PL225277B1 - Szczep Weisella cibaria, zawierająca go kultura starterowa, zakwas, pieczywo oraz sposób otrzymywania pieczywa i zastosowanie szczepu, kultury starterowej lub zakwasu do wytwarzania pieczywa - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Weissella cibaria ZFJ8, zdeponowany w Kolekcji Kultur Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. Wacława Dąbrowskiego w Warszawie pod numerem KKP 2058p, zawierająca go kultura starterowa, zakwas, pieczywo oraz sposób otrzymywania pieczywa obejmujący wykorzystanie wymienio nego szczepu, kultury starterowej lub zakwasu uzyskanego z udziałem szczepu Weissella cibaria ZFJ8 zdeponowanego w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. Wacława Dąbrowskiego w Warszawie, pod numerem KKP 2085p oraz zastosowanie wymienionego szczepu, kultury starterowej lub zakwasu do wytwarzania pieczywa.

Procesy psucia inicjowane przez rozwój pleśni są jednym z głównych czynników wpływających negatywnie na trwałość pieczywa. Ponadto obecność grzybów mikotoksynotwórczych stwarza poważne zagrożenie dla zdrowia konsumentów. Ryzyko psucia pieczywa można ograniczyć p oprzez stosowanie chemicznych związków konserwujących, jednak wprowadzenie kwasu propion owego lub etanolu niekorzystnie wpływa na cechy sensoryczne wypieków nadając im nietypowy, kwaśny lub alkoholowy aromat. Ponadto rośnie liczba konsumentów negatywnie ustosunkowanych do obecności wszelkich dodatków technologicznych w pieczywie, między innymi preferujących pi eczywo ekologiczne.

Rosnąca popularność pieczywa charakteryzującego się „wartością dodaną”, to jest zawierającego zwiększoną zawartość substancji bioaktywnych, w stosunku do pieczywa produkowanego z j asnej mąki, spowodowała, że do produkcji chleba wprowadzane są takie surowce jak owies i jęczmień. Surowce te odznaczają się stosunkowo dużą zawartością cennych składników odżywczych m.in. antyoksydantów, egzogennej lizyny, mikroelementów, wielu witamin i cennych minerałów oraz bło nnika pokarmowego (w tym β-glukanów). Zawartość β-glukanów pochodzących z owsa lub jęczmienia na poziomie zapewniającym dostarczenie przynajmniej 1g β-glukanu na mierzalną porcję żywności uprawnia do umieszczania na etykietach oświadczeń zdrowotnych, dotyczących redukcji przez β-glukan owsiany/jęczmienny poziomu cholesterolu we krwi. (Rozporządzenie Komisji (UE) nr 1160/2011 14 Lis 2011).

Jednym ze sposobów korzystnego oddziaływania na cechy organoleptyczne, jakość mikrobiologiczną i trwałość pieczywa jest stosowanie zakwasów piekarskich, czyli mieszaniny mąki i wody poddanej procesowi samorzutnej lub inicjowanej fermentacji mlekowej w obecności wyselekcjonowanych kultur starterowych bakterii fermentacji mlekowej [Corsetti i wsp. 2000, Arendt, 2007]. Autochtoniczna populacja szczepów LAB ciast zawierających mąkę jęczmienną stanowi silną konkurencję dla inokulum wprowadzanego w postaci komercyjnej kultury starterowej. W związku z tym do otrzymywania zakwasów piekarskich, sporządzanych z mąki jęczmiennej powinno się stosować kultury starterowe, zawierające bakterie fermentacji mlekowej pochodzące z ekosystemu mąki jęczmiennej [Meroni i wsp. 2009]. Szczepy takie są przystosowane do warunków panujących w zakwasie i cieście jęczmiennym, zatem i do wykorzystywania dostępnych w środowisku substratów/związków chemicznych, w tym β-glukanu.

Oddziaływanie przeciwpleśniowe bakterii fermentacji mlekowej polega na hamowaniu wzrostu pleśni poprzez uwalnianie do środowiska metabolitów przeciwpleśniowych (hamujących wzrost pleśni) lub/i na hamowaniu syntezy lub unieczynnieniu mikotoksyn syntetyzowanych przez pleśnie. Ograniczenie rozwoju pleśni poprzez stosowanie kultur starterowych wpływa korzystnie na wydłużenie trwałości pieczywa.

Kultury starterowe o udokumentowanej aktywności przeciwpleśniowej znane są z publikacji patentowych np. dokumentu WO2009/141427 opisującego szczep Lactobacillus amylovorus DSM 19280 lub dokumentu US2012/0070536 ujawniającego szczep Lactobacillus sanfranciscensis WB1006, jak również z literatury niepatentowej np. szczep Lactobacillus plantarum FST 1.7 stanowiący kulturę starterową opisaną przez Dal Bello i wsp. [2007].

Zdolność do syntezy związków o właściwościach antygrzybowych wykrywano najczęściej wśród szczepów bakterii należących do rodzaju Lactobacillus a w szczególności gatunku L. plantarum, a także Lactobacillus sakei, Lactobacillus paralimentarius Lactobacillus rosiae. Biorąc pod uwagę liczbę szczepów LAB przebadanych przez różnych autorów pod względem aktywności przeciwpleśniowej można stwierdzić, że jest to właściwość dość rzadko występująca, przy czym nie jest ona związana z przynależnością gatunkową LAB, lecz jest cechą szczepową. Przykładowo, spośród 1200

PL 225 277 B1 izolatów pochodzących z różnorodnego materiału roślinnego oraz z przewodu pokarmowego kurcząt, przebadanych przez Magnusson i wsp. zdolność do hamowania wzrostu pleśni stwierdzono w przypadku 4% szczepów, z których najwięcej należało do gatunku Lactobacillus coryniformis. Ponadto aktywność antypleśniową stwierdzono u takich gatunków jak Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sakei, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus parvulus. Garofalo i wsp. przeprowadzili selekcję spośród 216 szczepów LAB wyizolowanych z ciast zakwasowych i naturalnych zakwasów piekarskich, w wyniku której wyodrębnili dwa szczepy charakteryzujące się zdolnością do syntezy związków przeciwgrzybowych - Lactobacillus paralimentarius PB127 i Lactobacillus rossiae LD108.

W badaniach prowadzonych przez Valerio i współpracowników skupiono się na określeniu aktywności przeciwgrzybowej bakterii wyizolowanych z mąki pszennej; aktywność tę stwierdzono u 10 spośród 125 izolatów w tym należących do gatunków: Leuconostoc citreum i Lactobacillus rossiae. Zannini i wsp. wyizolowali z zakwasów pszennych, ciasta chlebowego i ciasta słodkiego 217 szczepów LAB i zbadali ich aktywność antymikrobiologiczną wobec pleśni Aspergillus heteromorphus, Eurotium niveglaucum oraz Penicilium roseopurpureum, wyizolowanych z pomieszczeń piekarni rzemieślniczych oraz tzw. zwrotów piekarskich. W grupie otrzymanych szczepów LAB, 21 izolatów charakteryzowało się silną aktywnością antypleśniową. Biorąc pod uwagę doniesienia literatury naukowej i patentowej można stwierdzić, że wysoki poziom aktywności przeciwpleśniowej jest cechą raczej nieoczekiwaną dla szczepów bakterii z gatunku Weissella cibaria.

Celem wynalazku było opracowanie kultury starterowej do pieczywa jęczmiennego, zawierającej szczep/szczepy bakterii fermentacji mlekowej, charakteryzującej się korzystnym wpływem na jakość, to jest na trwałość (związaną z nieobecnością pleśni) oraz właściwości organoleptyczne pieczywa jęczmiennego z udziałem mąki jęczmiennej 20% i powyżej oraz na jego walory odżywcze/prozdro wotne wynikające z zawartości beta glukanu.

Szczep bakterii fermentacji mlekowej będący przedmiotem wynalazku wyizolowano z mąki jęczmiennej poddanej fermentacji spontanicznej (tj. z zakwasu sporządzonego z całoziarnowej mąki jęczmiennej, będącej jedynym źródłem węglowodanów w podłożu). W wyniku selekcji spośród grupy nowo wyizolowanych szczepów bakterii fermentacji mlekowej (LAB) należących do gatunku Weissella cibaria, nieoczekiwanie stwierdzono, że nowy, nieopisany wcześniej szczep Weisella cibaria ZFJ8 wykazuje wysoką aktywność przeciwpleśniową.

Przedmiotem wynalazku jest więc nowy szczep bakterii, który został określony jako Weissella cibaria ZFJ8 i zdeponowany 6 października 2014 w Kolekcji Kultur Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. Wacława Dąbrowskiego w Warszawie, Polska pod numerem KKP 2058p.

Kryteria selekcji szczepów bakterii do kultury starterowej stanowiły: aktywność przeciwdrobn oustrojowa (w tym zdolność do hamowania wzrostu pleśni), oraz zdolność do syntezy wybranych metabolitów takich jak kwas mlekowy, octowy, produkty fermentacji wpływające na aromat pieczywa (diacetyl, acetoina, octan etylu, aldehyd octowy). Od innych szczepów gatunku Weissella cibaria szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku odróżnia wysoka aktywność przeciwpleśniowa. Nieoczekiwanie okazało się również, że szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2085p według wynalazku charakteryzuje ograniczony metabolizm β-glukanu zbożowego (pochodzącego z jęczmienia i owsa) czego efektem jest stosunkowo wysoki poziom β-glukanu w zakwasach i pieczywie otrzymanym z udziałem tego szczepu jako kultury starterowej.

Zaletą nowego szczepu Weisella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku jak i stosowania opracowanej kultury zawierającej ten szczep jest więc możliwość otrzymywania pieczywa o wysokiej zawartości pochodzącego z mąki jęczmiennej β-glukanu, co wynika z ograniczonej (w stosunku do innych szczepów LAB) zdolności do metabolizowania β-glukanu jęczmiennego przez ten szczep bakterii.

Przedmiotem wynalazku jest również kultura starterowa do inicjowania fermentacji zakwasów, w szczególności jęczmiennych i jęczmienno-owsianych, szczególnie do pieczywa jęczmiennego i jęczmienno-owsianego, zawierająca szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku, która umożliwia uzyskanie pieczywa o wysokiej zawartości β-glukanu oraz charakteryzującego się wydłużoną trwałością, dzięki aktywności przeciwpleśniowej tego szczepu.

W korzystnym przykładzie wykonania, kultura starterowa według wynalazku ma postać biomasy. W innym korzystnym przykładzie wykonania, kultura starterowa według wynalazku ma postać preparatu otrzymanego po wysuszeniu biomasy metodą fluidyzacji.

PL 225 277 B1

Przedmiotem wynalazku jest również zakwas do wytwarzania pieczywa, do którego wytworzenia stosowany jest szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku lub kultura starterowa według wynalazku.

Korzystnie, zakwas według wynalazku tworzony jest z mąki jęczmiennej, korzystniej tworzony jest z mąki jęczmiennej wymieszanej z wodą w stosunku 1:1 lub 1:1,5 lub 1:2. W przykładzie wykonania, do wytworzenia zakwasu według wynalazku stosowana jest kultura starterowa według wynalazku w postaci biomasy, korzystnie dodawana w ilości 0,5%. W innym przykładzie wykonania, do wytworzenia zakwasu według wynalazku stosowana jest kultura starterowa według wynalazku w postaci preparatu otrzymanego po wysuszeniu biomasy metodą fluidyzacji, korzystnie dodawana w ilości 1%. Zakwas według wynalazku stosowany jest do wytwarzania pieczywa z udziałem przynajmniej 20% mąki jęczmiennej.

Przedmiotem wynalazku jest również pieczywo otrzymane z wykorzystaniem szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku, kultury starterowej według wynalazku lub zakwasu według wynalazku.

Korzystnie, pieczywo według wynalazku obejmuje przynajmniej 20% udział mąki jęczmiennej. Korzystnie, w pieczywie według wynalazku zawartość β-glukanu wynosi przynajmniej około 1%.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania pieczywa, w szczególności pieczywa jęczmiennego i jęczmienno-owsianego, który obejmuje etap wykorzystania szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku, kultury starterowej według wynalazku do inicjowania fermentacji zakwasów zawierającej Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p lub zakwasu według wynalazku do wytwarzania pieczywa, do którego wytworzenia stosowany jest szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p.

Wynalazek obejmuje też zastosowanie szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku, kultury starterowej według wynalazku lub zakwasu według wynalazku do wytwarzania pieczywa, w szczególności pieczywa jęczmiennego i jęczmienno-owsianego.

Krótki opis figur rysunku

Fig. 1 przedstawia aktywność przeciwdrobnoustrojową kultury starterowej złożonej z wyizolowanych bakterii W cibaria ZFJ8 KKP 2058p, wyrażoną jako liczba pleśni oraz bakterii niepożądanych w zakwasach jęczmiennych po 24h fermentacji

Szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku został wyizolowany z zakwasu przygotowanego z mąki jęczmiennej. Izolację szczepu przeprowadzono poprzez wielokrotne pasażowanie (selekcję) pojedynczych kolonii rosnących na podłożu MRS zawierającym maltozę jako źródło węgla. Afiliację taksonomiczną szczepu bakterii do gatunku Weissella cibaria, potwierdzono na podstawie porównania z sekwencjami bakteryjnych odcinków 16S rDNA, zdeponowanymi w bazie GenBank i stwierdzenia ich zgodności w 99%, (różnicowanie międzygatunkowe i wewnątrzgatunkowe RAPD-PCR). Wyniki analizy genetycznej odcinka 16S rRNA, określonego niniejszym wynalazkiem szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p przedstawia SEQ ID NO.1

Wyizolowany szczep bakterii ZFJ8 zdeponowany jako KKP 2058p według wynalazku, z którego sporządzono kulturę starterową będącą przedmiotem wynalazku, należy do gatunku Weissella cibaria, rodziny Leuconostocaceae i jest reprezentowany przez Gram dodatnie, katalazo-dodatnie niewytwarzające przetrwalników, krótkie pałeczki. Optymalna temperatura wzrostu mieści się w zakresie 25°C-35°C. Gatunek ten należy do grupy bakterii heterofermentacyjnych. W wyniku prowadzonej przez te bakterie fermentacji mlekowej, z cukrowców oprócz kwasu mlekowego powstają również inne produkty jak etanol i kwas octowy. Nowy szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku nieoczekiwanie wykazuje bardzo wysoką aktywność przeciwdrobnoustrojową, znacznie wyższą od innych znanych szczepów tego gatunku.

Szczep według wynalazku może być stosowany jako składnik kultury starterowej do przygot owania zakwasu, w szczególności z mąki jęczmiennej. Sposoby przygotowywania zakwasów i stosowania kultur starterowych są znane specjalistom w dziedzinie. Na przykład, można namnożyć bakterie prowadząc hodowlę czystej kultury szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku w podłożu płynnym optymalnym dla bakterii fermentacji mlekowej, na przykład w fermentorze. Tak namnożone bakterie można następnie oddzielić od podłoża, na przykład przez wirowanie i stosować w formie biomasy lub preparatu otrzymanego po wysuszeniu biomasy metodą fluidyzacji, który to sposób jest znany z polskiego patentu nr 214654 zgłoszonego 03.11.2008.

Kulturę starterową według wynalazku, zawierającą szczep według wynalazku można, w celu otrzymania zakwasu, dodawać do mąki, korzystnie mąki jęczmiennej, wymieszanej z wodą, korzystnie

PL 225 277 B1 w stosunku 1:1 lub 1:1,5 lub 1:2 (wydajność odpowiednio 200%, 250% i 300%), korzystnie w ilości 0,5% (w przypadku biomasy) lub 1% (w przypadku stosowania preparatu kultury starterowej suszonej).

Zastosowanie będącego przedmiotem wynalazku nowego szczepu Weissella cibaria ZFJ8, zdeponowanego w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego im. prof. Wacława Dąbrowskiego w Warszawie, pod numerem KKP 2058p, jako kultury starterowej do inicjowania fermentacji mąki jęczmiennej (prowadzenia zakwasów jęczmiennych) ponadto pozwala na zachowanie wysokiego stężenia naturalnego β-glukanu w pieczywie jęczmiennym, ponieważ bakterie tego szczepu charakteryzują się niższą zdolnością metabolizowania tego węglowodanu niż inne bakterie wyizolowane ze środowisk zakwasów. W przypadku większości badanych szczepów, zastosowanych jako monokultury do inicjowania fermentacji zakwasów jęczmiennych, stwierdzano znaczny (około 70%) ubytek β-glukanu po 24 godzinnej fermentacji.

Okazało się, że przy zastosowaniu szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku w zakwasach jęczmiennych ubytek β-glukanu był na poziomie około 30% początkowej ilości. Jednocześnie w przypadku tego szczepu ilość syntetyzowanego przez bakterie kwasu mlekowego i octowego, oraz związków wpływających na cechy organoleptyczne ciast i pieczywa jak diacetyl, acetoina i aldehyd octowy pozostawała na wysokim poziomie.

Zakwas otrzymany przy zastosowaniu kultury starterowej według wynalazku można zastosować do przygotowania pieczywa, korzystnie z udziałem około 20% lub więcej mąki jęczmiennej, dowolnym, odpowiednim znanym w dziedzinie sposobem.

Szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku, również przy zastosowaniu w kulturze starterowej do przygotowania zakwasu z mąki jęczmiennej, charakteryzuje się zdolnością do hamowania wzrostu pleśni, w tym hamowania wzrostu pleśni w pieczywie, a zdolność ta nie jest cechą oczywistą dla bakterii tego gatunku.

Wykazano, że bakterie szczepu Weisella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku hamują wzrost pleśni w znacznie wyższym stopniu niż inne bakterie, a w zakwasach otrzymanych z udziałem innych kultur starterowych (złożonych ze szczepów LAB wyizolowanych z mąki jęczmiennej) stwierdzono obecność pleśni i bakterii z rodzaju Bacillus na wyższym poziomie niż w zakwasie sporządzonym z kulturą starterową szczepu Weisella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady wykonania, nieograniczające jego zakresu.

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1. Izolacja i charakterystyka właściwości przeciwdrobnoustrojowych Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p.

Szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku został wyizolowany z zakwasu przygotowanego z mąki jęczmiennej (wydajność zakwasu 200% tj. mąka i woda w stosunku 1:1). Zakwas utrzymywano w temperaturze 30°C i odnawiano co 24h poprzez zaszczepienie nowej porcji mąki i wody dojrzałym zakwasem, w ilości 20%. Izolację szczepu przeprowadzono poprzez wielokrotne pasażowanie (selekcję) pojedynczych kolonii rosnących na podłożu MRS zawierającym maltozę jako źródło węgla. Afiliację taksonomiczną szczepu bakterii do gatunku Weissella cibaria, potwierdzono na podstawie porównania z sekwencjami bakteryjnych odcinków 16S rDNA, zdeponowanymi w bazie GenBank i stwierdzenia ich zgodności w 99%., (różnicowanie międzygatunkowe i wewnątrzgatunkowe RAPD-PCR).

W tabeli 1 przedstawiono wyniki oddziaływania przeciwpleśniowego szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p według wynalazku w porównaniu do innych szczepów gatunku Weissella cibaria, wyizolowanych ze środowisk mąki i ciast zakwasowych. Aktywność przeciwdrobnoustrojową przedstawiona została jako strefa zahamowania wzrostu pleśni przez bakterie/odciek po hodowli bakterii badanych szczepów. Aktywność badanych szczepów LAB oceniano metodą studzienkową, w pożywce agarozowej, stosując warunki inkubacji i podłoża optymalne do wzrostu poszczególnych organizmów wskaźnikowych. W przypadku badania antagonizmu wobec pleśni odciek po hodowli bakterii mlekowych nanoszono na pożywkę zaszczepioną zarodnikami pleśni o liczbie początkowej 10⁶ jtk/ml. W celu określenia charakteru związków oddziaływujących przeciwpleśniowo oprócz odcieku pochodzącego bezpośrednio z hodowli LAB, stosowano również odciek po neutralizacji wartości pH i traktowaniu katalazą, oraz ten sam odciek dodatkowo poddany trawieniu enzymem proteolitycznym. Pomiaru stref zahamowania wzrostu bakterii niepożądanych w zakwasach dokonywano po dwóch dobach inkubacji; w przypadku badania aktywności przeciwpleśniowej po trzech dobach.

PL 225 277 B1

T a b e l a 1

Aktywność przeciwpleśniową bakterii fermentacji mlekowej wyizolowanych z zakwasów piekarskich, wyrażona jako wielkość strefy zahamowania wzrostu pleśni (mm).

Bakterie gatunku Weisella cibaria, izolaty z mąki jęczmiennej	Pleśnie/organizmy testowe
Penicillum sp. B Asperagillus niger A	Fusarium sp.
Wielkość stref zahamowania wzrostu, mm
Weissella cibaria KKP 3	-	4	-
Weissella cibaria ZFJ 8 KKP 2058p	5	10	6
Weissella cibaria KKP 7	1	4	-
Weissella cibaria Sm IA	-	-	-
Weissella cibaria Sm IB	-	-	-
Weissella cibaria 1A	-	-	-
Weissella cibaria 1B	-	-	-
Weissella cibaria 1C	-	-	-
Weissella cibaria I H	1	-	2
Weissella cibaria II F	-	-	-
Weisella cibaria 1850 5	-	-	-

brak aktywności

Stwierdzono, że szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p charakteryzuje się silną aktywnością przeciwdrobnoustrojową skierowaną przeciw pleśniom. Wykazano, że aktywność przeciwdrobnoustrojowa Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p jest uwarunkowana zdolnością do syntezy substancji czynnych o charakterze białkowym i porównano aktywność tego szczepu z aktywnościami szczepów Lactobacillus coryniformis syntetyzujących substancje o charakterze białkowym (bakteriocyny) hamujące wzrost drobnoustrojów. Wykazano, że po poddaniu neutralizacji wartości pH i trawieniu katalazą odciek pochodzący z hodowli szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p zachowywał właściwości przeciwdrobnoustrojowe, natomiast poddanie go trawieniu proteinazą K (Sigma-Aldrich) rozkładającą białka powodowało utratę tych właściwości. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe szczepu W. cibraria ZFJ8 KKP 2058p, w porównaniu do bakteriocynogennego szczepu L. coryniformis 9 przedstawiono w tabeli 2. Istotna ze względu na zastosowanie w pieczywie jest aktywność wobec bakterii przetrwalnikujących z rodzaju Bacillus. Stwierdzono, że W. cibraria ZFJ8 KKP 2058p ogranicza wzrost pleśni (A. niger ZF, Fusarium sp. ZF, P. chrysogenum NCPF 2802 oraz bakterii Gram-dodatnich (B. cereus ATCC 11778, B. coagulans DSM 2308, B. subtilis ATCC 6633, L. innocua CIP 8011, L. monocytogenes K) i Gram-ujemnych (S. saintpaul PIWET, S. typhimurium PIWET).

T a b e l a 2

Aktywność przeciwdrobnoustrojową odcieku poddanego neutralizacji odczynu i trawieniu katalazą po hodowli szczepów W. cibaria ZFJ8 KKP 2058p, L. coryniformis 9, w klasycznej pożywce MRS. Przedstawiono wyniki w odniesieniu do organizmów wskaźnikowych wykazujących wrażliwość na działanie białek syntetyzowanych przez badane szczepy lAb.

Bakterie aktywności przeciwdrobnoustrojowej	Organizmy testowe
B.cereus ATCC 11778	B.coagulans DSM 2308	B. subtilis ATCC 6633	L. innocua CIP 8011	L.monocytogenes K	E. coli PIWET	S. saintpaul PIWET	S.tyhimorium PIWET	A. Niger ZF	Fusarium sp. ZF	P.chrysogenum NCPF 2802
Wielkość stref zahamowania wzrostu [mm]
W. cibaria ZFJ8 KKP 2058p	5	7	7	6	5	0	5	4	5	5	7
L. coryniformis 9	0	0	5	0	4	4	0	0	2	3	2

PL 225 277 B1

P r z y k ł a d 2. Przygotowanie i analiza właściwości kultury starterowej i zakwasu.

Kulturę starterową do inicjowania fermentacji zakwasu jęczmiennego do pieczywa otrzymano poprzez hodowlę czystej kultury szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p poprzez namnażanie bakterii w podłożu płynnym optymalnym dla bakterii fermentacji mlekowej (MRS lub w podłożu glukozowym zawierającym niezbędne składniki odżywcze: sole, witaminy), w temperaturze 30°C, w fermentorze utrzymywano poziom pH 6,5. Bakterie oddzielano od podłoża poprzez wirowanie i stos owano w formie biomasy lub preparatu otrzymanego po wysuszeniu biomasy metodą fluidyzacji, w sposób znany z polskiego patentu nr 214654. Otrzymano preparaty o zawartości bakterii co na jmniej 1 x 10⁹ j.t.k./g.

Kulturę starterową dodawano do mąki jęczmiennej, wymieszanej z wodą w stosunku 1:1,1:1,5 lub 1:2 (wydajność odpowiednio 200%, 250% i 300%) w ilości 0,5% (w przypadku biomasy) lub 1% (w przypadku stosowania preparatu kultury starterowej suszonej).

Po 20-24 h fermentacji w gotowym zakwasie oznaczano m.in. liczbę niepożądanych drobnoustrojów, zawartość β-glukanu oraz oceniano jego jakość organoleptyczną. Zakwas otrzymany z użyciem kultury starterowej według wynalazku charakteryzował się wyraźnie niższą zawartością/liczbą drobnoustrojów niepożądanych niż zakwasy otrzymane z kulturą handlową oraz poprzez fermentację spontaniczną (bez kultur starterowych) co wskazuje na większą zdolność hamowania wzrostu drobnoustrojów niepożądanych w zakwasach przez Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p. Porównanie liczby wybranych drobnoustrojów w zakwasach przedstawiono na fig. 1.

Z użyciem otrzymanych zakwasów przygotowano pieczywo jęczmienne wprowadzając do ciasta 40% mąki jęczmiennej w postaci zakwasu.

Nieoczekiwanie okazało się, że zakwasy oraz pieczywo jęczmienne otrzymane z udziałem kultury starterowej zawierającej biomasę szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p charakteryzują się wyższą zawartością β-glukanu niż otrzymane z udziałem innych kultur starterowych.

W tabeli 3 przedstawiono zawartość β-glukanu w zakwasach (o wydajności 200%) z różnymi kulturami starterowymi, zawartość β-glukanu w świeżo sporządzonym zakwasie wynosi 1,8% (w s.m.) w mące sięgała 3,8% (w s.m).

T a b e l a 3

Zawartość β-glukanu w zakwasach jęczmiennych

Próbka	Wilgotność, %	Zawartość β-glukanu po 24 h, % s.m.	Ubytek β-glukanu, %
zakwas jęczmienny spontaniczny	58,0	0,34	81,1
zakwas jęczmienny, kultura komercyjna LV1	57,2	0,39	78,3
zakwas jęczmienny, Weissella cibaria ZF3	56,2	0,76	58
zakwas jęczmienny, kultura K3	54,8	0,80	55,6
zakwas jęczmienny,	57,0	1,35	25
Weissella cibaria KKP 2058p

K3 kultura starterowa złożona ze szczepu Weissella cibaria ZF3 KKP oraz Pediococcus pentosaceus ZF2

P r z y k ł a d 3. Przygotowanie i analiza pieczywa.

Kulturę starterową zawierającą szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p przygotowano w postaci biomasy. Bakterie hodowano w temperaturze 30°C przez 24 godziny, a następnie odwirowaną biomasę zastosowano jako kulturę starterową (w ilości 0,5% w stosunku do mąki) do zainicjowania fermentacji zakwasu o wydajności 250% (przygotowanego z maki jęczmiennej i wody w proporcji 1000 g mąki: 1500 ml wody).

Z udziałem zakwasu przygotowano ciasto, a następnie otrzymano pieczywo jęczmienne i jęc zmienno-owsiane o podanej poniżej recepturze.

Wytwarzanie ciasta i wypiek chleba

Z zakwasem piekarskim z mąki jęczmiennej wprowadzano do ciasta 20-40% całej ilości mąki przewidzianej recepturą, (w zależności od stopnia ukwaszenia zakwasu). Ciasta przygotowywano w oparciu o następujące receptury:

PL 225 277 B1

A. Ciasto jęczmienne

Surowce	Próby kontrolne na zakwasie z udziałem kultury komercyjnej LV1	na zakwasie z udziałem kultury Weissella cibaria
30% mąki w kwasie	40% mąki 30% w kwasie	30% mąki w kwasie	40% mąki w kwasie
1. Kwas	1500 g	1500 g	1500 g	1500 g
piekarski		200 g		200 g
	1400 g	1200 g	1400 g	1200 g
	60 g	60 g	60 g	60 g
2. Mąka jęczmienna całoziarnowa	30 g	30 g	30 g	30 g
3. Mąka pszenna typ 550 4. Drożdże (4%) 5. Sól (1,5%) 6. Woda	1)ok. 500 ml	1)	1)ok. 500 ml	1)

1) ilość wody pozwalająca na uzyskanie optymalnej konsystencji ciasta

B. Ciasto jęczmienno-owsiane

Surowce	Próby kontrolne na zakwasie z udziałem kultury komercyjnej LV1	na zakwasie z udziałem kultury Weissella cibaria
30% mąki w kwasie	20% mąki w kwasie	30% mąki w kwasie	20% mąki w kwasie
1.	Kwas	1500 g	1000 g	1500 g	1000 g
	piekarski	-	-	-	-
		1000 g	1200 g	1000 g	1200 g
		400 g	400 g	400 g	400 g
2.	Mąka jęczmienna całoziarnowa	60 g	80 g	60 g	80 g
3.	Mąka pszenna typ 550	40 g	50 g	40 g	50 g
4.	Otręby owsiane	1)ok. 1200 ml	1)	1)ok. 1200 ml	1)
5.	Drożdże (4%)
6.	Sól (1,5%)
7.	Woda

¹) ilość wody pozwalająca na uzyskanie optymalnej konsystencji ciasta

W tabeli 4 przedstawiono zawartość β-glukanu w pieczywie otrzymanym na zakwasie z różnymi kulturami. Pieczywo pszenno-jęczmienno i pszenno-jęczmienno-owsiane otrzymane z użyciem kultury Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p charakteryzowało się stosunkowo wyższą zawartością β-glukanu niż pieczywo otrzymane z inną kulturą starterową. Najwyższą zawartość β-glukanu uzyskano w pieczywie jęczmienno-owsianym z 20% mąki w zakwasie.

T a b e l a 4

Wpływ zastosowania kultury starterowej zawierającej szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p na zanieczyszczenia mikrobiologiczne, trwałość oraz zawartość β-glukanu w pieczywie pszenno-jęczmiennym jęczmiennym i jęczmienno owsianym w przeliczeniu na 100 g produktu

Rodzaj pieczywa Udział mąki jęczmiennej, w tym w postaci zakwasu	Zanieczyszczenia mikrobiologiczne, grupy drobnoustrojów, j.t.k/g	Trwałość, oznaki pleśnienia, dni	zawartość β-glukanu w pieczywie, %
Suma bakterii z rodzaju Bacillus	pleśnie
1	2	3	4	5
chleb jęczmienny, (30% w zakwasie), z kulturą komercyjną LV1	1,0 x 101	2,1 x 101	5	0,45

PL 225 277 B1 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5
chleb jęczmienny (30% w zakwasie), z kulturą zawierającą Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p)	n.w.	n.w.	8	0,96
chleb jęczmienny 40 (30% w zakwasie) z kulturą komercyjną LV1	n.w.	n.w	6	0,56
chleb jęczmienny 40 (30% w zakwasie) z kulturą zawierającą Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p	n.w.	n.w.	9	1,1
chleb jęczmienno-owsiany z zakwasem (20%) z kulturą komercyjną LV1	1,4 x 101	1,6 x 101	5	0,61
chleb jęczmienno-owsiany z zakwasem (20%) z kulturą wg zawierającą Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p	n.w.	n.w.	8	1,2

n.w. - nie wykryto

Pieczywo jęczmienne, otrzymane z zastosowaniem kultury starterowej według wynalazku tj. zawierającej szczep Weissella cibaria ZFJ8 KKP 2058p, charakteryzowało się zwiększoną trwałością w porównaniu do pieczywa z kulturą komercyjną.

Literatura cytowana w opisie włączona niniejszym jako odniesienie:

Arent E. Ryan L. Dal Bello F.; (2007), Impact of sourdough on texture of bread. Food Microbiology. 10 24,165-174

Corsetti A, Gobbetti M, De Marco B, Balestrieri F, Paoletti F, Russi L, Rossi J.: (2000), Combined effect of sourdough lactic acid bacteria and additives on bread firmness and staling. J. Agric Food Chem., 48(7), 3044-51.

Dal Bello, F., Clarke, C. I., Ryan, L. A. M., Ulmer, H., Schober, T. J., Strom, K., Sjorgren, J., Van Sinderen, D., Schnurer, J. and Arendt, E. K. 2007. Improvement of the quality and shelf life of wheat bread by fermentation with the antifungal strain Lactobacillus plantarum FST 1.7. Journal of Cereal Science, 45: 309-318.

Meroni A., Dal Bello F., Arendt E.: (2009) Sourdough in gluten-free bread making: An ancient technology to solve a novel issue? Food Microbiology, 26, 676-684

Magnusson J., Strom K., Roos S., Sjogren J..Schnurer J.: Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Lett., 2003; 219(1): 129-135.

Lavermicocca P., Valerio F., Evidente A., Lazzaroni S., Corsetti A., Gobbetti M.: Purification and characterization of novel antifungal compounds by sourdough Lactobacillus plantarum 21B. Appl. Environ. Microb., 2000; 66(9): 4084-4090.

Garofalo C., Zannini E., Aquilanti L., Silvestri G., Fierro O., Picariello G., Clementi F.: Selection of sourdough lactobacilli with antifungal activity for use as biopreservatives in bakery products. J. Agr. Food Chem., 2012; 60(31): 7719-7728.

Valerio F., Favilla M., De Bellis P., Sisto A., de Candida S., Lavermicocca P.: Antifungal activity of strains of lactic acid bacteria isolated from a semolina ecosystem against Penicillium roqueforti, Aspergillus niger and Endomyces fibuliger contaminating bakery products. Syst. Appl. Microbiol., 2009; 32(6): 438-448.

Zannini E., Garofalo C. Aquilanti L., Santarelli S., Silvestri G., Clementi F.: Microbiological and technological characterization of sourdough destined for bread making with barley flour. Food Microbiol., 2009; 26(7): 744-753.

PL 225 277 B1

LISTA SEKWENCJI <110> IBPRT <120> Szczep Weisella cibaria, zawierająca go kultura starterowa, zakwas, pieczywo oraz sposób otrzymywania pieczywa i zastosowanie szczepu, kultury starterowej lub zakwasu do wytwarzania pieczywa <130> PK/2829/AGR <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1425 <212> DNA <213> Weissella cibaria <400> 1

gtcgacgctt	tgtggttcaa	ctgatttgaa	gagcttgctc	agatatgacg	atggacattg	60
caaagagtgg	cgaacgggtg	agtaacacgt	gggaaaccta	cctcttagca	ggggataaca	120
tttggaaaca	gatgctaata	ccgtataaca	ataacaaccg	catggttgct	acttaaaaga	180
tggttctgct	atcactaaga	gatggtcccg	cggtgcatta	gttagttggt	gaggtaatgg	240
ctcaccaaga	cgatgatgca	tagccgagtt	gagagactga	tcggccacaa	tgggactgag	300
acacggccca	tactcctacg	ggaggcagca	gtagggaatc	ttccacaatg	ggcgaaagcc	360
tgatggagca	acgccgcgtg	tgtgatgaag	ggtttcggct	cgtaaaacac	tgttgtaaga	420
gaagaatgac	attgagagta	actgttcaat	gtgtgacggt	atcttaccag	aaaggaacgg	480
ctaaatacgt	gccagcagcc	gcggtaatac	gtatgttcca	agcgttatcc	gggatttatt	540
gggcgtaaag	cgagcgcaga	cggttattta	agtctgaagt	gaaagccctc	agctcaactg	600
aggaattgct	ttggaaactg	gatgacttga	gtgcagtaga	ggaaagtgga	actccatgtg	660
tagcggtgaa	atgcgtagat	atatggaaga	acaccagtgg	cgaaggcggc	tttctggact	720
gtaactgacg	ttgaggctcg	aaagtgtggg	tagcaaacag	gattagatac	cctggtagtc	780
cacaccgtaa	acgatgagtg	ctaggtgttt	gagggtttcc	gcccttaagt	gccgcagcta	840
acgcattaag	cactccgcct	ggggagtacg	accgcaaggt	tgaaactcaa	aggaattgac	900
ggggacccgc	acaagcggtg	gagcatgtgg	tttaattcga	agcaacgcga	agaaccttac	960
caggtcttga	catcccttga	caactccaga	gatggagcgt	tcccttcggg	gacaaggtga	1020
caggtggtgc	atggttgtcg	tcagctcgtg	tcgtgagatg	ttgggttaag	tcccgcaacg	1080
agcgcaaccc	ttattactag	ttgccagcat	ttagttgggc	actctagtga	gactgccggt	1140
gacaaaccgg	aggaaggtgg	ggatgacgtc	aaatcatcat	gccccttatg	acctgggcta	1200
cacacgtgct	acaatggcgt	atacaacgag	ttgccaaccc	gcgagggtga	gctaatctct	1260
taaagtacgt	ctcagttcgg	attgtaggct	gcaactcgcc	tacatgaagt	cggaatcgct	1320
agtaatcgcg	gatcagcacg	ccgcggtgaa	tacgttcccg	ggtcttgtac	acaccgcccg	1380
tcacaccatg	agagtttgta	acacccaaag	ccggtggggt	aacct		1425

PL 225 277 B1

Claims (15)

1. Nowy szczep bakterii Weissella cibaria ZFJ8 zdeponowany pod numerem KKP 2058p w dniu 6 października 2014r. w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie, Polska.

2. Kultura starterowa do inicjowania fermentacji zakwasów, w szczególności jęczmiennych i jęczmienno-owsianych, znamienna tym, że zawiera szczep Weissella cibaria ZFJ8 zdeponowany pod numerem KKP 2058p, określony w zastrz. 1.

3. Kultura starterowa według zastrz. 2, znamienna tym, że ma postać biomasy.

4. Kultura starterowa według zastrz. 2-3, znamienna tym, że ma postać preparatu otrzymanego po wysuszeniu biomasy metodą fluidyzacji.

5. Zakwas do wytwarzania pieczywa, znamienny tym, że do jego wytworzenia stosowany jest szczep Weissella cibaria ZFJ8 zdeponowany pod numerem KKP 2058p określony w zastrz. 1 lub kultura starterowa określona w dowolnym z zastrz. 2-4.

6. Zakwas według zastrz. 5, znamienny tym, że tworzony jest z mąki jęczmiennej.

7. Zakwas według zastrz. 6, znamienny tym, że tworzony jest z mąki jęczmiennej wymieszanej z wodą w stosunku 1:1 lub 1:1,5 lub 1:2.

8. Zakwas według zastrz. 7, znamienny tym, że do jego wytworzenia stosowana jest kultura starterowa w postaci biomasy określona w zastrz. 3, korzystnie dodawana w ilości 0,5%.

9. Zakwas według zastrz. 7, znamienny tym, że do jego wytworzenia stosowana jest kultura starterowa w postaci preparatu otrzymanego po wysuszeniu biomasy metodą fluidyzacji, jak określona w zastrz. 4, korzystnie dodawana w ilości 1%.

10. Zakwas według dowolnego z zastrz. 5-9, znamienny tym, że pieczywem jest pieczywo z udziałem przynajmniej 20% mąki jęczmiennej.

11. Pieczywo, znamienne tym, że otrzymane jest z wykorzystaniem szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP zdeponowanego pod numerem 2058p, określonego w zastrz. 1, kultury starterowej określonej w dowolnym z zastrz. 2-4 lub zakwasu określonego w dowolnym z zastrz. 5-10.

12. Pieczywo według zastrz. 11, znamienne tym, że obejmuje przynajmniej 20% udział mąki jęczmiennej.

13. Pieczywo według dowolnego z zastrz. 11 lub 12, znamienne tym, że zawartość β-glukanu wynosi przynajmniej około 1%.

14. Sposób wytwarzania pieczywa, w szczególności pieczywa jęczmiennego i jęczmienno-owsianego, znamienny tym, że obejmuje etap wykorzystania szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP zdeponowanego pod numerem 2058p określonego w zastrz. 1, kultury starterowej określonej w dowolnym z zastrz. 2-4 lub zakwasu określonego w dowolnym z zastrz. 5-10.

15. Zastosowanie szczepu Weissella cibaria ZFJ8 KKP zdeponowanego pod numerem 2058p określonego w zastrz. 1, kultury starterowej określonej w dowolnym z zastrz. 2-4 lub zakwasu określonego w dowolnym z zastrz. 5-10 do wytwarzania pieczywa, korzystnie pieczywa jęczmiennego i jęczmienno-owsianego.