PL225333B1 - Preparat wykazujący aktywność ludzkiej deaminazy cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (AID) oraz sposób otrzymywania tego preparatu w systemie bakteryjnym - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat wykazujący aktywność ludzkiej deaminazy cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (AID) oraz sposób otrzymywania tego preparatu w systemie bakt eryjnym. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy zmodyfikowanego genu ludzkiej AID, umożliwiającego produkcję aktywnego enzymu w systemie bakteryjnym.

Deaminaza cytydyny indukowana aktywacją limfocytów B (ang. activation-induced cytidine deaminase, AICDA, AID) jest kluczowym białkiem zaangażowanym w proces różnicowania przeciwciał. Niezwykłą cechą układu immunologicznego kręgowców jest zdolność do wyprodukowania ogromnej liczby różnych przeciwciał, wielokrotnie przewyższającej liczbę kodujących je genów. Jest to możliwe dzięki istnieniu dodatkowych mechanizmów, umożliwiających zwiększenie poziomu zmienności genetycznej. Podstawowym mechanizmem tej zmienności jest rekombinacja somatyczna zachodząca p omiędzy genami V (ang. variable), D (ang. diversity) i J (ang. joining), kodującymi łańcuchy lekkie i ciężkie immunoglobulin. Rekombinacja ta umożliwia powstanie pierwotnego, niezależnego od obecności antygenu, zestawu przeciwciał. W wyniku aktywacji limfocytów B w obecności antygenu następuje wtórne różnicowanie genów kodujących immunoglobuliny, na drodze hipermutacji somatycznych (ang. somatic hypermutation, SHM) i rekombinacji prowadzącej do tzw. przełączania klas (ang. class switch recombination, CSR). SHM polega na wprowadzeniu mutacji punktowych, których obecność pociąga za sobą zmiany reszt aminokwasowych tworzących domenę przeciwciała odpowiedzialną za wiązanie antygenu. CSR natomiast obejmuje powstanie pęknięć obu nici w obrębie DNA i rekombinację, w wyniku której zmianie ulega część efektorowa przeciwciała - rejon stały łańcucha ciężkiego. W rezultacie z pierwotnych immunoglobulin typu M (IgM) powstają immunoglobuliny reprezentujące różne klasy: IgG, IgE, IgD oraz IgA [1]. Poszczególne klasy immunoglobulin mają odmienne powinowactwo wobec receptorów komórkowych, a co za tym idzie, pełnią odmienne funkcje podczas aktywowania szlaków odpowiedzi immunologicznej. Molekularne podłoże SHM i CSR pozostawało niepoznane aż do końca XX wieku, kiedy to badania grupy kierowanej przez T. Honjo doprowadziły do o dkrycia białka AID [2] i wykazania, że pełni ono kluczową rolę w inicjowaniu obu wspomnianych procesów [3]. U osób posiadających zmutowaną formę genu AID występują poważne zaburzenia immunologiczne: brak hipermutacji somatycznych, brak przełączania klas immunoglobulin (zespół hiper-lgM; HIGM2) i rozrost węzłów chłonnych [4]. Rola AID w zapewnieniu prawidłowej odpowiedzi immunologicznej jest bardzo istotna, jednak najnowsze dane literaturowe wskazują, że białko to może pełnić jeszcze ważniejszą funkcję poza układem odpornościowym. Istnieją bowiem przesłanki pozwalające sądzić, że AID bierze udział w demetylacji genomu. Obecnie wiadomo, że metylacja genomu jest jednym z najistotniejszych czynników epigenetycznych determinujących ekspresję genów. Najczęściej metylacji ulega węgiel w pozycji 5 cytozyny, co prowadzi do powstania 5-metylocytozyny (5 meC). U ssaków zidentyfikowano szereg enzymów odpowiedzialnych za metylację de novo i utrzymywanie metylacji podczas replikacji DNA [5]. Znacznie mniej wiadomo na temat molekularnych podstaw demetylacji. Może ona zachodzić zarówno w sposób bierny (gdy grupy metylowe nie zostaną wprowadzone do cząsteczek potomnych po replikacji DNA), jak i aktywny (gdy grupy metylowe są usuwane z DNA). Aktywna, globalna demetylacja genomu zachodzi podczas dwóch etapów rozwoju ssaków; przed pierwszym podziałem zygoty oraz w pierwotnych komórkach płciowych, między 11,25 a 13,5 dniem życia embrionalnego [6]. Demetylacja ta umożliwia powrót komórek do stanu pluripotencji i przeprogramowanie genomu, co jest niezbędnym warunkiem prawidłowego przebiegu procesów różnicowania i rozwoju [7]. Wyniki najnowszych badań sugerują, że w ten niezwykle istotny proces może być zaangażowana AID [7, 8].

Mimo, że od odkrycia AID upłynęło niemal 15 lat, nadal nie znaleziono odpowiedzi na wiele pytań dotyczących struktury i mechanizmu katalitycznego tego enzymu. AID reprezentuje rodzinę białek AID/APOBEC i jest deaminazą cytydyny o masie około 24 kDa. Na końcu karboksylowym posiada silny sygnał eksportu z jądra komórkowego, natomiast na końcu aminowym stosunkowo słaby sygnał lokalizacji jądrowej. W związku z tym AID występuje przede wszystkim w cytoplazmie [9]. Podobnie jak inne białka z tej samej rodziny, AID posiada wysoce zachowawczy motyw aminokwasowy, koord ynujący atom cynku wewnątrz rdzenia katalitycznego. Można zatem sądzić, że mechanizm katalizowanej przez AID deaminacji cytydyny do urydyny jest podobny jak w przypadku innych deaminaz zale żnych od obecności cynku [10]. Najbliższym homologiem AID jest białko APOBECl - enzym katalizujący deaminację cytydyny w obrębie mRNA kodującego apolipoproteinę B. Biorąc pod uwagę podobieństwo tych dwóch enzymów postulowano początkowo, że substratem dla AID jest również mRNA [3, 9,

PL 225 333 B1

11], Kwestia ta była przedmiotem intensywnych badań, których wyniki nie są całkowicie jednoznaczne [12]. Obecnie jednak większość dowodów przemawia za tym, że AID deaminuje cytydynę w jednoniciowym DNA [9, 13, 14], w obrębie motywu WRCY (W = A/T; R = A/G; Y = C/T) [15]. Enzym ten jest jedynym znanym ludzkim białkiem, zdolnym do wywierania bezpośredniego wpływu mutagennego na genom. W związku z tym, nadmierna ekspresja AID prowadzi do zaburzeń odpowiedzi immunologic znej [16] lub rozwoju nowotworów [17]. Według niektórych źródeł aktywność AID in vitro jest uzależniona od obecności rybonukleazy, co sugeruje, że AID silnie wiąże się z komórkowym RNA. Po izolacji AID może wiązać się z występującym w preparacie RNA co uniemożliwia oddziaływanie enzymu z substratem [15]. Jak wspomniano powyżej, wiele kwestii dotyczących struktury i aktywności AID jest niejasnych. Kontrowersje budzi na przykład zdolność AID do deaminacji wolnej cytydyny, czy deoksycytydyny - niektóre wyniki wskazują, że AID wykazuje tę aktywność [2, 15], natomiast inne świadczą o jej braku [18]. W konsekwencji nie można jednoznacznie stwierdzić, czy aktywność AID jest ham owana przez inhibitor deaminaz wolnej cytydyny - tetrahydrourydynę [10]. Struktura przestrzenna AID jest nieznana, a wszelkie informacje na jej temat zostały zebrane na podstawie danych dotyczących innych enzymów z tej rodziny oraz modeli bioinformatycznych [10, 19]. Nie ustalono również, czy AID występuje w formie monomeru [20], czy też - podobnie jak Apobec2 - tetrameru [19, 21]. Nie ma także zgodności co do tego, czy AID działa procesywnie (jest zdolna do deaminacji wielu cytydyn po przyłączeniu do cząsteczki substratowej) [22], czy też dystrybutywnie (oddysocjowuje po dokonaniu pojedynczej deaminacji) [23]. Ponadto, jednym z najistotniejszych zagadnień wymagającym wyjaśnienia jest regulacja aktywności AID - jej ekspresji, lokalizacji subkomórkowej i kierowania do właściwych rejonów docelowych, przy jednoczesnym zapewnieniu, że inne fragmenty genomu nie ulegną niepożądanym mutacjom.

Podstawową przyczyną uniemożliwiającą udzielenie odpowiedzi na zasadnicze pytania dotyczące struktury i aktywności biochemicznej AID jest brak wydajnego systemu do produkcji tego białka. Mimo że AID pełni bardzo istotne funkcje i cieszy się ogromnym zainteresowaniem badaczy w wiodących laboratoriach na świecie, enzym ten nadal nie jest dostępny komercyjnie. Opublikowano szereg prac dotyczących otrzymywania AID: (i) w systemie bakteryjnym, jako białko fuzyjne z S-transferazą glutationową (GST) [2, 24] lub zaopatrzone w znacznik streptawidynowy [18]; (ii) w komórkach owadzich [25]; (iii) w systemie translacji in vitro [26]. System bakteryjny jest najwydajniejszy i najtańszy spośród wymienionych powyżej, zatem wydaje się optymalny w przypadku otrzymywania dużych ilości enzymu do badań strukturalnych (w tym krystalograficznych) i biochemicznych (w tym testowania związków modulujących aktywność enzymu). Na podstawie danych literaturowych można sądzić, że preparaty AID otrzymywane dotychczas w systemie bakteryjnym były zanieczyszczone deaminazą bakteryjną. W rzeczywistości pozwalały one badać aktywność deaminazową enzymów bakteryjnych, a nie AID [10]. Stąd w szeregu publikacjach pojawiły się sprzeczne informacje dotyczące funkcjonowania AID, m. in. jej zdolności do deaminacji wolnego nukleozydu, czy ulegania inhibicji w obecności tetrahydrourydyny.

W zgłoszeniu patentowym nr US 2012/0 151 613 A1 (opublikowanym 2012 06 14) opisano funkcjonalne mutanty ludzkiej AID, które posiadają co najmniej dziesięciokrotnie zwiększoną aktywność enzymatyczną w porównaniu z białkiem typu dzikiego. Mutanty te otrzymano w systemie bakteryjnym i eukariotycznym.

W zgłoszeniu patentowym nr JP 2004 033 137 A (opublikowanym 2004 02 05) opisano hodowlę komórek ssaczych, w których zachodzi produkcja ludzkiej AID jako etap metody mającej na celu badanie związków o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym. Nie opisano jak dotąd podejścia pozwalającego na wydajną i ekonomiczną produkcję ludzkiej AID, podejścia, które można by zastosować do otrzymywania tego enzymu w dużej skali przemysłowej.

Pomimo trwających badań, jak dotąd nie opracowano i nie opatentowano także wydajnej metody otrzymywania preparatu wykazującego aktywność ludzkiej AID w systemie bakteryjnym.

Celem wynalazku było doprowadzenie do uzyskania zmodyfikowanego genu ludzkiej AID, umożliwiającego produkcję aktywnego enzymu w systemie bakteryjnym. Unikalnym elementem proponowanego rozwiązania jest zmodyfikowany gen ludzkiej AID. Jego otrzymanie polegało na: (i) wykorzystaniu całej sekwencji cDNA kodującej ludzką AID z wyjątkiem elementów nie ulegających translacji 5' i 3', (ii) jednoczesnym zastosowaniu sekwencji kodujących dwa znaczniki: GST i heksahistydynowy; (iii) jednoczesnym wykorzystaniu sekwencji kodujących dwa motywy rozpoznawane przez proteazy: trombinę i enterokinazę, (iv) złożeniu sekwencji kodujących poszczególne elementy białka fuzyjnego w następującej kolejności (od końca 5' do 3'): znacznik GST, motyw rozpoznawany przez

PL 225 333 B1 trombinę, znacznik heksahistydynowy, motyw rozpoznawany przez enterokinazę, AID. Opracowano także sposób otrzymywania w systemie bakteryjnym preparatu wykazującego wysoką aktywność AID.

Nieoczekiwanie okazało się, że tak zmodyfikowany gen umieszczony w wektorze ekspresyjnym umożliwia wydajną produkcję AID w systemie bakteryjnym. Ponadto, proces produkcji białka cechuje unikalny skład pożywki do hodowli bakteryjnej i zoptymalizowane warunki temperaturowe prowadzenia hodowli bakteryjnej. Bez zastosowania tych czynników enzym nie powstaje w sposób wydajny lub jest nieaktywny. Jednocześnie wykluczono, by obserwowana aktywność pochodziła od deaminazy bakteryjnej.

Proponowane rozwiązanie otwiera drogę do szczegółowego zbadania struktury i aktywności biochemicznych AID. Umożliwi także opracowanie specyficznych inhibitorów AID, które znajdą zastosowanie w terapii schorzeń związanych z podwyższonym poziomem ekspresji AID, m. in. niektórych nowotworów i infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C czy wirusem Eppsteina-Barr [16, 17, 27]. Ze względu na swoją wysoką wydajność, proponowana metoda może znaleźć zastosowanie w produkcji AID do celów komercyjnych.

Przedmiotem wynalazku jest preparat wykazujący aktywność ludzkiej deaminazy cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (AID) zawierający białko powstałe w wyniku ekspresji zmodyfikowanego genu ludzkiej AID w komórkach bakteryjnych, przy czym zmodyfikowany gen obejmuje:

(i) całą sekwencję cDNA kodującą ludzką AID wraz z kodonami STOP, z wyjątkiem elementów nieulegających translacji 5' i 3', obejmującą pozycje 80-679 w sekwencji oznaczonej SEQ. ID nr 1;

(ii) jednocześnie sekwencje kodujące dwa znaczniki; GST i heksahistydynowy;

(iii) jednocześnie sekwencje kodujące dwa motywy rozpoznawane przez proteazy; trombinę i enterokinazę;

(iv) sekwencje kodujące poszczególne elementy białka fuzyjnego w następującej kolejności (od końca 5' do 3'): znacznik GST, motyw rozpoznawany przez trombinę, znacznik heksahistydynowy, motyw rozpoznawany przez enterokinazę, AID, stanowiące sekwencję oznaczoną SEQ. ID nr 3 lub sekwencje wykazujące co najmniej 85% podobieństwa sekwencji aminokwasowej wobec SEQ. ID 4;

przy czym hodowlę komórek bakteryjnych, w których ekspresjonowany jest zmodyfikowany gen AID, prowadzi się w pożywce zawierającej źródło jonów cynku oraz hodowlę prowadzi się w temperaturze zawartej pomiędzy 15 a 30°C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu wykazującego aktywność ludzkiej deaminazy cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (AID) w systemie bakteryjnym, w którym wykorzystuje się zmodyfikowany gen ludzkiej AID, przy czym:

(i) wykorzystuje się całą sekwencję cDNA kodującą ludzką AID wraz z kodonami STOP, z wyjątkiem elementów nieulegających translacji 5' i 3', obejmującą pozycje 80-679 w sekwencji oznaczonej SEQ. ID nr 1;

(ii) stosuje się jednocześnie sekwencje kodujące dwa znaczniki: GST i heksahistydynowy;

(iii) stosuje się jednocześnie sekwencje kodujące dwa motywy rozpoznawane przez proteazy; trombinę i enterokinazę;

(iv) składa się sekwencje kodujące poszczególne elementy białka fuzyjnego w następującej k olejności (od końca 5' do 3'): znacznik GST, motyw rozpoznawany przez trombinę, znacznik heksa histydynowy, motyw rozpoznawany przez enterokinazę, AID, stanowiące sekwencję oznaczoną SEQ. ID nr 3 lub sekwencje wykazujące co najmniej 85% podobieństwa sekwencji aminokwasowej wobec SEQ. ID 4;

przy czym hodowlę komórek bakteryjnych, w których ekspresjonowany jest zmodyfikowany gen AID prowadzi się w pożywce zawierającej źródło jonów cynku oraz hodowlę prowadzi się w temperaturze zawartej pomiędzy 15 a 30°C.

W korzystnej realizacji, źródło jonów cynku stanowi chlorek cynku o stężeniu zawartym w przedziale od 0,01 do 2 mM, korzystnie 0,06 mM.

W korzystnej realizacji, hodowlę prowadzi się w temperaturze 18°C.

Dla lepszego zilustrowania omawianych zagadnień, opracowane rozwiązania zostały przedstawione na rysunku, gdzie:

figura 1 oraz sekwencja oznaczona jako SEQ. ID nr 1 przedstawia sekwencję cDNA ludzkiej AID, zdeponowaną w bazie GenBank pod numerem NM_020661.2. W obrębie cDNA rejon kodujący białko obejmuje pozycje 80-673 (sekwencja aminokwasowa uwidoczniona pod sekwencją nukleotydową i przedstawiona jako SEQ. ID nr 2), po czym następują dwa kodony STOP. W niniejszym rozPL 225 333 B1 wiązaniu wykorzystano całą sekwencję cDNA kodującą ludzką AID wraz z kodonami STOP (pozycje

80-679), z pominięciem elementów nieulegających translacji 5' i 3';

figura 2 przedstawia (A) schemat konstruktu do ekspresji ludzkiej AID w systemie bakteryjnym, Konstrukt zawiera sekwencje kodujące: (i) znacznik GST, (ii) motyw rozpoznawany przez trombinę, (iii) znacznik heksahistydynowy, (iv) motyw rozpoznawany przez enterokinazę, (v) ludzką AID; (B) sekwencję nukleotydową i aminokwasową GST-AID. Sekwencja kodująca GST obejmuje pozycje 1-660, sekwencja kodująca AID obejmuje pozycje 712-1305. Sekwencje kodujące miejsce rozpoznawane przez trombinę (TR), znacznik heksahistydynowy (H) oraz miejsce rozpoznawane przez enterokinazę (EK) oznaczono czarnymi ramkami. Miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne BamHI i EcoRI, które zostały użyte podczas klonowania, zaznaczono szarymi prostokątami, ponadto sekwencję przedstawiono jako sekwencję SEQ ID NR 3oraz SEQ lD Nr 4;

figura 3 przedstawia analizę metodą elektroforezy w denaturującym żelu poliakrylamidowym frakcji uzyskanych w wyniku oczyszczania białka GST-AID metodą chromatografii powinowactwa do glutationu. M - wzorzec mas, L - ekstrakt białek rozpuszczalnych, NZ - frakcja białek nie związanych ze złożem, P - frakcja białek wymywanych ze złoża podczas przemycia buforem nie zawierającym glutationu, E1-E5 - frakcje białek wymywanych ze złoża podczas kolejnych etapów elucji buforem zawierającym glutation, T- frakcja po wymianie buforu na 50 mM TrisHCl zawierający 3% glicerol. Frakcje E1 oraz T zostały użyte podczas testów aktywności deaminazowej. Na figurze zaznaczono lokalizację białka GST-AID o przewidywanej masie około 50 kDa;

figura 4 przedstawia analizę metodą Western Blot białek zawartych we frakcjach uzyskanych w wyniku oczyszczania GST-AID metodą chromatografii powinowactwa do glutationu. M - wzorzec mas, L - ekstrakt białek rozpuszczalnych, NZ - frakcja białek niezwiązanych ze złożem, P1 do P3 frakcje białek wymywanych ze złoża podczas kolejnych etapów przemycia buforem niezawierającym glutationu, E1-E3 - frakcje białek wymywanych ze złoża podczas kolejnych etapów elucji buforem zawierającym glutation;

figura 5 przedstawia wynik analizy MALDI TOF białka o masie około 50 kDa eluowanego z fragmentu żelu poliakrylamidowego po analizie frakcji powstałej w wyniku elucji GST-AID ze złoża glutationowego (frakcji E1). Wykryte peptydy zaznaczono na wykresie zielonymi kropkami. U dołu, w sekwencji aminokwasowej GST-AID, wykryte peptydy zostały podkreślone;

figura 6 przedstawia schemat sposobu badania aktywności deaminazowej uzyskanego preparatu białkowego. W pierwszym etapie reakcji preparat białkowy inkubowano 30 minut w temperaturze 37°C z wyznakowaną radioaktywnie 80-nukleotydową cząsteczką ssDNA zawierającą jedną resztę cytydyny w pozycji 40. W drugim etapie dodawano 2 U glikozylazy uracylo-DNA (ang. uracil-DNA glycosylase, UDG) i inkubowano przez 30 min w temperaturze 37°C. W trzecim etapie preparat podd awano lizie alkalicznej poprzez inkubację 15 min, w temperaturze 80°C w obecności NaOH o stężeniu końcowym 0,2 M. Ostateczny produkt reakcji analizowano metodą elektroforezy w denaturującym żelu poliakrylamidowym. Oczekiwanym produktem reakcji jest 40-nukleotydowa cząsteczka ssDNA;

figura 7 przedstawia analizę metodą elektroforezy w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym produktów reakcji badania aktywności deaminazow'cj preparatów białkowych GST-AID w postaci frakcji po elucji (El) oraz frakcji po wymianie buforu (50 mM Tris-HCl, 3% glicerol). Skład mieszanin reakcyjnych w poszczególnych ścieżkach numerowanych od 3 do 6 oraz (K-) i (K+) opisuje tabela 2. (K-) - kontrola negatywna, (K+) - kontrola pozytywna. Na żelu widoczna jest 80-nukleotydowa cząsteczka substratowa oraz 40-nukleotydowy produkt reakcji;

figura 8 przedstawia (A) analizę produktów reakcji na każdym z trzech etapów badania aktywności (etapy reakcji zaznaczono cyframi od 1 do 3). Analizę przeprowadzono dla reakcji kontrolnych oraz reakcji z preparatem białkowym pochodzącym z frakcji E1 oraz (B) test aktywności frakcji E1 wobec cząsteczki substratowej nie zawierającej reszty cytydyny. Analizę przeprowadzono po każdym z trzech etapów reakcji;

figura 9 przedstawia analizę metodą elektroforezy w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym mieszaniny reakcyjnej, w której badano aktywność deaminazową preparatu białkowego GSTAID-N51A w postaci frakcji po elucji (E1 ). Skład mieszanin reakcyjnych w poszczególnych ścieżkach numerowanych od 3 do 6 oraz kontroli negatywnej (K-) i kontroli pozytywnej (K+) opisuje tabela 2. Na żelu widoczna jest 80-nukleotydowa cząsteczka substratowa. Brak 40-nukleotydowego produktu reakcji świadczy o braku aktywności deaminazowej preparatu zawierającego GST-AID-N51 A.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązanie.

PL 225 333 B1

P r z y k ł a d 1

W celu otrzymania konstruktu ekspresyjnego do produkcji ludzkiej AID w systemie bakteryjnym, posłużono się klonem cDNA ludzkiej AID w wektorze pOTB7 (Genecopoeia). Klon poddano sekwencjonowaniu z wykorzystaniem zestawu odczynników BigDye Terminator v1.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems), zgodnie z instrukcją producenta. Odczyt sekwencji przeprowadzono przy użyciu sekwenatora ABI-PRISM. Otrzymaną sekwencję porównano z sekwencjami ludzkiej AID, zdeponowanymi w internetowej bazie danych GenBank. W rezultacie potwierdzono zgodność sekwencji klonu w wektorze pOTB7 (pOTB7-AlD) z sekwencją zdeponowaną w bazie GenBank pod numerem NM_020661. Stwierdzono, że jest to gen typu dzikiego, nieobciążony mutacjami charakterystycznymi dla zespołu chorobowego HIGM2. Wektor pOTB7-AID posłużył następnie jako cząsteczka matrycowa w reakcji PCR, przeprowadzonej w celu namnożenia sekwencji kodującej ludzką AID.

Na podstawie danych literaturowych można było sądzić, że AID jest białkiem trudnym do produkcji i oczyszczenia. Aby zapewnić łatwiejszy przebieg tych procesów, do otrzymania AID postan owiono wykorzystać wektor ekspresyjny pGEX-4T-1 (GE Healthcare), zawierający sekwencję kodującą GST (fig. 2A). Połączenie AID z GST powinno wyraźnie zwiększyć rozpuszczalność produkowanego białka i ułatwić jego oczyszczanie. Miejsce klonowania w tym plazmidzie znajduje się poniżej sekwe ncji kodującej GST i krótkiego łącznika, kodującego sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez trombinę. Wprowadzenie insertu w tej samej ramce odczytu umożliwia produkcję białka fuzyjnego, a następnie oczyszczenie go metodą chromatografii powinowactwa na złożu zawierającym glutation. Dodatkowo w obrębie insertu wprowadzono sekwencję kodującą znacznik heksahistydynowy oraz sekwencję kodującą motyw rozpoznawany przez enterokinazę.

Opisana strategia umożliwia produkcję białka zaopatrzonego w znacznik GST i znacznik heksahistydynowy, a co za tym idzie, również zastosowanie dwóch niezależnych metod oczyszczania: chromatografii powinowactwa do glutationu i do jonów niklu. Ponadto, miejsca rozpoznawane przez trombinę i enterokinazę pozwalają na odcięcie obu znaczników i otrzymanie natywnego białka.

Unikalną cechą proponowanego rozwiązania jest uzyskanie zmodyfikowanego genu ludzkiej AID polegające na: (i) wykorzystaniu całej sekwencji cDNA kodującej ludzką AID z wyjątkiem elementów nieulegających translacji 5' i 3', (ii) jednoczesnym zastosowaniu dwóch znaczników; GST i heks ahistydynowego; (iii) złożeniu sekwencji kodujących poszczególne elementy białka fuzyjnego w następującej kolejności (od końca 5' do 3'): GST, motyw rozpoznawany przez trombinę, znacznik heksahistydynowy, motyw rozpoznawany przez enterokinazę, AID (fig. 2B).

W celu uzyskania insertu kodującego AID zaopatrzoną w sekwencję kodującą znacznik heksahistydynowy i sekwencję kodującą motyw rozpoznawany przez enterokinazę, przeprowadzono reakcję PCR, z wykorzystaniem starterów: F_03_aid, F_04_aid, R_03_aid i wektora pOTB7-AlD jako matrycy. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 1. Ze względu na znaczną długość dodatkowych sekwencji dołączanych do sekwencji kodującej AID, PCR przeprowadzono w dwóch etapach. W pierwszym posłużono się starterem F_03_aid, homologicznym do końca 5' namnażanego fragmentu genu, który wprowadzał sekwencję kodującą motyw rozpoznawany przez enterokinazę oraz start erem R_03_aid, komplementarnym do końca 3' namnażanego fragmentu genu. Starter R_03_aid wprowadzał miejsce rozpoznawane przez endonukleazę EcoRl.

T a b e l a 1

Sekwencje zastosowanych starterów

Nazwa	Sekwencja 5'-3'
F_03_aid	GACGACGACGACAAGATGGACAGCCTCTTGATGAAC
F_04_aid	ATGGATCCCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGATGGA
R_03_aid	ATGAATTCCTATCAAAGTCCCAAAGTACGA
mutAID_F	CTTTGGTTATCTTCGCGCTAAGAACGGCTGCC
mutAID_R	GAAACCAATAGAAGCGCGATTCTTGCCGACGG

Produkt PCR rozcieńczono stukrotnie i wykorzystano do drugiego etapu. Posłużono się w nim starterem F_04_aid, który wprowadzał sekwencję kodującą znacznik heksahistydynowy oraz miejsce rozpoznawane przez endonukleazę BamHI. Jako drugiego startera użyto ponownie R_03_aid. Obie reakcje PCR przeprowadzono w objętości 50 pI za pomocą 2 U polimerazy DNA Pfu o wysokiej doPL 225 333 B1 kładności kopiowania (Promega), w obecności 1 x stężonego buforu do PCR (Promega), mieszaniny czterech trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) o stężeniu 0,2 mM, m atrycy pOTB7-AID w ilości 10 ng na reakcję oraz wymienionych wyżej starterów w ilości 10 pikomoli na reakcję. Reakcje PCR przeprowadzono stosując następujący program: etap pierwszy - inkubacja w temperaturze 95°C przez 2 minuty; etap drugi - trzydzieści cykli obejmujących kolejno: inkubację w temperaturze 95°C przez 1 minutę, inkubację w temperaturze 57°C przez 30 sekund, inkubację w temperaturze 72°C przez 2 minuty; etap trzeci - inkubacja w temperaturze 72°C przez 7 minut, zakończona schłodzeniem mieszaniny reakcyjnej do temperatury 4°C. Produkty reakcji PCR analizowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym w warunkach natywnych i poddano dalszej obróbce, polegającej na cięciu restrykcyjnym enzymami BamUl i EcoRI. Tymi samymi enzymami trawiono plazmid pGEX-4T-1. Uzyskane substraty reakcji ligacji analizowano metodą elektroforezy w żelu agar ozowym w warunkach natywnych. W kolejnym etapie przygotowane plazmidy i inserty poddano ligacji z użyciem 1 U ligazy DNA T4 (Fermentas). Reakcję przeprowadzono w objętości 10 pl, w obecności 1 x stężonego buforu do ligacji (Fermentas), 100 ng wektora i 50 ng insertu przez 16 godz. w temperaturze 4°C. Produktami ligacji transformowano komórki kompetentne E. coli DH5a. Transformowane bakterie hodowano na szalkach ze stałą pożywką LB (ang. Luria Broth; 2 g peptonu; 1,25 g wyciągu drożdżowego; 1,25 g chlorku sodu; 3,75 g agaru na 250 ml pożywki), zawierającą ampicylinę o stężeniu 200 pg/ml. Uzyskane pojedyncze kolonie wykorzystano do przygotowania płynnych kultur w pożywce LB zawierającej ampicylinę, z których izolowano plazmidy metodą lizy alkalicznej. Prawidłowość procesu klonowania potwierdzono, tnąc wyizolowane plazmidy enzymami BamHI i EcoRl oraz analizując uzyskane produkty metodą elektroforezy w żelu agarozowym w warunkach natywnych. W wyniku cięcia plazmidów, wyzwalany był dsDNA o długości ok. 630 par zasad. Plazmidy wyzwalające oczekiwane fragmenty sekwencjonowano z wykorzystaniem zestawu odczynników BigDye Terminator v1.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems), zgodnie z instrukcją producenta. Odczyt sekwencji przeprowadzono przy użyciu sekwenatora ABI- PRISM. Na tej podstawie dokonano wyboru wektora pGEX-4T-1-AID (fig. 2B), zawierającego poprawny konstrukt kodujący AID, zaopatrzoną w znacznik GST i znacznik heksahistydynowy oraz motywy rozpoznawane przez proteazy.

Otrzymany wektor ekspresyjny pGEX-4T-1-AID wprowadzono do komórek kompetentnych E. coli BL21 (DE3)pLysS (Novagen) na drodze transformacji metodą szoku cieplnego. Zawiesinę ogrzano 30 s w temperaturze 42°C. Do transformowanych komórek dodano pożywkę LB i inkubowano 45 min w temperaturze 37°C, wytrząsając z prędkością 250 rpm. Mieszaninę wylano i rozprowadzono na szalkach ze stałą pożywką LB zawierającą ampicylinę, a następnie szalki inkubowano 16 h w temperaturze 37°C. Spośród otrzymanych na szalce kolonii bakteryjnych, wybrano jedną i sporządzono płynną hodowlę w celu przeprowadzenia ekspresji AID. Kolonię przeniesiono do 20 ml płynnej pożywki LB zawierającej ampicylinę (200 ng/ml) i chloramfenikol (34 pg/ml), hodowlę wytrząsano 16 godz. w temperaturze 37°C z prędkością 300 rpm i wykorzystano do zaszczepienia 1000 ml świeżej pożywki LB z chlorkiem cynku (0,06 mM), ampicyliną (200 ng/ml) i chloramfenikolem (34 ng/ml). Hodowlę bakterii przeprowadzono w tych samych warunkach do chwili osiągnięcia przez nią gęstości optycznej OD₆₀₀ = 0,6-0,8. Wówczas zachodzą najbardziej intensywne podziały komórek (faza wzrostu logarytmicznego), jest to zatem najkorzystniejszy moment by indukować ekspresję heterologicznego genu. Temperaturę hodowli obniżono do 18°C i indukowano ekspresję AID dodając do pożywki izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do stężenia końcowego 0,5 mM.

Ekspresję prowadzono przez kolejne 16 godzin. Unikalną cechą proponowanego rozwiązania jest prowadzenie hodowli: (i) w obecności 0,06 mM chlorku cynku; (ii) w temperaturze 18°C. Zawiesinę bakterii wirowano 15 min z prędkością 4000 rpm w temperaturze 4°C. Supernatant dekantowano, a osad zawieszono w buforze PBS (o składzie podanym poniżej) do ekstrakcji białek rozpuszczalnych oraz oczyszczania produkowanego białka metodą chromatografii powinowactwa do glutationu. W celu ekstrakcji białek rozpuszczalnych, osad z jednego litra hodowli bakteryjnej zawieszono w 50 ml buforu PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3) zawierającego 50 U benzonazy (Novagen), koktajl Inhibitorów proteaz (Roche Diagnostics), ditiotreitol (DTT) w stężeniu końcowym 1 mM, oraz Triton X-100 w stężeniu końcowym 1%. Dodatek inhibitorów proteaz zapobiega degradacji białek, natomiast benzonaza trawi kwasy nukleinowe. Zastosowanie słabego detergentu, jakim jest Triton X-100, wspomaga uwalnianie białek z błon cytoplazmatycznych, natomiast zdolności redukcyjne DTT są wykorzystywane w celu uniemożliwienia tworzenia międzycząsteczkowych mostków disiarczkowych pomiędzy resztami cystein w białkach. Zawiesinę inkubowano w temperaturze 4°C przez 30 minut, a następnie wirowano z prędkością 12000 rpm w temperaturze 4°C przez 15 mi8

PL 225 333 B1 nut, w celu oddzielenia frakcji białek rozpuszczalnych od nierozpuszczalnych. Białko GST-AID obecne było w supernatancie, co potwierdziły analizy w denaturującym żelu poliakrylamidowym. Supematant zawierający frakcję białek rozpuszczalnych wykorzystano następnie do wstępnego oczyszczenia produkowanego białka GST-AID na złożu glutationouym; Glutatione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare).

Podczas oczyszczania białka zastosowano procedurę zgodną z instrukcją producenta. 1 ml złoża przemyto 30 ml buforu PBS, a następnie wiązano z powstałym po wirowaniu ekstraktem białk owym, poprzez 30 minutowe wytrząsanie w temperaturze pokojowej. Całość nakładano na kolumnę chromatograficzną zbierając frakcję białek niezwiązanych ze złożem. Następnie, przemyto złoże 30 ml buforu PBS, w celu odmycia reszty białek niezwiązanych. Frakcję białek związanych ze złożem eluowano przemywając kolumnę pięciokrotnie 2 ml buforu 50 mM TrisHCl, pH 8,0 zawierającego zredukowany glutation o stężeniu końcowym 10 mM. Frakcje po elucji były łączone i zagęszczane, a n astępnie w celu usunięcia glutationu wymieniono w nich bufor na 50 mM TrisHCl z dodatkiem 3% glicerolu. Procedurę zagęszczania frakcji i wymiany buforu przeprowadzono przy użyciu filtrów Amicon Ultra firmy MILLIPORE (15 ml; 10000 MWC), wirując z prędkością 5000 rpm, w temperaturze 4°C. Poszczególne frakcje białkowe analizowano metodą elektroforezy w denaturującym żelu poliakrylam idowym (fig. 3). Opisana procedura oczyszczania GST-AID pozwoliła na pozbycie się znacznej części białek bakteryjnych.

Obecność GST-AID w tak oczyszczanym preparacie została potwierdzona metodą MALDI TOF (fig. 5.) oraz Western Blot (fig. 4). MALDI TOF jest techniką spektrometrii mas, powszechnie stosowaną w badaniach proteomicznych do identyfikacji białek. W celu przeprowadzenia analizy MALDI TOF, z żelu poliakrylamidowego, w którym analizowano frakcje po oczyszczeniu na złożu glutationowym wycięto fragment zawierający białko o masie około 50 kDa. Z wyciętego fragmentu żelu eluowano białka i poddano je analizie. Analiza potwierdziła, że uzyskana frakcja zawiera pełnej długości GST AID. W metodzie Western Blot wykorzystano komercyjnie dostępne I-rzędowe królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko AID (Sigma, numer katalogowy SAB2900301). Detekcję przeprowadzono metodą kolorymetryczną - przeciwciała Il-rzędowe (kozie, poliklonalne przeciwciała przeciwko króliczym IgG) były sprzężone z fosfatazą alkaliczną.

Zarówno metoda MALDI TOF, jak i Western Blot pozwoliła potwierdzić, że produkowanym białkiem jest białko fuzyjne GST-AID o przewidywanej masie około 50 kDa. Wstępnie oczyszczony preparat białkowy, w postaci frakcji po elucji i wymianie buforu, został uż yty podczas charakterystyki aktywności enzymatycznej GST-AID.

AID katalizuje reakcję deaminacji cytydyny do urydyny w jednoniciowej cząsteczce DNA. W celu wykazania, że produkowane białko wykazuje tę aktywność zastosowano metodę opublikowaną w 2002 roku przez Petersen-Malirt i współautorów [28].

Aktywność deaminazową produkowanego białka testowano w trzyetapowej reakcji (fig. 6). Jako substratu do reakcji użyto 80-nukleotydowej jednoniciowej cząsteczki DNA, która zawiera tylko jedną resztę cytydyny w pozycji 40. Cząsteczka ta została wyznakowana radioizotopowo na końcu 5' za pomocą ATP w reakcji katalizowanej przez kinazę polinukleotydową T4 (Fermentas), zgodnie z instrukcją producenta.

W pierwszym etapie cząsteczkę DNA inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z preparatem białkowym pochodzącym z pierwszego etapu elucji GST-AID ze złoża glutationowego lub z preparatem białkowym po wymianie buforu. W pierwszym etapie reakcji, w przypadku obecności aktywnej deaminazy cytydyny w mieszaninie reakcyjnej dochodzić powinno do deaminacji cytydyny do urydyny.

W drugim etapie, do reakcji dodawano 2 U glikozylazy uracylo-DNA (ang. uracil DNA glycosylase, UDG, Fermentas) i inkubowano dalsze 30 minut w temperaturze 37°C. Enzym ten usuwa uracyl, pozostawiając miejsce apirymidynowe.

W trzecim etapie reakcji przeprowadzono lizę alkaliczną, poprzez dodanie NaOH do stężenia końcowego 0,2 M i inkubację mieszaniny reakcyjnej przez 15 minut w temperaturze 80°C. Liza alk aliczna umożliwia przerwanie nici DNA w miejscu pirymidynowym. Produkty końcowe trzyetapowej reakcji analizowano metodą elektroforezy w denaturującym żelu poliakrylamidowym. W przypadku obecności aktywności deaminazowej spodziewano się zaobserwować produkt o długości 40 nukleot ydów. Równocześnie przeprowadzono dwie reakcje kontrolne; pozytywną reakcję kontrolną (K+), bez ekstraktu białkowego, ale z wykorzystaniem cząsteczki substratowej posiadającej U zamiast C w poPL 225 333 B1 zycji 40 oraz negatywną reakcją kontrolną (K-), bez ekstraktu białkowego z wykorzystaniem standardowej cząsteczki substratowej zawierającej C w pozycji 40.

Podczas badania aktywności GST-AID testowano cztery różne warunki przebiegu reakcji. Dane literaturowe sugerują, że związany z białkiem bakteryjny RNA może hamować aktywność deaminazową produkowanego białka. Dlatego podczas badania aktywności GST-AID testowano wpływ RNazy na przebieg reakcji.

Wiadomo również, że białko AID ma w swej cząsteczce skoordynowany jon cynku, dlatego t estowano przebieg reakcji w obecności chlorku cynku. Szczegółowy skład poszczególnych mieszanin reakcyjnych zawiera tabela 2. Przeprowadzone testy aktywności GST-AID wykazały wysoką aktywność deaminazową otrzymanego preparatu. Dodanie RNazy lub cynku nie miało wpływu na wynik reakcji. Wyniki analizy produktów przeprowadzonych reakcji w denaturującym żelu poliakrylamidowym przedstawiono na figurze 7.

T a b e l a 2

Szczegółowy skład poszczególnych mieszanin reakcyjnych

	Numer próby i skład mieszaniny reakcyjnej
	(K-)	(K+)	3	4	5	6
ZnCl2	80 pm (0,8 pl)	80 pm (0,8 pl)	-	-	80 pm (0,8 pl)	80 pm (0,8 pl)
RNaza A	1 pg (0,2 pl)	1 pg (0,2 pl)	-	1 pg (0,2 pl)	-	1 pg (0,2 pl)
Cząsteczka substratowa C	1 pmol	-	1 pmol	1 pmol	1 pmol	1 pmol
Cząsteczka substratowa U	-	1 pmol	-	-	-	-
Bufor	do 10 pl	do 10 pl	do 10 pl	do 10 pl	do 10 pl	do 10 pl
AID (frakcja E1 lub T)	-	-	8 pl	8 pl	8 pl	8 pl

W celu potwierdzenia, że obserwowana aktywność jest aktywnością deaminazową, przeprowadzono szereg dodatkowych testów kontrolnych. Testowano aktywność preparatu białkowego wobec cząsteczki substratowej niezawierającej cytydyny - wykorzystana cząsteczka zawierała tymidynę w pozycji 40 nukleotydu. Test ten wykazał brak wpływu AID na cząsteczki DNA nie zawierające cytydyny (fig. 8B). Świadczy to o specyficzności reakcji i dowodzi, że obserwowana aktywność jest aktywnością deaminazy cytydyny.

Testowano również produkty reakcji po poszczególnych etapach, w celu sprawdzenia, po którym etapie pojawia się produkt końcowy o długości 40 nukleotydów. W przypadku zanieczyszczenia badanego preparatu nukleazami, można by się spodziewać obecności krótszych fragmentów DNA już po pierwszym etapie reakcji.

Analiza wykazała obecność jedynie 80-nu-kleotydowej cząsteczki substratowej po pierwszym etapie reakcji, co dodatkowo dowodzi, że obserwowana aktywność nie jest aktywnością nukleazową. Pojawienie się niewielkiej ilości 40-nukleotydowego produktu reakcji po drugim etapie można tłumaczyć podatnością miejsca apirymidynowego na rozerwanie nici DNA (fig. 8A).

Uzyskany preparat białkowy nie jest homogenny. Dlatego, aby wykluczyć, że obserwowana aktywność pochodzi od białka bakteryjnego, przygotowano w identyczny sposób preparat, w którym zamiast GST-AID było obecne zmutowane białko, pozbawione aktywności deaminazowej. Aby otrzymać konstrukt kodujący takie nieaktywne białko posłużono się metodą ukierunkowanej mutagenczy, za pomocą której wprowadzono mutację nie synonimiczną do otrzymanego wcześniej konstruktu pGEX-4T-1-AlD.

Wcześniejsze badania wykazały, że zamiana asparaginy (N) na alaninę (A) w pozycji 51 sekwencji aminokwasowej AID prowadzi do całkowitej utraty aktywności deaminazowej tego białka [26]. W celu wprowadzenia powyższej mutacji przeprowadzono reakcję PCR na matrycy pGEX-4T-1-AID, z wykorzystaniem starterów mutAID_F i mutAID_R (tabela 1).

PL 225 333 B1

Oba startery zaprojektowano w ten sposób, aby wprowadzały mutację do sekwencji nukleotydowej. Reakcja PCR służyła amplifikacji całego plazmidu pGEX-4T-1-AID, z jednoczesnym wprowadzeniem pożądanej zmiany w sekwencji nukleotydowej przez zastosowane startery. Reakcję PCR przeprowadzono w dwóch mieszaninach reakcyjnych o objętości 50 pl każda, za pomocą 2 U polimerazy DNA Pfu o wysokiej dokładności kopiowania (Promega), w obecności 1 x stężonego buforu do PCR (Promega), mieszaniny czterech trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) o stężeniu 0,2 mM, matrycy pGEX-4T-1-AlD w ilości 500 ng na reakcję oraz wymienionych wyżej starterów w ilości 50 pikomoli na reakcję. Pierwsze dziesięć cykli reakcji przebiegało dla każdego ze starterów z osobna (w każdej mieszaninie reakcyjnej obecny był tylko jeden z pary starterów). Po dziesiątym cyklu wymieszano obie reakcje, podzielono ponownie na dwie probówki i kontynuowano amplifikację przez następnych dwadzieścia cykli.

Reakcje PCR przeprowadzono stosując następujący program: etap pierwszy - inkubacja w temperaturze 95°C przez 2 minuty; etap drugi - dziesięć lub dwadzieścia cykli obejmujących kolejno: inkubację w temperaturze 95°C przez 1 minutę, inkubację w temperaturze 60°C przez 30 sekund, inkubację w temperaturze 72°C przez 11 minut; etap trzeci - inkubacja w temperaturze 72°C przez 15 minut, zakończona schłodzeniem mieszaniny reakcyjnej do temperatury 4°C.

Produkty reakcji PCR analizowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym w warunkach natywnych i poddano dalszej obróbce, polegającej na cięciu enzymem restrykcyjnym Dpnl. Enzym ten umożliwia selektywne trawienie metylowanej matrycy użytej podczas reakcji PCR. Produktem trawienia restrykcyjnego transformowano komórki kompetentne E. coli TOP 10 (Invitrogen).

Transformowane bakterie hodowano na szalkach ze stałą pożywką LB, zawierającą ampicylinę o stężeniu 200 pg/ml. Uzyskane pojedyncze kolonie wykorzystano do przygotowania płynnych kultur w pożywce LB zawierającej ampicylinę, z których izolowano plazmidy metodą lizy alkalicznej. Wyizolowane plazmidy analizowano poprzez sekwencjonowanie z wykorzystaniem zestawu odczynników BigDye Terminator v1.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems), zgodnie z instrukcją producenta. Odczyt sekwencji przeprowadzono przy użyciu sekwenatora ABI-PRISM. Na tej podstawie dokonano wyboru plazmidu, zawierającego wprowadzaną mutację.

Otrzymany wektor ekspresyjny pGEX-4T-1-AID-N51 A wprowadzono do komórek kompetentnych E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagcn) na drodze transformacji metodą szoku cieplnego.

Dalsze etapy przygotowania ekstraktów białkowych zmutowanego białka przebiegały tak jak w przypadku GST-AID typu dzikiego. Testy aktywności preparatu białkowego GST-AID- N51A wykazały brak jakiejkolwiek aktywności deaminazowej (fig. 9). W ten sposób wykluczono, by obserwowana wcześniej aktywność preparatu zawierającego GST-AID typu dzikiego pochodziła od deaminazy bakteryjnej.

Proponowane rozwiązanie, obejmujące: (i) unikalną modyfikację genu ludzkiej AID, umożliwiającą produkcję preparatu wykazującego aktywność ludzkiej AID w systemie bakteryjnym oraz (ii) sposób otrzymywania preparatu wykazującego aktywność AID w systemie bakteryjnym, może znaleźć szereg zastosowań praktycznych. Podejście to umożliwia uzyskanie dużych ilości preparatu o aktywności ludzkiej AID stosunkowo tanim kosztem. Jest to zatem rozwiązanie wysoce korzystne w przypadku wielkoskalowej produkcji AID do zastosowań komercyjnych (obecnie preparat o takiej aktywności nie jest dostępny handlowo).

Biorąc pod uwagę rolę AID, taki preparat znajdzie szerokie grono nabywców wśród naukowców na świecie. Jego dostępność umożliwi lepsze poznanie właściwości biochemicznych i struktury przestrzennej AID, a także projektowanie oraz otrzymywanie cząsteczek modulujących (hamujących bądź stymulujących) jej aktywność, w tym również związków czynnych farmakologicznie.

PL 225 333 B1

Lista sekwencji

SEQ. ID nr 1

NM_020661.2_nt

AGAGAACCATCATTAATTGAAGTGAGATTTTTCTGGCCTGAGACTTGCAGGGA

GGCAAGAAGACACTCTGGACACCACTATGGACAGCCTCTTGATGAACCGGAGG

AAGTTTCTTTACCAATTCAAAAATGTCCGCTGGGCTAAGGGTCGGCGTGAGAC

CTACCTGTGCTACGTAGTGAAGAGGCGTGACAGTGCTACATCCTTTTCACTGGA

CTTTGGTTATCTTCGCAATAAGAACGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCCTCCG

CTACATCTCGGACTGGGACCTAGACCCTGGCCGCTGCTACCGCGTCACCTGGTT

CACCTCCTGGAGCCCCTGCTACGACTGTGCCCGACATGTGGCCGACTTTCTGCG

AGGGAACCCCAACCTCAGTCTGAGGATCTTCACCGCGCGCCTCTACTTCTGTG

AGGACCGCAAGGCTGAGCCCGAGGGGCTGCGGCGGCTGCACCGCGCCGGGGT

GCAAATAGCCATCATGACCTTCAAAGATTATTTTTACTGCTGGAATACTTTTGT

AGAAAACCACGAAAGAACTTTCAAAGCCTGGGAAGGGCTGCATGAAAATTCA

GTTCGTCTCTCCAGACAGCTTCGGCGCATCCTTTTGCCCCTGTATGAGGTTGAT

GACTTACGAGACGCATTTCGTACTTTGGGACTTTGATAGCAACTTCCAGGAATG

TCACACACGATGAAATATCTCTGCTGAAGACAGTGGATAAAAAACAGTCCTTC

AAGTCTTCTCTGTTTTTATTCTTCAACTCTCACTTTCTTAGAGTTTACAGAAAAA

ATATTTATATACGACTCTTTAAAAAGATCTATGTCTTGAAAATAGAGAAGGAA

CACAGGTCTGGCCAGGGACGTGCTGCAATTGGTGCAGTTTTGAATGCAACATT

GTCCCCTACTGGGAATAACAGAACTGCAGGACCTGGGAGCATCCTAAAGTGTC

AACGTTTTTCTATGACTTTTAGGTAGGATGAGAGCAGAAGGTAGATCCTAAAA

AGCATGGTGAGAGGATCAAATGTTTTTATATCAACATCCTTTATTATTTGATTC

ATTTGAGTTAACAGTGGTGTTAGTGATAGATTTTTCTATTCTTTTCCCTTGACGT

TTACTTTCAAGTAACACAAACTCTTCCATCAGGCCATGATCTATAGGACCTCCT

AATGAGAGTATCTGGGTGATTGTGACCCCAAACCATCTCTCCAAAGCATTAAT

ATCCAATCATGCGCTGTATGTTTTAATCAGCAGAAGCATGTTTTTATGTTTGTA

CAAAAGAAGATTGTTATGGGTGGGGATGGAGGTATAGACCATGCATGGTCACC

TTCAAGCTACTTTAATAAAGGATCTTAAAATGGGCAGGAGGACTGTGAACAAG

ACACCCTAATAATGGGTTGATGTCTGAAGTAGCAAATCTTCTGGAAACGCAAA

CTCTTTTAAGGAAGTCCCTAATTTAGAAACACCCACAAACTTCACATATCATAA

TTAGCAAACAATTGGAAGGAAGTTGCTTGAATGTTGGGGAGAGGAAAATCTAT

TGGCTCTCGTGGGTCTCTTCATCTCAGAAATGCCAATCAGGTCAAGGTTTGCTA

CATTTTGTATGTGTGTGATGCTTCTCCCAAAGGTATATTAACTATATAAGAGAG

TTGTGACAAAACAGAATGATAAAGCTGCGAACCGTGGCACACGCTCATAGTTC

TAGCTGCTTGGGAGGTTGAGGAGGGAGGATGGCTTGAACACAGGTGTTCAAGG

CCAGCCTGGGCAACATAACAAGATCCTGTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAGAAAGAGAGAGGGCCGGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTT

GGGAGGCCGAGCCGGGCGGATCACCTGTGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTG

GCCAACATGGCAAAACCCCGTCTGTACTCAAAATGCAAAAATTAGCCAGGCGT

GGTAGCAGGCACCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCG

CTTGAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCAGTAAGCTGAGATCGTGCCGTTGCACTC

CAGCCTGGGCGACAAGAGCAAGACTCTGTCTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAGA

GAGAGAGAGAGAAAGAGAACAATATTTGGGAGAGAAGGATGGGGAAGCATT

GCAAGGAAATTGTGCTTTATCCAACAAAATGTAAGGAGCCAATAAGGGATCCC

TATTTGTCTCTTTTGGTGTCTATTTGTCCCTAACAACTGTCTTTGACAGTGAGAA

AAATATTCAGAATAACCATATCCCTGTGCCGTTATTACCTAGCAACCCTTGCAA

PL 225 333 B1

TGAAGATGAGCAGATCCACAGGAAAACTTGAATGCACAACTGTCTTATTTTAA TCTTATTGTACATAAGTTTGTAAAAGAGTTAAAAATTGTTACTTCATGTATTCA ΤΤΤΑΊ ATTTTATATTATTTTGCGTCTAATGATTTTn ATTAACATGATTTCCTTT Γ CTGATATATTGAAATGGAGTCTCAAAGCTTCATAAATTTATAACTTTAGAAATG ATTCTAATAACAACGTATGTAATTGTAACATTGCAGTAATGGTGCTACGAAGC _{CATTTCTCTTGATTTTTAGTAAACTTTTATGACAGCAAATTTGCTTCTGGCTCAC} TTTCAATCAGTTAAATAAATGATAAATAATTTTGGAAGCTGTGAAGATAAAAT ACCAAATAAAATAATATAAAAGTGATTTATATGAAGTTAAAATAAAAAATCAG TATGATGGAATAAACTTG

SEQ. ID nr 2

NM_020661.2_aa

MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVK_RRDSATSFSLDFGYLRNKN

GCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRI

FTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWE

GLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL**

SEQ. ID nr 3

GST-AID_nt

ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGA

CTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGA

TGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCA

ATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCA

TACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGT

GCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTC

GAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAA

GCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTT

AAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGT

TGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTT

TAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCA

AGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGAC

CATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCCACCATCATCATCATCAT

GACGACGACGACAAGATGGACAGCCTCTTGATGAACCGGAGGAAGTTTCTTTA

CCAATTCAAAAATGTCCGCTGGGCTAAGGGTCGGCGTGAGACCTACCTGTGCT

ACGTAGTGAAGAGGCGTGACAGTGCTACATCCTTTTCACTGGACTTTGGTTATC

TTCGCAATAAGAACGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCCTCCGCTACATCTCGG

ACTGGGACCTAGACCCTGGCCGCTGCTACCGCGTCACCTGGTTCACCTCCTGG

AGCCCCTGCTACGACTGTGCCCGACATGTGGCCGACTTTCTGCGAGGGAACCC

CAACCTCAGTCTGAGGATCTTCACCGCGCGCCTCTACTTCTGTGAGGACCGCA

AGGCTGAGCCCGAGGGGCTGCGGCGGCTGCACCGCGCCGGGGTGCAAATAGC

CATCATGACCTTCAAAGATTATTTTTACTGCTGGAATACTTTTGTAGAAAACCA

TGAAAGAACTTTCAAAGCCTGGGAAGGGCTGCATGAAAATTCAGTTCGTCTCT

CCAGACAGCTTCGGCGCATCCTTTTGCCCCTGTATGAGGTTGATGACTTACGAG

ACGCATTTCGTACTTTGGGACTTTGATAGGAATTC

PL 225 333 B1

SEQ. ID nr 4

GST-AID_aa

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNL

PYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAY

SKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYM

DPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDL

VPRGSHHHHHHDDDDKMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRR

DSATSFSLDFGYLRNKNGCHVEELFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCA

RHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYC

WNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGE**

SEQ. ID nr 5

F_03_aid

GACGACGACGACAAGATGGACAGCCTCTTGATGAAC

SEQ. ID nr 6

F_04_aid

ATGGATCCCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGATGGA

SEQ. ID nr 7

R_03_aid

ATGAATTCCTATCAAAGTCCCAAAGTACGA

SEQ. ID nr 8 mutAID_F

CTTTGGTTATCTTCGCGCTAAGAACGGCTGCC

SEQ. ID nr 9 mutAIDR

GAAACCAATAGAAGCGCGATTCTTGCCGACGG

Literatura

1. Delker, R. K., S. D. Fugmann and F. N. Papavasiliou, A coming-of-age story: activationinduced cytidine deaminase turns 10. Nat. Immunol, 2009. 10 (11); p. 1147-53.

2. Muramatsu, M., et al., Specific expression of activation-mduced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J. Biol. Chem., 1999. 274 (26): p. 18470-6.

3. Muramatsu, M., et al., Class switch recombination and hypermutation reguire activationinduced cytidine deaminase (AID), apotential RNA editing enzyme. Cell, 2000.102 (5): p. 553-63.

4. Revy, P., et al., Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell, 2000. 102 (5): p. 565-75.

5. Bestor, T. H., The DNA methyltransferases of mammals. Hum. Mol. Genet., 2000. 9 (16): p. 2395-402.

PL 225 333 B1

6. Gehring, M., W. Reik and S. Henikoff, DNA demethylation by DNA repair. Trends Genet., 2009. 25 (2): p. 82-90.

7. Teperek-Tkacz, M., et al., Epigenetic reprogramming: is deamination key to active DNA demethylation? Reproduction, 2011.142 (5): p. 621-32.

8. Fritz, E. L. and F. N. Papavasiliou, Cytidine deaminases: AIDing DNA demethylation? Genes Dev., 2010. 24 (19): p. 2107-14.

9. Conticello, S. G., The AID/APOBEC family of nucleic acid mutators. Genome Biol, 2008. 9 (6): p. 229.

10. Samaranayake, M., et al., Evaluation of molecular models for the affinity maturation of antibodies: roles of cytosine deamination by AID and DNA repair. Chem., Rev., 2006.106 (2): p. 700-19.

11. Honjo, T., K. Kinoshita and M. Muramatsu, Molecular mechanism of class switch recombination: linkage with somatic hypermutation. Annu. Rev. Immunol., 2002. 20: p. 165-96.

12. Honjo, T., et al., AID to overcome the limitations of genomie Information. Nat. Immunol., 2005. 6 (7): p. 655-61.

13. Barreto, V. M., A. R. Ramiro and M. C. Nussenzweig, Activation-induced deaminase: controversies and open questions. Trends Immunol., 2005. 26 (2): p. 90- 6.

14. de Yebenes, V. G. and A. R. Ramiro, Activation-induced deaminase: light and dark sides. Trends Mol. Med., 2006.12 (9): p. 432-9.

15. Bransteitter, R., et al., Actiration-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003. 100 (7): p. 4102-7.

16. Machida, K., et al., Hepatitis C virus (HCV)-induced immunoglobulin hypermutation reduces the affinity and neutralizing activities of antibodies against HCV envelopeprotein. J. Virol., 2008. 82 (13): p. 6711-20.

17. Marusawa, H., Aberrant AID expression and human cancer development. Int. J. Blochem. Cell Biol., 2008. 40 (8): p. 1399-402.

18. Dickerson, S. K., et al., AID mediates hypermutation by deaminating single stranded DNA. J. Exp. Med., 2003.197 (10): p. 1291-6.

19. Bhagwat, A. S., M. A. Carpenter and J. M. Bujnicki, Is AID a monomer in solution? DNA Repair (Amst), 2008. 7 (3): p. 349-50; author reply 351-2.

20. Brar, S. S., et al., Activation-induced deaminase, AID, is catalytically active as a monomer on single-strandedDNA. DNA Repair (Amst), 2008. 7 (1): p. 77-87.

21. Prochnow, C., et al., The APOBEC-2 crystal structure and functional implications for the deaminase AID. Nature, 2007. 445 (7126): p. 447-51.

22. Chelico, L., P. Pham and M. F. Goodman, Stochastic properties of processive cytidine DNA deaminases AID and APOBEC3G. Philos Trans R Soc Lond B Biol. Sci., 2009. 364 (1517); p. 583-93.

23. Coker, H. A. and S. K. Petersen-Mahrt, The nuclear DNA deaminase AID functions distributively whereas cytoplasmic APOBEC3G has a processive mode of action. DNA Repair (Amst), 2007. 6 (2): p. 235-43.

24. Papavasiliou, F. N. and D. G. Schatz, The activation-induced deaminase functions in a posteleavage step of the somatic hypermutation process. J. Exp. Med., 2002. 195 (9): p. 1193-8.

25. Bransteitter, R., et al., Biochemical analysis of hypermutational targeting by wild type and mutant activation-induced cytidine deaminase. J. Biol. Chem., 2004. 279 (49): p. 51612-21.

26. Shivarov, V., R. Shinkura and T. Honjo, Dissociation of in vitro DNA deamination activity and physiological functions of AID mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008. 105 (41): p. 15866-71.

27. Epeldegui, M., et al., Infection of human B cells with Epstein-Barr virus results in the expression of somatic hypermutation-inducing molecules and in the accrual of oncogene mutations. Mol. Immunol., 2007. 44 (5): p. 934-42.

28. Petersen-Mahrt, S. K., R. S. Harris and M. S. Neuberger, AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature, 2002. 418 (6893): p. 99-103.

Claims (4)

1. Preparat wykazujący aktywność ludzkiej deaminazy cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (AID), znamienny tym, że zawiera białko powstałe w wyniku ekspresji zmodyfikowanego genu ludzkiej AID w komórkach bakteryjnych, przy czym zmodyfikowany gen obejmuje:

(i) całą sekwencję cDNA kodującą ludzką AID wraz z kodonami STOP, z wyjątkiem elementów nieulegających translacji 5' i 3', obejmującą pozycje 80-679 w sekwencji oznaczonej SEQ. ID nr 1;

(ii) jednocześnie sekwencje kodujące dwa znaczniki: GST i heksahistydynowy;

(iii) jednocześnie sekwencje kodujące dwa motywy rozpoznawane przez proteazy; trombinę i enterokinazę;

(iv) sekwencje kodujące poszczególne elementy białka fuzyjnego w następującej kolejności (od końca 5' do 3'); znacznik GST, motyw rozpoznawany przez trombinę, znacznik heksahistydynowy, motyw rozpoznawany przez enterokinazę, AID, stanowiące sekwencję oznaczoną SEQ. ID m 3 lub sekwencje wykazujące co najmniej 85% podobieństwa sekwencji aminokwasowej wobec SEQ. ID 4;

przy czym hodowlę komórek bakteryjnych, w których ekspresjonowany jest zmodyfikowany gen AID, prowadzi się w pożywce zawierającej źródło jonów cynku oraz hodowlę prowadzi się w temperaturze zawartej pomiędzy 15 a 30°C.

2. Sposób otrzymywania preparatu wykazującego aktywność ludzkiej deaminazy cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (AID) w systemie bakteryjnym, znamienny tym, że wykorzystuje się zmodyfikowany gen ludzkiej AID, przy czym:

(i) wykorzystuje się całą sekwencję cDNA kodującą ludzką AID wraz z kodonami STOP, z wyjątkiem elementów nieulegających translacji 5' i 3', obejmującą pozycje 80-679 w sekwencji oznaczonej SEQ. ID nr 1;

(ii) stosuje się jednocześnie sekwencje kodujące dwa znaczniki: GST i heksahistydynowy;

(iii) stosuje się jednocześnie sekwencje kodujące dwa motywy rozpoznawane przez proteazy: trombinę i enterokinazę;

(iv) składa się sekwencje kodujące poszczególne elementy białka fuzyjnego w następującej k olejności (od końca 5' do 3'): znacznik GST, motyw rozpoznawany przez trombinę, znacznik heksahistydynowy, motyw rozpoznawany przez enterokinazę, AID, stanowiące sekwencję oznaczoną SEQ. ID nr 3 lub sekwencje wykazujące co najmniej 85% podobieństwa sekwencji aminokwasowej wobec SEQ. ID 4;

przy czym hodowlę komórek bakteryjnych, w których ekspresjonowany jest zmodyfikowany gen AID prowadzi się w pożywce zawierającej źródło jonów cynku oraz hodowlę prowadzi się w temperaturze zawartej pomiędzy 15 a 30°C.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że źródło jonów cynku stanowi chlorek cynku o stężeniu zawartym w przedziale od 0,01 do 2 mM, korzystnie 0,06 mM.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w temperaturze 18°C.