PL228849B1 - Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne - Google Patents
Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjneInfo
- Publication number
- PL228849B1 PL228849B1 PL412829A PL41282915A PL228849B1 PL 228849 B1 PL228849 B1 PL 228849B1 PL 412829 A PL412829 A PL 412829A PL 41282915 A PL41282915 A PL 41282915A PL 228849 B1 PL228849 B1 PL 228849B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phage
- phages
- bacteria
- incubation
- strain
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 title claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 title description 5
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 title description 5
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 19
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 17
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 41
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 34
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 16
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 15
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 11
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000034655 secondary growth Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 4
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 208000015688 methicillin-resistant staphylococcus aureus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000702072 Podoviridae Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 206010040793 Skin and subcutaneous tissue infections Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000010841 municipal wastewater Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229910000384 uranyl sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(12)OPIS PATENTOWY (i9)PL (n)228849 (13) B1 (51) Int.CI.
(21) Numer zgłoszenia: 412829 C12N 7/00 (2006.01)
A61K 35/76 (2015.01) A61P 17/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 24.06.2015
Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących (54) do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne
| (73) Uprawniony z patentu: | |
| BIOPHAGE PHARMA SPÓŁKA AKCYJNA, | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: | Kraków, PL |
| 02.01.2017 BUP 01/17 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| GRZEGORZ RAK, Kraków, PL | |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | |
| 30.05.2018 WUP 05/18 | (74) Pełnomocnik: |
| rzecz, pat. Alina Magońska |
σ>
'st
CM
CM
Ω.
PL 228 849 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus o potencjale technologicznym oraz terapeutycznym do zwalczania zakażeń wywołanych przez Staphylococcus aureus, w tym MRSA (Methicyllin-Resistant Staphylococcus aureus).
Bakteriofagi (nazywane również fagami) są to wirusy infekujące bakterie. Fagi stanowią istotny składnik biosfery, ich liczbę szacuje się na 1031. Są obecne także w organizmie ludzi i zwierząt, izolowano je m.in. ze śliny, kału, moczu, układu pokarmowego.
Ogromny światowy kryzys antybiotykoterapii obserwowany od kilku lat sprawia, iż w ostatnich latach odnotowuje się renesans badań nad bakteriofagami, co jest związane z dużą możliwością ich zastosowania w leczeniu zakażeń bakteryjnych w tym antybiotykoopornych. O wzmożonym zainteresowaniu bakteriofagami może świadczyć ilość opublikowanych prac - kilka tysięcy rekordów zamieszczonych w bazie PubMed oraz wzrastająca liczba firm (obecnie jest ich 29) podejmująca próbę zastosowania bakteriofagów na różnych polach eksploatacji.
Problem leczenia antybiotykoopornych zakażeń został uznany za jedno z głównych zagrożeń zdrowotnych w XXI w. i za temat priorytetowy w ochronie zdrowia publicznego przez szereg organizacji i agencji na całym świecie (m.in. Światową Organizację Zdrowia (WHO), Parlament Europejski, Europejskie Centrum Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC - ang. European Centre forDisease Prevention and Control), amerykańskie Centrum Prewencji i Kontroli Zakażeń (CDC - ang. Centres for Diseases Control and Prevention), czy amerykańską Agencję Żywności i Leków (ang. FDA - Food and Drug Administration), Autorytety medyczne, agencje światowe zajmujące się zdrowiem publicznym, są zgodne, co do tego, iż istnieje pilna potrzeba stworzenia całkowicie nowej klasy środków przeciwbakteryjnych, na które oporność nie może się rozwinąć wskutek tych samych mechanizmów, co na antybiotyki. Terapię z użyciem bakteriofagów uznaje się za wysoce perspektywiczną, skuteczną i bezpieczną, co potwierdzają liczne badania na modelach zwierzęcych w leczeniu pojedynczych i mieszanych infekcji bakteryjnych (Matsuzaki et al. 2003; Chibani-Chennoufi et al. 2004; Ryan et al. 2011; VinodKumar et al. 2011; Vieira et al. 2012; Chhibber et al. 2013), a także badania u ludzi prowadzone przez Ośrodek Terapii Fagowej przy IITD PAN we Wrocławiu, doświadczenia ośrodków rosyjskich i gruzińskich (terapia fagowa dostępna, jako standardowa metoda leczenia) i badania kliniczne prowadzone zgodnie z aktualnymi standardami przez kilka firm zachodnich (Abul-Hassan et al. 1990; Wang et al. 2006; Merabishvili et al. 2009; Rhoad et al. 2009; Wright et al. 2009; Kutter et al. 2010; Abedon et al. 2011; Pagava et al. 2011; Sarker et al. 2012; McCallin et al. 2013). Największą zaletą bakteriofagów jest ukierunkowanie na określony gatunek, a nawet typ fagowy bakterii, przy braku niepożądanego wpływu na komórki leczonego organizmu. Dzięki wybiórczemu działaniu fagów na określony gatunek bakterii, w przeciwieństwie do antybiotyków, nie uszkadzają one fizjologicznej flory organizmu. Kolejne zalety stosowania fagów w kontekście farmaceutycznym to:
a) zdolność do samoreplikacji. Możliwość samoreplikacji bakteriofagów nabiera szczególnego znaczenia w przypadku leczenia infekcji rozwijających się w słabiej ukrwionych tkankach, do eliminacji bakterii wystarczy wówczas dotarcie do zakażonego miejsca nawet małej liczby cząstek fagowych z uwagi na możliwość ich namnażania się bakteriofagów (wg i Kutter et al. 2010, fagi mogą zwiększać swoje miano w ranie 400-1200 razy) i zdolność penetrowania do tkanek,
b) ze względu na brak możliwości namnażania się w komórkach eukariotycznych, po eradykacji bakterii miano faga zmniejsza się aż do ich całkowitego usunięcia z ustroju (tzw. „auto dosing”),
c) niska toksyczność fagi składają się z kwasu nukleinowego oraz białek, które są właściwie nietoksyczne. Jednak fagi mogą wchodzić w interakcje z układem immunologicznym, co przynajmniej potencjalnie skutkuje niekorzystną odpowiedzią immunologiczną (przeciwciała anty-fagowe), chociaż nie dostarczono istotnych dowodów na to, iż jest to aktualnie problem w fagoterapii,
d) zdolność do usuwania biofilmów bakteryjnych.
Przewiduje się, że terapie bakteriofagami dotyczące różnych schorzeń stanowić będą przyszłościowy kierunek rozwoju medycyny.
Patogenem o szczególnym znaczeniu epidemiologicznym jest Staphylococcus aureus (znajduje się na liście patogenów alarmowych (Załącznik nr 1 do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 11 marca 2005 r. w sprawie rejestrów zakażeń zakładowych oraz raportów o występowaniu tych zakażeń),
PL 228 849 B1 o czym świadczą prezentowane poniżej dane. Staphylococcus aureus został zaliczony do najbardziej problematycznej grupy antybiotykoopornych bakterii określanych jako ESKAPE Group (E. faecium,
S. aureus, K. pneumoniae, A. baumanii, P. aeruginosa, Enterobacter spp.).
S. aureus) ze względu na wrodzoną wirulencję, możliwość wywoływania różnych zagrażających życiu infekcji i zdolność adaptacji do różnych warunków środowiska nazywany jest „superbakterią”. W ostatnich latach zaobserwowano pojawienie się w środowisku pozaszpitalnym szczepów S. aureus opornych na metycylinę (Community- Acquired Methicillin Resistant Staphylococcus aureus - CA-MRSA), dotychczas typowych patogenów szpitalnych (Hospital-Acquired MRSA - HA-MRSA). Szczepy MRSA stanowią poważny problem opieki zdrowotnej. Według statystyk na terenie Wielkiej Brytanii w latach 1990-2001 nastąpił 19-krotny wzrost przypadków sepsy u dzieci spowodowanej MRSA. W USA w 2005 r. szczep MRSA wywołał 94 tys. zakażeń, powodując prawie 19 tys. zgonów (więcej niż AIDS). W Polsce rocznie ok. 10% pacjentów spośród 600 000 pacjentów hospitalizowanych z powodu zakażeń jest zainfekowanych szczepami MRSA. Z tej grupy umiera rocznie 3 tys. osób (5%).
Z uwagi na fakt, iż bakteriofagi przeciwko S. aureus będące przedmiotem niniejszego wynalazku planuje się wykorzystywać w terapii, przy izolacji i charakterystyce bakteriofagów kierowano się m.in. wytycznymi dot. biologicznych produktów leczniczych tj. „ICH Topic Q 5 D Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Product (European Medicines Agency nr CPMP/ICH/294/95) oraz w Rozporządzeniu Ministra Zdrowia w sprawie Dobrej Praktyki Wytwarzania - wymagania szczegółowe w Aneksie nr 2 „Wytwarzanie biologicznych produktów leczniczych dla ludzi”, Podrozdział „System serii posiewowej i banku komórkowego”.
Zgodnie z danymi literaturowymi (Parracho et al. 2012; Verbeken et al. 2014; Nilsson et al. 2014) oraz Opinią Komisji Europejskiej z dnia marca 2012 r. produkty lecznicze zawierające bakteriofagi należą do kategorii biologicznych produktów leczniczych.
Znany jest z polskiego opisu patentowego PL195437 sposób przygotowania poliwalentnych preparatów fagowych do leczenia zakażeń bakteryjnych, polegający na utworzeniu zbioru szczepów patogenów bakteryjnych określonego rodzaju oraz drugiego zbioru szczepów bakteriofagów specyficznych wobec przynajmniej jednego szczepu bakterii, następnie określa się aktywność lityczną szczepu bakteriofaga wobec każdego szczepu bakterii, posługując się metodami statystycznymi. Zgodnie z wynalazkiem korzystnie szczepy patogenne należały do rodzaju Staphylococcus albo Pseudomonas. Środek do leczenia infekcji wywołanych przez patogeny bakteryjne zawiera jako czynnik aktywny szczep bakteriofaga wybrany ze zbioru szczepów zdeponowanych. Zgodnie z wynalazkiem skuteczność w leczeniu tak przygotowanego preparatu fagowego jest wysoka szczególnie w leczeniu posocznicy (88%).
Bakterie z rodzaju Staphylococcus wywołują różne zagrażające życiu infekcje dlatego dąży się do otrzymania preparatu fagowego o jeszcze wyższej skuteczności.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że poddanie wybranych fagów dodatkowej selekcji według podanych poniżej kryteriów pozwala na otrzymanie fagów o zwiększonej skuteczności.
W opisie użyto następujących oznaczeń zdefiniowanych poniżej:
- burst size (plon fagowy) - określany także wielkością wyrzutu po okresie namnażania bakteriofaga, jest to średnia ilość wirionów potomnych pochodzących z infekcji jednej komórki gospodarza
- czas latencji - zwany także czasem uśpienia, jest to okres w cyklu rozwojowym bakteriofaga, który trwa od adsorpcji bakteriofaga do komórki bakteryjnej, aż do lizy komórki.
- bacterial challenge - jest to tzw. „test obciążeniowy”, w którym sprawdza się w warunkach in vitro zdolność bakteriofaga do eradykacji komórek bakterii z hodowli płynnej na drodze ich lizy.
- aktywność lityczna - jest to zdolność bakteriofaga do lizy komórki bakteryjnej, liza komórki bakterii, w procesie uwalniania fagów potomnych, prowadzi do jej śmierci.
- MOI (Multiplicity of infection) - definiowany jako średnia liczba zakażania każdej komórki, obliczana jako stosunek liczby cząstek bakteriofaga i komórek bakterii.
Zasadniczym wymaganiem stawianym fagom do celów terapeutycznych jest potwierdzenie ich natury litycznej (wiruletnej), co jest możliwe do weryfikacji metodą sekwencjonowania, a następnie analizy genomu faga pod kątem obecności genów toksyn bakteryjnych, integraz i genów konwersji lizogennej. Obecność jakiegokolwiek genu z wyżej wymienionych klas całkowicie dyskwalifikuje użycie bakteriofaga w fagoterapii, ponieważ świadczy o jego szkodliwości albo o jego lizogennej naturze.
Oprócz metod molekularnych również inne testy mogą mieć wartość prognostyczną w ocenie natury litycznej fagów. Są to np.
PL 228 849 B1
a) morfologia łysinek fagowych - formowanie dużych klarownych łysinek jest cechą charakterystyczną dla fagów litycznych (Adams, 1959),
b) przynależność taksonomiczna - fagi wirulentne należą do rodziny Myoviridae i Podoviridae (Pantucek et al. 2004; Kwiatek et al. 2012; Łobocka et al. 2012; Kłem et al. 2013).
Z punktu widzenia selekcji w warunkach in vitro fagów o potencjale terapeutycznym bardzo istotne jest określenie:
a) zakresu aktywności litycznej czyli zdolności do lizowania w warunkach in vitro szczepów klinicznych. Jest to jedna z najważniejszych cech faga selekcjonowanego do celów terapeutycznych. Procent zlizowanych szczepów przez danego faga zależeć będzie w dużej mierze od kolekcji bakterii. Wyniki rzędu 50-90% są bardzo dobre i pozwalają na tworzenie koktajli o bardzo wysokiej aktywności terapeutycznej. Dobrymi wynikami w przypadku szczepów klinicznych są wyniki rzędu 15-30% lizowanych szczepów;
b) stopnia wirulencji fagów w teście bacterial challenge - fagi, które powodują skuteczną liżę określonej hodowli bakterii, w mniejszym stężeniu (chodzi tu o stężenie faga) są bardziej wirulentne. W badaniu takim określamy jak szybko populacja faga może wzrastać relatywnie w stosunku do populacji bakterii (Gill and Hyman 2010);
c) prognozuje się, iż fagi, które wiążą się do komórek gospodarza szybko (czas adsorpcji faga), mają krótki czas latencji i duży burst size tj. plon fagowy mogą być najbardziej skuteczne w terapii (Gill and Hyman 2010; Nilsson et al. 2014). Do celów terapeutycznych nadają się najlepiej fagi o stosunkowo wysokich plonach fagowych (-100 pfu lub więcej) i niskich czasach latencji (<1-1,5 h). W celu scharakteryzowania powyższych parametrów wzrostu bakteriofaga należy przeprowadzić doświadczenie typu one-step growth (Ellis i Delbruck 1939). Polega ono na prześledzeniu pojedynczego cyklu rozwoju bakteriofaga w komórce bakteryjnej;
d) odporność na czynniki fizykochemiczne (np. pH).
Wpływ pH na przeżywalność faga ma kluczowe znaczenie przy stosowaniu doustnym preparatów fagowych oraz przy stosowaniu fagów razem z innymi preparatami, które mogą mieć niskie lub wysokie pH (Pujato et al. 2014, Li i Zhang 2014). W przypadku preparatu na rany należy przetestować wytrzymałość faga na zakres pH w którym mieści się pH preparatu, pH osocza i naturalne pH skóry. Zwykle jest to zakres pH 5.0-8.0.
W aspekcie technologicznym natomiast niezwykle ważną kwestią jest:
a) namnażanie się faga do wysokiego miana,
b) stabilność temperaturowa.
Wpływ temperatury na przeżywalność fagów jest niezwykle istotny jeśli chodzi o zapewnienie prawidłowej aktywności fagów w trakcie przechowywania.
Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofaga specyficznego wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00076; F/00077; F/00078; F/00079, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją.
Nowy szczep bakteriofaga jest specyficzny wobec bakterii Staphylococcus aureus.
Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepu bakteriofaga wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00076; F/00077; F/00078; F/00079 do wytwarzania preparatów do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Staphylococcus.
Korzystnie do wytwarzania preparatu do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Staphylococcus stosuje się mieszankę fagów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00076; F/00077; F/00078; F/00079 wykazujących się brakiem interferencji.
Preparat stosuje się do leczenia infekcji skóry i tkanki podskórnej.
Bakteriofagi będące przedmiotem wynalazku zostały zdeponowane zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. R. Weigla 12) w dniu 03. 06. 2015 r i otrzymały numery dostępu depozytu F/00076- dla faga Puł/14/14256; F/00077- dla faga W/5/14256; F/00078- dla faga Kos/10/22119; F/00079- dla faga Kr/6/1934.
Bakteriofagi będące przedmiotem niniejszego wynalazku scharakteryzowano pod kątem ich przynależności taksonomicznej, cech morfologicznych, biologicznych. Dodatkowo, zgodnie z wymaganiami
PL 228 849 B1 przytoczonej powyżej wytycznej Q5D fagi posiadają udokumentowanie pochodzenie i opisaną procedurę ich pozyskiwania.
I. Wyniki badań
I. 1. Izolacja bakteriofagów
Bakteriofagi wyizolowano ze ścieków miejskich (oczyszczalnie, udokumentowana miejsce i data pobrania materiału podano w tabeli 1 ). Próbki ścieków poddano obróbce fizycznej poprzez proces filtracji na bibule filtracyjnej, sączeniu przez filtr o średnicy porów 1 pm i sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Tak otrzymane próbki skoncentrowano metodą filtracji tangencjalnej wg dokładnie wystandaryzowanej metodyki - próbki koncentrowano ok. 10 razy. Skoncentrowane próbki ścieków poddano ponownie procesowi sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Do izolacji fagów zastosowano procedurę „enrichment” z użyciem szczepu Staphylococcus aureus o symbolu jak w tabeli 1, pochodzącego z kolekcji własnej (szczep indykatorowy posiada dobrze udokumentowane pochodzenie oraz charakterystykę potwierdzającą jego przynależność do gatunku Staphyloccocus aureus). W celu izolacji fagów przygotowano układ doświadczalny, w którym połączono w określonym stosunku objętościowym 11.6x skoncentrowane podłoże bulionowe suplementowane jonami Ca+2 oraz Mg+2, inoculum szczepu indykatorowego w fazie logarytmicznej oraz skoncentrowaną próbkę ścieków. Tak przygotowany układ doświadczalny inkubowano w temperaturze 37°C przez ok. 18 h w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm przez ok. 4 h, a następnie przy 50 rpm przez ok. 14 h). Dla układu założono próbkę kontrolną w której zamiast próbki ścieków dodano odpowiednią objętość wody WFI (ang. Water for Injection).
Po zakończonej inkubacji zmierzono gęstość układu doświadczalnego przy pomocy densytometru McFarlanda, a następnie układ odwirowano przy 3000 obr/min. przez 30 min. w temp. 4°C. Supernatant sprawdzono na obecność bakteriofagów stosując metodę RTD (ang. Routine Test Dilution). W skrócie zastosowano następującą metodykę: do probówki z upłynnionym 0,7% agarem dodano 100 pl szczepu indykatorowego S. aureus. Płynny agar wylano na płytkę z podłożem agarowym i pozostawiono do zestalenia (ok. 30 min). Na zestaloną warstwę agaru naniesiono 30 pl odwirowanego supernatantu. Płytki inkubowano przez ok. 20 h w temp. 24°C, a następnie przez ok. 2-3 h w temp. 37°C. Po zakończonej inkubacji na płytce z podłożem agarowym zaobserwowano wyraźną strefę lizy. Wycięto fragment zlizowanej murawy bakteryjnej, tak aby nie pobrać bakterii i umieszczono w probówce z podłożem bulionowym, wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej przez ok. 30 min. i otrzymano w ten sposób zawiesinę fagów. Z tak otrzymanej próbki wyprowadzono czystą linię fagową stosując 5-krotny proces reizolacji. Przy każdym procesie reizolacji sprawdzono za pomocą lupy binokularnej morfologię łysinek fagowych. Do procesu reizolacji łysinek fagowych zastosowano test Gratia. Przygotowano szereg rozcieńczeń zawiesiny fagów w bulionie, następnie wybrano trzy-cztery rozcieńczenia, które przeznaczono do procesu reizolacji. Do probówki z upłynnionym 0,7% agarem wzbogaconym (ok. 3 ml, temperatura łaźni wodnej ok. 48°C) dodano 100 pl odpowiedniego szczepu S. aureus, a następnie 200 pl odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny fagów. Płynny agar wylano na płytkę z podłożem agarowym i pozostawiono do zestalenia (ok. 30 min). Płytki inkubowano przez ok. 20 h w temp. 24°C, a następnie przez ok. 2-3 h w temp. 37°C. Pojedyncze łysinki izolowano za pomocą igły iniekcyjnej, umieszczano w probówce z podłożem bulionowym, wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej, a następnie odwirowano przy 3000 obr/min. przez 10 min. Po tym czasie wykonano test Gratia - 5 razy (5 reizolacji). Po ostatniej reizolacji próbkę przesączono i przeznaczono do otrzymania lizatu fagowego.
Z próbki z 5-reizolacji przygotowano I pasaż bakteriofaga. Namnażanie faga wykonano metodą płytkową. Wykonano test Gratia wg opisu przedstawionego powyżej, po zakończonej inkubacji, płytki zalano ok. 10 ml podłoża bulionowego i umieszczono na wytrząsarce/kołysce laboratoryjnej przez 5 h, następnie płytki inkubowano przez ok. 18 h w temp. 2-8°C. Po zakończonej inkubacji tak otrzymany I pasaż faga poddano sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Z pasażu I wykonano pasaż II faga do dużej objętości. Do podłoża bulionowego dodano w odpowiednim MOI lizat fagowy z I pasażu, a następnie inoculum bakterii S.aureus w fazie logarytmicznej. Tak przygotowaną hodowlę inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) przez 4 h, monitorując postęp lizy, następnie w celu uzyskania całkowitej lizy hodowlę przeniesiono do chłodni (2-8°C). Po zakończonej inkubacji lizat poddano sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Tak otrzymany lizat fagowy poddano charakterystyk morfologicznej, biologicznej i morfologicznej.
PL 228 849 Β1
Tabela 1.
Izolacja bakteriofagów p/S.aureus (próbki do izolacji, szczepy indykatorowe).
| Symbol faga | Nr szczepu S.aureus | Miejsce pobrania próbek |
| Puł/14/14256 | 14256 | Oczyszczalnia Ścieków woj. Lubelskie |
| Kr/6/1934 | 1934 | Oczyszczalnia Ścieków woj. Podkarpackie |
| W/5/14256 | 14256 | Oczyszczalnia Ścieków woj. Małopolskie |
| Kos/10/22119 | 22119 | Oczyszczalnia Ścieków woj. Małopolskie |
I. 2. Przynależność taksonomiczna i charakterystyka morfologiczna bakteriofagów Przynależność taksonomiczną fagów oraz ich charakterystykę morfologiczną przeprowadzono z zastosowaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
W badaniach wykorzystano technikę kontrastowania negatywowego wg. następującej preparatyki. Siatki miedziane 300 mesh były przepłukiwane w acetonie w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie na siatki nakładano warstwę kolodium, a następnie napylano warstwą węgla. Po napyleniu na błonki węglowe nakładano 5 μΙ próbki i adsorbowano przez 3 minuty. Po odsączeniu nadmiaru próbki preparat barwiono przez 15 s w 2% wodnym roztworze siarczanu uranylu. Obserwacja fagów obywała się w mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 39000 razy. Obrazy utrwalane były przy pomocy cyfrowej kamery.
Tabela 2.
Przynależność taksonomiczna oraz charakterystyka morfologiczna badanych fagot.
| Nazwa faga | Przynależność taksonomiczna (rodzina) | Morfotyp | Wymiary | |||
| Wys gł- | Szer gł- | Dł. Og | Szer. Og- | |||
| Puł/14/14256 | Myoviridae | Al | 82,42 +/- 3,61 | 78,39 +/- 4,54 | 201,91 +/- 4,38 | 19,7 +/- 1,74 |
| Kr/6/1934 | Myoviridae | Al | 90,03 +/- 3,18 | 84,16 +/- 2,35 | 192,43 +/- c6,76 | 20,68 +/- 0,89 |
| W/5/14256 | Myoviridae | Al | 80,63 +/- 2,56 | 73,11 +/- 2,22 | 190,65 +/- 14,07 | 18,52 +/- 0,74 |
| Kos/10/22119 | Myoviridae | Al | 83,22 +/- 3,91 | 76,67 +/- 3,18 | 195,49 +/- 10,93 | 18,78 +/- 1,8 |
Wizualizacja cząstek fagowych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM)przedstawiono na fig. 1 w kolejności dla fagów: Puł/14/1425, Kr/6/1934 i na fig. 2 w kolejności dla fagów W/5/14256, Kos/10/22119.
Wniosek:
badane fagi reprezentują rodzinę Myoviridae, do której przynależą bakteriofagi lityczne.
I.3. Wpływ czynników fizykochemicznych na aktywność biologiczną fagów Zbadano odporności fagów gronkowcowych na pH oraz na temperaturę.
1. Wpływ pH
Do badania stabilności fagów na określone wartości pH, lizały fagowe inkubowano w podłożu bulionowym o różnych wartościach pH (pH w zakresie 3-11, adiustowanych NaOH lub HCl) przez 1 h
PL 228 849 B1 w temperaturze 25°C. Miano fagów poddanych badaniom wpływu pH oznaczono testem Gratia wg opisu podanego powyżej. W niniejszym teście przygotowano kontrolę pH, w celu określenia wpływ samego pH na zahamowanie wzrostu szczepu, widocznego jako przejaśnienie) i tym samym wykluczenia nieswoistej reakcji.
Fag Puł/14/14256
W zakresie pH 5-10 nie zanotowano wpływu pH na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji. Natomiast przy pH = 3,0 i pH = 11 następuje kompletna inaktywacja cząstek fagowych. Inkubacja fagów w podłożu o pH = 4,0 powoduje redukcję aktywności faga o 2 log.
Fag Kr/6/1934
W zakresie pH 4-10 nie zanotowano wpływu pH na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji. Natomiast w skrajnych wartościach pH tj. 3 następuje kompletna inaktywacji cząstek fagowych. Przy pH = 11,00 następuje znaczna redukcja aktywności biologicznej o ok. 7 rzędów wielkości (redukcja miana z rzędu 108 pfu/ml do 10 pfu/ml)
Fag W/5/14256
W zakresie pH 5-10 nie zanotowano wpływu pH na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji. Natomiast przy pH = 3,0 i pH = 11 następuje kompletna inaktywacja cząstek fagowych. Inkubacja fagów w podłożu o pH = 4,0 powoduje redukcję aktywności faga o 4 log.
Fag Kos/10/22119
W zakresie pH 4-10 nie zanotowano wpływu pH na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji. Inkubacja faga w podłożu o pH = 3,0 powoduje prawie całkowitą inaktywację cząstek fagowych - zaobserwowano jedynie pojedyncze łysinki, po 1 h inkubacji w pH = 3,0. W pH =11 następuje kompletna inaktywacji aktywności biologicznej faga. Przy pH = 4,0 następuje obniżenie aktywności faga o 4 log.
2. Termostabilność fagów
Dla określenia termostabilności fagów, badane fagi w postaci lizatów fagowych inkubowano w temp. 37°C (kontrola testu), 50°C, 60°C i 70°C. Próbki były pobierane do testów dla temperatury 37°C, 50°C, 60°C po 1 godzinie i 3 godzinach, natomiast dla temperatury 70°C po 30 min. i 1 godzinie. Miano fagów poddanych badaniom termostabilności oznaczono testem Gratia wg opisu podanego powyżej.
Fag Puł/14/14256
Nie zanotowano wpływu temperatury 50°C oraz 60°C do 3 h inkubacji na aktywność biologiczną faga - rząd wielkości zostaje utrzymany, choć po 3 h inkubacji w temp. 60°C następuje nieznaczna redukcja aktywności w obrębie rzędu wielkości. Natomiast w temp. 70°C po 0,5 h inkubacji zanotowano znaczą redukcję aktywności faga o blisko 7 rzędów wielkości. Inkubacja przez 1 h w temp. 70°C powoduje prawie kompletną inaktywację cząstek fagowych - odnotowano obecność pojedynczych łysinek.
Fag Kr/6/1934
Nie zanotowano wpływu temperatury 50°C do 3 h oraz 60°C do 1 h inkubacji na aktywność biologiczną faga. Inkubacja faga w temp. 60°C przez 3 h powoduje obniżenie jego aktywności o 1 log. Natomiast w temp. 70°C po 0,5 h inkubacji zanotowano prawie całkowitą redukcję aktywności faga tylko pojedyncze łysinki fagowe. Inkubacja przez 1 h w temp. 70°C powoduje kompletną inaktywację cząstek fagowych.
Fag W/5/14256
Nie zanotowano wpływu temperatury 50°C do 3 h oraz 60°C do 1 h inkubacji na aktywność biologiczną faga. Inkubacja faga w temp. 60°C przez 3 h powoduje obniżenie jego aktywności o 1 log. Natomiast w temp. 70°C po 0,5 h inkubacji następuje całkowita redukcja aktywności cząstek fagowych.
Fag Kos/10/22119
Nie zanotowano wpływu temperatury 50°C do 3 h inkubacji na aktywność biologiczną faga. Inkubacja faga w temp. 60°C przez 1 h oraz 3 h powoduje obniżenie jego aktywności o 1 log. Natomiast w temp. 70°C po 0,5 h i 1 h inkubacji zanotowano prawie całkowitą redukcję aktywności faga - tylko pojedyncze łysinki fagowe.
Wnioski:
Fagi będące przedmiotem niniejszego wynalazku cechują się odpornością na działanie czynników fizykochemicznych tj. pH i temperaturę.
II. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, w których opisano przeprowadzone doświadczenia dokumentujące wynalazek
II.1. P r z y k ł a d.
Ocena morfologii łysinek fagowych
PL 228 849 Β1
Puł/14/14256
Łysinki duże, okrągłe, zlizowane (wyraźnie zlizowany środek łysinki, mniej zlizowane brzegi łysinki), brzegi łysinki regularne. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 3.
W/5/14256
Łysinki duże, wyraźnie zlizowany środek łysinki, otoczony słabiej zlizowaną strefą, okrągłe brzegi łysinki regularne. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 4.
Kos/10/22119
Łysinki duże, okrągłe, zlizowane, brzegi łysinki regularne. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 5. Kr.6/1934
Łysinki duże, zlizowane (w środku łysinki słabsza liza), okrągłe, brzegi łysinki regularne. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 6.
Wniosek:
Fagi będące przedmiotem niniejszego wynalazku formują na murawie bakteryjnej łysinki charakterystyczne dla fagów litycznych.
II.2. Przykład
Zakres aktywności litycznej test „host rangę”
W celu określenia aktywności litycznej fagów będących przedmiotem niniejszego wynalazku wykonano spot test. Przygotowano murawę bakteryjną każdego z testowanych szczepów S.aureus, w tym celu do 0,7% agaru wzbogaconego wprowadzono 100 μΙ inoculum odpowiedniego szczepu testowego w fazie logarytmicznej i wylano na płytkę z podłożem agarowym. Płytki pozostawiono do podsuszenia przez ok. 30 min. - 45 min. Na tak przygotowaną murawę wg określonego wzornika nakropiono po 10 μΙ danego lizatu fagowego. Płytki inkubowano w temp. 37°C przez ok. 18 h. Po zakończonej inkubacji odczytano wyniki testu stosując czterostopniową skalę w celu oceny stopnia zlizowania szczepu testowego. W celu sprawdzenia poprawności wykonania testu i wykluczenia reakcji fałszywie dodatnich, dla każdego testowanego szczepu wykonano kontrole ujemne.
Zakres aktywności litycznej przeprowadzono z użyciem 258 izolatów klinicznych S. aureus (wśród nich 33 szczepy z mechanizmem MRSA) pochodzących z zakażeń skóry i tkanki podskórnej oraz 5 szczepów pochodzących ze środowiska. Każdy z testowanych szczepów posiada dobrze udokumentowane pochodzenie i wykonaną charakterystykę potwierdzającą ich przynależność do gatunku S. aureus.
Test „host rangę” wykonano dla każdego z badanych fagów co najmniej dwukrotnie z każdym z testowanych szczepów, badanie wykonano w niezależnych eksperymentach. Do oceny lizy zastosowano 4 stopniową skalę: c - całkowita liza, o1 - przezroczysty spot, z kilkoma do kilkunastoma pojedynczymi koloniami wtórnego wzrostu szczepu; o2 - przezroczysty spot z wtórnym wzrostem szczepu w postaci licznych pojedynczych kolonii lub skupisk kolonii; o3 - silny wtóry wzrost szczepu w obrębie spotu z możliwą zlizowaną obwódką i wyraźnym przejaśnieniem.
Tabela 3.
Wyniki testu „host rangę” ze szczepami klinicznymi oraz środowiskowymi S.aureus. Stopień lizy szczepu testowego oceniono w 4 stopniowej skali: c - całkowita liza, o1 - przezroczysty spot, z kilkoma do kilkunastoma pojedynczymi koloniami wtórnego wzrostu szczepu; o2 - przezroczysty spot z wtórnym wzrostem szczepu w postaci licznych pojedynczych kolonii lub skupisk kolonii; o3 - silny wtóry wzrost szczepu w obrębie spotu z możliwą zlizowaną obwódką i wyraźnym przejaśnieniem.
| Fag | Stopień lizy (%) | |||
| c | 01 | o2 | o3 | |
| Puł/14/14256 | 42,97 | 7,41 | 7,41 | 39,35 |
| Kr/6/1934 | 40.68 | 7,60 | 8,37 | 38,21 |
| W/5/14256 | 41.06 | 7.98 | 7.98 | 39.54 |
| Kos/10/22119 | 41,83 | 6,46 | 8,37 | 39,54 |
PL 228 849 Β1
Tabela 4.
Wyniki testu „host rangę” ze szczepami klinicznymi S.aureus MRSA. Stopień lizy szczepu testowego oceniono w 4 stopniowej skali: c - całkowita liza, o1 - przezroczysty spot, z kilkoma do kilkunastoma pojedynczymi koloniami wtórnego wzrostu szczepu; o2 - przezroczysty spot z wtórnym wzrostem szczepu w postaci licznych pojedynczych kolonii lub skupisk kolonii; o3 - silny wtóry wzrost szczepu w obrębie spotu z możliwą zlizowaną obwódką i wyraźnym przejaśnieniem.
| Fag | Stopień | izy (%) | ||
| c | ol | o2 | o3 | |
| Puł/14/14256 | 21,21 | 9,09 | 9,09 | 60,60 |
| Kr/6/1934 | 12,12 | 15,15 | 15,15 | 57,57 |
| W/5/14256 | 18,18 | 12,12 | 12,12 | 57,57 |
| Kos/10/22119 | 21,21 | 9,09 | 12,12 | 57,57 |
W celu potwierdzenia, iż uzyskane wyniki w teście spot są rzeczywiście efektem namnażania się faga w komórkach gospodarza w wyniku czego powstaje liza, a nie efektem inhibicji wzrostu szczepu bakteryjnego, wykonano test kropelkowy dla każdego z fagów oraz dla mieszanki fagów. Do testu kropelkowego wybrano szczepy kliniczne (w tym MRSA) w łącznej liczbie 70 izolatów, cechujących się różnym stopniem wrażliwości na badane fagi oraz 13 szczepów laboratoryjnych (pochodzących z kolekcji międzynarodowej oraz z kolekcji własnej). W skrócie: przygotowano murawę bakteryjną szczepu testowego w sposób opisany w teście spot. Następnie wykonano seryjne rozcieńczenia w bulionie lizatu fagowego/mieszanki lizatów fagowych i naniesiono wg wzornika na murawę bakteryjną. Płytki inkubowano w temp. 37°C przez ok. 20 h. Wyniki odczytano wg opracowanej skali.
Wnioski:
potwierdzono, iż obserwowany efekt lizy jest efektem działania faga, a nie efektem nieswoistej inhibicji wzrostu szczepu testowego na podłożu agarowym.
Szerokie spektrum lityczne badanych fagów sugeruje ich poliwalentną naturę, wykazano wysoką siłę lityczną fagów.
Lizaty fagowe skomponowane w mieszankę fagową tzw. koktajl fagowy cechują się lepszą aktywnością lityczną oraz szerszym zakresem litycznym niż pojedyncze lizaty fagowe.
II.3. Przykład
Bacterial challenge
Wykonano szereg eksperymentów na podstawie, których wybrano wartość MOI dla każdego z fagów, będących przedmiotem niniejszego wynalazku.
Fag Puł/14/14256
MOI na poziomie 0,001 jest wystarczające do całkowitej redukcji bakterii S.aureus po 2 h inkubacji. Redukcja bakterii następuje z poziomu 2,64 χ 108 cfu/ml do niewykrywalnego poziomu w metodzie seryjnych rozcieńczeń (0 cfu/ml). W niniejszym eksperymencie sprawdzono także pojawianie się opornych mutantów na faga tzw. BIM (ang. Bacteriophage- lnsensitive Mutants). Inkubacja faga i bakterii przy wartości MOI = 0,001 wykazała brak obecności bakterii opornych na faga (potwierdzono w metodzie seryjnych rozcieńczeń na płytkach agarowych oraz metodą spektrofotometryczną przy OD600). Fag Puł/14/14256 jest fagiem o bardzo wysokim stopniu wirulencji w warunkach in vitro, ponieważ niska dawka faga powoduje skuteczną liżę hodowli bakteryjnej już po 2 h inkubacji.
Fag Kr/6/1934
MOI na poziomie 0,01 jest wystarczające do całkowitej redukcji bakterii S.aureus po 2 h inkubacji. Redukcja bakterii następuje z poziomu 3,83 χ 108 cfu/ml do niewykrywalnego poziomu w metodzie seryjnych rozcieńczeń (0 cfu/ml). W niniejszym eksperymencie sprawdzono także pojawianie się opornych mutantów na faga tzw. BIM (ang. Bacteriophage-lnsensitive Mutants). Inkubacja faga i bakterii przy wartości MOI = 0,01 wykazała brak obecności bakterii opornych na faga (potwierdzono w metodzie seryjnych rozcieńczeń na płytkach agarowych oraz metodą spektrofotometryczną przy OD600). Fag Kr/6/1934 jest fagiem o wysokim stopniu wirulencji w warunkach in vitro, ponieważ niska dawka faga powoduje skuteczną liżę hodowli bakteryjnej już po 2 h inkubacji.
Fag W/5/14256
MOI na poziomie 0,1 powoduje redukcję liczby bakterii o 3 log po 2 h inkubacji - redukcja z poziomu wyjściowego 4,63 χ 18 cfu/ml do poziomu 5,2 χ 105 cfu/ml. Po 3 h inkubacji następuje obni10
PL 228 849 B1 żenie liczby bakterii do niewykrywalnego poziomu w metodzie seryjnych rozcieńczeń (0 cfu/ml). W niniejszym eksperymencie sprawdzono także pojawianie się opornych mutantów na faga tzw. BIM (ang.
Bacteriophage-Insensitive Mutants). Inkubacja faga i bakterii przy wartości MOI = 0,1 wykazała brak obecności bakterii opornych na faga (potwierdzono w metodzie seryjnych rozcieńczeń na płytkach agarowych oraz metodą spektrofotometryczną przy OD600).
Fag Kos/10/22119
MOI na poziomie 0,1 powoduje redukcję liczby bakterii o 1 log po 2 h inkubacji - redukcja z poziomu wyjściowego 7,15 x 109 cfu/ml do poziomu 2,5 x 108 cfu/ml. Po 3 h inkubacji następuje obniżenie liczby bakterii do niewykrywalnego poziomu w metodzie seryjnych rozcieńczeń (0 cfu/ml). W niniejszym eksperymencie sprawdzono także pojawianie się opornych mutantów na faga tzw. BIM (ang. Bacteriophage-Insensitive Mutants). Inkubacja faga i bakterii przy wartości MOI = 0,1 wykazała brak obecności bakterii opornych na faga (potwierdzono w metodzie seryjnych rozcieńczeń na płytkach agarowych oraz metodą spektrofotometryczną przy OD600).
Wniosek: Badane fagi cechują się wysoką wirulencją, o czym świadczy szybkość eradykacji bakterii S.aureus z hodowli.
II.4. P r z y k ł a d
Parametry wzrostu bakteriofaga (czas adsorpcji, one-step growth)
1. Czas adsorpcji
Zawiesina homologicznego szczepu S.aureus (faza logarytmiczna) została zainfekowana fagiem przy określonej wartości MOI. Tak przygotowany układ doświadczalny inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) przez 90 min. Z układu doświadczalnego pobierano próbki w określonych interwałach czasowych (0; 5 min., 10 min., 15 min., 20 min., 25 min., 30 min., 45 min., 60 min., 90 min.). Pobrane próbki odwirowano przy 10 000 obr/min. przez 5 min. w temp. pokojowej. W supernatancie sprawdzono miano niezadsorbowanych fagów testem Gratia. Adsorpcja faga została wyrażona jako procent redukcji miana faga w supernatancie w porównaniu do kontroli.
2. One-step growth
Zawiesina homologicznego szczepu S.aureus (faza logarytmiczna) została zainfekowana fagiem przy określonej wartości MOI. Tak przygotowany układ doświadczalny inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) w celu umożliwienia adsorpcji faga do receptorów bakterii gospodarzy. Następnie układ odwirowano przy 10 000 obr. przez 5 min. w temp. pokojowej. Supernatant odrzucono, natomiast pellet zawieszono w określonej objętości podłoża bulionowego. Dokładnie wymieszano i inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) przez 120 min. W trakcie inkubacji pobierano z układu doświadczalnego próbki w określonych interwałach czasowych 5 min., 10 min., 15 min., 20 min., 25 min., 30 min., 35 min., 40 min., 45 min., 50 min., 55 min., 60 min., 70 min., 80 min., 90 min., 100 min., 110 min., 120 min. Następnie niezwłocznie wykonywano seryjne rozcieńczenia pobranych próbek i wykonywano test Gratia. Wykreślono krzywą one-step growth.
Czas latencji określono jako: czas pomiędzy adsorpcją faga a pierwszym uwolnieniem (wyrzutem) cząstek fagowych.
Burst size obliczono jako stosunek końcowego miana uwolnionych cząstek fagowych do początkowej liczny zainfekowanych komórek bakterii w czasie latencji faga.
PL 228 849 Β1
Tabela 5.
Charakterystyka parametrów wzrostu fagów (na podstawie testu czas adsorpcji oraz one-step growth)
| Fag | Czas adsorpcji* | Czas latencji (min.) | Burst size (pfu/zainfekowane komórki) |
| Puł/14/14256 | 15 min. | 15 | ok. 16 |
| Kr/6/1934 | 15 min. | 5 | ok. 10 |
| W/5/14256 | 10 min. | 15 | ok. 16 |
| Kos/10/22119 | 15 min. | 10 | ok, 9 |
‘przy podanym czasie adsorpcji procent fagów zaadsorbowanych do komórek gospodarza wynosił ponad 90%.
Wniosek:
Badane fagi cechują się krótkim czasem adsorpcji i krótkim okresem latencji oraz wysokim plonem fagowym (burst size) co predysponuje ich odpowiednimi kandydatami do fagoterapii.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00076; F/00077; F/00078; F/00079, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją.
- 2. Nowy szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że jest specyficzny wobec bakterii Staphylococcus aureus.
- 3. Zastosowanie szczepu bakteriofaga wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00076; F/00077; F/00078; F/00079 do wytwarzania preparatów do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Staphylococcus.
- 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że do wytwarzania preparatu do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Staphylococcus stosuje się mieszankę fagów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00076; F/00077; F/00078; F/00079, wykazujących się brakiem interferencji.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że stosuje się do wytwarzania preparatów do leczenia infekcji skóry i tkanki podskórnej.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412829A PL228849B1 (pl) | 2015-06-24 | 2015-06-24 | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412829A PL228849B1 (pl) | 2015-06-24 | 2015-06-24 | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL412829A1 PL412829A1 (pl) | 2017-01-02 |
| PL228849B1 true PL228849B1 (pl) | 2018-05-30 |
Family
ID=57629129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL412829A PL228849B1 (pl) | 2015-06-24 | 2015-06-24 | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL228849B1 (pl) |
-
2015
- 2015-06-24 PL PL412829A patent/PL228849B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL412829A1 (pl) | 2017-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pirnay et al. | Personalized bacteriophage therapy outcomes for 100 consecutive cases: a multicentre, multinational, retrospective observational study | |
| Brady et al. | Bacteriophages as an alternative to conventional antibiotic use for the prevention or treatment of Paenibacillus larvae in honeybee hives | |
| Alves et al. | Development of a high-throughput ex-vivo burn wound model using porcine skin, and its application to evaluate new approaches to control wound infection | |
| Kim et al. | Two novel bacteriophages control multidrug-and methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius biofilm | |
| Islam et al. | Application of a novel phage ZPAH7 for controlling multidrug-resistant Aeromonas hydrophila on lettuce and reducing biofilms | |
| WO2022048061A1 (zh) | 一种耐高温宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及其组合物 | |
| CN104830806B (zh) | 一种宽裂解谱沙门氏菌噬菌体及其抑菌应用 | |
| CN109310722A (zh) | 用于预防弧菌感染的方法和组合物 | |
| Pirnay et al. | Retrospective, observational analysis of the first one hundred consecutive cases of personalized bacteriophage therapy of difficult-to-treat infections facilitated by a Belgian consortium | |
| CN101798568B (zh) | 一种分离的副溶血弧菌噬菌体及其在杀菌和防菌中的应用 | |
| CN113430176A (zh) | 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用 | |
| Zhang et al. | The expansion of a single bacteriophage leads to bacterial disturbance in gut and reduction of larval growth in Musca domestica | |
| Letarov et al. | Ecological basis for rational phage therapy | |
| Goodarzi et al. | Biological characteristics and anti-biofilm activity of a lytic phage against vancomycin-resistant Enterococcus faecium | |
| CN110964700B (zh) | 一株马流产沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN110129282B (zh) | 溶藻弧菌噬菌体和噬菌体组合物及其应用 | |
| Jiang et al. | Characterization of the lytic phage flora with a broad host range against multidrug-resistant Escherichia coli and evaluation of its efficacy against E. coli biofilm formation | |
| PL228849B1 (pl) | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Staphylococcus i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne | |
| CN119193502A (zh) | 一种耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌噬菌体及应用 | |
| Li et al. | vB_Ent31 bacteriophage may combat Enterobacter cloacae infections with macrophage modulating activity | |
| KR20090035861A (ko) | 박테리오파지 ｋｃｔｃ１１１２０ｂｐ를 함유하는 세균증식 억제 또는 사멸용 제제 | |
| PL228848B1 (pl) | Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne | |
| Duarte et al. | A new bacteriophage infecting Staphylococcus epidermidis with potential for removing biofilms by combination with chimeric lysin CHAPSH3b and vancomycin | |
| KR20230038491A (ko) | 파지의 상승적 조성물 및 이의 형성 방법 | |
| Köhne et al. | Newly isolated bacteriophages show efficacy and phage-antibiotic synergy in vitro against the equine genital pathogens Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa |