PL228062B1 - Sposób wykrywania zwiekszonego ryzyka zachorowania na raka skóry oraz zastosowanie genotypowego wariantu genu GRHL3 - Google Patents
Sposób wykrywania zwiekszonego ryzyka zachorowania na raka skóry oraz zastosowanie genotypowego wariantu genu GRHL3Info
- Publication number
- PL228062B1 PL228062B1 PL410049A PL41004914A PL228062B1 PL 228062 B1 PL228062 B1 PL 228062B1 PL 410049 A PL410049 A PL 410049A PL 41004914 A PL41004914 A PL 41004914A PL 228062 B1 PL228062 B1 PL 228062B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- grhl3
- skin cancer
- cancer
- snp
- chr1
- Prior art date
Links
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 56
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 101001069926 Homo sapiens Grainyhead-like protein 3 homolog Proteins 0.000 title abstract description 82
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 36
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 16
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 claims description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 claims description 10
- 238000000123 temperature gradient gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 102100034230 Grainyhead-like protein 3 homolog Human genes 0.000 abstract description 63
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 description 13
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 10
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 10
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 101001069933 Homo sapiens Grainyhead-like protein 1 homolog Proteins 0.000 description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 9
- 102100034228 Grainyhead-like protein 1 homolog Human genes 0.000 description 8
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 6
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 6
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 6
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 102100034227 Grainyhead-like protein 2 homolog Human genes 0.000 description 3
- 101001069929 Homo sapiens Grainyhead-like protein 2 homolog Proteins 0.000 description 3
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 3
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 3
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- -1 GSK-33 Proteins 0.000 description 2
- 101100449524 Homo sapiens GRHL2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091061966 Homo sapiens miR-802 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108010065129 Patched-1 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000012850 Patched-1 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 2
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000002919 Van der Woude syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 208000014646 age-related hearing impairment Diseases 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 208000031068 ectodermal dysplasia syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101150025003 grhl1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 2
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 108091029509 miR-802 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 2
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 2
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108010058734 transglutaminase 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 7,12-dimethyltetraphene Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(C=CC=C1)C1=C2C ARSRBNBHOADGJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 description 1
- 102000038594 Cdh1/Fizzy-related Human genes 0.000 description 1
- 102100025051 Cell division control protein 42 homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100038423 Claudin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100038447 Claudin-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010009260 Cleft lip and palate Diseases 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 108010025454 Cyclin-Dependent Kinase 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100026805 Cyclin-dependent-like kinase 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- VFZRZRDOXPRTSC-UHFFFAOYSA-N DMBA Natural products COC1=CC(OC)=CC(C=O)=C1 VFZRZRDOXPRTSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100036945 Dead end protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034579 Desmoglein-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100036528 Glutathione S-transferase Mu 3 Human genes 0.000 description 1
- 101000882908 Homo sapiens Claudin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000882890 Homo sapiens Claudin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 description 1
- 101000924316 Homo sapiens Desmoglein-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101001071716 Homo sapiens Glutathione S-transferase Mu 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000695187 Homo sapiens Protein patched homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001130298 Homo sapiens Ras-related protein Rab-25 Proteins 0.000 description 1
- 108091070493 Homo sapiens miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091008065 MIR21 Proteins 0.000 description 1
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100449528 Mus musculus Grhl3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010029098 Neoplasm skin Diseases 0.000 description 1
- 108010077960 Neurocalcin Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091034145 PolymiRTS Proteins 0.000 description 1
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100028680 Protein patched homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 102100031528 Ras-related protein Rab-25 Human genes 0.000 description 1
- 241001575049 Sonia Species 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000002258 X-ray Repair Cross Complementing Protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010000443 X-ray Repair Cross Complementing Protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000876 binomial test Methods 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000016653 cleft lip/palate Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 208000002169 ectodermal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 101150089658 get1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000012335 pathological evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108010033674 rho GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy metod identyfikacji obecności o najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w genie GRHL3 oraz wykorzystania tych polimorfizmów jako markerów do określenia zwiększonej podatności pacjentów na zachorowanie na raka skóry. Ponadto, opisane polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w sekwencji kodującej białko GRHL3 zostały zidentyfikowane jako potencjalnie kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania białka GRHL3.
Description
Wynalazek dotyczy diagnostyki chorób nowotworowych, a w szczególności - wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry. Dokładniej, niniejszy wynalazek dotyczy metod identyfikacji osób ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka skóry w oparciu o polimorfizmy pojedynczych nukleotydów występujące w genie GRHL3. Niniejszy wynalazek może znaleźć zastosowanie w prognostycznych badaniach genetycznych, mających na celu wskazanie pacjentów ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka skóry oraz w diagnostyce medycznej przy określaniu terapii celowanej (inhibitory ścieżki PI3K/Akt).
Raki skóry to najczęściej występujący typ nowotworu u ludzi na świecie, a związana z nimi zachorowalność i śmiertelność wzrasta z roku na roki. Najczęściej występującą odmianą raka skóry jest nieczerniakowy rak skóry, do której to kategorii zalicza się rak podstawnokomórkowy (basal cell carcinoma - BCC; około 75% przypadków) i rak kolczystokomórkowy (squamous cell carcinoma - SCC; około 20% przypadków). Według Światowej Organizacji Zdrowia (World Health Organization - WHO), rocznie na całym świecie diagnozowanych jest od 2 do 3 milionów nowych przypadków nieczerniak owych raków skóry (non-melanoma skin cancer - NMSC) i około 132.000 nowych przypadków czerniaka złośliwego. Czerniak złośliwy obejmuje mniej niż 5% przypadków wszystkich raków skóry, ale ze względu na agresywny charakter związana z nim śmiertelność pacjentów jest największa. W przeciwieństwie do czerniaka, nieczerniakowe raki skóry wykazują mniejszą zdolność do przerzutowania i rzadko prowadzą do śmierci pacjenta. Trudności w leczeniu nieczerniakowych raków skóry dotyczą zazwyczaj przypadków, w których do diagnozy doszło w późnych stadiach rozwoju choroby. Należy podkreślić, że objawy nieczerniakowego raka skóry mogą być podobne do nienowotworowych zmian skórnych i często są ignorowane przez pacjentów. Jak dotąd, podstawową metodą leczenia nieczerniakowych raków skóry jest chirurgiczne usunięcie chorobowo zmienionej tkanki. Problemy pojawiają się gdy zmiana nowotworowa jest bardzo rozległa lub tworzy głęboki naciek na sąsiadujące tkanki czy narządy. Wycięcie chirurgiczne zmiany chorobowej staje się wtedy niemożliwe lub jest bardzo szpecące, zwłaszcza jeśli dotyczy głowy i szyi. Biorąc pod uwagę wydłużenie średniej długości życia społeczeństwa oraz fakt, że nieczerniakowe raki skóry rozwijają się głównie u osób starszych, wzrasta zapotrzebowanie na skuteczne zapobieganie, wczesne wykrywanie jak również hamowanie wzrostu tego typu nowotworów.
Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) głównym czynnikiem środowiskowym przyczyniającym się do rozwoju raka skóry jest promieniowanie ultrafioletowe1. W przypadku czerniaka złośliwego wykazano, że ryzyko jego rozwoju związane jest zarówno z ekspozycją na promieniowanie UV jak również z genetycznymi predyspozycjami pacjenta. Podobnie, około 90% przypadków nieczerniakowych raków skóry związanych jest z ekspozycją skóry na promieniowanie ultrafioletowe. Liczne badania wykazały, że narażenie na pochodzące ze środowiska promieniowanie UV prowadzi do nagromadzenia mutacji oraz wpływa na aktywność i dystrybucję komórek odpowiedzi immunologicznej w skórzeiv. Stosunkowo nowym zjawiskiem klinicznym jest rosnąca liczba przypadków NMSC u pacjentów z obniżonym poziomem odporności. Wykazano, że u pacjentów, którym podawane są leki immunosupresyjne (np. w związku z przeszczepem organów) częstość występowania raka kolczystokomórkowego w porównaniu z osobami zdrowymi jest podwyższonav,vi.
Większość ludzkich chorób skóry (w tym nowotwory skóry), jest powiązana z nieprawidłowym różnicowaniem lub zaburzoną równowagą pomiędzy proliferacją i różnicowaniem keratynocytów w naskórku. Różnicowanie keratynocytów i stratyfikacja naskórka to procesy dynamiczne, mające kluczowe znaczenie dla utrzymywania bariery skórnej. U ludzi proces stratyfikacji trwa ok. 30 dni a zmiany w cyklu komórkowym, zmiany metaboliczne oraz zmiany strukturalne keratynocytów są precyzyjnie regulowane przez złożone szlaki sygnałowe, prowadzące do aktywacji odpowiednich czynn ików transkrypcyjnych. Jednym z nich jest ewolucyjnie konserwowany czynnik transkrypcyjny Grainyhead-like 3 (GRHL3). Wiadomo, że GRHL3 uczestniczy w następujących procesach biologicznychv:
• rozwój naskórka;
• rozwój ośrodkowego układu nerwowego;
• ścieżka sygnałowa kontrolująca polaryzację komórek w płaszczyźnie nabłonka (planar cell polarity - PCP) zaangażowana w zamknięcie cewy nerwowej;
• gojenie się ran;
• regulacja biogenezy i organizacji cytoszkieletu aktynowego;
• rozwój ektodermy;
PL 228 062 B1 • pozytywna regulacja transkrypcji przez polimerazę RNA typu II;
• proces ustalania wzoru specyfikacji;
• pozytywna regulacja aktywności GTPazy Rho;
• migracja komórek śródbłonka i angiogeneza.
Czynnik transkrypcyjny GRHL3 odpowiada za prawidłowe funkcjonowanie bariery skórnej poprzez bezpośrednią regulację ekspresji genów kodujących białka (m.in. TGM1, PTEN, RhoGEF19), jak również genu kodującego mikroRNA: miR-21. Hsa-miR-21 normalnie ulega ekspresji w postmitotycznych, ponadpodstawnych warstwach naskórka, w których ekspresji ulega również GRHL3™. Wiadomo również, że poziom ekspresji GRHL3 oraz jego bezpośredniego genu docelowego PTEN jest regulowany przez miR-21 (Fig. 1).
Pętla regulacyjna GRHL3/PTEN/miR-21 wydaje się zapewniać równowagę pomiędzy proliferacją a różnicowaniem keratynocytów w naskórku'. Badania eksperymentalne pokazały, że obniżony poziom ekspresji genu GRHL3 przyczynia się do podwyższenia poziomu ekspresji miR-21lx. Podwyższony poziom ekspresji miR-21 obserwowany jest w wielu różnych typach nowotworów, w tym w rakach skóry i innych chorobach skóry takich jak np. łuszczyca. Na poziomie molekularnym, nadekspresja miR-21 prowadzi do aktywacji ścieżki sygnałowej PI3K/AKT/mTOR, która jest jedną z najczęściej aktywowanych ścieżek przekazywania sygnału w nowotworachx. Aktywacja tej ścieżki odgrywa znaczącą rolę także w przypadku czerniaka złośliwego1. Czynnik transkrypcyjny GRHL3 odgrywa zatem ważną rolę supresora nowotworów skóry poprzez pośrednią inhibicję ścieżki PI3K/AKT i hamowanie ekspresji miR-21. Wykazano, że usunięcie lub inaktywacja genu kodującego GRHL3 w naskórku dorosłych myszy prowadzi do obniżenia ekspresji PTEN, bezpośredniego genu docelowego regulowanego przez GRHL3, oraz do zwiększenia ekspresji miR-21, co powoduje aktywację ścieżki przekazywania sygnału PI3K/AKT/mTOR oraz całkowitą utratę fosforylacji ERK (ale bez zmian w poziomie fosforylacji EGFR) a także indukuje powstawanie agresywnych nowotworów typu kolczystokomórk owegovl. Myszy, którym wstrzykiwano podskórnie keratynocyty pozbawione funkcjonalnego genu Grhl3 wykazują zwiększoną zapadalność na nowotwory skóry. Ponadto, myszy szczepu typu „warunkowy knock-ouf, w których gen Grhl3 jest selektywnie inaktywowany wyłącznie w naskórku (Grhl0- K14Cre ) są o wiele bardziej podatne na powstawanie raka kolczystokomórkowego pod wpływem chemicznej karcynogenezy przy użyciu DMBA/TPA niż myszy kontrolne genotypu „dzikiego” (Grhl3+/+). Pośrednia regulacja ścieżki przekazywania sygnału PI3K/AKT przez czynnik transkrypcyjny GRHL3 wydaje się mieć znaczenie zarówno w procesie rozwoju raka skóry jak i dla jego oporności na terapię.
Oprócz czynników zewnętrznych, takich jak promieniowanie UV, z ryzykiem rozwoju raka skóry związana jest zmienność genetyczna, prowadząca do międzyosobniczych różnic fenotypowych. W ystępowanie u danej osoby nietypowych wariantów genów, odpowiedzialnych za prawidłowe funkcjonowanie lub strukturę naskórka i/lub prawidłowe funkcjonowanie układu odpornościowego i/lub proces naprawy uszkodzeń DNA, może przyczynić się do zwiększenia ryzyka rozwoju raka skóry. Przyczyną rozwoju raka skóry na poziomie molekularnym jest nagromadzenie mutacji w sekwencji DNA genów, które zaangażowane są w utrzymanie równowagi pomiędzy proliferacją i różnicowaniem komórek naskórka. Raki skóry charakteryzują się wysoką częstością występowania mutacji typu tranzycji w sekwencji DNA (C/T i CC/TT) spowodowanych przez promieniowanie UV. Najczęściej spotykane mutacje de novo dotyczą onkogenu Ras i SMO, a także genów supresorowych p53 i PTCH*. Dziedziczone polimorfizmy pojedynczych nukleotydów zwiększające ryzyko rozwoju raka skóry stwierdzono m.in. w genie XRCC1XI11 i w promotorze genu MDM2xiv. Liczne badania wykazały przydatność informacji o pojedynczych i wielokrotnych mutacjach w onkogenach czy supresorach nowotworowych. Na przykład, wiedza o mutacjach w genach EGFR i KRAS pozwala przewidzieć reakcję fizjologiczną pacjenta na niektóre leki ukierunkowane na te targety molekularne '. Identyfikacja inaktywujących polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (single nucleotide polymorphism - SNP) w kodującej sekwencji genu GRHL3 może być użyteczna do określenia podwyższonego ryzyka rozwoju raka skóry czy też zasadności stosowania w terapii inhibitorów np. ścieżki PI3K/AKT u konkretnego pacjenta.
Publikacja Peyrard-Janvid i wsp. „Dominant Mutatio ns in GRHL3 Cause Van der Woude Syndrome and Disrupt Oral Periderm Development” The American Journal of Human Genetics 2014; 94(1 ):23-32, dotyczy mutacji w genie GRHL3 u pacjentów z zespołem Van der Woude (rozszczep wargi i podniebienia) i nie odnosi się do raka skóry.
Publikacja Petrof i wsp. „Mutations in GRHL2 Result in an Autosomal-Recessive Ectodermal Dysplasia Syndrome” AJGH 2014; 95(3):308-314 dotyczy mutacji w genie GRHL2 u pacjentów z dysplazją ektodermalną i nie odnosi się ani do raka skóry ani do GRHL3.
PL 228 062 B1
Publikacja Lin i wsp. „The grainyhead-like 2 gene (GRHL2) single nucleotide polymorphism is not associated with age-related hearing impairment in Han Chinese” The Laryngoscope 2011; 121 (6):1303-1307 odnosi się do SNP w genie GRHL2 w kontekście utraty słuchu i nie odnosi się ani do raka skóry ani do GRHL3. Publikacja Van Laer i wsp. „The grainyhead like 2 gene (GRHL2), alias TFCP2L3, is associated with age-related hearing impairment” Human Molecular Genetics 2008; 17(2): 159-169, dotyczy SNP, ale wyłącznie w odniesieniu do głuchoty i GRHL2 i nie odnosi się ani do raka, ani do GRHL3.
Publikacja Peters i wsp. „Mutation of a transcription factor, TFCP2L3, causes progressive a utosomal dominant hearing loss, DFNA28” Human Molecular Genetics 2002; 11(23):2877-2885 dotyczy SNP, ale wyłącznie w odniesieniu do głuchoty i GRHL2 i nie odnosi się ani do raka, ani do GRHL3.
Publikacja Kamiyama i wsp. „Polymorphisms in the 3'UTR in the neurocalcin δ gene affect mRNA stability, and confer susceptibility to diabetic nephropathy” Human Genetics 2007; 122(3-4):397-407 dotyczy SNP, ale tylko w odniesieniu do cukrzycy i GRHL2 i nie odnosi się ani do raka, ani do GRHL3.
Publikacja Bhandari i wsp. „The Grainyhead transcription factor Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis in skin: modulation of the miR-21 target MSH2 by RNA-binding protein DND1” Oncogene 32:1497-1507 dotyczy funkcjonalnej roli GRHL3 w raku skóry, ale bez odniesienia do SNP.
Publikacja Darido i wsp. „Targeting of the Tumor Suppressor GRHL3 by a miR-21-Dependent Proto-Oncogenic Network Results in PTEN Loss and Tumorigenesis” Cancer Cell 2011; 20(5):635648 odnosi się do funkcjonalnej roli GRHL3 w raku skóry, ale bez odniesienia do SNP.
Publikacja Panis i wsp. „Putative circulating markers of the early and advanced stages of breast cancer identified by high-resolution label-free proteomics” Cancer Letters 2013 330(1 ):57-66 wspomina o GRHL3 w nowotworach, ale odnosi się wyłącznie do raka piersi i nie wspomina o SNP.
Międzynarodowy wniosek patentowy WO2013029116A1 dotyczy między innymi funkcjonalnej roli GRHL3 w raku skóry, ale nie odnosi się do SNP.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry u ludzi, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) identyfikację w próbce biologicznej pobranej od pacjenta obecności co najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) w eksonie 11 genu Grainyhead-like 3 (GRHL3) występującego w postaci homozygotycznej lub heterozygotycznej w pozycji (według numeracji GRCh37/hg19):
- Chr1: 24669457, i/lub
- Chr1: 24669459,
b) określenia genotypu, który prowadzi do zwiększonego ryzyka powstania raka skóry, w przypadku identyfikacji co najmniej jednego z następujących polimorfizmów (według numeracji GRCh37/hg19):
- C T zmiana w pozycji chr1 : 24669457, i/lub
- C G zmiana w pozycji chr1 : 24669459.
Korzystnie, rak jest nieczerniakowym rakiem skóry lub czerniakiem złośliwym.
Korzystnie, obecność genotypu jest wykrywana za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
Korzystnie, badanie DNA, RNA lub białek przeprowadza się przy użyciu dowolnej metody identyfikacji homozygotycznych lub heterozygotycznych SNP w sekwencji genomowej, genetycznej lub białkowej, zwłaszcza takiej jak: metoda Western blot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierze SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla alleli (dynamie allele-specific hybridization - DASH), latarnie molekularne (molecular beacons), sondy typu TaqMan, wydłużanie starterów (primer extension), spektrometria masowa typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight), metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), test ligaeji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (single-strand conformation polymorphism), elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis - TGGE), wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction - HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing - NGS) w materiale wyizolowanym z fragmentu tkanki lub krwi pobranej od pacjenta, przy czym co najmniej jeden z takich SNP obecny na statystycznie znaczącym poziomie wskazuje na zaburzenie funkcjonowania procesów zależnych od działania GRHL3.
PL 228 062 B1
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie in vitro biomarkera molekularnego obejmującego polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) w eksonie 11 genu Grainyhead-like 3 (GRHL3) występującym w postaci homozygotycznej lub heterozygotycznej w pozycji (według numeracji GRCh37/hg19):
- Chr1 : 24669457, i/lub
- Chr1 : 24669459, przy czym rzeczonym polimorfizmem jest:
- C T zmiana w pozycji chr1 : 24669457, i/lub
- C G zmiana w pozycji chr1 : 24669459, do diagnozowania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry u ludzi, przy czym występowanie rzeczonych polimorfizmów w próbce biologicznej pobranej od pacjenta wskazuje na zwiększone ryzyko zachorowania na raka skóry.
Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku warianty genetyczne, zawierające polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), zarówno homozygotycznych jak i heterozygotycznych, związane z rakiem skóry w genie Grainyhead-like 3 (GRHL3) lub jego produktach są wykrywane za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku badanie DNA, RNA lub białek przeprowadza się przy użyciu dowolnej metody identyfikacji homozygotycznych lub heterozygotycznych SNP w sekwe ncji genomowej, genetycznej lub białkowej, zwłaszcza takiej jak: metoda Western blot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierze SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla alleli (dynamic allele-specific hybridization DASH), latarnie molekularne (molecular beacons), sondy typu TaqMan, wydłużanie starterów (primer extension), spektrometria masowa typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight), metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i podobne, test ligacji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (single-strand conformation polymorphism), elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis - TGGE), denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction - HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing - NGS) w materiale wyizolowanym z próbki tkanki lub krwi pobranej od pacjenta, przy czym co najmniej jeden z takich SNP obecny na statystycznie znaczącym poziomie wskazuje na zaburzenie funkcjonowania procesów zależnych od działania GRHL3. Korzystnie, w zastosowaniu według wynalazku rak jest nieczerniak owym rakiem skóry lub rakiem jest czerniak złośliwy.
Szczegółowy opis
Ujawniono polimorfizmy pojedynczych nukleotydów zidentyfikowane w sekwencji kodującej genu GRHL3 i specyficzne dla pacjentów z rakiem skóry. Ich obecność w sekwencji DNA może prowadzić do upośledzenia funkcji białka GRHL3, a zatem może wpływać na obniżanie aktywności białka PTEN i aktywację szlaku PI3K/AKT/mTOR. W szczególności, ta część wynalazku odnosi się do dwóch polimorfizmów pojedynczych nukleotydów położonych w eksonie 11 genu GRHL3. Według bazy danych UCSC oba polimorfizmy znajdują się we wszystkich wariantach alternatywnego składania transkryptu GRHL3, które kodują białko (Fig. 2) (http://genome.ucsc.edu). Na Fig. 2 przedstawiono warianty alternatywnego składania mRNA GRHL3.
Ponadto, obecność obu polimorfizmów prowadzi do zmiany sekwencji aminokwasowej i pote ncjalnie może wpływać na prawidłowe funkcjonowanie różnych izoform białka GRHL3. Pierwszy SNP (SNP1) jest zmianą typu C>T w pozycji 24669457 na chromosomie 1 w eksonie 11 genu GRHL3, według numeracji GRCh37/hg19. Drugi SNP (SNP2) jest zmianą typu C>G w pozycji 24669459 na chromosomie 1 w eksonie 11 genu GRHL3, według numeracji GRCh37/hg19.
Ujawniono metody służące do określania u pacjentów zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry, zwłaszcza typu nieczerniakowego i czerniaka złośliwego, w oparciu o identyfikację co najmniej jednego z wymienionych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genie GRHL3.
Kolejną realizacją wynalazku jest zastosowanie metod określania u pacjentów zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry, w szczególności typu nieczerniakowego i czerniaka złośliwego, w oparciu o identyfikację co najmniej jednego z wymienionych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genie GRHL3, w badaniach przesiewowych populacji ludzkiej w celu wykrywania osób ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka skóry.
PL 228 062 B1
Kolejną realizacją wynalazku jest zastosowanie metod określania u pacjentów zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry, w szczególności typu nieczerniakowego i czerniaka złośliwego, w oparciu o identyfikację co najmniej jednego z wymienionych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genie GRHL3 w populacyjnych programach profilaktyki i wczesnego wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry.
Istota niniejszego wynalazku jest zilustrowana przez następujące przykłady nie wyczerpujące wszystkich możliwości zastosowania wynalazku. W trakcie rutynowej pracy laboratoryjnej może w ystąpić duża liczba zmian i wariantów proceduralnych, które jednak mieszczą się w zakresie niniejszego wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Identyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów charakterystycznych dla pacjentów z rakiem skóry.
Rakowe zmiany skórne wraz z marginesem zdrowej tkanki zostały usunięte chirurgicznie i poddane wstępnej ocenie patologicznej. Fragmenty tkanki nowotworowej oraz tkanki zdrowej z marginesu wyciętej zmiany zostały pobrane od 32 pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry oraz od 2 pacjentów z czerniakiem złośliwym. Tkanki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy. Następnie, za pomocą zestawu do izolacji DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) wyizolowano genomowe DNA. Wzbogacenie próbek w wybrane sekwencje docelowe przeprowadzono za pomocą indywidualnie zaprojektowanego zestawu HaloPlex (Agilent) i tak przygotowaną bibliotekę DNA zawierającą fragmenty genów GRHL poddano ukierunkowanemu głębokiemu sekwencjonowaniu nowej generacji w systemie MiSeq (Illumina).
Inne znane metody, które mogą zostać wykorzystane do wykrywania obecności polimorfizmów w sekwencji genu GRHL3 lub zmienionych aminokwasów w produkcji białkowym genu GRHL3 z tkanek bądź płynów ustrojowych pobranych od pacjentów obejmują, ale nie są ograniczone do: Western biot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierze SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla allełi (dynamie allele-specific hybridization - DASH), latarnie molekularne (molecular beacons), sondy typu TaqMan, wydłużanie starterów (primer extension), spektrometria mas typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight), metody ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i podobne, test ligacji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (single-strand conformation polymorphism), elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis TGGE), denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction - HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing - NGS) oraz trawienie restrykcyjne poprzedzone reakcją PCR.
P r z y k ł a d 2
Analiza częstości i korelacja występowania alleli w badanej populacji
Częstość występowania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w grupie pacjentów z rakiem skóry porównano do częstości ich występowania w populacji europejskiej na podstawie danych z bazy 1000Genomes. Do określenia statystycznej istotności odchyleń (przy poziomie istotności p<0,05) dla częstości występowania SNP w badanej populacji zastosowano test dwumianowy. Rozkład SNP o odmiennej częstości występowania w badanej grupie pacjentów przedstawia Manhattan Plot (Fig. 3).
Na podstawie wyżej opisanej analizy wytypowano dwa polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP1 i SNP2) w sekwencji kodującej GRHL3, które występują w populacji badanych pacjentów z rakiem skóry istotnie częściej niż w populacji europejskiej. Co najmniej jeden z opisywanych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów wykryto w sumie u 9 pacjentów (5 osób z BCC, 3 osoby z SCC, 1 osoba z czerniakiem złośliwym), jak pokazano w Tabeli 1.
PL 228 062 Β1
Tabela 1. Częstość występowania SNP1 i SNP2 w badanej populacji pacjentów z rakiem skóry
| pozycja | liczba pacjentów z wykrytym polimorfizmem | częstość występowania w populacji europejskiej (1000 Genomes) | częstość obserwowana w badanej grupie | wartość p | |
| SNP1 | Chr1:24669457 | 3/34 | 0,030 | 0,044118 | 0,460325709845 |
| SNP2 | Chr1:24669459 | 6/34 | 0,004 | 0,088235 | 0,000000362507 |
Oba polimorfizmy znajdują się w sąsiednich kodonach i mają charakter niesynonimiczny, a więc wprowadzają zmiany w sekwencji aminokwasowej białka i mogą mieć wpływ na jego strukturę i/lub prawidłowe funkcjonowanie. Co więcej, oba aminokwasy, w kodonach których zlokalizowane są polimorfizmy, znajdują się w motywie potencjalnie rozpoznawanym przez kinazy takie jak GSK-33, ERK1, ERK2 oraz CDK5 (Rys. 4) (http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/).
Obecność każdego polimorfizmu z osobna przynosi taki sam skutek na poziomie molekularnym - utratę miejsca fosforylacji białka GRHL3, zatem polimorfizmy SNP1 i SNP2 można potraktować jako równocenne. Prawdopodobieństwo, że pojawiły się one w grupie pacjentów z rakiem skóry przypadkowo wynosi wtedy p=4,06238021027x10 . Innym sposobem przedstawienia powyższego wyniku jest następujące stwierdzenie: prawdopodobieństwo, że występowanie u danej osoby dowolnego z tych SNP zwiększa jej ryzyko zachorowania na raka skóry, wynosi ponad 99,99999995%.
Konsekwencje molekularne każdego z opisywanych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów: SNP1 i SNP2 na modyfikacje potranslacyjne i funkcjonowanie białka GRHL3 są przedmiotem dalszych badań autorów patentu.
Zmiana poziomu ekspresji genów GRHL w nieczerniakowych rakach skóry.
Czynniki transkrypcyjne z rodziny GRHL są ewolucyjnie zachowaną, tkankowo-specyficzną grupą białek. Ich rola sprowadza się do regulacji transkrypcji (poprzez aktywację lub represję) genów istotnych dla utrzymania właściwej struktury i funkcji nabłonka. Kontrolują one ekspresję m.in. takich genów jak: DSG1, CDH1, RAB25, CLDN3 i CLDN4, TGM1, PTEN, RhoGEF19, geny z kompleksu EDC, hTERT oraz PCNA i biorą udział w utrzymaniu równowagi pomiędzy proliferacją i różnicowaniem keratynocytów w naskórku. Zaburzenia w poziomie ekspresji genów GRHL mogą być pośrednio powiązane z wieloma chorobami skóry i/lub mogą sprzyjać nowotworzeniu.
Przykład: Zmiany poziomu ekspresji genów GRHL w nieczerniakowych rakach skóry
RNA wyizolowano z tkanki nowotworowej oraz tkanki zdrowej pobranej z marginesu wciętej zmiany, z użyciem homogenizatora Bio-Gen PR0200 oraz zestawu RNeasy® Fibrous Tissue Mini Kit firmy Oiagen. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono na 250 ng mRNA z pomocą Superscript® VILO™ Master Mix firmy lnvitrogen. Detekcję zmian poziomu ekspresji w tkance nowotworowej w odniesieniu do tkanki zdrowej danego pacjenta przeprowadzono za pomocą odczynników Life Technologies: TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2x) No AmpErase UNG i TaqMan Gene Expression Assay:
| Gene | Assay ID | Obejmowane eksony | Długość amplikonu |
| GRHL1 | Hs01119372 m1 | 15-16 | 84 |
| GRHL2 | Hs00227745 m1 | 12-13 | 82 |
| GRHL3 | Hs00297962 m 1 | 14-15 | 99 |
| HPRT | Hs03929098 m1 | 2-3 | 159 |
Real-Time PCR przeprowadzono w systemie 7900HT Fast Real-Time PCR firmy Applied Biosystems. U pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry zaobserwowano spadek poziomu ekspresji genów GRHL1 i GRHL3 oraz korelację pomiędzy poziomem ekspresji obu genów.
Zastosowanie: Spadek poziomu ekspresji genów GRHL molekularnym znacznikiem raka skóry
PL 228 062 B1
Wpływ polimorfizmów pojedynczych nukleotydów na poziom ekspresji genów GRHL w nieczerniakowych rakach skóry.
Regulacja ekspresji genów jest procesem złożonym i zależy od wielu czynników. Co więcej, każdy z etapów ekspresji genów może być regulowany za pomocą różnych mechanizmów. Ekspresja genów GRHL w naskórku zależy od etapu różnicowania, w którym znajduje się keratynocyt oraz od metabolicznego i fizjologicznego stanu komórki.
a) Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w sekwencjach regulatorowych (promotory)
Sekwencjonowanie nowej generacji genów GRHL pozwoliło na wskazanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w regionach regulatorowych genów GRHL u pacjentów z rakiem skóry. Na podstawie przygotowanej analizy Manhattan Plot (opisano wcześniej) wskazano polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, które mogą być powiązane ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka skóry. Zmiana częstości ich występowania w populacji badanych pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry w porównaniu z populacją europejską była statystycznie istotna.
PL 228 062 Β1
Tabela 1 Wykaz SNPów w sekwencjach promotorowych genów GRHL u pacjentów z rakiem skóry
| chromosom | (•n | pozycji | rs | liczba pacjentów | liczba atlell | CZfStoiiw populacji EUR (1000 Genomi OB) | częstość w populacji badanej | kierunek zmiany częstoid | wartość P |
| chrl | GRHL3 | 24634151 | rs464B973 | 16 | 20 | 0,170 | 0,286 | * | 0,016 |
| chrl | GRHL3 | 24635447 | rs72876716 | 6 | 6 | 0,190 | 0,086 | - | 0,022 |
| chrl | GRHL3 | 24635817 | r$7507l937 | 6 | 6 | 0,190 | 0,086 | - | 0,022 |
| chrl | GRHL3 | 24637441 | rs35621722 | 21 | 27 | 0,250 | 0,386 | ♦ | 0,012 |
| chrl | GRHL3 | 24638154 | rs942541 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | - | 0,006 |
| chrl | GRHL3 | 24638249 | rs591716 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | - | 0,006 |
| Chrl | GRHL3 | 24638433 | rs592614 | 6 | 6 | 0.220 | 0,086 | - | 0,006 |
| Chrl | GRHL3 | 24639258 | 6 | 6 | 0,001 | 0,086 | 4 | 0,000 | |
| chrl | GRHL3 | 24639409 | 7 | 7 | 0,001 | 0,100 | 4 | 0,000 | |
| chrl | GRHL3 | 24639413 | rs544030 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | - | 0,006 |
| chrl | GRHL3 | 24639724 | rs 1769650 | 4 | 4 | 0,210 | 0,057 | - | 0,001 |
| chrl | GRHL3 | 24639778 | rsl748402 | 6 | 6 | 0.220 | 0,086 | - | 0,006 |
| chrl | GRHL3 | 24639877 | rsl748401 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | 0,006 | |
| chrl | GRHL3 | 24639932 | rsl 769649 | 6 | G | 0,210 | 0,086 | - | 0,008 |
| chrl | GRHL3 | 24640017 | rs620141 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | - | 0,006 |
| chrl | GRHL3 | 24640314 | rs62153S | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | - | 0,006 |
| chrl | GRHL3 | 24640456 | rs622345 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | - | 0.006 |
| chrl | GRHL3 | 24640491 | rs4 78996 | 6 | 6 | 0,220 | 0,086 | 0,006 | |
| chrl | GRHL3 | 24641130 | TS2763209 | 25 | 33 | 0,001 | 0,471 | + | ο,οοο |
| chrl | GRHL3 | 24641134 | 5 | 5 | 0,001 | 0,071 | 4 | 0.000 | |
| chrl | GRHL3 | 24641138 | rsl88840086 | 4 | 4 | 0,180 | 0,057 | - | 0.005 |
| chrl | GRHL3 | 24641157 | rsS5771417 | 14 | 14 | 0,001 | 0,200 | + | 0,000 |
| chrl | GRHL3 | 24641169 | rsS6087219 | 34 | 50 | 0,001 | 0,714 | + | 0,000 |
| chrl | GRHL3 | 24641177 | rs55927162 | 32 | 48 | 0,210 | 0,686 | + | ο,οοο |
| chrl | GRHL3 | 24641185 | rs56256719 | 33 | 50 | 0,240 | 0,714 | 4- | 0,000 |
| Chrl | GRHL3 | 24641759 | rsl2045977 | 35 | 51 | 0,540 | 0,729 | 4 | 0,002 |
| chrl | GRHL3 | 24641835 | rsl1249086 | 35 | 52 | 0,540 | 0,743 | 4 | 0,001 |
| chr2 | GRHLI | 10085631 | rslO929625 | 8 | 8 | 0,220 | 0,114 | 0,030 | |
| chr2 | GRHLI | 10086360 | rsl036060 | 35 | 60 | 0,930 | 0,857 | - | 0,030 |
| chri | GRHLI | 10086394 | rsl90470103 | 2 | 2 | 0,001 | 0,029 | 4 | 0,002 |
| Chr2 | GRULI | 10086398 | rsl036059 | 23 | 39 | 0,680 | 0,557 | 0,039 | |
| chr2 | GRHLI | 10086732 | 10 | 11 | 0.001 | 0,157 | * | 0,000 | |
| chr2 | GRHL1 | 10086802 | rs872904 | 3 | 6 | 0,310 | 0,086 | - | 0,000 |
| chr2 | GRHL1 | 10038366 | «2033324 | 1 | 1 | 0,130 | 0,014 | - | 0,001 |
| chr2 | GRHL1 | 10089843 | 11 | 22 | ο,οοι | 0,314 | 4 | 0,000 | |
| chr2 | GRHLI | 10089845 | 11 | 22 | 0,001 | 0,314 | 4 | 0,000 | |
| chr2 | GRULI | 10089850 | 10 | 19 | 0,001 | 0,271 | 4 | 0,000 | |
| chr2 | GRHL1 | 10090435 | 11 | 11 | 0,001 | 0,157 | 4 | 0,000 | |
| chr2 | grhli | 10091420 | 7 | 7 | 0,001 | 0,100 | 4 | 0,000 | |
| chr2 | GRULI | 10091422 | rsl 15898376 | 5 | 7 | 0,230 | 0,100 | - | 0.010 |
| chr2 | GRHLI | 10091472 | rs4630741 | 2 | 4 | 0,520 | 0,057 | - | 0,000 |
Polimorfizmy oznaczone „+” występują w populacji pacjentów częściej niż w populacji europejskiej, zaś rzadziej.
Sens biologiczny
Obecność polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w sekwencji rozpoznawanej przez czynniki transkrypcyjne może prowadzić do utraty, osłabienia, wzmocnienia lub utworzenia miejsca wiązania białko/DNA, co w konsekwencji prowadzi do zmian w poziomie ekspresji genów.
b) Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w regionach 3’UTR genów GRHL
U pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry zaobserwowano jednoczesny spadek poziomu ekspresji genów GRHL1 i GRHL3. Poziom ekspresji obu genów w tym samym czasie i przestrzeni może zależeć od regulacji poprzez miRNA. Cząsteczki mikroRNA (miRNA) regulują poziom ekspresji genów poprzez wiązanie się do specyficznych 7-nukleotydowych sekwencji w obszarze 3’UTR czą10
PL 228 062 Β1 steczek mRNA. Poprzez obniżenie efektywności translacji informacji genetycznej do białka, dochodzi do wyciszenia poziomu ekspresji genu. Zaburzenie regulacji poziomu ekspresji genów może mieć kluczowe znaczenie w procesie nowotworzenia. Jedną z przyczyn zaburzenia interakcji miRNA/mRNA może być obecność polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) w sekwencji kodującej 3’UTR. W efekcie może dochodzić do likwidacji istniejących lub tworzenia nowych specyficznych 6-8 nukleotydowych sekwencji rozpoznawanych przez miRNA i w efekcie do niepożądanego podwyższenia lub obniżenia poziomu ekspresji danego genu. Sekwencjonowanie nowej generacji genów GRHL pozwoliło na wskazanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów u pacjentów z rakiem skóry w regionach kodujących 3’UTR genów GRHL. Na podstawie przygotowanej analizy Manhattan Plot wskazano polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, które mogą być powiązane ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka skóry. Zmiana częstości ich występowania w populacji badanych pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry w porównaniu z populacją europejską była statystycznie istotna.
| chromosom | gen | pozycja | rs | liczba pacjentów | liczba alleli | częstoić w populacji EUR (1000 Genoms DB) | czestoić w populacji badanej | kierunek zmiany częstoicl | warto» P |
| chrl | GRHL3 | 24692283 | «548942 | 17 | 22 | 0,210 | 0,314 | + | 0,039 |
| chr2 | GRULI | 10142073 | rs 1052835 | 2B | 39 | 0,420 | 0,557 | + | 0,022 |
| chr2 | GRHL1 | 10143469 | 3 | 3 | 0,001 | 0,043 | + | 0,000 | |
| chrS | GRHL2 | 102586349 | «16867839 | 1 | 1 | 0,150 | 0.014 | - | 0,000 |
| chrS | GRHL2 | 102611707 | «567029 | 1 | 2 | 0,610 | 0,029 | 0,000 | |
| chrS | GRHL2 | 102681482 | rs7820879 | 13 | 13 | 0,001 | 0,186 | + | 0,000 |
| chrS | GRHL2 | 102681820 | «201378138 | 4 | 4 | 0,001 | 0,057 | + | 0,000 |
Obecność polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w sekwencji rozpoznawanej przez miRNA może prowadzić do utraty, osłabienia, wzmocnienia lub utworzenia miejsca wiązania miRNA/mRNA. Wpływ polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genach GRHL określono z wykorzystaniem dwóch baz danych: PolymiRTS Database 3.0 oraz MirSNP. Jeden z polimorfizmów pojedynczych nukleotydów: rs1052835 zasługuje na szczególną uwagę. Występuje on w 3’UTR genu GRHL1 u pacjentów z nieczerniakowym rakiem skóry znacznie częściej niż w populacji europejskiej, co więcej występuje najczęściej w postaci homozygotycznej. Zmiana pojedynczego nukleotydu powoduje utworzenie dodatkowej komplementarnej pary zasad w sekwencji rozpoznawanej przez hsa-miR-802, co wzmacnia siłę wiązania miRNA/mRNA. Według bazy miRó (http://ferrolab.dmi.unict.it/index.html). hsa-miR-802 występuje w nieczerniakowych rakach skóry, a do jego genów docelowych należą: PTCH1 (receptor dla SHH, supresor nowotworzenia), PTGS2, GSTM3. Co ciekawe, szlak przekazywania sonie hedgehog jest kluczowy w rozwoju nieczerniakowych raków skóry (przykładowe publikacje):
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17988327.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20848446.), zaś czynnik transkrypcyjny GRHL1 wykazuje (podobnie jak PTCH1) aktywność supresorową (praca Michała Mląckiego). miR-802 może regulować oba geny i wykazywać działanie onkogenne w kontekście rozwoju raka skóry. Obecność SNP w sekwencji rozpoznawanej przez miR-802 może prowadzić do nadmiernej represji genu GRHL1.
Wykaz sekwencji
Sekwencja ID 1
SNP1 - http://www.nebi.nim.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=41268753
Chr 1: 24669457, C^T rs41268753:
CCTTCGGCCAGAGACTGACCTGGAGA[C/T]GCCACCCGTGCTGTTCATCCCCAATGT
Sekwencja ID 2
SNP2 - http://www.ncbi.nim.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=141193530
Chr 1: 24669459, C^G rs141193530:
CCTTCGGCCAGAGACTGACCTGGAGACG[C/G]CACCCGTGCTGTTCATCCCCAATGT
PL 228 062 B1
Literatura:
1. http://www.who.int/uv/faq/skincancer/en/index1 .html
2. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2013 http://www.cancer.Org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/doc ument/acspc-036845. pdf
3. http://www.who.int/uv/publications/solaradgbd/en/
4. Norval M, McLoone P, Lesiak A, Narbutt J: The effect of chronic ultraviolet radiation on the human immune system. Photochemistry and Photobiology 2008; 84 (1): 19-28
5. Fortina A, Piaserico S, Caforio AP, et al.: Immunosuppressive Level and Other Risk Factors for Basal Cell Carcinoma and Squamous Cell Carcinoma in Heart Transplant Recipients. Arch Dermatol. 2004; 140(9):1079-1085
6. Kirsten D, Mertz, Proske D, Kettelhack N, Kegel C, Keusch G, Schwarz A, Ambuhl PM, Pfaltz M, Kempf W: Basal cell carcinoma in a series of renal transplant recipients: epidemiology and clinicopathologic features International Journal of Dermatology 2010; 49(4):385-389
7. hhttp://www.phosphosite.org/proteinAction.do?id=2472328&showAIISites=true
8. Darido C, Georgy SR, Wilanowski T, Dworkin S, Auden A, Zhao Q, Rank G, Srivastava S, FinlayMJ, Papenfuss AT, Pandolfi PP, Pearson RB, Jane SM: Targeting of the Tumor Suppressor GRHL3 by a miR-21-Dependent Proto-Oncogenic Network Results in PTEN Loss and Tumorigenesis Cancer Cell 2011; 20(5):635-648
9. Bhandari A, Gordon W, Dizon D, Hopkin AS, Gordon E, Yu Z, Andersen B: The Grainyhead transcription factor Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis in skin: modulation of the miR-21 target MSH2 by RNA-binding protein DND1 Oncogene 2013; 32: 1497-1507
10. Vivanco I, Sawyers CL: The phosphatidylinositol 3-Kinase-AKT pathway in human cancer Nature Reviews Cancer 2002; 2:489-501
11. Davies MA: The role of the PI3K-AKT pathway in melanoma. Cancer Journal 2012; 18(2): 142-7
12. Sarasin A: The molecular pathways of ultraviolet-induced carcinogenesis Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 1999; 428(1-2):5-10
13. Han J, Hankinson SE, Colditz GA, Hunter DJ: Genetic variation in XRCC1, sun exposure, and risk of skin cancer British Journal of Cancer 2004; 91:1604-1609
14. Nan H, Qureshi AA, Hunter DJ, Han J: A functional SNP in the MDM2 promoter, pigmentary phenotypes, and risk of skin cancer Cancer Causes & Control 2009; 20(2): 171 -179
15. Tong Jin, Chun-Xiao Yu, Tong Jin, Chun-Xiao Yu, Da-Peng Lei, Da-Yu Liu, Feng-Lei Xu, Yong-Tian Lu, Xin-Liang Pan: Identification of epidermal growth factor receptor (EGFR) exon 20 single nucleotide polymorphism in Chinese squamous cell carcinoma of head and neck (SCCHN) Acta Oto-laryngologica 2009; 129(11): 1306-1312
Claims (10)
1. Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry u ludzi, znamienny tym, że obejmuje:
a) identyfikację w próbce biologicznej pobranej od pacjenta obecności co najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) w eksonie 11 genu Grainyhead-like 3 (GRHL3) występującego w postaci homozygotycznej lub heterozygotycznej w pozycji (według numeracji GRCh37/hg19):
- Chr1 : 24669457, i/lub
- Chr1: 24669459,
b) określenia genotypu, który prowadzi do zwiększonego ryzyka powstania raka skóry, w przypadku identyfikacji co najmniej jednego z następujących polimorfizmów (według numeracji GRCh37/hg19):
- C >T zmiana w pozycji chr1: 24669457, i/lub
- C >G zmiana w pozycji chr1: 24669459.
PL 228 062 B1
2. Sposób według zastrz. 1, w którym rak jest nieczerniakowym rakiem skóry.
3. Sposób według zastrz. 1, w którym rak jest czerniakiem złośliwym.
4. Sposób według zastrz. 1, w którym obecność wariantu genetycznego jest wykrywana za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
5. Sposób według zastrz. 4, w którym badanie DNA, RNA lub białek przeprowadza się przy użyciu dowolnej metody identyfikacji homozygotycznych lub heterozygotycznych SNP w sekwencji genomowej, genetycznej lub białkowej, w tym: metoda Western blot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierze SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla alleli (dynamie allele-specific hybridization - DASH), latarnie molekularne (molecular beacons), sondy typu TaqMan, wydłużanie starterów (primer extension), spektrometria masowa typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight), metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), test ligacji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (singlestrand conformation polymorphism), elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis - TGGE), wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction - HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing - NGS) w materiale wyizolowanym z fragmentu tkanki lub krwi pobranej od pacjenta, przy czym co najmniej jeden z takich SNP obecny na statystycznie znaczącym poziomie wskazuje na zaburzenie funkcjonowania procesów zależnych od działania GRHL3.
6. Zastosowanie in vitro biomarkera molekularnego obejmującego polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) w eksonie 11 genu Grainyhead-like 3 (GRHL3) występującym w postaci homozygotycznej lub heterozygotycznej w pozycji (według numeracji GRCh37/hg19):
- Chr1: 24669457, i/lub
- Chr1: 24669459, przy czym rzeczonym polimorfizmem jest:
C >T zmiana w pozycji chr1: 24669457, i/lub C >G zmiana w pozycji chr1: 24669459, do diagnozowania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka skóry u ludzi, przy czym występowanie rzeczonych polimorfizmów w próbce biologicznej pobranej od pacjenta wskazuje na zwiększone ryzyko zachorowania na raka skóry.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym warianty genetyczne, zawierające polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), zarówno homozygotycznych jak i heterozygotycznych, związane z rakiem skóry w genie Grainyhead-like 3 (GRHL3) lub jego produktach są wykrywane za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym badanie DNA, RNA lub białek przeprowadza się przy użyciu dowolnej metody identyfikacji homozygotycznych lub heterozygotycznych SNP w sekwencji genomowej, genetycznej lub białkowej, w tym metoda Western blot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierze SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla alleli (dynamic allele-specific hybridization - DASH), latarnie molekularne (molecular beacons), sondy typu TaqMan, wydłużanie starterów (primer extension), spektrometria masowa typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight), metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i podobne, test ligacji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (single-strand conformation polymorphism), elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis - TGGE), denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing NGS) w materiale wyizolowanym z próbki tkanki lub krwi pobranej od pacjenta, przy czym co najmniej jeden z takich SNP obecny na statystycznie znaczącym poziomie wskazuje na zaburzenie funkcjonowania procesów zależnych od działania GRHL3.
9. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym rak jest nieczerniakowym rakiem skóry.
10. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym rakiem jest czerniak złośliwy.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410049A PL228062B1 (pl) | 2014-11-03 | 2014-11-03 | Sposób wykrywania zwiekszonego ryzyka zachorowania na raka skóry oraz zastosowanie genotypowego wariantu genu GRHL3 |
| US15/106,163 US10000816B2 (en) | 2013-12-19 | 2014-12-19 | Method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the GRHL3 gene |
| EP14835533.2A EP3083999B1 (en) | 2013-12-19 | 2014-12-19 | A method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the grhl3 gene |
| AU2014367369A AU2014367369B2 (en) | 2013-12-19 | 2014-12-19 | A method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the GRHL3 gene |
| PCT/PL2014/050078 WO2015093998A1 (en) | 2013-12-19 | 2014-12-19 | A method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the grhl3 gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410049A PL228062B1 (pl) | 2014-11-03 | 2014-11-03 | Sposób wykrywania zwiekszonego ryzyka zachorowania na raka skóry oraz zastosowanie genotypowego wariantu genu GRHL3 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410049A1 PL410049A1 (pl) | 2016-05-09 |
| PL228062B1 true PL228062B1 (pl) | 2018-02-28 |
Family
ID=55910556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410049A PL228062B1 (pl) | 2013-12-19 | 2014-11-03 | Sposób wykrywania zwiekszonego ryzyka zachorowania na raka skóry oraz zastosowanie genotypowego wariantu genu GRHL3 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL228062B1 (pl) |
-
2014
- 2014-11-03 PL PL410049A patent/PL228062B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410049A1 (pl) | 2016-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109415770B (zh) | 乳腺癌标志物及应用 | |
| Capasso et al. | Common genetic variants in NEFL influence gene expression and neuroblastoma risk | |
| Hoffman et al. | microRNA miR-196a-2 and breast cancer: a genetic and epigenetic association study and functional analysis | |
| Kunder et al. | Real-time PCR assay based on the differential expression of microRNAs and protein-coding genes for molecular classification of formalin-fixed paraffin embedded medulloblastomas | |
| Sun et al. | Hsa‐mir‐27a genetic variant contributes to gastric cancer susceptibility through affecting miR‐27a and target gene expression | |
| Tepel et al. | Frequent promoter hypermethylation and transcriptional downregulation of the NDRG2 gene at 14q11. 2 in primary glioblastoma | |
| Javeri et al. | Downregulation of miR-34a in breast tumors is not associated with either p53 mutations or promoter hypermethylation while it correlates with metastasis | |
| Watkins et al. | An integrated genomic and expression analysis of 7q deletion in splenic marginal zone lymphoma | |
| Xie et al. | Role of ATG10 expression quantitative trait loci in non‐small cell lung cancer survival | |
| Chang et al. | Downregulation of RECK by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in non‐small cell lung cancer | |
| Pavlidou et al. | Diagnostic significance and prognostic role of the ARID1A gene in cancer outcomes | |
| Zheng et al. | Genetic variants at the miR-124 binding site on the cytoskeleton-organizing IQGAP1 gene confer differential predisposition to breast cancer | |
| Qin et al. | Downregulation of microRNA-132 by DNA hypermethylation is associated with cell invasion in colorectal cancer | |
| Wong et al. | DNA methylation of tumor suppressor protein-coding and non-coding genes in multiple myeloma | |
| Kong et al. | Recent advances in understanding FOXN3 in breast cancer, and other malignancies | |
| AU2014367369B2 (en) | A method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the GRHL3 gene | |
| Thomas et al. | Molecular heterogeneity in malignant peripheral nerve sheath tumors associated with neurofibromatosis type 1 | |
| Liu et al. | Association between functional PSMD10 Rs111638916 variant regulated by MiR-505 and gastric cancer risk in a Chinese population | |
| Zhang et al. | Up-regulation of CRKL by microRNA-335 methylation is associated with poor prognosis in gastric cancer | |
| Hu et al. | Specific microRNAs as novel biomarkers for combination chemotherapy resistance detection of colon adenocarcinoma | |
| Wang et al. | Aberrant methylation of RUNX3 is present in Aflatoxin B1-induced transformation of the L02R cell line | |
| Dreidax et al. | p19-INK4d inhibits neuroblastoma cell growth, induces differentiation and is hypermethylated and downregulated in MYCN-amplified neuroblastomas | |
| Puerta-Garcia et al. | Molecular biomarkers in colorectal carcinoma | |
| JP2011520454A (ja) | 結腸直腸癌を評価する方法及びかかる方法に使用するための組成物 | |
| Høland et al. | Inferior survival for patients with malignant peripheral nerve sheath tumors defined by aberrant TP53 |