PL226977B1 - Aptamer DNA wykazujacy powinowactwo dometki Arg oraz jego zastosowanie - Google Patents
Aptamer DNA wykazujacy powinowactwo dometki Arg oraz jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL226977B1 PL226977B1 PL408735A PL40873514A PL226977B1 PL 226977 B1 PL226977 B1 PL 226977B1 PL 408735 A PL408735 A PL 408735A PL 40873514 A PL40873514 A PL 40873514A PL 226977 B1 PL226977 B1 PL 226977B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- tag
- aptamer
- arg
- buffer
- Prior art date
Links
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 title description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBAOFQIOOBQLHE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,9-dihydropurin-9-ium-6-one;chloride Chemical compound Cl.N1C(N)=NC(=O)C2=C1N=CN2 IBAOFQIOOBQLHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LELMRLNNAOPAPI-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;aminophosphonous acid Chemical compound NP(O)O.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 LELMRLNNAOPAPI-UFLZEWODSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101001072338 Homo sapiens Proliferating cell nuclear antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044255 human PCNA Human genes 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki Arg oraz jego zastosowanie.
Rozwój współczesnej biologii molekularnej, biotechnologii czy też medycyny jest uwarunkowany między innymi dostępem do wysokiej jakości preparatów białkowych. Dużą ich część stanowią białka rekombinowane uzyskiwane poprzez produkcję pożądanych preparatów w odpowiednio przygotowanych komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. Szybką i łatwą procedurę izolacji produkowanego białka może zapewnić dodanie do jego sekwencji aminokwasowej metki fuzyjnej, która umożliwia oczyszczenie pożądanego białka za pomocą chromatografii powinowactwa. Pośród różnych typów chromatografii powinowactwa stosowanych do pozyskiwania białek rekombinowanych można wymienić układy opierające się na wiązaniu np. metki histydynowej do złoża zawierającego jony niklu, transferazy glutationowej do złoża ze związanym glutationem, czy też białka wiążącego maltozę do złoża z unieruchomioną dekstryną.
Aptamery DNA definiuje się jako jednoniciowe cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego o długości około 40-100 nukleotydów, które mogą wiązać określony cel molekularny z wysoką specyficznością oraz powinowactwem. Dzięki bogatym strukturom drugo i trzeciorzędowym tworzonym przez jednoniciowe DNA możliwe jest optymalne dopasowanie wyselekcjonowanego aptameru do określonego celu molekularnego.
Celem wynalazku jest dostarczenie nowej metody identyfikowania molekuł posiadających metkę argininową (określaną dalej jako „metka Arg”), w szczególności poprzez zapewnienie nowej cząsteczki posiadającej wysokie powinowactwo do celu molekularnego zawierającego metkę Arg, to jest dowolnej cząsteczki (np. peptydu, białka, glikoproteiny, pochodnej DNA modyfikowanej poprzez przyłączenie peptydu) zawierającej kilka kolejno występujących po sobie reszt argininowych.
Nieoczekiwanie okazało się że, określony powyżej cel techniczny może być zrealizowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
Według wynalazku aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki Arg posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Nr Id. 1, tj.
5' CTTTGTAATTGGTTCTGAGTTCCGTTGTGGGAGGAACATG-3'
Istotą wynalazku jest również zastosowanie oligonukleotydu posiadającego Sekw. Nr Id. 1 do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do celu molekularnego zawierającego metkę Arg.
Korzystnie, oligonukleotyd może być zastosowany do wiązania białka zawierającego metkę Arg.
Oligounkleotyd według wynalazku jest także zwany w dalszej części opisu aptamerem 24-10.
Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywiste, że dopuszczalna jest pewna zmienność sekwencji DNA według wynalazku, pod warunkiem zachowania jej powinowactwa do molekuł zawierających metkę Arg, które umożliwia selektywne oczyszczenie białek z metką Arg z mieszaniny kilku białek. W szczególności możliwe są warianty wskazanej powyżej sekwencji różniące się co najmniej jedną zasadą purynową lub pirymidynową.
Aptamer 24-10 o sekwencji określonej powyżej może być zastosowany do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do celów molekularnych zawierających metkę Arg, w szczególności:
- do detekcji celów molekularnych zawierających metkę Arg,
- do oczyszczania celów molekularnych zawierających metkę Arg,
- do wiązania celów molekularnych zawierających metkę Arg,
- do oznaczania stężenia celów molekularnych zawierających metkę Arg.
W celu lepszego ujawnienia istoty wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o rysunek, zawierający fig. 1 oraz fig. 2.
Na fig. 1 przedstawiono wiązanie białka posiadającego metkę argininową przez opracowany aptamer. Ścieżki: 1) marker białkowy, 2) białko 8xArg-PCNA wykorzystane do eksperymentu, 3) białko PCNA wykorzystane do eksperymentu, 4) preparat białkowy odzyskany ze złoża zawierającego aptamer 24-10, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem 8xArg-PCNA, 5) preparat białkowy odzyskany ze złoża zawierającego aptamer 24-10, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem PCNA, 6) preparat białkowy odzyskany ze złoża zawierającego aptamer referencyjny, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem 8xArg-PCNA, 7) preparat białkowy odzyskany ze złoża zawierającego aptamer referencyjny, które poddano wcześniejszej inkubacji z białkiem PCNA.
PL 226 977 B1
Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono korzystając z Coomassie Brilliant Blue R-250.
Na fig. 2 przedstawiono oczyszczanie białka posiadającego metkę 8xArg z ekstraktu białkowego przygotowanego z komórek E. coli. Ścieżki: 1) marker białkowy, 2) 40 pg ekstraktu białkowego przygotowanego z komórek E. coli z nadekspresją 8xArg-PCNA, 3) białko 8xArg-PCNA oczyszczone za pomocą złoża chromatograficznego ze związanym aptamerem 24-10. Próbki rozdzielono w 12% denaturującym żelu poliakrylamidowym, a następnie wybarwiono w Coomassie Brilliant Blue R-250.
Wynalazek w korzystnych wariantach realizacji został bliżej omówiony w poniższych przykładach.
P r z y k ł a d 1. Uzyskanie aptamerów DNA posiadających powinowactwo do metki Arg.
W wyniku badań mających na celu opracowanie cząsteczki DNA wykazującej powinowactwo do celów molekularnych zawierających metkę Arg ustalono, że aptamer DNA zawierający następującą sekwencję:
5' CTTTGTAATTGGTTCTGAGTTCCGTTGTGGGAGGAACATG.3' (Sekw. Nr Id. 1) posiada wysokie powinowactwo do takich celów.
Cząsteczka DNA według wynalazku może być uzyskana dowolną rutynową metodą syntezy DNA znaną specjaliście.
W przykładowej realizacji cząsteczka oligonukleotydowa została uzyskana przy wykorzystaniu techniki syntezy chemicznej w fazie stałej (Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J.- J. and Morvan, F. Solid-Phase Chemical Synthesis of 5'-Triphosphate DNA, RNA, and Chemically Modified Oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 2012; 50:1.28.1-1.28.16.)
Uzyskaną cząsteczkę aptameru 24-10 o zdefiniowanej powyżej sekwencji, długości 40 nukleotydów, zsyntetyzowaną w ilości 521 mikrogramów, zweryfikowano metodą HPLC.
Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję według wynalazku może być poddawana dodatkowym modyfikacjom, w szczególności sprzęgana ze znanymi barwnikami (np. fluorescencyjnymi) lub innymi cząsteczkami (np. biotyną).
Przykładowo, biotynylowanany aptamer 24-10 w ilości odpowiednio 474 mikrogramów uzyskano poprzez zastosowanie metody zautomatyzowanej syntezy oligonukleotydów biotynylowanych na końcu 5'. (Pon, R.T. A Long Chain Biotin Phosphoramidite Reagent for The Automated Synthesis of 5'-Biotinylated Oligonucleotides, Tetrahedron Lett. 1991; 32: 1715-1718). Otrzymany produkt zweryfikowano metodą HPLC.
P r z y k ł a d 2. Wiązanie białka zawierającego metkę Arg do złoża chromatograficznego zawierającego aptamer według wynalazku.
pl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotn ie buforem BW (17,5 g/L NaCl; 50 mM bufor fosforanowy NaH2PO4/Na2HPO4; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 pl buforu BW, po czym dodano 20 pg biotynylowanego na końcu 5' aptameru 24-10 lub referencyjnego o sekwencji (ACTG)x7-ACGAGGAACATG. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem BW, a następnie dwukrotne płukanie buforem AS (137 mM NaCl; 12,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; 5 mM MgCl2; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 pl buforu AS, po czym dodano rekombinowanego ludzkiego białka PCNA, tak aby jego końcowe stężenie wyniosło 0,13 mg/ml. W przeprowadzonym eksperymencie wykorzystano dwa warianty białka PCNA: a) z metką 8xArg oraz b) bez metki 8xArg. Złoże inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem AS. Następnie do złoża dodano buforu GLB (50 mM Tris-HCl; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE; metoda Laemmliego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione za pomocą Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na fig. 1.
P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie białka posiadającego metkę Arg z białkowego ekstraktu komórkowego.
pl 50% złoża agarozowego ze sprzęgniętą streptawidyną umieszczono w 1,5 ml probówce typu eppendorf i przepłukano wodą destylowaną. Następnie przepłukano trzykrotnie buforem BW (0,3M NaCl; 50 mM bufor fosforanowy NaH2PO4/Na2HPO4; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,5). Przepłukane złoże zawieszono w 300 pl buforu BW, po czym dodano 20 pg biotynylowanego na końcu 5' apta4
PL 226 977 B1 meru 24-10. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po zakończonej inkubacji przeprowadzono trzykrotne płukanie buforem BW, a następnie dwukrotne płukanie buforem AS (137 mM
NaCl; 12,3 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4; 5 mM MgCl2; 0,1% (v/v) Tween 20; pH 7,4). Po ostatnim płukaniu złoże ze związanym aptamerem zawieszono w 300 μΐ buforu AS, po czym dodano białkowego ekstraktu przygotowanego z komórek E. coli zawierającego rekombinowane ludzkie białko 8xArg-PCNA tak aby końcowe stężenie białka całkowitego wyniosło 2,0 mg/ml. Złoże inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 h a po zakończonej inkubacji przepłukano czterokrotnie buforem AS. Następnie białko 8xArg-PCNA odzyskano ze złoża stosując bufor elucyjny (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM chlorowodorek guaniny, pH 7,5). Do preparatu uzyskanego białka dodano buforu GLB (50 mM Tris; 2% SDS (w/v); 2% błękit bromofenolowy (w/v); 10% glicerol; 200 mM β-merkaptoetanol; pH 6.8) i inkubowano przez 5 min w temperaturze 95°C. Otrzymaną próbkę poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE; metoda Laemmli'ego) w 12% żelu poliakrylamidowym. Po zakończonym rozdziale białko zostało wybarwione przy pomocy Coomassie Brilliant Blue R-250. Wyniki zostały przedstawione na fig. 2.
Wykaz sekwencji
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Aptamer DNA wykazujący powinowactwo do metki Arg posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Nr Id. 1.
- 2. Zastosowanie oligonukleotydu określonego w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania cząsteczki posiadającej powinowactwo do celu molekularnego zawierającego metkę Arg.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 2 do wiązania białka zawierającego metkę Arg.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408735A PL226977B1 (pl) | 2014-07-02 | 2014-07-02 | Aptamer DNA wykazujacy powinowactwo dometki Arg oraz jego zastosowanie |
| EP15747581.5A EP3164490B1 (en) | 2014-07-02 | 2015-07-02 | Dna aptamer recognising arginine tag and use thereof |
| PCT/PL2015/050027 WO2016003302A1 (en) | 2014-07-02 | 2015-07-02 | Dna aptamer recognising arginine tag and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408735A PL226977B1 (pl) | 2014-07-02 | 2014-07-02 | Aptamer DNA wykazujacy powinowactwo dometki Arg oraz jego zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL408735A1 PL408735A1 (pl) | 2016-01-04 |
| PL226977B1 true PL226977B1 (pl) | 2017-10-31 |
Family
ID=53783885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL408735A PL226977B1 (pl) | 2014-07-02 | 2014-07-02 | Aptamer DNA wykazujacy powinowactwo dometki Arg oraz jego zastosowanie |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3164490B1 (pl) |
| PL (1) | PL226977B1 (pl) |
| WO (1) | WO2016003302A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112871212B (zh) * | 2021-03-11 | 2022-09-13 | 福州大学 | 一种基于精氨酸适配体的光催化剂的制备方法及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6960457B1 (en) * | 1997-09-04 | 2005-11-01 | Stanford University | Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface |
| WO2005024042A2 (en) * | 2003-09-04 | 2005-03-17 | The Regents Of The University Of California | Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof |
-
2014
- 2014-07-02 PL PL408735A patent/PL226977B1/pl unknown
-
2015
- 2015-07-02 EP EP15747581.5A patent/EP3164490B1/en not_active Not-in-force
- 2015-07-02 WO PCT/PL2015/050027 patent/WO2016003302A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3164490A1 (en) | 2017-05-10 |
| WO2016003302A1 (en) | 2016-01-07 |
| PL408735A1 (pl) | 2016-01-04 |
| EP3164490B1 (en) | 2018-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10858647B2 (en) | Removal of DNA fragments in mRNA production process | |
| US6361943B1 (en) | Molecule that homologizes genotype and phenotype and utilization thereof | |
| EP2210098B1 (en) | Methods and compositions for detection and enrichment of target small rnas | |
| Purushothaman et al. | Transcriptomic and proteomic analyses of Amphiura filiformis arm tissue-undergoing regeneration | |
| US20190241895A1 (en) | Secretory immunoglobulin a (siga)-binding nucleic acid molecule, siga analysis sensor, and siga analysis method | |
| US10023870B2 (en) | DNA aptamers binding the histidine tag and their application | |
| PL226977B1 (pl) | Aptamer DNA wykazujacy powinowactwo dometki Arg oraz jego zastosowanie | |
| WO2003062417A1 (fr) | Produit de ligation arn-adn, et utilisation correspondante | |
| CN104774923B (zh) | 一种测定转录调控复合体的方法 | |
| JP6478392B2 (ja) | 核酸リンカー | |
| PL237531B1 (pl) | Aptamer DNA wiążący metkę lizylową i jego zastosowanie | |
| Weisel et al. | The Nop5–L7A–fibrillarin RNP complex and a novel box C/D containing sRNA of Halobacterium salinarum NRC-1 | |
| EP3234142B1 (en) | Dna aptamer recognising human pcna protein and use thereof | |
| Scholz et al. | Variation of the intercalating proline in artificial peptides mimicking the DNA binding and bending IHF protein | |
| JP2013039060A (ja) | 酵素様活性を有するタンパク進化用リンカー及びそのリンカーを用いた酵素様活性を有するタンパクのスクリーニング方法 | |
| CN109715645B (zh) | 核苷衍生物或其盐、多核苷酸的合成试剂、多核苷酸的制造方法、多核苷酸和结合核酸分子的制造方法 | |
| JP7176739B2 (ja) | 標的物質検出用核酸プローブ | |
| KR101069590B1 (ko) | Ｃｅａ에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 ｄｎａ 압타머 | |
| Yi et al. | RIPiT-Seq: A tandem immunoprecipitation approach to reveal global binding landscape of multisubunit ribonucleoproteins | |
| Tang et al. | Capillary electrophoresis as a tool for screening aptamer with high affinity and high specificity to ricin | |
| Smart | Investigating the interaction of HP1α with H1. 4 in heterochromatin: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science in Genetics at Massey University, Palmerston North, New Zealand | |
| Hocek et al. | Enzymatic Synthesis of Reactive RNA Probes Containing Squaramate-Linked Cytidine for Bioconjugations and Cross-Linking with Lysine-Containing Peptides and Proteins | |
| KR101069591B1 (ko) | Ｃｅａ에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 ｄｎａ 압타머 | |
| Krusemark et al. | Quantitative Population Behavior in Directed Chemical Evolution | |
| Bley | Mapping the RNA-protein interface in telomerase RNP |