PL227208B1 - Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu - Google Patents
Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanoluInfo
- Publication number
- PL227208B1 PL227208B1 PL412983A PL41298315A PL227208B1 PL 227208 B1 PL227208 B1 PL 227208B1 PL 412983 A PL412983 A PL 412983A PL 41298315 A PL41298315 A PL 41298315A PL 227208 B1 PL227208 B1 PL 227208B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phenylethanol
- phenylalanine
- culture
- ethyl acetate
- biomass
- Prior art date
Links
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 23
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims abstract description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 9
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 3
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 claims description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 2-phenyl-phenyl Chemical group 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000010891 toxic waste Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu wyprodukowanego przez szczep drożdżowy na drodze biokonwersji L-fenyloalaniny, polega na tym, że prowadzi się hodowlę okresową szczepu drożdżowego Saccharomyces cerevisiae AM1-d, który zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno - Spożywczego pod numerem KKP2055p na pożywce dedykowanej do biokonwersji L-fenyloalaniny do 2-fenyloetanolu, zawierającej L-fenyloalaninę, jako główne źródło azotu oraz ograniczoną zawartość pozostałych źródeł azotu, monitorując przyrost biomasy poprzez mierzenie OD600 oraz stężenia i 2-fenyloetanolu i glukozy w cieczy pohodowlanej. Po zakończeniu bioprocesu, hodowlę wiruje się, oddzieloną od biomasy ciecz pohodowlaną, zawierającą 2-fenyloetanol, poddaje się ekstrakcji octanem etylu, następnie po rozdzieleniu faz, fazę wodną ponownie poddaje się co najmniej jednokrotnej ekstrakcji kolejną porcją octanu etylu, fazy organiczne z etapów ekstrakcji łączy się i poddaje suszeniu bezwodnym siarczanem magnezu, a następnie odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu wyprodukowanego przez szczep drożdżowy na drodze biokonwersji L-fenyloalaniny.
Aromatyczny alkohol o różanym zapachu 2-fenyloetanol (ang. 2-phenylethanol — skrót 2-PE) jest powszechnie wykorzystywany w przemyśle perfumeryjnym, kosmetycznym i spożywczym. Większość 2-PE dla celów przemysłowych jest produkowana na drodze syntezy chemicznej. Synteza chemiczna tego związku generuje wiele toksycznych odpadów. Ze względu na wzrastającą wrażliwość społeczeństwa na problemy ekologiczne istnieje potrzeba poszukiwania nowych metod produkcji 2-PE przyjaznych dla środowiska. Obecnie niewielka część 2-PE otrzymywana jest poprzez ekstrakcję z płatków róży, ale jest to bardzo kosztowny sposób produkcji 2-PE. W tej sytuacji obiecujące jest wykorzystanie metod biotechnologicznych spełniających kryteria opisane m.in. w dyrektywie Rady WE (The Council of the European Communities. Council Directive 88/388/EEC of 22 June 1988), że za naturalne substancje uważa się nie tylko związki wydzielone ze źródeł naturalnych przez zastosowanie procesu fizycznego (np. ekstrakcji), lecz także otrzymane w wyniku biotransformacji przeprowadzonej przy użyciu enzymów lub mikroorganizmów, co znane jest z publikacji J.Krzyczkowska, E.Białecka-Floriańczyk, I.Stolarzewicz, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2009, 3 (64), 5.
Z publikacji „Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of 2-phenylethanol via Ehrlich pathway”, Kim B et al. znany jest szczep na pożywce zawierającej 10 g/l L-fenyloalaniny jako substratu, który produkuje 4,8 g/l 2-fenyloetanolu, czyli z wydajnością 48%. Publikacja ta nie ujawnia w jaki sposób produkt może być wydzielany.
Z publikacji „Optimisation of biotransformation conditions for production of 2-phenylethanol by a Saccharomyces cerevisiae CWY132 mutant”, Cui Z. et al. ujawniono sposób, według którego uzyskano wydajność przeliczając ilość 2-fenyloetanolu w gramach na ilość substratu (L-fenyloalaniny) w gramach - 70,4%. Publikacja ta nie ujawnia w jaki sposób produkt może być wydzielany.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu wyprodukowanego przez szczep drożdżowy na drodze biokonwersji L-fenyloalaniny. Zgodnie z wynalazkiem prowadzi się hodowlę okresową szczepu drożdżowego Saccharomyces cerevisiae AM1-d, który zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP2055p na pożywce dedykowanej do biokonwersji L-fenyloalaniny do 2-fenyloetanolu, zawierającej L-fenyloalaninę, jako główne źródło azotu oraz ograniczoną zawartość pozostałych źródeł azotu, monitorując przyrost biomasy poprzez mierzenie OD600 oraz stężenia produktu 2-fenyloetanolu oraz glukozy w cieczy pohodowlanej. Po zakończeniu bioprocesu, hodowlę wiruje się a oddzieloną od biomasy ciecz pohodowlaną, zawierającą 2-fenyloetanol, poddaje się ekstrakcji octanem etylu, który jest rozpuszczalnikiem posiadającym status GRAS (ang. generalny recognized as safe). Po rozdzieleniu faz, fazę wodną ponownie poddaje się, co najmniej jednokrotnej ekstrakcji kolejną porcją octanu etylu. Po rozdzieleniu fazy organicznej i wodnej, fazy organiczne z etapów ekstrakcji łączy się i poddaje suszeniu bezwodnym siarczanem magnezu w celu wydzielenia 2-fenyloetanolu a następnie odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem.
Jako pożywkę korzystnie stosuje się pożywkę o składzie 15 g/l glukozy, 8 g/l sacharozy, 5 g/l L-fenyloalaniny, 0.5 g/l MgSO4 bezw.cz., 1,7 g/l YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu.
Dzięki opracowanemu sposobowi uzyskano końcowy produkt wydzielony z cieczy pohodowlanej z wydajnością ~86% o czystości > 99% (GC). Produkt końcowy (2-fenyloetanol) spełnia kryteria produktu naturalnego. Zastosowany ekstrahent - octan etylu jest nietoksyczny i nadaje się do ekstrakcji produktów naturalnych, które później mogą być dodatkami między innymi do produktów spożywczych. Ponadto octan etylu może być wielokrotnie wykorzystywany, po uprzedniej destylacji regeneracyjnej, do ekstrakcji 2-PE, co istotnie może zmniejszyć koszty produkcji 2-PE i zmniejszyć ilość generowanych odpadów.
Wyniki badań zostały zilustrowane na wykresach, gdzie Fig. 1 pokazuje krzywą wzrostu hodowli okresowej szczepu Saccharomyces cerevisiae AM1-d w bioreaktorze oraz zmiany stężenia glukozy w pożywce w czasie hodowli, Fig. 2 pokazuje stężenie 2-PE (w/v) w cieczy pohodowlanej szczepu S. cerevisiae AM1-d rosnącego na podłożu, Fig. 3 pokazuje krzywą kalibracji, do oznaczenia 2-PE w płynie pohodowlanym, Fig. 4 pokazuje chromatogramy HPLC fazy wodnej na kolejnych stopniach ekstrakcji a Fig. 5 przedstawia analizę czystości otrzymanego produktu 2-PE.
PL 227 208 B1
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady wykonania.
P r z y k ł a d I
Warunki hodowli szczepu Saccharomyces cerevisiae AM1-d do produkcji 2-fenyloetanolu.
Szczep S. cerevisiae AM1-d rozsiano redukcyjnie na szalkach Petriego ze stałą pożywką YPD (o składzie 20 g/l glukozy, 20 g/l peptonu mięsnego, 10 g/l ekstraktu drożdżowego oraz 20 g/l agaru) i inkubowano 2 dni w temperaturze 30°C. Zaszczepiono materiałem z pojedynczych kolonii pobranym ezą o średnicy 5 mm 100 ml płynnego YPD (pożywka bez agaru) w kolbie Erlenmayera o pojemności 300 ml i hodowano przez noc przy stałej prędkości wytrząsania 240 rpm w temperaturze 30°C. Następnie 80 ml hodowli nocnej zaszczepiono 4 I pożywki o składzie 15 g/l glukoza, 8 g/l sacharoza, 5 g/l L-fenyloalanina, 0,5 g/l MgSO4 bezw.cz., 1,7 g/l YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu (pH=4,6), znajdującej się w bioreaktorze o pojemności roboczej 4,5 I. W ten sposób uzyskano hodowlę o gęstości optycznej - OD600 (ang. optical density) ~0,15. Następnie prowadzono hodowlę okresową przez 72 h w 30°C ze stałym mieszaniem 250 rpm, stałym natlenieniem 100% i bez utrzymywania stałego pH. Bioreaktor automatycznie rejestrował natlenienie i pH hodowli, ponieważ był wyposażony w elektrody DO i pH. W trakcie bioprocesu pobierano 12 ml próby w punktach czasowych: 0 h (początek hodowli), 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 7 h, 8 h, 24 h, 30 h, 48 h, 54 h oraz 72 h (koniec hodowli), aby monitorować przyrost biomasy poprzez mierzenie OD600 oraz stężenia produktu 2-fenyloetanolu oraz glukozy w cieczy pohodowlanej. Gęstość optyczną nierozcieńczonych hodowli mierzono przy długości fali równej 600 nm w kuwetach o długości drogi optycznej 1 cm (spektrofotometr SP-830 PLUS Metertech). Na podstawie OD600 wyznaczono krzywą wzrostu (Fig. 1) oraz wyliczono tempo wzrostu μ=0.28 h'1 według wzoru μ = Określono także produkcyjność procesu (P), jako P = ^22. [g,l,h], która wyniosła 0.044 g 2-PE/l/h oraz współczynnik wydajności produktu względem biomasy, YPX=0.403 g 2-PE/U OD600, zgodnie ze wzorem YPX = &Cpe [—-—1 .
Δί/ O£>600 Ltf OZ)600J
W celu określenia stężenia glukozy i 2-fenyloetanolu w pożywce 1 ml próbki cieczy hodowlanej były wirowane 10 minut, 2150 x g, w 4°C, aby oddzielić biomasę od cieczy pohodowlanej. Biomasa była odpadem, natomiast pożywka (ciecz pohodowlana) była dalej analizowana. Stężenie glukozy w pożywce (Fig. 1) oznaczano zestawem Glucose Assay (BioMaxima) zgodnie ze wskazówkami producenta. Oznaczanie stężenia 2-PE opisuje Przykład II.
P r z y k ł a d II
Oznaczanie stężenia 2-fenyloetanolu w cieczy pohodowlanej.
Stężenie 2-PE sprawdzano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (chromatograf PE NELSON NCI900) z detektorem UV/VIS (Perkin Elmer 785A detector) i kolumną z wypełnieniem C18, 150 x 4.6 mm, ziarno 5 μm (kolumna Cosmosil 5C18-MS-II).
Krzywą kalibracji (Fig. 3) o współczynniku determinacji R2 =0,994, wykonano odważając określoną ilość 2-PE (ALDRICH) i rozpuszczając ją w odpowiedniej ilości mieszaniny acetonitryl:woda (1:1), używając acetonitrylu do HPLC (POCH). Jako eluent wybrano mieszaninę acetonitryl:woda w stosunku 30:70. Mierzono absorbancję przy długości fali λ = 259 nm.
Przed analizą próbek z cieczy pohodowlanych na HPLC rozcieńczano je acetonitrylem w stosunku 1:1. Jeżeli pole powierzchni piku odpowiadającego 2-PE wykraczało poza obszar krzywej kalibracji próbkę dodatkowo rozcieńczano. Na Fig. 2 pokazano zmiany stężenia 2-PE w trakcie hodowli w cieczy pohodowlanej opisanej w Przykładzie I. Uzyskane wyniki pokazują, że na podłożu 8 drożdże produkują w zastosowanych warunkach ~3,2 g 2-PE na 1 litr hodowli szczepu S. cerevisiae AM1-d.
P r z y k ł a d III
Ekstrakcja octanem etylu 2-PE z cieczy pohodowlanej.
W celu wydzielenia 2-PE, po zakończeniu bioprocesu, hodowlę wirowano 10 minut, 2150 x g, w 4°C, aby oddzielić biomasę od cieczy pohodowlanej. Biomasa była odpadem, natomiast pożywka (ciecz pohodowlana) zawierała 2-PE. Do ekstrakcji 2-PE z cieczy pohodowlanej użyto octanu etylu, który jest rozpuszczalnikiem posiadającym status GRAS (ang. generalny recognized as safe). Do rozdzielacza o pojemności 2 I wlano 900 ml płynu pohodowlanego oraz 200 ml octanu etylu. Dodawano 7 g chlorku sodu w celu przyspieszenia rozdziału fazy wodnej od organicznej oraz zapobiegania tworzenia się emulsji podczas rozdziału. Całość wytrząsano przez 3 min. Po rozdzieleniu faz, fazę organiczną zlewano do kolby natomiast fazę wodną zawracano do rozdzielacza i dodawano kolejną porcję octanu etylu - 150 ml oraz 7 g chlorku sodu. Ponownie wytrząsano 3 min. Po rozdzieleniu fazy organicznej i wodnej, fazę organiczną dodawano do poprzedniej. Fazę wodną zawracano ponownie do rozdzielacza i ekstrahowano kolejną porcją (150 ml) octanu etylu, tak jak poprzednio. Po każdym
PL 227 208 B1 stopniu ekstrakcji pobierano próbkę fazy wodnej w celu oznaczenia ilości 2-PE. Po pierwszym stopniu ekstrakcji zawartość 2-PE w fazie wodnej wynosiła ~0,4 g/l, po 2 stopniu ilości 2-PE były śladowe na poziomie 0,05 g/L, natomiast po 3 stopniu ekstrakcji w fazie wodnej nie wykryto 2-PE (Fig. 4). Uzyskane wyniki pokazują, że zastosowanie octanu etylu pozwala na 100% wydzielenie produktu z płynu pohodowlanego, a dzięki statusowi GRAS octanu etylu, technika wydzielania 2-PE jest przyjazna dla środowiska, a produkt z powodzeniem może być określany mianem naturalnego.
P r z y k ł a d IV
Wydzielenie 2-PE po etapie ekstrakcji.
Uzyskaną fazę organiczną po etapie ekstrakcji, opisaną w Przykładzie III, pozostawiono na 24 godz. nad środkiem suszącym - bezwodnym siarczanem (Vl) magnezu, przesączono do zważonej uprzednio kolby i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Resztki rozpuszczalnika i ewentualnych innych lotnych składników usunięto na pompie olejowej (ciśnienie poniżej 1 mm Hg). Kolbę ponownie zważono i wyliczono ilość otrzymanego 2-PE (C2PE.wag), jako różnicę masy kolby z 2-PE i masy pustej kolby. Z ilości 2-PE w cieczy pohodowlanej oznaczonej zgodnie z opisem w Przykładzie II (C2PE.eks) oraz ilości 2-PE wydzielonej z cieczy pohodowlanej wyznaczono wydajność procesu wydzielania 2-PE, zgodnie ze wzorem: W = c2 pE'w aB 1 0 0 %. Opracowana metoda pozwala na
C2PE.eks wydzielenie produktu z cieczy pohodowlanej z wydajnością na poziomie 86%.
W celu oznaczenia czystości uzyskanego 2-PE pobierano próbki, które analizowano wykorzystując technikę chromatografii gazowej opisaną w Przykładzie V.
P r z y k ł a d V
Oznaczanie czystości otrzymanego produktu - 2-fenyloetanolu.
Czystość 2-PE sprawdzano za pomocą chromatografii gazowej (GC) - chromatograf gazowy Hewlett Packard Series III 5890 GS (kolumna kapilarna średnio polarna) z detektorem jonizacyjno- płomieniowym (FID). Jako gaz nośny wykorzystywano hel. Zakres temperatur wynosił 100-260°C (z szybkością grzania 10°C/min). Przykładowe chromatogramy ilustrujące czystość uzyskanego produktu przedstawione są na Fig. 5. Analiza uzyskanych wyników pokazuje, że zastosowana technika wydzielenia 2-fenyloetanolu z płynu pohodowlanego pozwala na uzyskanie produktu o czystości > 99%.
Claims (2)
1. Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu wyprodukowanego przez szczep drożdżowy na drodze biokonwersji L-fenyloalaniny, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę okresową szczepu drożdżowego Saccharomyces cerevisiae AM1-d, który zdeponowano w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP2055p na pożywce dedykowanej do biokonwersji L-fenyloalaniny do 2-fenyloetanolu, zawierającej L-fenyloalaninę, jako główne źródło azotu oraz ograniczoną zawartość pozostałych źródeł azotu, monitorując przyrost biomasy poprzez mierzenie OD600 oraz stężenia i 2-fenyloetanolu i glukozy w cieczy pohodowlanej a po zakończeniu bioprocesu, hodowlę wiruje się, oddzieloną od biomasy ciecz pohodowlaną, zawierającą 2-fenyloetanol, poddaje się ekstrakcji octanem etylu, następnie po rozdzieleniu faz, fazę wodną ponownie poddaje się co najmniej jednokrotnej ekstrakcji kolejną porcją octanu etylu, fazy organiczne z etapów ekstrakcji łączy się i poddaje suszeniu bezwodnym siarczanem magnezu a następnie odparowuje się rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako pożywkę stosuje się pożywkę o składzie 15 g/l glukozy, 8 g/l sacharozy, 5 g/l L-fenyloalaniny, 0.5 g/l MgSO4 bezw.cz., 1,7 g/l YNB bez aminokwasów i siarczanu amonu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412983A PL227208B1 (pl) | 2015-07-01 | 2015-07-01 | Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412983A PL227208B1 (pl) | 2015-07-01 | 2015-07-01 | Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL412983A1 PL412983A1 (pl) | 2017-01-02 |
| PL227208B1 true PL227208B1 (pl) | 2017-11-30 |
Family
ID=57629134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL412983A PL227208B1 (pl) | 2015-07-01 | 2015-07-01 | Sposób wytwarzania naturalnego 2-fenyloetanolu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL227208B1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624626B (zh) * | 2018-05-15 | 2021-07-16 | 上海应用技术大学 | 一种生产β-苯乙醇的菌株及方法 |
| TWI735195B (zh) * | 2020-03-30 | 2021-08-01 | 財團法人食品工業發展研究所 | 酵母菌及使用其製備2-苯乙醇或啤酒之方法 |
-
2015
- 2015-07-01 PL PL412983A patent/PL227208B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL412983A1 (pl) | 2017-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Venkateswarulu et al. | Isolation and characterization of plumbagin (5-hydroxyl-2-methylnaptalene-1, 4-dione) producing endophytic fungi Cladosporium delicatulum from endemic medicinal plants | |
| Chreptowicz et al. | Production of natural 2-phenylethanol: from biotransformation to purified product | |
| Praveenkumar et al. | Breaking dormancy: an energy-efficient means of recovering astaxanthin from microalgae | |
| Stafsnes et al. | Isolation and characterization of marine pigmented bacteria from Norwegian coastal waters and screening for carotenoids with UVA-blue light absorbing properties | |
| Chreptowicz et al. | Enhanced bioproduction of 2-phenylethanol in a biphasic system with rapeseed oil | |
| Han et al. | Identification of a small molecule signaling factor that regulates the biosynthesis of the antifungal polycyclic tetramate macrolactam HSAF in Lysobacter enzymogenes | |
| Mojaat et al. | Optimal selection of organic solvents for biocompatible extraction of β-carotene from Dunaliella salina | |
| Řezanka et al. | γ-Lactones from the soft corals Sarcophyton trocheliophorum and Lithophyton arboreum | |
| He et al. | Sesquiterpenyl epoxy-cyclohexenoids and their signaling functions in nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora | |
| CN102816708A (zh) | 一株产2-苯乙醇酵母菌株及其培养方法与应用 | |
| Battu et al. | Isolation of secondary metabolites from Pseudomonas fluorescens and its characterization | |
| Molina et al. | Differences in the composition of phenolics and fatty acids of cultured mycobiont and thallus of Physconia distorta | |
| Cantrell et al. | Isolation and identification of antifungal fatty acids from the basidiomycete Gomphus floccosus | |
| Söderhäll et al. | Light inhibits the production of alternariol and alternariol monomethyl ether in Alternaria alternata | |
| CN105018352A (zh) | 一种产曲酸真菌菌株及制备方法 | |
| Mdaini et al. | Production of natural fruity aroma by Geotrichum candidum | |
| IIZUKA et al. | MICROBIOLOGICAL STUDIES ON PETROLEUM AND NATURAL GAS IX. CANDIDAL OXIDATION OF DECANE | |
| CN101691368A (zh) | 喹啉酮生物碱衍生物的脱水甲基化产物及制备方法与应用 | |
| JP2005176684A (ja) | Ｏｃ４５１５９物質生産菌、該物質の製造方法及び農園芸用殺虫剤 | |
| CN102190612B (zh) | 一种天然海藻内生真菌二萜生物碱类化合物及其制备和应用 | |
| Hamada et al. | Secondary metabolites from isolated lichen mycobionts cultured under different osmotic conditions | |
| CN104350949B (zh) | 冬虫夏草液态发酵工艺 | |
| CN102675293A (zh) | 一种吲哚二酮哌嗪类衍生物及其制备方法和应用 | |
| CN104630119A (zh) | 抑藻活性物质紫色杆菌素及其制备方法 | |
| JP5943361B2 (ja) | トリアシルグリセロールの製造方法 |