PL225497B1 - Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40⁰ C - Google Patents
Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40⁰ CInfo
- Publication number
- PL225497B1 PL225497B1 PL407623A PL40762314A PL225497B1 PL 225497 B1 PL225497 B1 PL 225497B1 PL 407623 A PL407623 A PL 407623A PL 40762314 A PL40762314 A PL 40762314A PL 225497 B1 PL225497 B1 PL 225497B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- medium
- hours
- corynebacterium glutamicum
- culture
- isolated
- Prior art date
Links
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 46
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 63
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 42
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 31
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 28
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 28
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 24
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 claims description 21
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 claims description 21
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 21
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 21
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 21
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 21
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 14
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 claims description 14
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 13
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 7
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 abstract description 3
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 3
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N diethyl sulfate Chemical compound CCOS(=O)(=O)OCC DENRZWYUOJLTMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940008406 diethyl sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100350224 Bacillus subtilis (strain 168) pdhB gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034229 Citramalyl-CoA lyase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010036824 Citrate (pro-3S)-lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 description 1
- 101100236536 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) glcB gene Proteins 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- 241000759360 Corynebacterium glutamicum S9114 Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100406344 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150036393 aceB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 101150106096 gltA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042350 gltA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40°C, przy użyciu pożywki kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, o składzie (w/v): 1% ekstraktu wołowego, 1% bacto-peptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,3% NaCl, wody destylowanej do 100%, o pH do 7,2.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40°C, zachowujących w tych warunkach zdolność do intensywnego metabolizmu cukrów.
Bakterie Corynebacterium glutamicum, wyizolowane w 1957 roku w Japonii opisano jako mezofilne, nieruchliwe, nieprzetrwalnikujące, gram-dodatnie, morfologicznie zmienne mikroorganizmy glebowe. Nadano im status GRAS (generally regarded as safe), zatem bez przeszkód mogą być wykorzystywane w przemyśle biotechnologicznym. Obecnie z udziałem tych mikroorganizmów prowadzi się produkcje aminokwasów m.in. L-glutaminianu i L-lizyny oraz nukleozydów.
W ostatnich latach podejmowane są badania nad rozszerzeniem spektrum produktów, możliwych do uzyskania z udziałem bakterii C. glutamicum. Opracowuje się metody biosyntezy kwasów organicznych, jak kwas mlekowy i bursztynowy, jak również etanolu, izobutanolu, diamin: kadaweryny i putrescyny, ksylitolu, kwasu γ-aminomasłowego, czy polihydroksymaślanu z udziałem bakterii C. glutamicum. Bakterie należące do gatunku C. glutamicum są chemoorganotrofami i mają stosunkowo niskie wymagania pokarmowe. Jest to bardzo ważna cecha, która wpływa na ograniczenie kosztów produkcji związanych m.in. z oczyszczaniem produktu końcowego (czasopismo Microbial Biotechnology (2012) 6, 87-102).
Temperatura, w jakiej prowadzony jest proces biotechnologiczny ma ogromne znaczenie, ponieważ szybkość reakcji chemicznych, a więc również metabolizmu jest od niej zależna. Temperatura wpływa również na rozpuszczalność substancji będących składnikami pożywek służących do hodowli mikroorganizmów. Procesy biotechnologiczne są uzależnione od aktywności komórek mikroorganizmów. Dla każdego gatunku, a nawet szczepu można określić temperatury kardynalne: minimalne, optymalne i maksymalne. Poniżej temperatury minimalnej lub powyżej temperatury maksymalnej aktywność metaboliczna drobnoustrojów ulega spowolnieniu lub zupełnemu zahamowaniu. Optimum temperaturowe prowadzenia procesów biotechnologicznych z udziałem znanych szczepów C. glutamicum mieści się w granicach 25-37°C i z tego powodu często konieczne jest chłodzenie medium fermentacyjnego w czasie biosyntezy prowadzonej z udziałem tych szczepów. Stosowanie termotolerancyjnych mutantów C. glutamicum, zdolnych do wzrostu w temperaturze przekraczającej 40°C, może być korzystne dla przemysłu biotechnologicznego, ponieważ jak wynika z podstawowych zależn ości fizyko-chemicznych, podwyższenie temperatury o kilka stopni zwiększa szybkość reakcji i skraca czas trwania procesu. W skali przemysłowej obserwuje się wydzielanie dużej ilości ciepła w czasie wzrostu mikroorganizmów oraz fermentacji powadzonej z ich udziałem, aby zapobiec utracie aktywn ości metabolicznej komórek konieczne jest instalowanie systemów chłodzących fermentory. Wykorzystywanie szczepów termotolerancyjnych ogranicza koszty z tym związane.
W czasopiśmie Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology (2002) 28:333-337 opisano próby wykorzystania termotolerancyjnego szczepu C. glutamicum 2262, producenta kwasu glutaminowego. Podwyższona temperatura aktywuje sekrecję glutaminianu, dlatego zastosowanie szczepu termotolerancyjnego w tym przypadku byłoby bardzo korzystne. W zakresie temperatur 33-40°C obserwowano stały wzrost tempa przyrostu biomasy, jednakże przekroczenie 40°C skutkowało gwałtownym zahamowaniem szybkości namnażania komórek. W tak wysokich temperaturach obserwowano również około 40% spadek aktywności karboksylazy fosfoenolopirogronianu i dehydrogenazy glutaminianowej, względem maksymalnej, zmierzonej aktywności tych enzymów. W konsekwencji, wewnątrz komórek następowała akumulacja pirogronianu, co wymusza przekształcenie go do kwasu mlekowego, który jest łatwo wydzielany poza komórkę. Biosynteza mleczanu wiąże się z utlenianiem NADH do NAD+, brak równowagi pomiędzy wymienionymi kosubstratami skutkuje zaburzeniem funkcjonowania metabolizmu całej komórki.
Ujawnione zostały także wyniki badania szczepu C. glutamicum AHP-3, producenta L-lizyny, pod kątem szybkości wzrostu oraz końcowego stężenia aminokwasu w hodowlach prowadzonych w zakresie temperatur 30-42°C. Zaobserwowano, że choć tempo wzrostu ulega zahamowaniu, to ilość produktu końcowego rośnie. Poszukując przyczyny tego zjawiska wykazano zmiany w ilości mRNA odpowiadającego produktom transkrypcji niektórych genów kodujących enzymy biorące udział w różnych szlakach metabolicznych. Podwyższenie temperatury z 30 do 40°C powoduje hamowanie ekspresji genów kodujących: dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu (gapA), syntazę cytrynianową (gltA), liazę cytrynianową (aceA) i syntazę jabłczanową (aceB), w przeciwieństwie do karboksykinazy fosfoenolopirogronianu (pck) i enzymu jabłczanowego (malE), których ekspresja była aktywowana. ZaPL 225 497 B1 obserwowano również spadek tempa biosyntezy L-tryptofanu i L-argininy. Podobne zmiany, wywołane podwyższeniem temperatury, obserwowano również w przypadku szczepu referencyjnego C. glutamicum ATCC 13032 (czasopismo Applied Microbiology and Biotechnology (2003) 62:69-75.
W czasopiśmie World Journal of Microbiology and Biotechnology (2012) 28:1035-1043 zamieszczono wyniki badań nad możliwością otrzymania termo tolerancyjnych szczepów produkujących kwas glutaminowy. Szczepy C. glutamicum S9114 i ATCC 13761 po kolejnych działaniach obejmujących mutagenizację z użyciem siarczanu dietylu (DES) i promieniowania UV poddano trzykrotnie tasowaniu genomowemu (ang. genome shuffling). W efekcie uzyskano komórki rosnące w temperaturze 44°C, np. szczep C. glutamicum F343, który po 24-godzinnej hodowli wykazywał czterokrotnie większy przyrost biomasy niż szczepy wyjściowe.
Wiadomo jest, iż bakterie z gatunku C. glutamicum wykorzystują różne źródła węgla, wśród których znajdują się węglowodany, kwasy organiczne i alkohole, które są włączane do centralnego metabolizmu na różnych poziomach. Dla mikroorganizmów tych jednym z najważniejszych szlaków komó rkowych jest cykl kwasów trikarboksylowych (TCA, cykl Krebsa), który odpowiada za całkowite utlenianie acetylo-CoA oraz dostarczenie substratów dla reakcji anaplerotycznych, odpowiadających m.in. za biosyntezę niektórych aminokwasów.
W Kolekcji Czystych Kultur ŁOCK 105, działającej przy Instytucie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej znajduje się szczep bakterii Corynebacterium glutamicum ATCC 13287.
Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40°C, przy użyciu pożywki kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, o składzie (w/v): 1% ekstraktu wołowego, 1% bacto-peptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,3% NaCl, wody destylowanej do 100%, o pH do 7,2, według wynalazku polega na tym, że biomasą szczepu bakterii Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 szczepi się zestaloną agarem pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum i prowadzi aktywację szczepu w czasie 24 godziny w temperaturze 30°C, po czym uzyskane komórki przenosi się na wysteryl izowaną płynną pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Coryne bacterium glutamicum i prowadzi hodowlę posiewową wytrząsaną w czasie 18 godzin w temperaturze 30°C. Uzyskaną w wyniku tej hodowli zawiesinę mikroorganizmów, rozcieńczoną w fizjologicznym roztworze soli, wysiewa się p owierzchniowo na pożywkę mineralną zestaloną agarem o składzie (w/v): sacharoza 2%, hydrolizat kazeiny 1%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4 7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, zawierającą nadto 100 μ-g/l D-biotyny i 500 μ-g/l tiaminy, o pH 7,2, po czym uzyskane w ten sposób pojedyncze kolonie pobiera się i przesiewa redukcyjnie na stałą pożywkę o tym samym składzie, a powstałe w wyniku tego pojedyncze kolonie izoluje się i przenosi na skosy agarowe z pożywki kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum. Następnie prowadzi się hodowlę inokulacyjną wyizolowanych kolonii na sterylnej pożywce minimalnej o składzie (w/v): sacharoza 2%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, zawierającej nadto 100 μ-g/l D-biotyny i 500 μ-g/l tiaminy, o pH 7,2, w temperaturze 30°C w czasie 18 godzin, uzyskanymi zawiesinami szczepi się sterylną pożywkę minimalną o składzie i pH jak pożywka inokulacyjna i prowadzi hodowlę wytrząsaną w temperaturze 30°C w czasie 24 godzin, po czym izoluje się szczepy wykazujące wyraźny przyrost biomasy jako szczepy ze zniesioną auksotrofią homoserynową. Następnie biomasą szczepów ze zniesioną auksotrofią homoserynową szczepi się wysterylizowaną pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum i prowadzi ich inkubację w temperaturze 30°C w czasie 24 godzin, uzyskane komórki przenosi się na wysterylizowaną pożywkę posiewową o podanym wyżej składzie i pH i prowadzi hodowlę posiewową w czasie 24 godzin w temperaturze 30°C, po czym komórki uzyskane w wyniku hodowli posiewowej wysiewa się powierzchniowo na podłoże kompleksowe do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, na którym inkubuje się je w czasie 24 godzin w temperaturze 44°C, a otrzymane w wyniku tej inkubacji pojedyncze kolonie izoluje się, przenosi na stałe podłoże kompleksowe do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, inkubuje na tym podłożu w czasie 24 godzin w temperaturze 44°C i otrzymane w wyniku inkubacji pojedyncze kolonie przenosi się na pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, na której mogą być przechowywane. W dalszej kolejności prowadzi się hodowlę inokulacyjną wytrząsaną tych szczepów na pożywce inokulacyjnej o wyżej podanym składzie i pH, w temperaturze 37°C w czasie 18 godzin, uzyskane inokulum przenosi się na pożywkę minimalną o wyżej podanym składzie i pH i prowadzi hodowlę wytrząsaną w temperaturze
PL 225 497 B1
44°C w czasie 48 godzin, a po jej zakończeniu izoluje się szczepy, które wykazują najwyższe tempo wzrostu biomasy w temperaturze 44°C. Dalej wyizolowane szczepy namnaża się w hodowli wytrząsanej na pożywce posiewowej o wyżej podanym składzie i pH, w temperaturze 44°C w czasie 18 godzin, rozcieńcza w fizjologicznym roztworze soli i wysiewa powierzchniowo na pożywkę o składzie (w/v): 1,5% cytrynianu sodu lub 1% cytrynianu sodu i 0,5% kwasu glutaminowego, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 1,5% agaru, wody wodociągowej do 100% oraz 100 μ-g/l D-biotyny i 500 μ-g/l tiaminy, o pH 7,2, oraz na pożywkę o składzie (w/v) : 1,5% bursztynianu sodu lub 1% bursztynianu sodu i 0,5% kwasu glutaminowego oraz 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NHhSO^ 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 1,5% agaru, wody wodociągowej do 100%, zawierającej nadto 100 jag/l D-biotyny i 500 ag/l tiaminy, o pH 7,2 i prowadzi inkubację na tych pożywkach w temperaturze 44°C w czasie 72 godziny, po czym izoluje kolonie mikroorganizmów wykazujące najintensywniejsze tempo wzrostu w tych warunkach, przenosi je na pożywki posiewowe o składzie takim jak pożywki, z których je izolowano i po hodowli posiewowej przenosi się je w celu przechowania na pożywki o takim samym składzie jak pożywki posiewowe. W dalszej kolejności kolonie mikroorganizmów wyizolowane po hodowli na pożywkach zawierających bursztynian sodu i cytrynian sodu aktywuje się na pożywce kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, w temperaturze 44°C, następnie prowadzi ich hodowlę inokulacyjną na pożywce o składzie (w/v): 1% glukozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, wody wodociągowej do 100%, zawierającej nadto 100 μ-g/l D-biotyny i 500 μ-g/l tiaminy, o pH 7,2, w temperaturze 44°C w czasie 24 godzin, uzyskane inokulum każdego szczepu przenosi się na pożywkę o składzie (w/v): 10% glukozy, 3,4% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 5% CaCO3, wody wodociągowej do 100%, zawierającej także 100 ag/l D-biotyny oraz 500 ag/l tiaminy, o pH 7,2 i prowadzi hodowlę wytrząsaną w temperaturze 44°C w czasie 72 godziny, przy czym pierwszą dobę hodowli prowadzi się w warunkach tlenowych, a w kolejnych dobach ogranicza się dostęp tlenu i zmniejsza szybkość obrotową wstrząsarki, po czym spośród uzyskanych kolonii szczepów zdolnych do wzrostu w temperaturze 44°C i najaktywniej metabolizujących źródło węgla wyizolowuje się kolonie o największym przyroście biomasy i najwyższym tempie zużywania glukozy.
Sposobem według wynalazku otrzymuje się ze szczepu Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 nowe termotolerancyjne mutanty, zdolne do wzrostu w temperaturze 44°C i biosyntezy homoseryny, podczas gdy wykorzystywany szczep Corynebacterium glutamicum ATCC 13287, będący producentem lizyny, nie posiada takiej zdolności. Prostymi metodami selekcji izoluje się kolonie rosnące w temperaturze 44°C. Wyizolowane szczepy testuje się pod kątem szybkości wzrostu w p ożywkach płynnych. Te, które wykazują intensywny przyrost biomasy są wykorzystywane w kolejnych etapach selekcji. Ponieważ temperatura ma wpływ na aktywność enzymów związanych z cyklem kwasów trikarboksylowych, cyklem glioksalowym, glikolizą i glukoneogenezą, w trakcie izolacji wykorzystuje się substancje zaangażowane w wymienione szlaki metaboliczne tj. cytrynian sodu, bursztynian sodu i kwas glutaminowy. Na pożywkach zawierających bursztynian sodu jako źródło węgla, obserwuje się powstanie kolonii o jednakowym zabarwieniu, różniących się wielkością. Powstanie kolonii o większej średnicy świadczy o lepszej zdolności komórek do wykorzystywania wprowadzonego źródła węgla. Na pożywkach zawierających cytrynian sodu otrzymuje się kolonie zróżnicowane pod względem barwy (kremowe, cieliste i ciemnopomarańczowe) oraz wielkości. Stwierdzono, że szczepy rosnące na pożywkach stałych w postaci ciemnopomarańczowych kolonii wykazują bardziej intensywny wzrost w temperaturze 44°C. Ostatnim etapem jest ocena szybkości wzrostu i tempa zużywania glukozy w czasie hodowli prowadzonej w zdefiniowanych, mineralnych pożywkach płynnych. Pierwsza doba hodowli odbywa się w warunkach tlenowych, wówczas obserwuje się intensywny przyrost biomasy. W kolejnych dobach ogranicza się dostęp tlenu, co wiąże się ze spadkiem szybkości namnażania komórek i umożliwia ocenę aktywności szlaków metabolicznych na podstawie pomiaru tempa w ykorzystywania źródła węgla oraz stężenia powstałych produktów fermentacji.
Otrzymane sposobem według wynalazku termotolerancyjne szczepy C. glutamicum, zdolne do intensywnego wzrostu w temperaturze 44°C, szybko metabolizujące dostarczone źródło węgla, które dotychczas uzyskiwano metodami inżynierii genetycznej, znajdą zastosowanie do produkcji aminokwasów, nukleozydów, kwasów organicznych, innych substancji naturalnie wytwarzanych przez te mikroorganizmy. Metody produkcji z udziałem szczepów otrzymanych sposobem według wynalazku będą bardziej wydajne i tańsze.
PL 225 497 B1
Sposób według wynalazku ilustruje poniższy przykład.
P r z y k ł a d.
Izolacja rewertantów szczepu Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 zdolnych do biosyntezy homoseryny
W pierwszym etapie przygotowano skosy agarowe z pożywki kompleksowej o składzie (w/v): 1% ekstraktu wołowego, 1% bacto-peptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,3% NaCl, 1,5% agaru, wody destylowanej do 100%, następnie skorygowano ich pH do 7,2, po czym poddano ogrzewaniu do rozpuszczenia składników i przeniesiono do probówek zamkniętych korkami z waty, które poddano je sterylizacji. Zawartość probówek zaszczepiono biomasą komórek Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 pobraną z 48 godzinnej hodowli, przechowywanej w chłodni w temperaturze 4°C. Hodowle na skosach inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 30°C. Uzyskane komórki zaszczepiono na wysterylizowaną i ostudzoną pożywkę posiewową. Hodowlę na pożywce posiewowej prowadzono w kolbach stożkowych o objętości 500 ml zawierających po 50 ml pożywki posiewowej o pH 7,2 i składzie (w/v): 1% ekstraktu wołowego, 1% bacto-peptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,3% NaCl, wody destylowanej do 100%. Pożywkę wysterylizowano, a następnie szczepiono komórkami bakterii pobranymi ze skosów agarowych. Hodowlę posiewową prowadzono przez 18 godzin w temperaturze 30°C w inkubatorze z wytrząsaniem, przy prędkości obrotów wynosi 200 rpm. W efekcie uzyskano zawiesinę mikroorganizmów zawierającą 108-109 komórek/ml, którą rozcieńczono w fizjologicznym roztworze soli (0,85% NaCl) i wysiano powierzchniowo na pożywkę zestaloną agarem o pH 7,2, o składzie (w/v) : sacharoza 2%, hydrolizat kazeiny 1%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, zawierającą 100 μ-g/l D-biotyna i 500 μ-g/l tiaminy. Uzyskane w ten sposób pojedyncze kolonie pobierano oczkiem i przesiewano redukcyjnie na stałą pożywkę o tym samym składzie. Obserwowano powstanie pojedynczych kolonii, które izolowano i przeniesiono na skosy agarowe z pożywki kompleksowej.
Aby potwierdzić zniesienie auksotrofii homoserynowej wykonano potwierdzające testy fermentacyjne. W tym celu przygotowano hodowlę inokulacyjną w 250 ml kolbach, zawierających po 50 ml sterylnej pożywki inokulacyjnej o pH 7,2, o składzie (w/v): sacharoza 2%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, 100 μ-g/l D-biotyny, 500 μ-g/l tiaminy. Hodowlę prowadzono 18 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem, w temperaturze 30°C. Uzyskaną zawiesinę komórek, w ilości 2,5 ml przeniesiono do 50 ml sterylnej pożywki minimalnej, umieszczonej w 250 ml kolbach. Skład pożywki minimalnej (w/v): sacharoza 2%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, 100 μg/l D-biotyny, 500 μg/l tiaminy. Po 24 godzinach hodowli, w temperaturze 30°C, prowadzonej w inkubatorze z wytrząsaniem, przy częstości obrotów 200 rpm, szczepy rewertanty ze zniesioną auksotrofią homoserynową wykazały wyraźny przyrost biomasy.
W tablicy 1 przedstawiono stężenia biomasy szczepu auksotroficznego ATCC 13287 i szczepów ze zniesioną auksotrofią ATCC 13287 RW, po 24-godzinne j hodowli w zdefiniowanej pożywce minimalnej nie zawierającej D,L-homoseryny.
T a b l i c a 1
| Szczep | Stężenie biomasy [gs.m./l] |
| ATCC 13287 | 0,59 |
| ATCC 13287 RW.A | 2,46 |
| ATCC 13287 RW.B | 2,31 |
| ATCC 13287 RW.C | 2,13 |
| ATCC 13287 RW.D | 2,09 |
Ponieważ populacja mikroorganizmów w obrębie szczepu nie była jednorodna, możliwe było wyizolowanie komórek wykazujących nieco odmienne cechy biochemiczne. Opisana metoda izolacji rewertantów o zniesionej auksotrofii względem homoseryny była skuteczna. Jedynie w przypadku
PL 225 497 B1 komórek, które powróciły do fenotypu dzikiego, obserwowano intensywny wzrost w czasie hodowli w pożywkach nie zawierających homoseryny.
Izolacja szczepów termotolerancyjnych
W pierwszym etapie przygotowano skosy agarowe z pożywki kompleksowej. Skosy zaszczepiono biomasą komórek Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 oraz ATCC 13287 RW.A pobraną z 48 godzinnej hodowli, przechowywanej w chłodni w temperaturze 4°C. Skosy inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 30°C. Uzyskanymi komórkami zaszczepiono wysterylizowaną i ostudzoną pożywkę posiewową. Hodowlę posiewową szczepu Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 prowadzono postępując jak w przykładzie I. Uzyskano gęstą zawiesinę mikroorganizmów zawierającą 108-109 komórek/ml, którą wykorzystano w pierwszym etapie selekcji.
W pierwszym etapie selekcji 100 μl gęstej zawiesiny drobnoustrojów uzyskanej w hodowli posiewowej wysiano powierzchniowo na podłoże kompleksowe zestalone agarem o pH 7,2, o składzie (w/v): 1% ekstraktu wołowego, 1% bacto-peptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,3% NaCl, 1,5% agaru, wody destylowanej do 100%. Pożywkę z wysianymi drobnoustrojami inkubowano w czasie 24 godzin w temperaturze 44°C. Otrzymane w ten sposób pojedyncze kolonie izolowano i wykorzystano w kolejnych etapach selekcji. Pojedyncze kolonie, uzyskane w pierwszym etapie selekcji, przeniesiono na stałe podłoże kompleksowe o składzie jak w pierwszym etapie selekcji. Po wykonaniu posiewu redukcyjnego, pożywki z drobnoustrojami inkubowano w czasie 24 godzin w temperaturze 44°C. Otrzymane w ten sposób pojedyncze kolonie izolowano i przeniesiono na skosy agarowe z pożywki kompleksowej, na której były przechowywane.
W drugim etapie selekcji porównano zdolności wzrostu w temperaturze 44°C wyizolowanych mutantów oraz szczepu wzorcowego (którego optymalna temperatura wzrostu wynosi 30°C). Szczepy aktywowano na skosach agarowych o opisanym wyżej składzie. Hodowlę inokulacyjną prowadzono w kolbach o objętości 250 ml, które zawierały po 50 ml pożywki inokulacyjnej o pH 7,2, o składzie (w/v): sacharoza 3%, hydrolizat kazeiny 1%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4 7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, woda wodociągowa do 100%. Stosowano suplementację pożywki witaminami i aminokwasami tj. 100 μg/l D-biotyny, 500 μg/l tiaminy, a w przypadku szczepów wykazujących auksotrofię homoserynową, również D,L-homoseryną stosowaną w ilości 700 mg/l. Hodowlę inokulacyjną prowadzono przez 18 godzin w temperaturze 37°C, w inkubatorze z wytrząsaniem, przy prędkości obrotowej 200 rpm. Uzyskane inokulum przeniesiono sterylnie do kolb o objętości 500 ml, zawierających po 50 ml pożywki minimalnej o pH 7,2 i o składzie (w/v): sacharoza 15%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, woda wodociągowa do 100%. Stosowano suplementację pożywki witaminami i aminokwasami tj.: D-biotyną użytą w ilości 100 μg/l oraz tiaminą użytą w ilości 500 μg/l, a w przypadku szczepów auksotroficznych również D,L-homoseryną użytą w ilości 700 mg/l. Hodowlę prowadzono w inkubatorze z wytrząsaniem przez 48 godzin, utrzymując temperaturę 44°C i prędkość obrotów 200 rpm. Ilość biomasy mierzono metodą spektrofotometryczną. Gęstość optyczną odpowiednio rozcieńczonej w wodzie destylowanej zawiesiny komórek mierzono względem wody przy długości fali λ=540 nm. Porównanie tempa przyrostu biomasy, w kolejnych dobach hodowli pozwoliło na selekcję szczepów o wyraźnej tolerancji na podwyższoną temperaturę.
W tablicy 2 porównano przyrost stężenia biomasy szczepów auksotroficznych: wzorcowego Corynebacterium glutamicum ATCC 13287, termotolerancyjnych (W44), zdolnych do biosyntezy homoseryny (ATCC 13287 RW), a także wykazujących jednocześnie termotolerancję i zniesioną auksotrofię RW44.
T a b l i c a 2
| Szczep | Przyrost biomasy [gs.m./l] | |
| 24 godz. | 48 godz. | |
| ATCC 13287 | 0,83 | 1,16 |
| ATCC 13287 RW.A | 0,61 | 0,99 |
| W44.1 | 3,43 | 4,00 |
| W44.2 | 3,35 | 3,94 |
| RW44.1 | 3,37 | 4,34 |
| RW44.2 | 3,51 | 4,28 |
PL 225 497 B1
Szczep wzorcowy Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 oraz rewertant ze zniesioną auksotrofią homoserynową oznaczony jako ATCC 13287 RW.A, dobrze rosły w temperaturze 30°C, podniesienie temperatury do 44°C znacznie ograniczyło tempo namnażania się tych mikroorganizmów. Osiągnięcie niewielkiego przyrostu biomasy sugerowało, że w całej populacji znajdują się mutanty, mniej wrażliwe na podwyższoną temperaturę hodowli. Opisaną metodą selekcji otrzymano szczepy oznaczone, jako W44.1, W44.2, RW44.1, RW.44.2, które szybko namnażały się w temperaturze 44°C, przy czym fenotypy RW44.1 i RW.44.2 nie wymagały obecności homoseryny w pożywce. Przedstawione wyniki potwierdziły możliwość uzyskania termotolerancyjnych komórek Corynebacterium glutamicum metodą prostej selekcji.
Izolacja termotolerancyjnych szczepów Corynebacterium glutamicum, rosnących w temperaturze 44°C i aktywnie metabolizujących dostępne źródło węgla.
Wyizolowane w sposób opisany powyżej mutanty, zdolne do wzrostu w podwyższonej temperaturze, namnażano w inkubatorze z wytrząsaniem przy szybkości obrotów 200 rpm w temperaturze 44°C przez 18 godzin, stosując opisaną powyżej pożywkę posiewową. W ten sposób uzyskano zawiesinę mikroorganizmów zawierającą 108-109 komórek/ml, którą rozcieńczono w fizjologicznym roztworze soli (0,85% NaCl), uzyskując kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia, następnie 100 μΙ zawiesiny wysiano powierzchniowo na sterylne pożywki zestalone agarem, o pH 7, o składzie (w/v): 1,5% cytrynianu sodu lub 1% cytrynianu sodu i 0,5% kwasu glutaminowego oraz 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4,0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2,1,5% agaru, wody wodociągowej do 100% oraz 100 μg/l D-biotyny, 500 μg/l tiaminy, i o składzie (w/v): 1,5% bursztynianu sodu lub 1% bursztynianu sodu i 0,5% kwasu glutaminowego oraz 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4, 0,1%KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCh, 1,5% agaru, wody wodociągowej do 100% oraz 100 μg/l D-biotyny, 500 μg/l tiaminy, a w przypadku szczepów auksotroficznych również 700 mg/l D,L-homoseryny. Płytki z wysianymi mikroorganizmami inkubowano 72 godziny w temperaturze 44°C.
W efekcie, na pożywkach zawierających bursztynian sodu, uzyskano pojedyncze kolonie zróżnicowane pod względem wielkości, a jeśli jako źródło węgla zastosowano cytrynian sodu, również barwą. Wybrane kolonie mikroorganizmów, wykazujące intensywny wzrost oraz różniące się cechami fenotypowymi, izolowano i wykorzystano w kolejnych etapach selekcji. Izolację czystych kultur prowadzono metodą posiewu redukcyjnego, stosując pożywkę o takim samym składzie jak ta, z której izolowano szczep. Pojedyncze kolonie przenoszono na skosy agarowe, które służyły do przechowywania szczepów, przygotowane z takiej samej pożywki. Przeprowadzono testy fermentacyjne, które miały na celu ocenę uzdolnień metabolicznych wyizolowanych szczepów i umożliwiły wybór tych, które rosły intensywnie w podwyższonej temperaturze i jednocześnie szybko metabolizowały dostarczane źródło węgla. Komórki aktywowano na skosach agarowych opisanych powyżej. Skosy z mikroorganizmami inkubowano w temperaturze 44°C. Hodowlę inokulacyjną prowadzono w kolbach stożkowych o objętości 250 ml, zawierających po 50 ml sterylnej pożywki o pH 7,2, o składzie (w/v): 1% glukozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NHhSO^ 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, wody wodociągowej do 100% oraz 100 μg/l D-biotyny, 500 μg/l tiaminy, a w przypadku szczepów auksotroficznych również 700 mg/l D,L-homoseryny. Inokulum w ilości 2,5 ml przeniesiono do kolb stożkowych o objętości 500 ml, zawierających po 50 ml pożywki o pH 7,2 o składzie (w/v): 10% glukozy, 3,4% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 5% CaCO3, wody wodociągowej do 100% oraz 100 μg/l D-biotyny, 500 μg/l tiaminy, a w przypadku szczepów auksotroficznych również 700 mg/l D,L-homoseryny. Hodowle prowadzono przez 72 godziny w temperaturze 44°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Pierwszą dobę hodowli prowadzono w warunkach tlenowych, utrzymując obroty wytrząsarki 200 rpm, w kolejnych dobach ograniczono dostęp tlenu i zmniejszono szybkość mieszania do 100 rpm. Przyrost biomasy kontrolowano spektrofotometrycznie przy długości fali λ=540 nm, próbę przygotowywano rozcieńczając 1 ml hodowli w 2 ml 10% kwasu octowego i uzupełniając do 10 ml wodą destylowaną, uzyskując w ten sposób dziesięciokrotne rozcieńczenie. Próbę odniesienia stanowiła mieszanina 8 ml wody destylowanej i 2 ml 10% kwasu octowego. Tempo zużywania glukozy, oznaczano wykorzystując barwną reakcję cukrów redukujących z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNS) i pomiar spektrofotometryczny przy długości fali λ=540 nm. Jednocześnie podobne analizy przeprowadzono dla szczepu wzorcowego, rosnącego w 30°C. Otrzymane wyniki pozwoliły na ocenę aktywności metabolicznej wyizolowanych kultur.
PL 225 497 B1
W tablicy 3 porównano stężenia biomasy i zużycia cukrów redukujących w czasie hodowli te rmotolerancyjnych szczepów Corynebacterium glutamicum, które izolowano z pożywek zawierających bursztynian sodu, jako główne źródło węgla.
T a b l i c a 3
| Szczep | Stężenie biomasy [gs.m./l] | Wykorzystanie cukrów redukujących [g/l] | ||||
| 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | |
| WB44.1 | 2,89 | 3,06 | 3,30 | 46,4 | 64,7 | 74,4 |
| WB44.3 | 2,75 | 3,26 | 3,73 | 61,4 | 66,6 | 72,0 |
| WBG44.2 | 3,56 | 3,31 | 3,22 | 63,6 | 72,1 | 84,9 |
| RB44.2 | 3,25 | 3,03 | 2,83 | 44,3 | 57,5 | 69,7 |
| RBG44.4 | 2,86 | 3,16 | 3,36 | 51,4 | 61,7 | 68,9 |
| RBG44.5 | 3,38 | 3,12 | 2,84 | 55,0 | 58,1 | 67,1 |
W tablicy 4 porównano stężenia biomasy i zużycia cukrów redukujących przez termotolerancyjne szczepy Corynebacterium glutamicum, które izolowano z pożywek zawierających cytrynian sodu, jako główne źródło węgla.
T a b l i c a 4
| Szczep | Zabarwienie kolonii | Stężenie biomasy [gs.m./l] | Wykorzystanie c redukujących | ukrów [g/l] | |||
| 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | ||
| WC44.2 | Ciemnopomarańczowe | 3,70 | 3,13 | 2,66 | 60,6 | 64,5 | 76,5 |
| WCG44.3 | Ciemnopomarańczowe | 3,50 | 3,34 | 2,98 | 51,9 | 58,5 | 73,2 |
| RC44.2 | Ciemnopomarańczowe | 3,47 | 3,26 | 2,90 | 53,8 | 61,9 | 71,3 |
| RCG44.3 | Ciemnopomarańczowe | 3,39 | 3,19 | 2,66 | 51,4 | 63,1 | 77,6 |
| WC44.3 | Żółte | 3,34 | 2,80 | 2,54 | 31,7 | 50,1 | 70,4 |
| RCG44.5 | Żółte | 2,80 | 3,12 | 3,41 | 49,9 | 57,0 | 64,4 |
| RCG44.6 | Kremowe | 3,39 | 3,46 | 3,21 | 53,7 | 59,6 | 65,4 |
| RCG44.7 | Kremowe | 3,17 | 3,05 | 2,86 | 55,1 | 60,2 | 61,7 |
Otrzymane termotolerancyjne szczepy rosły dobrze w temperaturze 44°C. Na pożywkach z bursztynianem sodu otrzymano kolonie o podobnej morfologii, różniące się jedynie wielkością. Wśród wyizolowanych wariantów znalazły się takie, które oprócz intensywnego namnażania biomasy szybko metabolizowały glukozę np. szczep WBG44.2 (tablica 3). Stosowanie pożywek zawierających cytrynian sodu powodowało uzyskanie kolonii zróżnicowanych pod względem wielkości i zabarwienia. Najlepsze właściwości, tj. szybkie tempo wzrostu i metabolizmu cukrów wykazały szczepy tworzące duże kolonie o zabarwieniu ciemnopomarańczowym, np. RCG44.3 WC44.2 (tablica 4).
W tablicy 5 porównano stężenia biomasy i zużycia cukrów redukujących w czasie hodowli szczepów termotolerancyjnych i komórek nie wykazujących tolerancji na wysoką temperaturę. Hodowle prowadzono przy użyciu testów fermentacyjnych opisanych powyżej. Dla szczepów ATCC 13287 i ATCC 13287RW temperatura hodowli wynosiła 30°C, a dla WBG44.2, RCG44.3, WC44.2, W44.1, W44.2 - 44°C.
PL 225 497 B1
T a b l i c a 5
| Szczep | Stężenie biomasy [gs.m./l] | Wykorzystanie cukrów redukujących [g/l] | ||||
| 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | 24 godz. | 48 godz. | 72 godz. | |
| WBG44.2* | 3,56 | 3,31 | 3,22 | 63,6 | 72,1 | 84,0 |
| RCG44.3** | 3,39 | 3,19 | 2,66 | 51,4 | 63,1 | 77,6 |
| WC44.2** | 3,70 | 3,13 | 2,66 | 60,6 | 64,5 | 76,5 |
| W44.1 | 3,80 | 3,15 | 3,07 | 23,1 | 43,9 | 61,9 |
| RW44.1 | 3,62 | 3,32 | 3,04 | 40,4 | 54,8 | 61,0 |
| ATCC 13287 | 3,35 | 3,18 | 3,19 | 47,9 | 56,1 | 74,9 |
| ATCC 13287 RW | 3,37 | 3,19 | 3,12 | 48,3 | 59,4 | 71,7 |
* szczepy izolowane z pożywek zawierających bursztynian sodu ** szczepy izolowane z pożywek zawierających cytrynian sodu
Otrzymane termotolerancyjne szczepy (WBG44.2, RCG44.3, WC44.2) były zdolne do intensywnego wzrostu w temperaturze 44°C i dobrze metabolizowały dostarczone źródło węgla, a zmierzone parametry były zbliżone do tych, jakie obserwowano dla szczepów rosnących w 30°C (W44.1, RW44.1). Jak wynika z tablicy 5 warianty W44.1 i RW44.1, mimo iż w pierwszej dobie hodowli prowadzonej w temperaturze 44°C wykazują znaczny przyrost biomasy, to znacznie wolniej wykorzystują dostępne źródło węgla. Zastosowanie tylko jednego etapu selekcji nie byłoby zatem skuteczne.
Claims (1)
- Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40°C, przy użyciu pożywki kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, o składzie (w/v): 1% ekstraktu wołowego, 1% bacto-peptone, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,3% NaCl, wody destylowanej do 100%, o pH do 7,2, znamienny tym, że biomasą szczepu bakterii Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 szczepi się zestaloną agarem pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum i prowadzi aktywację szczepu w czasie 24 godziny w temperaturze 30°C, uzyskane komórki przenosi się na wysterylizowaną płynną pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum i prowadzi hodowlę posiewową wytrząsaną w czasie 18 godzin w temperaturze 30°C, po czym otrzymaną zawiesinę mikroorganizmów, rozcieńczoną w fizjologicznym roztworze soli, wysiewa się powierzchniowo na pożywkę mineralną zestaloną agarem, o składzie (w/v): sacharoza 2%, hydrolizat kazeiny 1%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, zawierającą nadto 100 μ-g/l D-biotyny i 500 μ-g/l tiaminy, o pH 7,2, uzyskane w ten sposób pojedyncze kolonie pobiera się i przesiewa redukcyjnie na stałą pożywkę o tym samym składzie, a powstałe w wyniku tego pojedyncze kolonie izoluje się i przenosi na skosy agarowe z pożywki kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, następnie prowadzi się hodowlę inokulacyjną wyizolowanych kolonii na sterylnej pożywce minimalnej o składzie (w/v): sacharoza 2%, octan sodu 0,82%, (NH4)2SO4 0,66%, KH2PO4 0,1%, MgSO4-7H2O 0,02%, FeSO4-7H2O 0,001%, CaCl2 0,001%, agar 1,5%, woda wodociągowa do 100%, zawierającej nadto 100 μg/l D-biotyny i 500 μg/l tiaminy, o pH 7,2, w temperaturze 30°C w czasie 18 godzin, uzyskanymi zawiesinami szczepi się sterylną pożywkę minimalną o składzie jak pożywka inokulacyjną i prowadzi hodowlę wytrząsaną w temperaturze 30°C w czasie 24 godzin, po czym izoluje się szczepy wykazujące wyraźny przyrost biomasy jako szczepy ze zniesioną auksotrofią homoserynową, następnie biom asą szczepów ze zniesioną auksotrofią homoserynową szczepi się wysterylizowaną pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum i prowadzi ich inkubację w temperaturze 30°CPL 225 497 B1 w czasie 24 godzin, uzyskane komórki przenosi się na wysterylizowaną pożywkę posiewową o podanym wyżej składzie i pH i prowadzi hodowlę posiewową w czasie 24 godzin w temperaturze 30°C, po czym komórki uzyskane w wyniku hodowli posiewowej wysiewa się powierzchniowo na podłoże kompleksowe do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, na którym inkubuje się je w czasie 24 godzin w temperaturze 44°C, a otrzymane w wyniku tej inkubacji pojedyncze kolonie izoluje się, przenosi na stałe podłoże kompleksowe do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, inkubuje na tym podłożu w czasie 24 godzin w temperaturze 44°C i otrzymane w wyniku inkubacji pojedyncze kolonie przenosi się na pożywkę kompleksową do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, na której mogą być przechowywane, w dalszej kolejności prowadzi się hodowlę inokulacyjną wytrząsaną tych szczepów na pożywce inokulacyjnej o wyżej podanym składzie i pH, w temperaturze 37°C w czasie 18 godzin, uzyskane inokulum przenosi się na pożywkę minimalną o wyżej podanym składzie i pH i prowadzi hodowlę wytrząsaną w temperaturze 44°C w czasie 48 godzin, a po jej zakończeniu izoluje się szczepy, które wykazują najwyższe tempo wzrostu biomasy w temperaturze 44°C, dalej wyizolowane szczepy namnaża się w hodowli wytrząsanej na pożywce posiewowej o wyżej podanym składzie i pH, w temperaturze 44°C w czasie 18 godzin, rozcieńcza w fizjologicznym roztworze soli i wysiewa powierzchniowo na pożywkę o składzie (w/v): 1,5% cytrynianu sodu lub 1% cytrynianu sodu i 0,5% kwasu glutaminowego, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 1,5% agaru, wody wodociągowej do 100% oraz 100 pg/l D-biotyny i 500 pg/l tiaminy, o pH 7,2 oraz na pożywkę o składzie (w/v): 1,5% bursztynianu sodu lub 1% bursztynianu sodu i 0,5% kwasu glutaminowego oraz 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 1,5% agaru, wody wodociągowej do 100%, zawierającej nadto 100 pg/l D-biotyny i 500 pg/l tiaminy, o pH 7,2 i prowadzi inkubację na tych pożywkach w temperaturze 44°C w czasie 72 godziny, po czym izoluje kolonie mikroorganizmów wykazujące najintensywniejsze tempo wzrostu w tych warunkach, przenosi je na pożywki posiewowe o składzie takim jak pożywki, z których je izolowano i po hodowli posiewowej przenosi się je w celu przechowania na pożywki o takim samym składzie jak pożywki posiewowe, następnie kolonie mikroorganizmów wyizolowane po hodowli na pożywkach zawierających bursztynian sodu i cytrynian sodu aktywuje się na pożywce kompleksowej do hodowli bakterii Corynebacterium glutamicum, w temperaturze 44°C, prowadzi ich hodowlę inokulacyjną na pożywce o składzie (w/v): 1% glukozy, 0,5% hydrolizatu kazeiny, 2% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, wody wodociągowej do 100%, zawierającej nadto 100 pg/l D-biotyny i 500 pg/l tiaminy, o pH 7,2, w temperaturze 44°C w czasie 24 godzin, uzyskane inokulum każdego szczepu przenosi się na pożywkę o składzie (w/v): 10% glukozy, 3,4% (NH4)2SO4, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4-7H2O, 0,001% FeSO4-7H2O, 0,001% CaCl2, 5% CaCO3, wody wodociągowej do 100%, zawierającej także 100 pg/l D-biotyny oraz 500 pg/l tiaminy, o pH 7,2 i prowadzi hodowlę wytrząsaną w temperaturze 44°C w czasie 72 godziny, przy czym pierwszą dobę hodowli prowadzi się w warunkach tlenowych, a w kolejnych dobach ogranicza się dostęp tlenu i zmniejsza szybkość obrotową wstrząsarki, po czym spośród uzyskanych kolonii szczepów zdolnych do wzrostu w temperaturze 44°C i najaktywniej metabolizujących źródło węgla wyizolowuje się kolonie o największym przyroście biomasy i najwyższym tempie zużywania glukozy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL407623A PL225497B1 (pl) | 2014-03-24 | 2014-03-24 | Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40⁰ C |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL407623A PL225497B1 (pl) | 2014-03-24 | 2014-03-24 | Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40⁰ C |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL407623A1 PL407623A1 (pl) | 2015-09-28 |
| PL225497B1 true PL225497B1 (pl) | 2017-04-28 |
Family
ID=54150862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL407623A PL225497B1 (pl) | 2014-03-24 | 2014-03-24 | Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40⁰ C |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL225497B1 (pl) |
-
2014
- 2014-03-24 PL PL407623A patent/PL225497B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL407623A1 (pl) | 2015-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Timoumi et al. | Impacts of environmental conditions on product formation and morphology of Yarrowia lipolytica | |
| Wu et al. | Microbial lipid production by Rhodosporidium toruloides under sulfate-limited conditions | |
| Looijesteijn et al. | Uncoupling of growth and exopolysaccharide production by Lactococcus lactis subsp. cremoris NIZO B40 and optimization of its synthesis | |
| Hettinga et al. | The propionic-acid bacteria-a review: I. growth | |
| CA2915389C (en) | L-isoleucine-producing corynebacterium glutamicum strain and method of producing l-isoleucine therefrom | |
| Forsyth et al. | Nutrition and distribution of salt response in populations of moderately halophilic bacteria | |
| Liu et al. | Enhancement of pyruvate productivity in Torulopsis glabrata: increase of NAD+ availability | |
| Saisriyoot et al. | Biomass and lipid production by Rhodococcus opacus PD630 in molasses-based media with and without osmotic-stress | |
| Putri et al. | Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Apis mellifera and their potential as antibacterial using in vitro test against growth of Listeria monocytogenes and Escherichia coli | |
| Sowmya et al. | Carotenoid production by Formosa sp. KMW, a marine bacteria of Flavobacteriaceae family: Influence of culture conditions and nutrient composition | |
| CN101993841B (zh) | 一种黄单胞菌及用其制备黄原胶的方法 | |
| US20210171991A1 (en) | Enhanced production of lipids by limitation of at least two limiting nutrient sources | |
| JP7728007B2 (ja) | 難培養性嫌気性微生物の高収率培養のための培地サプリメント及びそれを含む培地組成物 | |
| Yee et al. | The production of functional γ-aminobutyric acid Malaysian soy sauce koji and moromi using the trio of Aspergillus oryzae NSK, Bacillus cereus KBC, and the newly identified Tetragenococcus halophilus KBC in liquid-state fermentation | |
| CN109415417A (zh) | 通过含有编码糖磷酸转移酶系统(pts)的基因的微生物发酵生产甲硫氨酸或其羟基类似物形式的方法 | |
| Allan | Induction and cultivation of a stable L‐form of Bacillus subtilis | |
| Kisumi et al. | Valine accumulation by α-aminobutyric acid-resistant mutants of Serratia marcescens | |
| US20100040761A1 (en) | Novel Thraustochytrium SP, KJS-I, Bacillus Polyfermenticus KJS-2 and Feed Additive For Fish Including them | |
| McMurrough et al. | Effects of temperature variation on the fatty acid composition of Candida utilis | |
| Ali et al. | Characterization of a Saccharomyces cerevisiae mutant with enhanced production of β-D-fructofuranosidase | |
| PL225497B1 (pl) | Sposób otrzymywania szczepów bakterii Corynebacterium glutamicum zdolnych do wzrostu w temperaturze powyżej 40⁰ C | |
| Nishio et al. | Isolation of methanol-utilizing bacteria and its vitamin B12 production | |
| RU2665830C1 (ru) | Мутантный штамм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-глутамин (варианты), и способ получения L-глутамина | |
| RU2407786C1 (ru) | Питательная среда для выращивания deinococcus radiodurans | |
| RU2091483C1 (ru) | Способ получения бактериальных клеток рода clostridium, способных продуцировать споры и продукты метаболизма |