale cereale). Physiol. Plant. 89: 309-314 oraz Bórner A., Plaschke J., Korzun V., Worland A.J. 1996 . The relationships between the dwarfing genes of wheat and rye. Euphytica 89: 69-75 oraz Kubicka H., Kubicki B. 1990. Two types of dwarfness in winter rye (Secale cereale L.). Gen. Pol. 81: 9-19 oraz MelzG., Schlegel R., Sybenga J. 1988. Indentification of the chromosomes in the “Esto” set of trisomics. Plant Breed. 100: 169-172).

Recesywne geny karłowatości przypisano do wszystkich siedmiu chromosomów żyta (1R-7R), jednakże w przypadku trzech z nich lokalizacja chromosomowa nadal nie jest znana. Na chromosomach 1R, 2R, 3R oraz 6R zlokalizowano po jednym genie karłowatości. Z kolei na chromosomie 4R zlokalizowano trzy geny karłowatości, na 5R - cztery, a na 7R dwa. Nomenklatura recesywnych genów karłowatości żyta jest niespójna. W przypadku połowy zastosowano prawidłowe nazewnictwo skrótem dw (ang. dwarf) pisanym małą literą. Z kolei grupę trzech genów oznaczono symbolem ct (łac. compactum; ct1-ct3), ze względu na zwartą morfologię kłosa form źródłowych. Pozostałe geny oznaczono zróżnicowaną i niespójną symboliką. Bliższa lokalizacja recesywnych genów karłowatości na ramionach chromosomów została określona jedynie w przypadku genu ct1 (długie ramię chromosomu 7R), ct2 (długie ramię chromosomu 5R) oraz np. (długie ramię chromosomu 4R). Można przypuszczać, że niektóre z genów z chromosomów 4R, 5R i 7R są tożsame, jednakże ich identyfikacja byłaby możliwa jedynie po przeprowadzeniu tzw. testu alleliczności. Test ten polega na ocenie rozszczepień w obrębie populacji F₂ otrzymanych jako wynik krzyżowania wszystkich źródeł karłowatości we wszystkich kombinacjach (każdy z każdym), co nie jest możliwe ze względu na brak dostępu do znacznej większości form źródłowych.

Geny karłowatości żyta można identyfikować w materiałach hodowlanych za pomocą markerów molekularnych. Szybka, prosta i tania identyfikacja tych genów w materiałach hodowlanych na dzień dzisiejszy nie jest możliwa. Jest to spowodowane faktem, że jedynymi ich znacznikami są mało precyzyjne i znacznie oddalone od genu docelowego markery morfologiczne (gen np. - marker braku wosku, gen ct3- obecność słupkowia - wielu słupków w kwiecie) bądź molekularne markery typu RFLP, których otrzymanie jest kosztowne i czasochłonne.

Spośród wszystkich genów karłowatości żyta w praktycznej hodowli żyta jak dotąd zastosowanie znalazły tylko dwa: jeden gen dominujący - Dw1 (syn. Ddw1, HI) oraz jeden gen recesywny - ct2 (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetikdes Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173 oraz Kubicka H., Kubicki B. 1990. Two types of dwarfness in winter rye (Secale cereale L.). Gen. Pol.81: 9-19 oraz Plaschke J., Korzun V., Koebner R.M.D., Bórner A. 1995. Mapping of the GA3-insensitive dwarfing gene ct1 on chromosome 7R in rye. Plant Breed. 114: 113-116).

PL 230 793 Β1

Celem wynalazku było znalezienie markerów, które odróżniałyby formy karłowe od wysokich i dodatkowo pozwalały potwierdzić źródło karłowatości (tu gen dw9).

Istotą wynalazku są dwie pary oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości dw9 w roślinach żyta, według wynalazku, o sekwencjach:

BK344_F3 CTCTGGCTCGTAGTCACC

BK344_R3 CTCCGCGGGGAGCAC oraz

BK488_F4 ACCGTTGTGCTCGACCTG

BK488_R4 GGGTGGAGAGAGGCTACC

Istotę wynalazku stanowi również sposób wykrywania obecności genu karłowatości dw9 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzne fragmenty DNA sprzężone z badanym genem amplifikowane są w reakcji PCR z zastosowaniem jednocześnie w dwóch oddzielnych reakcjach dwóch par starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzujący się tym, że pierwszą parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach:

BK344 F3 CTCTGGCTCGTAGTCACC

BK344_R3 CTCCGCGGGGAGCAC natomiast drugą parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach:

BK488_F4 ACCGTTGTGCTCGACCTG

BK488_R4 GGGTGGAGAGAGGCTACC przy czym w przypadku pierwszej pary starterów stosuje się marker 5210344, (Wzór 1- prążki markera 5210344 związane z cechą karłowatości genu dw9), natomiast w przypadku drugiej pary starterów stosuje się marker 3747488 (Wzór 2 - prążek markera 3747488 związany z cechą karłowatości genu dw9 występujący u roślin wysokich, brak prążka związany z roślinami niskimi).

Wynalazek jest bliżej pokazany w przykładzie wykonania i na rysunku, na którym:

- Fig. 1 przedstawia elektroforegramy, na których pokazano segregację markera 5210344 w grupach genotypów karłowych (n) i wysokich (w) populacji mapującej F₂ mieszańca pomiędzy linią o normalnym wzroście (541) i karłową linią BK-1 (Wzór zaznaczono strzałkami);

- Fig. 2 przedstawia elektroforegramy, na których pokazano segregację markera 3747488 w grupach genotypów karłowych (n) i wysokich (w) populacji mapującej F₂ mieszańca pomiędzy linią o normalnym wzroście (541) i karłową linią BK-1 (Wzór zaznaczono strzałką);

- Fig. 3 przedstawia elektroforegram, na którym pokazano segregację markera 5210344 wśród niespokrewnionych linii wsobnych (A1-A22);

- Fig. 4 przedstawia elektroforegram, na którym pokazano segregację markera 3747488 wśród niespokrewnionych linii wsobnych (A1-A22).

Pełną nazwą wyróżniono linię BK-1 posiadającą gen dw9.

W pierwszym etapie wytworzono populację mapującą F₂ mieszańca linii 541 (linia wysoka) i BK-1 (linia karłowa) składającą się z 94 osobników. Każdy z osobników populacji mapującej został oznaczony fenotypowo (n - karłowy) lub w (wysoki). W trakcie badań opracowano dwa markery 5210344 (marker kodominujący) i 3747488 (marker dominujący), które w prosty i szybki sposób identyfikują rośliny żyta posiadające gen dw9 zarówno wśród genotypów populacji mapującej, co przedstawiono na Fig. 1 i Fig. 2, jak i w grupie genotypów niespokrewnionych, co przedstawiono na Fig. 3 i Fig. 4.

Przeprowadzone badania markerów 5210344 i 3747488 wykazały, że są one znacznikami genu dw9 w życie.

Metoda identyfikacji markerów 5210344 i 3747488

Materiał - DNA zostało wyizolowane z liści żyta znanymi metodami przy wykorzystaniu komercyjnie dostępnych zestawów.

Startery do amplifikacji markerów 5210344 i 3747488 zaprojektowano na podstawie sekwencji własnych.

Sekwencje starterów:

BK344_F3 CTCTGGCTCGTAGTCACC

BK344_R3 CTCCGCGGGGAGCAC

BK488_F4 ACCGTTGTGCTCGACCTG

BK488_R4 GGGTGGAGAGAGGCTACC

PL 230 793 Β1

Startery projektowano przy użyciu programu Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).

Skład mieszaniny reakcji PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy) dla markerów 5210344 i 3747488:

DNA	10 - 50 ng
10 x Taq bufor (200 mM Tris-HCI, 200 mM KCI, 50 mM {NH4)2SO4	lx
dNTP	0,2 mM
MgCI2	2 mM
Polimeraza Taq	0,5-1,0 U
Starter F	0,1-0,5 μΜ
Starter R	0,1-0,5 μΜ
H2O	W zależności od objętości końcowej mieszaniny PCR

Warunki amplifikacii DNA dla markerów 5210344 i 3747488

Reakcję PCR przeprowadzano w termocyklerze Thermalcycler T1 (Biometra)

Parametry PCR: 95°C - 1-3 min, 35 cykli (95°C - 45s, 58°C - 30s, 72°C - 40s), 72°C - 10 min Identyfikacja markerów 5210344 i 3747488

Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzano w 3,0% żelu agarozowym z dodatkiem 0,01% bromku etydyny, w buforze 1xTBE pH=8,5 przy napięciu 100 V przez 2,0 h. Jako wzorzec długości fragmentów DNA zastosowano GeneRuler Ladder 100 bp Plus (Fermentas). Po rozdziale żel podświetlano na transiluminatorze UV oraz wykonywano zdjęcie, po czym przeprowadzono komputerową analizę obrazów.

Wyniki

Testowanie markerów 5210344 i 3747488 na osobnikach populacji mapującej mieszańca 541 χ BK-1 wykazało dla markera 5210344 96,8% zgodność segregacji markera z karłowatością (Fig. 1), natomiast dla markera 3747488 - 96% zgodność segregacji z karłowatością (Fig. 2). Zastosowanie w analizie dwóch markerów równocześnie zwiększyło skuteczność rozróżniania genotypów karłowych od wysokich do 98%. Uzyskane dla kolekcji 24 linii wsobnych żyta, w tym 1 genotypu posiadającego gen dw9, wyniki identyfikacji z zastosowaniem markerów 5210344 i 3747488 oraz metody stanowiącej przedmiot wynalazku zaprezentowano na Fig. 3 (marker 5210344) i Fig. 4 (marker 3747488). Elektroforegramy przedstawiają segregację amplifikowanych fragmentów DNA po włączeniu do analiz par starterów F i R. Marker 5210344 błędnie identyfikował tylko 1 z 24 badanych genotypów (Fig. 3). Z kolei marker 3747488 miał mniejszą skuteczność gdyż błędnie identyfikował 3 genotypy (Fig. 4). Jednoczesne zastosowanie obu markerów w dwóch odrębnych reakcjach, pozwoliło zwiększyć skuteczność metody identyfikacji genu dw9 w niespokrewnionych genotypach żyta do 100%.

Zastosowanie testu molekularnego

Zastosowanie markerów 5210344 i 3747488 może być przydatne do identyfikacji genu dw9 obecnego w materiałach hodowlanych żyta.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Dwie pary oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości dw9 w roślinach żyta o sekwencjach:

   BK344_F3 BK344_R3 oraz

   BK488_F4

   BK488_R4

   CTCTGGCTCGTAGTCACC CTCCGCGGGGAGCAC

   ACCGTTGTGCTCGACCTG

   GGGTGGAGAGAGGCTACC

   PL 230 793 Β1
2. 2. Sposób wykrywania obecności genu karłowatości dw9 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzne fragmenty DNA sprzężone z badanym genem amplifikowane są w reakcji PCR z zastosowaniem jednocześnie w dwóch oddzielnych reakcjach dwóch par starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: