PL222084B1 - Rekombinowane przeciwciało monoklonalne o wysokim powinowactwie do natywnego antygenu bakteryjnego laseczki wąglika (Bacillus anthracis), sposób jego otrzymywania oraz zastosowanie ciałek inkluzyjnych jako nośnika immunogenu bakteryjnego do otrzymania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku dotyczy rekombinowanego przeciwciała monoklonalnego o wysokim powinowactwie do natywnego antygenu bakteryjnego laseczki wąglika (Bacillus anthracis), sposobu otrzymywania przeciwciał monoklonalnych oraz zastosowania ciałek inkluzyjnych jako nośnika immunogenu bakteryjnego do otrzymania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy sposobu otrzymywania przeciwciał monoklonalnych w wyniku immunizacji parenteralnej przy użyciu, bakteryjnych ciałek inkluzyjnych zawierających białko antygenowe.

Przedmiotem wynalazku są przeciwciała monoklonalne wykazujące wysokie powinowactwo do natywnego (naturalnie występującego) antygenu bakteryjnego laseczki wąglika (Bacillus anthracis) oraz rekombinowane wersje przeciwciała zawierające regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała o dowolnie zmodyfikowanej strukturze, a także ich zastosowanie.

Jeden z ważniejszych kategorii biofarmaceutyków o trudnym do przecenienia potencjale aplikacyjnym stanowią przeciwciała monoklonalne. Przeciwciała monoklonalne tworzą homogeniczną populację immunoglobulin monospecyficznych tj. zdolnych do przyłączania się do jednego epitopu w obrębie antygenu. Jednorodność cząsteczkowa przeciwciał monoklonalnych wynika z faktu, iż pochodzą one od jednej linii komórkowej limfocytów B, będącej klonem jednej wyjściowej komórki ‘matecznej‘. Silna odpowiedź: immunologiczna w formie przeciwciał rozpoczyna się od aktywacji nie pobudzonych (dziewiczych) limfocytów, u których obecne na powierzchni błony komórkowej receptory antygenów, stanowią formę zmodyfikowanych przeciwciał. W efekcie pobudzenia limfocyty B różnicują się w kierunku wytwarzania receptorów tj. immunoglobulin cechujących się wzrastającym powinowactwom względem antygenu. Z czasem obecne na powierzchni komórek B przeciwciała, różnicujące się pod wpływem kolejnych immunizacji ulegają stopniowo sekrecji. W procesie różnicowania limfocytów B w kierunku produkcji przeciwciał wysoce specyficznych względem określonego antygenu, partycypują również inne komórki, tj. komórki dendrytyczne prezentujące antygen w kontekście antygenów zgodności tkankowej MHC oraz limfocyty pomocnicze CD4⁺ typu 1 lub CD4⁺ typu 2 tj. Th1 lub Th2. W stanie silnego zróżnicowania, limfocyty B stają się wyspecjalizowanymi 'fabrykami' przeciwciał wydzielanych pozakomórkowo.

Przeciwciała monoklonalne pochodząc od jednej linii limfocytów B, reprezentują tym samym jedną klasę i podklasę immunoglobulin np. IgG1, IgG2a, IgG2b bądź inną. Przeciwciała, w tym generowane eksperymentalnie przeciwciała monoklonalne, rozpoznają nominalnie nieograniczony zakres struktur od białek przez lipidy, cukrowce do DNA i RNA oraz wiele form stanowiących kompleksy strukturalne i funkcjonalne jakie te składniki tworzą. Z faktu iż przeciwciała monoklonalne mogą być generowane wobec praktycznie dowolnych struktur nie tylko pochodzenia biologicznego, wynika skala możliwych ich zastosowań. Spektrum potencjalnych aplikacji przeciwciał monoklonalnych jest w związku z powyższym bardzo szeroki i obejmuje zarówno możliwości wysoce specyficznej diagnostyki w wielu aspektach, immuno-modulacji przebiegu chorób i odpowiedzi immunologicznej, czy też terapii polegającej na biernym uodparnianiu.

Mechanizm pasywnego uodparniania może okazać się szczególnie cenny w sytuacji zagrożenia atakiem terrorystycznym z wykorzystaniem zarodników B. anthracis, a zatem w warunkach potwierdzonego bądź domniemanego uwolnienia bojowych, tj, wysoce infekcyjnych zarodników laseczki wąglika. Z danych literaturowych wynika, że przeciwciała skierowane do różnych domen toksyny PA wykazują właściwości neutralizacji i hamowania tworzenia kompleksu toksyn PA i LF (czynnik letalny). Jednak ze względu na potwierdzoną uprzednio zdolność rekombinowanego białka czwartej C-terminalnej domeny białka PA obejmującej reszty aminokwasowe 596-735, do zapewnienia ochrony przed zakażeniem wąglikiem /Flick-Smith HC, Walker NJ, Gibson P, Bulifent H. Haward S, Miller J, Titball R.W. Wiliamson D, (2002) A recombinant Carboxy-terminal Domain of the Protective Antigen of Bacillus anthracis Protects Mice against Anthrax Infection, Infection and Immunity 70: 1553-1656, Patent EP130160A0, korzystne okazuje się użycie jako immunogenu ciałek inkluzyjnych zawierających ww. domenę. Białko to bowiem zawiera region poprzez który wchodzi ono w interakcje z receptorami na komórkach gospodarza, co stanowi istotny etap w procesie endocytozy toksyn. Po wytrawieniu przez proteazy gospodarza 20 kDa fragmentu z N-końca białka, antygen protekcyjny laseczki wąglika wiąże się z jednym z receptorów komórkowych CMG2 (ang. Capillary Morphogenesis Protein 2) oraz ATR/TEM8 (ang. Anthrax Toxin ReceptorTumor Endothelial Marker 8). Powstały w następstwie trawienia fragment PA63 o masie 63 kD oligomeryzuje na powierzchni komórki do hepPL 222 084 B1 tameru tworząc w błonie por. Oligomeryzacja białka PA63 na powierzchni komórki gospodarza umożliwia jednej z toksyn wąglika, a mianowicie białku o nazwie czynnik obrzęku HF (ang. Edema Factor) i toksynie letalnej tj, białku o nazwie czynnik letalny LF (ang. Lethal Factor) wniknięcie do cytozolu /Bradley.K.A., Mogridge. J., Mourez .M., Collier, R.J.. and Young. J.A. (2001). Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414, 225-229). Endocytoza toksyn do komórek gospodarza prowadzi do ich apoptozy, co ma tym istotniejsze znaczenie, że komórkami docelowymi dla wymienionych toksyn są kluczowe w odpowiedzi immunologicznej makrofagi i komórki dendrytyczne (Hanna, P.C., Acosta, D, and Collie, R.J. (1993). On the role of macrophages in anthrax, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10198-10201; Agrawa, A., Lingappa, J., Leppla, S.H. Agrawal, S., Jabbar. A., Quinn C.,& Pulendran B. (2003) Impairment of dendritic cells and adaptive immunity by anthrax lethal toxin Nature 424, 329-334). Generowanie w efekcie szczepienia odpowiedzi immunologicznej w formie przeciwciał wykazujących odpowiednio wysoką reaktywność z natywnym antygenem jest zasadniczo istotne z punktu widzenia jakości tej odpowiedzi, a w konsekwencji wartości diagnostycznej oraz potencjalnej charakterystyki ochronnej otrzymanych przeciwciał monoklonalnych. Możliwość wzbudzania reakcji immunologicznej na odpowiednim poziomie, tj. zapewniającej neutralizację patogenu w warunkach naturalnej infekcji in viva bądź w doświadczeniu, in vitro, zależy w decydującym stopniu od naturalnej immunogenności użytego antygenu i adiuwanta oraz prowokowania wzmocnienia odpowiedzi poprzez powtórne aplikowanie immunogenu.

W zgłoszeniu patentowym WO2005007804 (opubl. 27-1-2005) przedstawiono rozwiązanie opierające się na podwójnie aktywnej szczepionce przeciwko wąglikowi (DAAV), która nadaje jednoczesną ochronę przeciwko laseczkom jak i toksynom. W szczepionce użyto koniugat białka, w którym otoczkowy kapsydowy kwas poli-D-gamma-glutaminowy (PGA) jest kowalencyjnie związany z antygenem protekcyjnym (PA). Koniugat PGA-PA przekształca słaby immunogenicznie PGA w mocny/stabilny immunogen i synergicznie poprawia odpowiedź humoralną wobec PA. DAAV dostarcza zarówno profilaktyczne (antybakteryjne) i terapeutyczne (antytoksyczne) składniki/związki w jednej szczepionce. Surowice immunizowanych DAAV myszy były zdolne specyficznie wiązać kompleksy PGA z laseczkami wąglika i powodować ich śmierć, Surowice immunizowanych DAAV myszy były także zdolne do neutralizowania aktywności toksyny (laseczki) wąglika. Myszy immunizowane tą szczepionką zyskały ochranę przeciwko letalnej dawce bakterii.

W zgłoszeniu patentowym WO2005048918 (opubl. 02-06-2005) opisano białkowopolipeptydowy koniugat oraz jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, w którym liczne polipeptydy kwasu poli-D-gamma-glutaminowego o wysokiej masie cząsteczkowej, z których każdy zawiera zewnątrzkomórkowe epitopy białka otoczkowego laseczki wąglika, są związane z powierzchnią białka nośnikowego lub kompleksu białkowego.

W zgłoszeniu patentowym US20070148188 (opubl. 28-06-2007) przedstawiono koniugat kwasu poli-D-gamma glutaminowego i białka nośnikowego. Koniugat może mieć zastosowanie w celach terapeutycznej lub profilaktycznej immunizacji przeciwko infekcjom wąglika. Wynalazek dostarcza również metody oczyszczania kwasu poli-D-gamma-glutaminowego, metody koniugacji szczepionki oraz metody szczepienia przeciwko B. anthracis.

W zgłoszeniu patentowym WO2004058806 (opubl. 15-07-2004) opisano polipeptyd produkowany w genetycznie modyfikowanych mikroorganizmach, zawierający sekwencję aminokwasową białka E2 pestiwirusa w szczególności CSFV. Korzystnie, gdy jest to forma ciałek inkluzyjnych. Dodatkowe przykłady realizacji niniejszego wynalazku dotyczą polipeptydu, który zawiera sekwencje(ę) aminokwasów białka E2 pestiwirusa, w szczególności CSFV pozbawionego trans membranowego fragmentu.

W zgłoszeniu patentowym US2003170263 (opubl. 17-01-2007) opisano immunogenny reagent powodujący odpowiedź immunologiczną przeciwko laseczkom wąglika, który zawiera jeden bądź więcej polipeptydów, odpowiadających razem trzem domenom pełnej długości antygenu PA laseczki wąglika lub ich wariantom, a co najmniej jedna domena zawiera domenę 1 lub domenę 4 PA lub ich warianty. Polipeptydy immunogennego reagenta tak jak pełnej długości PA produkowane są przy pomocy ekspresji bakterii E. coli. Wysoką wydajność polipeptydów otrzymuje się za pomocą metod przedstawionych w rozwiązaniu.

W zgłoszeniu patentowym WO2004058816 (opubl. 15-07-2004) przedstawiono polipeptyd wytwarzany w genetycznie zmodyfikowanych mikroorganizmach zawierający sekwencje aminokwasowe proteazy cysteinowej motylicy wątrobowej, uzupełnione o sekwencję aminokwasową białka rdzenia HBV.

PL 222 084 B1

W zgłoszeniu patentowym WO2008139494 (opubl, 20-11-2008) opisano proces otrzymywania bioaktywnie/rekombinowanego białka z ciałek inkluzyjnych bez konieczności rozwijania ich do struktur cewkowych. Proces obejmuje rozpuszczanie (solubilizację) białek ciałek inkluzyjnych przy użyciu mocznika i propanolu.

W zgłoszeniu patentowym WO2009050388 (opubl. 23-04-2009) opisano przeciwciała anty PA, w których zmienny region ciężkiego łańcucha posiada sekwencję aminokwasową reprezentowaną przez SEKW NR ID 1 i w których zmienny region lekkiego łańcucha posiada sekwencję reprezentowaną przez SEKW NR ID 2, która jest modyfikowana w celu uzyskania homologii i tolerancji względem przeciwciał ludzkich.

W zgłoszeniu patentowym CA2652103 (opubl. 22-11-2007) opisano charakterystykę i izolację F20G75, F20G76 i F20G77 przeciwciał monoklonalnych anty PA o aktywności neutralizującej. Przeciwciała monoklonalne mogą być użyte u kompozycji farmaceutycznej celem traktowania pojedynczych podejrzanych lub zainfekowanych laseczką wąglika. Przeciwciała monoklonalne są przyłączone do specyficznego miejsca/regionu zawierającego aminokwasy 301-330 PA, SEVHGNAEV HASFFDIGSSVSAGFSNSNSS. Szczepionki zawierające te peptydy mogą być użyte do immunizacji poszczególnych organizmów przeciwko infekcjom wywołanym laseczkami wąglika.

W zgłoszeniu patentowym WO2008152655 (opubl. 18-12-20081 przedstawiono rekombinowane fuzyjne białka laseczek wąglika, proces przygotowania takich białek i kompozycji. Zrekombinowane fuzyjne białka zawierają natywny białkowy czynnik Edema (EF) lub białkowy zmutowany czynnik Edema (EFn) lub skrócony białkowy czynnik Edema (EFm) oraz natywny bądź zmutowany antygen protekcyjny (PA), opcjonalnie z łącznikiem, przy czym łącznik może być natywnym białkowym czynnikiem Lethal (LF) lub zmutowanym białkowym czynnikiem Lethal (LFm) lub skróconym białkowym czynnikiem Lethal (EFn). DNA. Kompozycja niniejszego wynalazku może być przydatna jako profilaktyczna lub terapeutyczna szczepionka przeciwko laseczce wąglika.

W zgłoszeniu patentowym US2004166120 (opubl. 26-08-2004) opisano metody służące do immunizacji ssaków przeciwko B. anthracis przy użyciu kompozycji zawierającej czysty zrekombinowany antygen protekcyjny (rPA), opcjonalnie w połączeniu ze skróconym polipeptydem Lethal Factor (LFn). Formulacje czystego immunogenu rPA posiadają niewielką lub zerową reaktogenność i w związku z tym mogą być wprowadzane do organizmów ssaczych w bardzo dużych dawkach - 50 do 100 mg lub więcej rPA, co jest ilością czterokrotnie większą niż ilość PA zawarta w dawkach konwencjonalnych szczepionek przeciwko wąglikowi. Preferowane kompozycje immunogenne są wolne od adiuwantów i innych niepożądanych związków, uwydatniających/podnoszących skuteczność i bezpieczeństwo tej kompozycji. W opisanym zgłoszeniu są także zawarte metody przygotowywania immunogennej kompozycji oraz oczyszczania polipeptydów rPA i LFn.

Pomimo istniejącego stanu techniki nadal istnieje potrzeba opracowania wydajnego sposobu otrzymywania przeciwciał monoklonalnych reaktywnych z natywnym antygenem. Nieoczekiwanie okazało się, że do immunizacji w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych reaktywnych z określonym natywnym antygenem, zastosować można preparat bakteryjnych ciałek inkluzyjnych zawierających ten antygen.

Celem wynalazku było opracowanie takiego sposobu otrzymywania przeciwciał monoklonalnych, którego pierwszy etap polega na wywołaniu wystarczająco silnej odpowiedzi immunologicznej poprzez zastosowanie jako immunogenu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych będących produktem nadekspresji dowolnego heterologicznego białka pochodzenia wirusowego bakteryjnego lub dowolnego organizmu eukariotycznego.

Nieoczekiwanie w niniejszym wynalazku opracowano sposób immunizacji w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych polegający na podawaniu na drodze parenteralnej jako wyłącznego immunogenu ciałek inkluzyjnych bakteryjnego pochodzenia wraz z dodatkiem odpowiedniego adiuwantu funkcjonalnego w immunizacjach na drodze iniekcji.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest rekombinowane przeciwciało monoklonalne o wysokim powinowactwie do natywnego antygenu bakteryjnego laseczki wąglika (Bacillus anthracis), charakteryzujące się tym, że zawiera regiony CDR1, CDR2 i CDR3 w zmiennym regionie łańcucha ciężkiego i CDR1, CDR2 i CDR3 w zmiennym regionie łańcucha lekkiego, pochodzące z dowolnych przeciwciał uzyskanych w efekcie użycia jako immunogenu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych zawierających bakteryjny antygen protekcyjny PA laseczki wąglika, w szczególności C-końcową domenę antygenu protekcyjnego laseczki wąglika PA4D.

PL 222 084 B1

W korzystnej realizacji wynalazku ciałka inkluzyjne zawierające bakteryjny antygen protekcyjny PA, w szczególności C-końcową domenę PA4D są wyprodukowane w systemie bakteryjnym, w szczególności w E. coli, korzystnie w E. coli szczepu BL21(DE3), która zawiera epitopy wchodzące w interakcje z receptorami komórkowymi gospodarza, w szczególności interakcje z receptorami ATR/TEM8 oraz CMG2, przy czym masa cząsteczkowa białka wynosi co najmniej 16 kDA.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku przeciwciało zawiera regiony CDR1, CDR2 i CDR3 w zmiennym regionie łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała B10D2 oraz region stały łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała lgG2a.

Drugim przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych, określonych w pierwszym przedmiocie wynalazku, charakteryzujący się tym, że immunizuje się parenteralnie myszy lub komórki in vitro przy użyciu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych zawierających bakteryjny antygen protekcyjny PA laseczki wąglika, w szczególności C-końcową domenę antygenu protekcyjnego laseczki wąglika PA4D, przy czym pierwszy etap polega na wywołaniu wystarczająco silnej odpowiedzi immunologicznej poprzez zastosowanie jako immunogenu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych będących produktem nadekspresji białka PA.

W korzystnej realizacji wynalazku w następstwie immunizacji wywołana zostaje funkcjonalna odpowiedź immunologiczna zapewniająca neutralizację natywnych toksyn laseczki wąglika.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sposób obejmuje sposób klonowania do plazmidu ekspresyjnego genu kodującego łańcuch ciężki przeciwciała lgG2a oraz genu kodującego łańcuch lekki, przy czym łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała IgG2a zawierają determinanty antygenowe przeciwciała B10D2, w którym obydwa geny znajdują się w dowolnym plazmidzie ekspresyjnym.

Trzecim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ciałek inkluzyjnych jako nośnika immunogenu bakteryjnego do otrzymania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych określonych w pierwszym przedmiocie wynalazku, charakteryzujących się zdolnością neutralizacji toksyn wąglika.

Ujawniono sposób immunizacji parenteralnej myszy przy użyciu ciałek inkluzyjnych PA4D, który zapewnia pojawienie się przeciwciał charakteryzujących się zdolnością neutralizacji toksyn laseczki wąglika, co wykazano w teście neutralizacji mysich makrofagów.

Ujawniono wyselekcjonowane dwie linie hybrydom B10D2 oraz B8G2 produkujące wysoce specyficzne przeciwciała klasy IgG1, które otrzymano w wyniku fuzji mysich komórek szpiczaka mnogiego ze splenocytami śledziony myszy szczepionej za pomocą ciałek inkluzyjnych zawierających PA4D,

Ujawniono wysoce specyficzne przeciwciała B10D2 oraz B8G2, izotypu IgG1 reaktywne z natywnyrn antygenem protekcyjnym laseczki wąglika.

Ujawniono sklonowane regiony CDR łańcucha ciężkiego oraz regiony CDR łańcucha lekkiego przeciwciała B10D2, a następnie sklonowane kompletne rekombinowane przeciwciało mysie izotopu IgG2a zawierające determinanty antygenowe tj. regiony CDR łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała B10D2.

Ujawniono sklonowanie genu kodującego łańcuch ciężki przeciwciała lgG2a zawierającego determinanty antygenowe przeciwciała B10D2 do plazmidu ekspresyjnego pBINPlus (Plant Research International Wageningen, NL), w którym obydwa geny znajdują się w plazmidzie ekspresyjnym pBINPA-LC-HC Agrobacterium tumefaciens pod kontrolą promotora malej podjednostki Rubisco.

Ujawniono transformowanie fragmentów liści tytoniu i regeneracja 350 linii transgenicznego tytoniu, u których metodą PCR wykazano obecność transgenów łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciała, oraz metodą ELISA oraz western blot wykazano ekspresję mysiego przeciwciała monoklonalnego klasy IgG2a.

Ujawniono, iż ulegające ekspresji w roślinie przeciwciało monoklonalne B10D2-P jest przeciwciałem izotypu lgG2a oraz że wykazuje powinowactwo do antygenu protekcyjnego PA laseczki wąglika.

W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku rozwiązanie zostało zilustrowane na rysunku, gdzie:

Figura 1.1 przedstawia bakteryjny wektor ekspresyjny pIGCmT7Kes (znany ze stanu techniki);

Figura 1.2 przedstawia sekwencję sklonowanej wstawki PA-4D w wektorze plGT7KesPA-4D (znaną ze stanu techniki);

Figura 1.3 rozdział elektroforetyczny izolowanych ciałek inkluzyjnych(,) zawierających antygen protekcyjny PA4D, gdzie: M - marker wielkości (94 kDa; 67 kDa; 43 kDa; 30 kDa; 20,1 kDa; 14,4 kDa), 1-2 lizat bakterii przed indukcją ekspresji, 3-6 lizat bakterii z nadekspresją PA4D, 7-8 izolowany preparat ciałek inkluzyjnych PA4D;

PL 222 084 B1

Figura 2 przedstawia średnie wartości wraz z odchyleniami standardowymi względnego miana przeciwciał anty-PA w surowicy rozcieńczanej 1:640 u pięciu myszy immunizowanych domięśniowo za pomocą ciałek inkluzyjnych zawierających białko C-końcowej domeny antygenu protekcyjnego PA

Bacillus anthracis adsorbowanego na wodorotlenku glinu. Strzałki oznaczają terminy immunizacji: 7, 21, 35 i 70 dzień doświadczenia;

Figura 3 przedstawia test neutralizacji in vitro mysich makrofagów przez surowice myszy 2E-1 szczepionej czterokrotnie iniekcyjnie ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi C-końcową domenę antygenu protekcyjnego PA. Procent przeżywalności makrofagów po dodaniu letalnego kompleksu toksyn PA/LF stanowi miarę zdolności neutralizacji przez surowicę pobraną 2 tygodnie po ostatniej czwartej immunizacji. Brak neutralizacji i przeżywalności makrofagów inkubowanych z toksynami z dodatkiem różnych rozcieńczeń surowicy pobranej od myszy kontrolnej poddanej iniekcji PBS z dodatkiem adiuwanta wodorotlenku glinu jako adiuwantu;

Figura 4 przedstawia wykres przedstawiający wynik oznaczania za pomocą testu ELISA względnego miana przeciwciał specyficznych względem antygenu PA w nadsączach pohodowlanych z pierwotnej hodowli hybrydom (fuzantów), myszy szczepionej ciałkami inkluzyjnymi PA4D. Wartość absorbancji OD w poszczególnych dołkach obrazuje względne miano przeciwciał IgG anty-PA odpowiednio na płytce A i B;

Figura 5 przedstawia wykres przedstawiający średnią wartość absorbancji oraz odchylenie standardowe dwóch pomiarów reaktywności przeciwciał wytwarzanych przez poszczególne klony hybrydom B8G1...B8G6 i przeciwciałami II rzędowymi znakowanymi peroksydazą chrzanową specyficznymi kolejno do izotypu IgG1, IgG2a bądź lgG2b. Współczynnik absorbancji o wartości od 0,35-0,4 dla dwóch próbek (dwa powtórzenia 10 krotnie rozcieńczonego nadsącza zbieranego 24 h po dożywianiu komórek) wskazuje na jednorodność i identyczność z izotopem IgG1 przeciwwciał produkowanych przez wszystkie klony. Jednorodność izotopową przeciwciał potwierdza brak sygnału interakcji przeciwciał II rzędowych specyficznych względem IgG2a lub IgG2b;

Figura 6 przedstawia średnią wartość absorbancji oraz odchylenie standardowe dwóch pomiarów reaktywność(ci) przeciwciał wytwarzanych przez poszczególne klony hybrydom B10DL...B10D6 z przeciwciałami II rzędowymi znakowanymi peroksydazą chrzanową, specyficznymi kolejno do izotypu IgG1, IgG2a bądź IgG2b. Współczynnik absorbancji o wartości od 0,23-0,41 dla dwóch próbek (dwa powtórzenia 10-krotnie rozcieńczonego nadsącza zbieranego 24 h po dożywianiu komórek) wskazuje na jednorodność i identyczność z izotypem IgG1 przeciwciał produkowanych przez wszystkie klony. Jednorodność izotopową przeciwciał potwierdza brak sygnału interakcji przeciwciał II rzędowych specyficznych względem lgG2a lub lgG2b;

Figura 7 przedstawia wartości absorbancji przy długości fali 450 nm, odzwierciedlające zdolność wiązania przeciwciała monoklonalnego B10D2 do antygenu protekcyjnego PA83 w teście kanapkowym ELISA. Do oznaczenia zastosowano komercyjne przeciwciało Mab C86613M, które opłaszczano na płytce w stałej koncentracji 0,5 μg ml, rekombinowany antygen PA83 w następujących stężeniach: 500; 250; 125, 62,5 oraz 31,25 ng/ml, detekcyjne przeciwciało B10D2 w stężeniach: 0,1; 0,4; 0,8 lub 1,2 μg/ml oraz drugorzędowe przeciwciało anty-lgG1 znakowane peroksydazą chrzanową;

Figura 8 przedstawia wartości absorbancji przy długości fali 450 nm, odzwierciedlające zdolność wiązania przeciwciała monoklonalnego B10D2 do antygenu PA4D solubilizowanego z ciałek w teście kanapkowym ELISA. Do oznaczenia zastosowano komercyjne przeciwciało Mab C86613M, które opłaszczano na płytce w stałej koncentracji 0,5 μg/ml, rekombinowany antygen PA83 w następujących stężeniach: 500; 250; 125, 62,5 oraz 31,25 ng/ml, detekcyjne przeciwciało B10D2 w stężeniach: 0,1; 0,4; 0,8 lub 1,2 μg/ml oraz drugorzędowe przeciwciało anty-lgG1 znakowane peroksydazą chrzanową;

Figura 9 przedstawia sekwencję kodującą (A) i mapę sekwencji łańcucha ciężkiego przeciwciała anty-PA4D - fragment stały (HC_const) i zmienny (PA-D4_HCv) (B);

Figura 10 przedstawia sekwencję kodującą (A) i mapę sekwencji łańcucha lekkiego przeciwciała anty-PA4D - fragment stały (LC_const) i zmienny (PA-D4_LCv) (B);

Figura 11 przedstawia plazmid pochodny wektora 1.1 (Plant Research International, Wageningen, NL), zawierającego pełną sekwencję łańcucha ciężkiego przeciwciała pod kontrolą promotora małej podjednostki rubisco chryzantemy i terminatora transkrypcji rubisco.

PL 222 084 B1

Opis skrótów:

LacZ - gen markerowy kodujący enzym β-galaktozydazę, i niżej

Pnos - promotor syntazy nopalinowej

T nos - terminator syntazy nopalinowej

PA-D4_HCv - sekwencja kodująca fragment zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała anty-PA

HCc - sekwencja kodująca fragment stały łańcucha ciężkiego przeciwciała

RbcP - sekwencja kodująca promotor małej podjednostki rubisco chryzantemy

RbcT - sekwencja kodująca terminator tenskrypcji małej podjednostki rubisco chryzantemy

Amp R - gen markerowy oporności na antybiotyk ampicylinę.

Figura 12 przedstawia plazmid pochodny wektora 1.1 (Plant Research International, Wageningen, NL), zawierającego pełną sekwencję łańcucha lekkiego przeciwciała pod kontrolą promotora małej podjednostki rubisco chryzantemy i terminatora transkrypcji rubisco.

Opis skrótów:

LacZ - gen markerowy kodujący enzym, β-galaktozydazę

Pnos - promotor syntazy nopalinowej

T nos - terminator syntazy nopalinowej

PA-D4_LCv - sekwencja kodująca fragment zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała anty-PA

LCc - sekwencja kodująca fragment stały łańcucha lekkiego przeciwciała

RbcP - sekwencja kodująca promotor małej podjednostki Rubisco chryzantemy

RbcT - sekwencja kodująca terminator transkrypcji małej podjednostki rubisco chryzantemy

Amp R - gen markerowy oporności na antybiotyk ampicylinę

Figura 13 przedstawia schemat plazmidu binarnego pBINPA-HC-LC do fransformacji za pomocą Agrobacterium tumefaciens pochodnego plazmidu pBIN1.1. Plazmid pBINPA-HC-LC zawiera sekwencje kodujące łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała monoklonalnego B10D2(,) izotypu IgG1(,) sklonowanego z hybrydomy B10D2 i rekombinowanego do izotypu IgG2a.

Opis skrótów:

LacZ - gen markerowy kodujący enzym β-galaktozydazęO

Pnos - promotor syntazy nopalinowej

T nos - terminator syntazy nopalinowej

PA-D4_LCv - sekwencja kodująca fragment zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała anty-PA

LCc - sekwencja kodująca fragment stały łańcucha lekkiego przeciwciała

PA-D4 HCv - sekwencja kodująca fragment zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała anty-PA

HCc - sekwencja kodująca fragment stały łańcucha ciężkiego przeciwciała

RbcP - sekwencja kodująca promotor małej podjednostki (R) rubisco chryzantemy

RbcT - sekwencja kodująca terminator transkrypcji małej podjednostki (R) rubisco chryzantemy

Npt II - sekwencja kodująca fosfotransferazę neomycyny (gen markerowy kodujący enzym warunkujący na antybiotyk kanamycynę)

LB, RB - odpowiednio lewa i prawa sekwencja graniczna plazmidu binarnego Agrobacterium

Amp R - gen markerowy oporności na antybiotyk ampicylinę

Figura 14 przedstawia elektroforezę produktów reakcji PCR przeprowadzonej na lizatach koloni Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pBINPA-LC-HC) przy wykorzystaniu primerów RHCcF i HCcR (A) oraz rozdział elektroforetyczny produktów reakcji PCR wykonanej na matrycy DNA genomowego izolowanego z liści 26 roślin potencjalnych transformantów TTA2 pokolenia T0 pierwotnych regenerantów, nietransformowanej rośliny kontrolnej oraz plazmidowym DNA wektora pBINPA-HC-LC użytego do transformacji genetycznej tytoniu przy wykorzystaniu primerów RHCcF i HCcR (B), gdzie:

Dla panelu A:

1-23 - kolonie bakterii uzyskane w wyniku elektroporacji plazmidu pBINPA-LC-HC

K- - kontrola negatywna - woda

K+ - kontrola pozytywna - plazmid pBINPA-LC-HC

Dla panelu B:

#1-26 - rośliny transgeniczne TTA2;

KN - kontrola negatywna;

„-” - woda,

KP - plazmid BINPA-HC-LC,

M - marker wielkości

PL 222 084 B1

Figura 15 wykres przedstawia koncentrację w ng/g świeżej tkanki przeciwciał IgG2a w ekstraktach transgenicznego tytoniu pokolenia T0 (B), które zostało wyliczone w oparciu o wartości absorbancji uzyskane w oznaczeniu ELISA (A) w oparciu o krzywą standardową (C), która przedstawia wartość absorbancji w zależności od koncentracji standardu przeciwciała izotypu IgG2a. Słupki na panelu B przedstawiają relatywne miano przeciwciała IgG2a w ekstraktach badanych roślin transgenicznych i kontroli negatywnej (KN) rozcieńczanych od 1:80 do 1:640.

Figura 16 przedstawia analizę ekspresji przeciwciał monoklonalnych w transgenicznych roślinach potomnych pokolenia T1 przy pomocy metody western biot z użyciem kozich przeciwciał specyficznych wobec całej cząsteczki (whole molecule) mysich IgG znakowanych alkaliczną fosfatazą.

gdzie:

M - marker wielkości białek (MBI Fermentas)

KP - kontrola pozytywna,

KN - kontrola negatywna nietransformowanej odmiany tytoniu W38, TTA2-6/1 ... TTA26/3 - potomstwo pokolenia T₁ rośliny TTA2-6; TTA2-3/1 ... TTA2-3/3 - potomstwo pokolenia T1 rośliny TTA2-3; TTA2-11/1 roślina T1 połonin; genotypu TTA2-11.

LC, HC - łańcuch lekki oraz łańcuch ciężki przeciwciał;

Figura 17 przedstawia (r) Relatywne miano przeciwciał Mab B10D2-P(,) specyficznych względem antygenu PA w ekstraktach białkowych z roślin transgenicznych TTA2 pokolenia T0. Słupki przedstawiają sygnał absorbancji próbek transgenicznych roślin, kontroli negatywnej - KN oraz nadsącza z hybrydomy B10D2 rozcieńczanych 1:40 ... 1:320 na płytce płaszczonej antygenem PA83. Detekcję przeciwciał związanych specyficznie z antygenem PA przeprowadzono za pomocą II rzędowego przeciwciała znakowanego peroksydazą chrzanową, specyficznego do łańcucha y_2a;

Figura 18 przedstawia dynamikę zmian ekspresji rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych Mab B10D2-P w trakcie wzrostu roślin i pod wpływem cięcia i (po) nawożeniu(a) pierwotnych regeneratów transgenicznego tytoniu TTA2.

gdzie:

Oznaczenie 1 - oznaczanie Mab B10D2-P po upływie ok. 4-6 tygodni od wysadzenia do gleby pierwotnych regenerantów

Oznaczenie 2 - oznaczanie Mab B10D2-P po upływie 16-20 tygodni od wysadzenia roślin do gleby

Nawożenie - oznaczanie Mab B10D2-P po upływie 20-24 tygodni od wysadzenia roślin do gleby, a następnie po 4 dniach od ogłowienia (ścięcie pędu poniżej ostatniego dolnego liścia) i zastosowania intensywnego nawożenia mineralnego 2x skoncentrowaną mineralną pożywką wg. Murashige i Skoog, 1962 (MS) - oznaczano świeżo rozwinięte liście wyrastające 4 dni po zabiegu.

Sposób otrzymywania przeciwciał monoklonalnych polega na zastosowaniu jako immunogenu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych. Pochodzące z bakterii ciałka inkluzyjne, zawierające rekombinowane białka, zastosowane w procedurze szczepienia jako jedyny immunogen, wzbudzają pojawienie się limfocytów (plazmocytów) wytwarzających przeciwciała specyficzne do natywnej formy białka. Szczególnym przykładem wynalazku jest sposób immunizacji domięśniowej myszy szczepu BALB/c przy użyciu ciałek inkluzyjnych PA4D zawierających 4-tą C-terminalną domenę antygenu protekcyjnego laseczki wąglika, korzystnie z dodatkiem adiuwanta wodorotlenku glinu. Efektem immunizacji ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi PA4D jest wysokie miano przeciwciał specyficznych względem natywnego antygenu protekcyjnego laseczki wąglika (Fig. 2), a jednocześnie, co wykazano w teście in vitro z wykorzystaniem unieśmiertelnionej linii makrofagów J774A.1, cechujących się zdolnością neutralizacji letalnego kompleksu toksyn (Fig. 3). Ochronne właściwości surowicy myszy szczepionej czterokrotnie domięśniowo przy pomocy ciałek inkluzyjnych zawierających PA4D wykazano w teście z użyciem rekombinowanego natywnego antygenu protekcyjnego, natywnego białka czynnika letalnego i linii makrofagów wysoce wrażliwej na powstający z udziałem tych białek letalny kompleks toksyn. Sposób immunizacji za pomocą bakteryjnych ciałek inkluzyjnych jest nie oczywistym i kontrprzeciwstawnym sposobem postępowania w stosunku do znanych z literatury naukowej i w opisach patentowych sposobem otrzymywania przeciwciał monoklonalnych. Brak w literaturze danych odnośnie użycia ciałek inkluzyjnych w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych, jest konsekwencją licznych badań, które wskazują, że ciałka inkluzyjne otrzymane jako wynik nadekspresji rekombinowanych białek w systemie bakteryjnym, stanowią zdenaturowaną i niefunkcjonalną ich postać [Marston F.A. (1984) The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli, Bioch J, 240, 1-12; Baneyx, F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Current Opinion

PL 222 084 B1 in Biotechnology 10, 411-421; Sahdev S., Khattar S.K., and Saint K.S. (2008) Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies Molecular and Cellular Biochemistry, 307, 249-264], która wymaga zastosowania zindywidualizowanych procedur oczyszczania i renaturacji [Rudolph, R. and H Lilie, H. (1996) In vitro folding of inclusion body proteins. The FASEB J. 10, 49-56), w celu późniejszego użycia do immunizacji, czy wykorzystania jako składnika szczepionki [Clark, E.D.B., 2001. Protein refolding for industrial processes. Curr. Opin. Biotechnol. 12, 202-207]. Potwierdzeniem ‘defektywnych‘ własności ciałek inkluzyjnych jest powstawanie tego rodzaju struktur również w komórkach eukariotycznych. Pojawianie się tego rodzaju struktur stanowi, efekt starzenia i konsekwencję procesów o charakterze patologicznym, przejawia się brakiem funkcjonalności białek, zaś klinicznie, występowaniem między innymi chorób neurodegeneracyjnych [Kopito, R.R. (2000) Aggresomes, inclusion bodies and protein agregation, Trendsin Cell Biology, 10, 524-530]. Podkreśla się ponadto, że ciałka inkluzyjne jako takie charakteryzują się niską immunogennością [Gerdts V, Mutwikri GK, Tikoo SR, Babiuk LA (2006) Mucosal delivery of vaccines in domestic Animals, Vet. Res. 37: 487-510].

Poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania według wynalazku.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Schemat otrzymania konstrukcji genowych i ekspresji 4-ej domeny antygenu protekcyjnego PA laseczki wąglika (Bacillus anthracis)

Dotychczasowe badania nad wykorzystaniem antygenu PA jako komponentu szczepionki wskazują, że protekcję przeciw wąglikowi można uzyskać stosując jako składnik szczepionki antygen protekcyjny PA bądź fragmenty toksyny PA. Wykazano, że istotne efekty ochronne uzyskać można stosując jako komponent szczepionki C-końcowy fragment antygenu PA nazywany domeną czwartą antygenu PA (PA4D). Właściwości ochronne C-końcowego odcinka antygenu PA wynikają z faktu, że w tym obszarze białka, zlokalizowano dwa regiony, poprzez które antygen PA przyłącza się do receptorów na komórkach ssaków. Związanie antygenu PA na komórkach gospodarza, jest krytycznie istotnym etapem, stanowiącym wstęp do przyłączania kolejnych toksyn wąglika i finalnie endocytozy kompleksu do komórki gospodarza. Interesujący fakt wynika z badań krystalograficznych, które wskazują, iż domena 4 przypomina strukturą budowę immunoglobuliny i zawiera od końca C motyw struktury szpilki, następnie alfa-helisy i układu polipeptydu typu ‘beta-sandwich'. Badania krystalograficzne potwierdziły, że głównie domena 4 antygenu PA partycypuje w interakcji pomiędzy receptorem ATR/TEM8 i PA. Niedawne badania porównawcze zdolności protekcyjnej kompletnej toksyny PA83 i C-końcowego 16 kDa fragmentu PA4D wskazują na daleko idącą szczepionkową ekwiwalentność obydwu form białka (Flick-Smith et al. 2002). Poziom ekspresji białek w systemie bakteryjnym zależy w znacznym stopniu od ich specyfiki, funkcji, a także, co istotne wielkości. Projektując ekspresję i użycie do immunizacji antygenu PA4D, uwzględniono spodziewaną wyższą wydajność wytwarzania niewielkiego białka jakim jest domena 4 antygenu PA.

Otrzymano plazmid do ekspresji domeny 4 antygenu protekcyjnego Bacillus anthracis oraz ekspresję tego białka w postaci ciałek inkluzyjnych w systemie bakteryjnym. Do konstrukcji wektora ekspresyjnego E. coli wykorzystano plazmid pCR2.1 udostępniony przez Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii w Puławach. Plazmid zawiera pełną sekwencję nukleotydową antygenu protekcyjnego.

Przygotowanie konstrukcji genetycznej i uzyskanie ekspresji PA-4P w systemie bakteryjnym.

W celu otrzymania antygenu protekcyjnego PA4D w postaci ciałek inkluzyjnych wykorzystano bakteryjny wektor ekspresyjny pIGCmT7Kes (fig. 1.1). Wektor pIGCmT7Kes (4926 pz.) powstał w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie, w pracowni prof. Andrzeja Płucienniczaka. System ekspresji oparty o wektor pIGGmT7Kes jest przedmiotem odrębnego międzynarodowego zgłoszenia patentowego, o numerze publikacji WO2007142547. Plazmid pIGCmT7Kes zawiera gen oporności na chloramfenikol, gen oporności na kanamycynę, terminator tryptofanowy, promotor RNA polimerazy z faga T7 oraz sekwencję kodującą kodon stop transkrypcji pochodzącą z faga TT.

Z plazmidu zawierającego pełną sekwencję nukleotydową PA powielono w reakcji PCR fragment DNA kodujący C-terminalną część antygenu PA4D. Startery użyte do reakcji PCR zaprojektowano na podstawie sekwencji DNA kodującej PA-4D. Startery wprowadzały miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne: EcoRI i Ndel dla primeru wiodącego, oraz HindIII dla primeru odwrotnego. Powielony fragment o długości 450 pz rozdzielono elektroforetycznie i wyizolowano z żelu poliakryl(o)amidowego, a następnie trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII i odbiałczono.

PL 222 084 B1

Otrzymane fragmenty DNA ligowano z wektorem pBluescript SK(-), trawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Produkt ligacji mobilizowano do komórek E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych komórek E. coli, obecność wklonowanej wstawki potwierdzono analizą restrykcyjną, a poprawność sekwencji zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Z wektora pBluescript SK(-) enzymami restrykcyjnymi Ndel i Hindlll wytrawiono i odbiałcza(o)no, fragment kodujący C-terminalny odcinek antygenu PA4D. Otrzymany fragment DNA ligowano z wektorem pIGCmT7Kes który poddano trawieniu tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli szczepu NM522. Po izolacji DNA plazmidowego z transformowanych kolonii E. coli, zastosowano trawienie enzymami restrykcyjnymi i potwierdzono obecność wklonowanej wstawki o długowi 449 pz kodującej PA4D (fig. 2.1) w wektorze pIGCmT7Kes. Uzyskany plazmid nazwano pIGT7KesPA-4D. Plazmidem pIGT7KesPA-4D zawierającym sprawdzoną wstawkę PA4D transformowano komórki E. coli szczepu BL21(DE3).

Procedura przygotowywania ciałek inkluzyjnych PA4D do immunizacji zwierząt obejmuje:

• hodowlę bakterii E. coli eksprymujących rekombinowane białko, • izolację ciałek inkluzyjnych zawierających PA-4D • hodowlę bakterii E. coli zawierających plazmid pIGCmT7Kes bez wstawki, • analizę obrazu prób ciałek inkluzyjnych poddanych elektroforezie w żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE) i pomiar stężenia białka w preparatach.

Do produkcji antygenu użyty został otrzymany w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków szczep bakteryjny E. coli BL21(DE3) transformowany plazmidem pIGT7KesPA-4D, zawierającym fragment DNA kodujący PA-4D.

Bakterie E. coli szczepu BL21(DE3) zawierające zrekombinowny plazmid hodowano przez 3 godziny przy temperaturze 37°C w pożywce Luria-Bertani (LB), zawierającej chloramfenikol (20 μg/ml), po czym rozcieńczono świeżym podłożem LB (1:100). Ekspresję białka indukowano przez dodanie IPTG do uzyskania stężenia końcowego 0,1 mM. Osad komórek zawieszono w buforze do Iizy (0,5 M NaCl, 0,05 M Tris HCl pH 7,5, 0,01 M EDTA, 0,005 M 2-Mercaptoethanol, 0,35 mg/ml lizozym) i inkubowano 30 minut w temp. 20°C. Dodano Triton X-100 do uzyskania stężenia 1%. Zawiesinę sonifikowano i zwirowano. Osad ciałek inkluzyjnych dwukrotnie zawieszano w buforze PBS zawierającym 1% Triton Χ-100, sonifikowano i zwirowano. Wyizolowane ciałka inkluzyjne dwukrotnie przemywano buforom PIS. Finalnie ciałka inkluzyjne zawieszono w buforze PBS.

Analiza oczyszczonych ciałek inkluzyjnych

Ekspresję rekombinowanego białka PA-4D w lizatach E. coli potwierdzono poddając próbki rozdziałowi elektroforetycznemu w 15% żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE). Białka uwidaczniano w żelu przy użyciu barwnika Coomassie Brillant Blue G (fig. 3.1).

Pomiar stężenia białka.

Stężenie białka w uzyskanym preparacie mierzono metodą Bradforda. Jako standard(u) używano albuminę wołową (BSA).

Wnioski

W układzie ekspresyjnym E. coli otrzymano wydajną ekspresję C-terminalnego odcinka antygenu protekcyjnego PA. Z1 litra hodowli bakterii E. coli szczepu BL21(DE3) niosących plazmid pIGT7KesPA-4D uzyskiwano około 4 mg ciałek inkluzyjnych zawierających ok. 95% białka PA-4D.

P r z y k ł a d 2

Schemat domięśniowej immunizacji myszy BALB/c dla potrzeb wytworzenia przeciwciał monoklonalnych.

Samiczki myszy szczepu BALB/c w wieku 6-8 tyg. poddano czterokrotnej immunizacji domięśniowej przy użyciu ciałek inkluzyjnych zawierających białko PA4D. Zwierzęta szczepiono w następujących terminach: 7, 21, 35 i 70-tym dniu doświadczenia. Zwierzę od którego pobrano śledzionę do otrzymania przeciwciał monoklonalnych na drodze fuzji splenocytów z komórkami mysiego szpiczaka, immunizowano dodatkowo dwukrotnie 10 dni i 3 dni przed pobraniem śledziony tj. w 92 i 102 dniu doświadczenia. W trakcie eksperymentu pobierano krew w następujących terminach: 7 dni przed pierwszą immunizacją, a następnie w 14, 28, 42, 56, 62, 77, 98 i 105 dniu doświadczenia. Myszom podawano jednorazowo w 100 μl PBS 25 μg ciałek inkluzyjnych z dodatkiem adiuwanta, wodorotlenku glinu, który stanowił ¼ aplikowanej objętości. Po zwirowaniu w osoczu krwi oznaczano przeciwciała IgG anty-PA według następującej procedury. Płytkę Nunc polysorb opłaszczano antygenem protekcyjnym PA83 (List Biological Laboratories, # 171C) w buforze PBS pH 7,4 w stężeniu 1 μg/ml przez

PL 222 084 B1 noc w temp 4°C. Następnie płukano 3x w PBST (PBS + 0,05% Tween 20) i blokowano przez 2 h przy użyciu 5% mleka odtłuszczonego w objętości 400 μl/dołek. Płytki ponownie płukano 3x w PBST. W kolejnym etapie na dołki płytki nakładano osocze myszy z poszczególnych terminów immunizacji rozcieńczone w PBS, w następujących proporcjach: 1:80; 1:160; 1:320 oraz 1:640. Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 40 min na wytrząsarce do mikropłytek przy obrotach 400 rpm, a następnie płukano trzykrotnie w PBST. W kolejnym etapie, na poszczególne dołki nakładano II rzędowe przeciwciało kozie anty-IgG mysie znakowane peroksydazą chrzanową (Sigma), rozcieńczano 1:5000 w PBS, inkubowano na wytrząsarce jak wyżej przez 40 min i płukano trzykrotnie w PBST. Reakcję wywoływano przez podanie substratu TMB, a następnie 30 min inkubowano w ciemności. Reakcję przerywano przez dodanie do poszczególnych dołków 50 μl 1N kwasu siarkowego. Bezpośrednio po przerwaniu reakcji płytki odczytywano przy użyciu czytnika mikropłytek (Biorad, Model 680) przy długości fali A450. Finalna objętość badanych próbek osocza oraz reagentów w poszczególnych dołkach wynosiła 100 pi, za wyjątkiem etapu blokowania (400 μθ i zatrzymania reakcji (150 μ^. W trakcie poszczególnych inkubacji, za wyjątkiem etapu blokowania, płytki przykrywane były samoprzylepną folią. Wyniki oznaczania miana (specyficznych) przeciwciał anty-PA przedstawiono na Fig. 2. Wynikiem czterokrotnej immunizacji myszy jest odpowiedź immunologiczna(,) którą oznaczano poprzez pomiar przeciwciał IgG, reaktywnych względem natywnego antygenu PA83. Przeciwciała anty-PA pojawiają się po drugiej immunizacji. Rezultatem podawania kolejnych dawek przypominających jest wzrost miana przeciwciał anty-PA.

P r z y k ł a d 3

Test neutralizacji toksyn PA/LF laseczki wąglika

Wygodnym narzędziem oceny właściwości ochronnych surowicy szczepionych zwierząt jest test neutralizacji toksyn in vitro tj. zapobiegania powstawania kompleksu egzotoksyn na komórkach gospodarza. W warunkach infekcji na komórkach gospodarza, powstaje letalny dla komórek kompleks, składający się z antygenu protekcyjnego PA oraz czynnika letalnego LF. Rezultatem efektywnego szczepienia przeciwko laseczce wąglika z użyciem antygenu protekcyjnego jako immunogenu, jest generowanie przeciwciał skierowanych do regionów tego białka które zmniejszają bądź uniemożliwiają jego interakcje z komórkami gospodarza, która zachodzi przede wszystkim poprzez swoiste receptory ATR (ang. Anthrax Toxin Receptor) oraz CMG2 (ang. Capillary Morphogenesis Protein 2). Jakkolwiek toksyny laseczki wąglika w procesie zakażenia wchodzą w interakcje z różnymi komórkami gospodarza, to jednak wykazują one szczególną swoistość względem komórek dendrytycznych i makrofagów. Z uwagi na te właściwości dogodny model do badania odpowiedzi immunologicznej po podaniu PA, stanowi linia mysich makrofagów J774A cechująca się nominalnie nieograniczoną proliferacją. Przyjmuje się, że wynik testu neutralizacji toksyn PA/LF, który polega na ocenie stopnia przeżywalności makrofagów mysich w kulturze in vitro po dodaniu toksyn, stanowi istotny wskaźnik efektywności przeciw-wąglikowej odpowiedzi immunologicznej (US7261900B2, Boyaka PN, Tafar A, Fischer R, Leppla SH, Fujihashi K, Jerry R. McGhee JR (2003) Effective Mucosal Immunity to Anthrax: Neutralizing Antibodies and Th Cell Responses Following Nasal Immunization with Protective Antigen, The Journal of Immunology 170: 5636-5643). Test neutralizacji toksyn PA/LF przez osocze myszy wykonano następująco. Na pojedynczą 96 dołkową płytkę przygotowano 20 ml zawiesiny komórek o gęsto₅ ści 1x10/ml. Makrofagi nanoszono na płytkę w objętości 200 μl/dołek. Inkubowano (je) przez noc w inkubatorze CO2 w temp. 37°C, w celu uzyskania adhezji komórek do dna studzienek. Przygotowano następnie rozcieńczenia próbek surowicy. W tym celu przygotowano płytkę pomocniczą, którą zablokowano przez noc przygotowanym wcześniej jałowym 2% roztworem albuminy wołowej. Na płytce pomocniczej przygotowano po 125 μl ośmiu rozcieńczeń osocza w medium RPMI bez FCS (FCS płodowa surowica cielęca) począwszy od 1:50 do 1:6400. Poszczególne rozcieńczenie próbki wykonano w trzech powtórzeniach. Z kultury makrofagów odpipetowano medium hodowlane, a następnie płytkę przepłukano medium RPMI bez FCS. Naniesiono następnie po 100 μl odpowiednich rozcieńczeń surowicy, dodano 100 μl przygotowanej uprzednio mieszaniny toksyn wąglika zawierającą po 100 ng/ml PA oraz LF, co umożliwiło uzyskanie stężenia końcowego po 50 ng/ml obu toksyn. Próbki wymieszano na drodze pipetowania. Do studzienek w kolejnych kolumnach naniesiono po 250 ul mediów kontrolnych, a następnie inkubowano w temp. 37°C przez 30 minut. Wykonano standardowy test cytotoksyczności z wykorzystaniem barwnika MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid), którego redukcja do formazanu o zabarwieniu fioletowym odzwierciedla aktywność dehydrogenaz mitochondriów komórek przeżywających w obecności toksyn. Do każdej studzienki dodano 25 μl roztworu 5 mM MTT w PBS. Inkubowano przez 1 godzinę w inkubatorze CO₂ w temp. 37°C,

PL 222 084 B1 a następnie przeprowadzono lizę komórek. Z każdego dołka odpipetowano po 60 μl medium, a następnie na płytkę naniesiono po 60 μl buforu do lizy (0,2N HCl, 10% Triton X-100, 20% izopropanol) i 60 μl DMSO. Inkubowano przez noc w temp. 37°C. Następnego dnia odczytywano absorbancję na czytniku mikropłytek. Mierzono stopień zmiany barwy z żółtej na fioletową przez odczyt absorbancji przy dwóch długościach fali światła: 585 nm i 655 nm (jako referencja). Wartość zmiany w kierunku fioletowej jest wprost proporcjonalna do ilości komórek, które przetrwały inkubację z toksynami wąglika. Zastosowano następujące media i bufor do lizy: Medium podstawowe zawierające 10 ml L-glutaminy, 2,5 ml peni-strep, RPMI base do 500 ml objętości (465 ml); Medium kontrolne: 2 ml L-glutaminy, 0,5 ml penicylina-streptomycyna, 10 ml FCS, RPMI base do 500 ml objętości (87,5 ml); Medium kontrolne: 1 ml Triton - X100, 99 ml RPMI Base; Bufor do lizy: 0,2N HC1,10% Triton X-100, 20% izopropanol. Na fig. 3 przedstawiono wyniki testu przeżywalności mysich makrofagów, odzwierciedlający efekt neutralizacji letalnego kompleksu toksyn laseczki wąglika PA/LF przez surowicę myszy 2E-1 szczepionej czterokrotnie przy użyciu ciałek inkluzyjnych zawierających białko PA4D, w porównaniu do kontroli jaką stanowiła próbka pobrana od myszy kontrolnej, poddanej czterokrotnej iniekcji według identycznego schematu jak myszy grupy doświadczalnej preparatem zawierającym jedynie adiuwant w buforze PBS. Efektem immunizacji ciałkami inkluzyjnymi jest znacząco wysoka przeżywalność komórek makrofagów w obecności toksyn laseczki wąglika, zależna od miana surowicy oraz całkowity brak właściwości ochronnych surowicy pochodzącej od zwierzęcia kontrolnego.

P r z y k ł a d 4

Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych

Materiał wyjściowy do otrzymania linii komórkowych hybrydom, wytwarzających przeciwciała monoklonalne stanowi śledziona pozyskana od myszy immunizowanej oraz komórki linii nowotworowej szpiczaka mnogiego. Dawcę plazmocytów, tj. komórek śledziony wytwarzających przeciwciała stanowiła mysz oznaczona symbolem 2E-1, immunizowana domięśniowo ciałkami inkluzyjnymi zawierającymi PA4D z adiuwantem wodorotlenkiem glinu, jak opisano w przykładzie nr 3 najpierw czterokrotnie w 7, 21, 35 i 70 -tym dniu doświadczenia, a następnie dwukrotnie na 10 i 3 dni przed pobraniem śledziony tj. w 92 i 102 dniu doświadczenia. Każdorazowo w pojedynczej dawce aplikowano 25 μg białka PA4D w ciałkach inkluzyjnych. Kluczowym etapem otrzymywania linii komórkowych hybrydom jest fuzja komórek śledziony z komórkami szpiczaka [Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-497]. Etapem poprzedzającym fuzję stanowiło przygotowanie linii komórkowej szpiczaka oraz izolacja komórek śledziony. Linię komórkową szpiczaka mnogiego, oporną na 8-azoguanidynę hodowana przez 48 h przed użyciem w warunkach selekcji i po wyeliminowaniu czynnika selekcyjnego ustalono gęstość ₅ zawiesiny 5x10⁵ komórek/ml. Komórki szpiczaka zbierano i wirowano w 50 ml probówce Corninga przy 1200 rpm w medium SFM. Usunięto supernatant i komórki zawieszano w 1 ml medium DMEMSFM (Medium Dulbecco z dwuwęglanem sodowym, niezbędnymi aminokwasami, 50 U penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny, 4 mM L-glutaminy, bez dodatku surowicy cielęcej). Czynność wirowania powtarzano trzykrotnie. Mysz immunizowano 72 h przed pobraniem śledziony, następnie bezpośrednio przed splenoktomią poddano anestezji poprzez odparowanie w zamkniętej zlewce 200 μl izofluranu, pobrano maksymalną objętość krwi (ok. 1,5 ml) i dokonano eutanazji. Sterylizowano powierzchnię skóry w 70% etanolu i po otwarciu powłok brzusznych pobrano śledzionę. Śledzionę wypreparowywano i umieszczono na szalce Petriego w medium DMEM-SFM. Za pomocą sterylnej pęsety śledziona została rozerwana, a komórki uwolnione do medium. W celu przyspieszenia uwalniania komórek śledziony, kilkakrotnie przepipetowano medium w którym pływają strzępki zrazików śledziony. Zebrano zawiesinę komórek śledziony do 15 ml probówki Corninga i umożliwiono sedymentacje większych fragmentów tkanki, a następnie supernatant przepipetowano do kolejnej probówki, wirowano 5 min przy 1200 rpm. Komórki zawieszono ponownie w 10 ml medium DMEM-SFM i policzono gęstość za pomocą hemocytometru. Dla potrzeb fuzji zastosowana proporcja komórek śledziony do komórek szpiczaka wynosiła 5:1. W jednej probówce poddawano fuzji 2 x 10⁸ komórek śledziony. W probówce o pojemności 12 ml zmieszano we właściwej proporcji odpowiednią ilość komórek szpiczaka i komórek śledziony, a następnie komórki wirowano i zawieszono w 0,5 ml medium DMEM-SFM. Ponownie wirowano przy 800 rpm do uzyskania luźnego peletu mieszaniny komórek szpiczaka i śledziony, a następnie przepipetowano do probówki o pojem. 50 ml. Do mieszaniny dodano 0,5 ml 40% PEG i zawartość łagodnie wstrząsano w celu wymieszania i rozerwania tworzących się strontów. Po ok. 30 sekundach dodano ponownie 0,5 ml 40% PEG mieszając jw. W ciągu 1-2 minut dodawano powoli 1 ml medium DMEM-SFM, łagodnie mieszając, a następnie przez 6 minut dodano dalsze 20 ml medium.

PL 222 084 B1

Zawiesinę fuzantów wirowano 5 min przy 1200 rpm, a następnie zawieszono w 20 ml medium. Fuzanty rozpipetowano na dwie płytki 96 dołkowe zawierające jako warstwę odżywczą mysie makrofagi wyizolowane uprzednio od jednego zwierzęcia i kulturę umieszczono w inkubatorze CO2 w temp. 37°C. Następnego dnia komórki odżywiano 0,1 ml/dołek medium zawierającym 10% surowicę cielęcą z dodatkiem HTM (Hypoksantyno/Tymidyna plus 2x metotreksan). Trzeciego dnia hodowli odpipetowano 0,1 ml medium i dodano świeżego 0,1 ml medium z dodatkiem HT. W 7 i 11 dniu kultury powtórzono odżywianie komórek jak wcześniej poprzez wymianę 0,1 ml medium. Następnie komórki odżywiano świeżym medium selekcyjnym co 7 dni. Po 3 tygodniach kultury zebrane nadsącza z hodowli fuzantów/hybrydom oznaczano na obecność przeciwciał IgG anty-PA. Oznaczanie miana przeciwciał w nadsączach z poszczególnych dołków w których hodowano hybrydomy wykonano zasadniczo według procedury opisanej w przykładzie 2, z tą różnicą, że w miejsce surowic do dołków na płytce nakładano nadsącza zbierane z poszczególnych dołków 24 h po odżywieniu komórek, które rozcieńczano w buforze PBS 1:20. Wynik oznaczania przeciwciał IgG anty-PA przedstawiony na Fig. 4 odzwierciedla usytuowanie kolonii hybrydom na płytkach A i B oraz sekrecję przez nie przeciwciał. Z przeprowadzonej analizy wynika, że na obu płytkach znajdują się hybrydomy wytwarzające przeciwciała specyficzne względem PA. W oparciu o wynik testu ELISA rozklonowywano hybrydomy znajdujące się w dołkach w których uzyskano wysoki sygnał absorbancji. Klonowanie przeprowadzono najpierw na płytkach z 48 dołkami, a następnie na płytkach 24 dołkowych i finalnie 12 i 6 sześciodołkowych. W międzyczasie nadsącza analizowano pod kątem reaktywności z antygenem PA, a linie niskoreaktywne oraz cechujące się niskim wigorem wzrostu eliminowano z dalszego przesiewania i klonowania. Zarówno linie rozklonowane, jak też te będące w trakcie klonowania, analizowano pod kątem ich specyficzności względem antygenu oraz izotopu w obrębie klasy IgG. Do oznaczania izotypów zakwalifikowano łącznie nadsącza z 12 dołków. Oznaczanie izotypów przeciwciał specyficznych względem PA przeprowadzono według następującego protokołu. Płytki Nunc polysorb opłaszczano antygenem PA w buforze PBS pH 7,4 w stężeniu 1 μg/ml przez noc w temp 4°C, 100 μl/dołek, płukano 3x PBST, a następnie blokowano przy użyciu 5% mleka odtłuszczonego w buforze PBS przez 2 h, 400 μl/dołek. Na płytki płukane jw. nakładano po 8 powtórzeń badanego nadsącza rozcieńczonego 1:400 w PBS, inkubowano na wytrząsarce przez 40 min przy 400 rpm. W kolejnym etapie płytki płukano 3x PBST, a następnie do określonych dołków naniesiono przeciwciała II rzędowe znakowane peroksydazą chrzanową (Boehringer Manhaim) rozcieńczone 1:10000: anty-mysie IgGl, anty-mysie IgG2a, anty-mysie IgG2b oraz anty-mysie IgM (Sigma) rozcieńczenie 1:2000. Płytki inkubowano na wytrząsarce jw., płukano trzykrotnie, a następnie nakładano substrat dla peroksydazy chrzanowej TMB. Po 0,5 h inkubacji w ciemności oraz zatrzymaniu reakcji poprzez podanie 50 μl/dołek 2N kwasu siarkowego, mierzono absorbancję na czytniku mikropłytek przy długości fali 450 nm. W wyniku klonowania i oznaczania izotypów rozklonowanych linii uzyskano dwie linie hybrydom B8G i B10D, z których każda reprezentuje jednorodny izotyp IgG1, co oznaczono w opisanym wyżej teście ELISA, właściwym do detekcji izotypów przeciwciał (Fig. 5 i Fig. 6).

P r z y k ł a d 5

Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli komórkowej hybrydomy

W celu oczyszczenia przeciwciał z linii hybrydomy B10D2 oraz B8G wykorzystano komercyjny zestaw Protein A Antibody Purification Kit firmy Sigma-Aldrich (Sigma, No PURE-1). Oczyszczanie przeciwciał przeprowadzono zgodnie z firmową instrukcją dołączoną przez producenta. Klarowny supernatant nadsącza z hodowli hybrydom zawierający przeciwciała, nanoszono na kolumnę zawierającą białko A po uprzednim dodaniu do supernatantu hybrydom firmowego buforu stymulującego wiązanie z białkiem A (Binding Buffer). Po związaniu przeciwciał, nadmiar białek nie zaadsorbowanych wymywano, a następnie po odsoleniu, związane przeciwciała wymywano z kolumny przy użyciu firmowego buforu do elucji. Przy użyciu buforu do elucji ustalono koncentrację przeciwciał na poziomie 1 μg/μl. Porcje przeciwciał zamrożono w temperaturze -20°C.

P r z y k ł a d 6

Reaktywność przeciwciała B10D2 w teście kanapkowym ELISA z natywnym antygenem PA oraz antygenem PA4D solublizowanym z ciałek inkluzyjnych.

Zdolność interakcji przeciwciała monoklonalnego B10D2 z natywnym antygenem PA83 kB oraz antygenem PA4D solublizowanym z ciałek inkluzyjnych oceniano w teście kanapkowym ELISA. W teście tym w serii odrębnych doświadczeń badano zdolność wykorzystania jako przeciwciała kotwiczącego do wykrywania domeny 4-tej antygenu protekcyjnego, określonego przeciwciała monoklonal14

PL 222 084 B1 nego z panelu dostępnych przeciwciał komercyjnych. Spośród przeciwciał reagujących z domeną 4-tą antygenu protekcyjnego do przeprowadzenia oceny interakcji przeciwciała B10D2 z natywnym PA i PA4D wytypowano przeciwciało izotypu IgG2a firmy Biodesign/Meridian Life Sciences oznaczone w katalogu #C88613M. Jedynie para przeciwciał C86613M/B10D2, gdzie przeciwciało C86613M użyto jako przeciwciało kotwiczące, zaś B10D2 jako przeciwciało detekcyjne, pozwalała na jakościowe oraz ilościowe wykrywanie natywnego antygenu PA83 oraz PA4D (Fig. 7 oraz Fig. 8). W celu jakościowego oraz ilościowego wykrywania PA83 oraz PA4D wykonywano test kanapkowy ELISA wg. Poniższej procedury. Na płytce płaskodennej Nunc maxisorb kotwiczono (opłaszczano) przez noc w stężeniu 1,0 μg/ml w buforze węglanowym pH 9,6 przeciwciało monoklonalne C86613M. Następnie płytkę płukano trzykrotnie w buforze PBS pH 7,4 z dodatkiem 0,05% Tween 20, blokowano w 5% mleku odtłuszczonym w buforze PBS i po kolejnej rundzie płukania na płytkę nanoszono standard natywnego antygenu protekcyjnego PA83 (Biological List code 171C) względnie standard PA4D poddany solubilizacji z ciałek inkluzyjnych według następującej procedury. Z zawiesiny ciałek inkluzyjnych pobrano 20 μΐ i zawieszono w 380 μΐ PBS+ 0,1% Triton Χ-100. Worteksowano 30 min, a następnie żwirowano na mikrowirówce Ependorf przez 10 min przy 10 000 obrotach. W supernatancie oznaczano zawartość białka ogólnego i na podstawie analizy zawartości białka po rozdziale na żelu techniką SDSPAGE kalkulowano koncentrację PA4D. Standardy nakładano w czterech powtórzeniach w następujących stężeniach: 500, 250, 125, 62,5 oraz 31,25 ng/ml, inkubowano przez 45 minut na wytrząsarce przy 300 obr./min. Po wypłukaniu, do dołów, w których nałożono uprzednio cztery powtórzenia standardu, naniesiono przeciwciało B10D2 w czterech następujących stężeniach: 0,1; 0,4; 0,8 i 1,2 μg/ml, inkubowano na wytrząsarce przy 300 obr./min, płukano jw., a następnie nakładano w rozcieńczeniu 1:10000 II rzędowe przeciwciało znakowane peroksydazą chrzanową specyficzne wobec łańcucha γ₁ (Boehringer). Po 45 minutach inkubacji na wytrząsarce i serii płukań na płytkę nałożono substrat TMB (Sigma). Płytkę inkubowano w ciemności przez 30 minut, a następnie przerwano reakcję poprzez dodanie do poszczególnych dołków po 50 μΐ 1N kwasu siarkowego. Wynik reakcji odczytywano za pomocą czytnika mikropłytek firmy Biorad przy długości fali 450 nm. Porównanie wpływu różnych stężeń przeciwciała wykrywającego B10D2 na wielkość sygnału odczytywanego przy fali 450 nm wskazuje, że największy przyrost sygnału absorbancji stwierdza się w przedziale stężeń 0,1 do 0,4 μg/ml. Można zatem przyjąć, że przy stężeniu ok. 0,4 μg/ml przeciwciała wykrywającego, w danych warunkach reakcji zbliża się do wartości „wysycenia”, w rezultacie czego dalsze zwiększenie stężenia przeciwciała wykrywającego nie wywołuje równie wysokiego wzrostu absorbancji. Zależność absorbancji od parametrów stężenia natywnego standardu antygenu protekcyjnego PA83 oraz rekombinowanego PA4D zawartego w ciałkach inkluzyjnych, od stężenia przeciwciała B10D2, wskazuje na równoczesną interakcję obydwu przeciwciał tj. komercyjnego przeciwciała C86613M oraz przeciwciała monoklonalnego B10D2 zarówno z natywnym PA83 (Fig. 6), jak też białkiem PA4D solubilizowanym z ciałek (Fig. 8). Równoczesne powinowactwo przeciwciała C86613M oraz B10D2 do antygenu PA4D solubilizowanego z ciałek wskazuje, że zawarty w ciałkach inkluzyjnych antygen cechuje się równoczesnym zachowaniem natywnej konformacji w dwóch odrębnych regionach 4-ej domeny, podobnie jak występuje to w natywnym rekombinowanym białku PA83. Ilość domen w ciałkach PA4D równocześnie dostępnych dla Mab C86613 oraz Mab B10D2 jest mniejsza, niż w natywnym rekombinowanym PA83, o czym świadczą niższe wartości absorbancji w ELISA kanapkowej z użyciem tych samych stężeń PA4D (Fig. 8) oraz PA83 (Fig. 7).

P r z y k ł a d 7

Klonowanie sekwencji DNA kodującej przeciwciało monoklonalne B10D2.

Klonowania sekwencji przeciwciała dokonano w trzech etapach: klonowano najpierw fragment kodujący region zmienny łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała B10D2, a następnie odcinek kodujący stałe fragmenty łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała klasy IgG2a oraz finalnie złożono na drodze klonowania pełną sekwencję przeciwciała hybrydowego obejmującą gen dla łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała IgG2a z determinantą regionu zmiennego przeciwciała B10D2. Do izolacji mRNA kodującego fragmenty zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała wykorzystano kultury 4-dniowych komórek hybrydomy oznaczonej B10D2. Komórki zbierano z płytki hodowlanej po uprzednim odpipetowaniu nadsącza i zawieszano w PBS. Do izolacji mRNA wykorzystano kit firmy Novagen (Straight A's™ mRNA Isolation Systems nr kat. 70752-3). Izolację mRNA wykonano zgodnie z instrukcją producenta. Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy pomocy kitu Novagen (First Strand cDNA Synthesis Kit, nr kat. 69001). Następnie w reakcji PCR zostały namnożone fragmenty zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała B10D2. Wykorzystano do tego celu zestaw

PL 222 084 B1 starterów firmy Novagen (Ig-primer set Amplification of human and mouse immunoglobulin variable regins, nr kat. 69831-3).

Produkty PCR kodujące fragmenty zmienne łańcucha lekkiego LC i łańcucha ciężkiego HC wklonowano do wektora pGEMTEasy (Promega, nr kat. A1360) uzyskując odpowiednio plazmidy pG8LCv 1 i pG8HCv1 a następnie zsekwencjonowano.

W celu klonowania fragmentów stałych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciał IgG2a, przy użyciu zestawu z firmy Novagen, nr kat. 70752-3 z mysich komórek wyizolowanych z grasicy uzyskano mRNA. Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy pomocy zestawu Novagen, nr kat. 69001. Fragmenty stałe immunoglobuliny namnożono w reakcji PCR przy użyciu zestawu starterów specyficznych odpowiednio do łańcucha kappa i gamma IgG2a, LCcF: 5'- GCC ATG GTC GAC GCT GAT GCT GCA CCA ACT -3' i LCcR: 5'- GAG CTC CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT -3'; HCcF: 5'- GCC ATG GTC GAC GCA GCT ACA ACA ACA GCC -3', HCcR: 5'- GAG CTC TCA AAG TTC ATC TTT ACC CGG AGT CCG GGA GAA GCT- 3'. W celu umożliwienia późniejszego klonowania do wektora pBINPlus wprowadzono odpowiednie miejsca restrykcyjne Ncol i SalI na końcu 5' starterów LCcF i HCcF lub SacI w starterach LCcR i HCcR. Dodatkowo starter HCcR kodował sekwencję KDEL. Produkty PCR sklonowano do wektora pGEMTEasy uzyskując odpowiednio plazmidy pHCc i pLCc i zsekwencjonowano (Fig. 9 i Fig. 10).

c/ Klonowanie pełnych sekwencji łańcucha lekkiego - LC i łańcucha ciężkiego - HC przeciwciała B10D2

Fragmenty zmienne LC i HC B10D2 namnożono za pomocą PCR z użyciem par starterów, odpowiednio: 8LCv-F (5'- GTC TAG ACC ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG -3') i 8LCv-R (5'- GTCGACCCTC TTAATCTCTA ATTTCCAGCT TGGTCCCCCC TC -3') oraz 8HCv-F (5'- GTCTAGACCA TGGCTGTCCT AGTGCTGCT -3') i 8HCv-R (5'- GTCG ACG GCT GAG G AGACGGTGAC TG A - 3'). Startery 8LCv-F i 8HCv-F zawierały na 5' końcu miejsca restrykcyjne dla Xbal i Ncol, zaś startery 8LCv-R i 8HCv-R zawierały na 5' końcu miejsce restrykcyjne dla SalI. Produkty PCR kodujące B10D2 LCv i HCv wklonowano do wektora pGEMTEasy uzyskując odpowiednio plazmidy pG8LCv2 i pG8HCv2, a następnie zsekwencjonowano. Fragmenty Ncol/Sall LCv i Sall/SacI LCc wklonowano do wektora 1.1 (Plant Research International, Wageningen, NL) zawierającego promotor i terminator małej podjednostki rubisko (Rbc S1 z chryzantemy) przeciętego enzymami Ncol i SacI. Analogicznie zligowano sekwencję cDNA kodującą łańcuch ciężki B10D2. Poprawność sekwencji LC i HC B10D2 w otrzymanych plazmidach nazwanych odpowiednio, pRbcLC (Fig. 12) i pRbcHC (Fig. 11) zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

P r z y k ł a d 8

Konstrukcja binarnego wektora Agrobacterium do transformowania roślin zawierającego rekombinowany gen łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała B10D2

Kasety ekspresyjne LC i HC B10D2 wycięte odpowiednio z plazmidów pRbcLC i pRbcHC enzymami AscI/PacI ligowano do wektora binarnego pBINPlus (Plant Research International Wageningen, NL) przeciętego AscI/PacI uzyskując plazmid pBIN-LC. Następnie kasetę ekspresyjną HC B10D2P po wycięciu z plazmidu pRbcHC enzymami AscI/PacI, wklonowano w obecności adaptera CGCGAT, do plazmidu pBIN-LC przeciętego AscI. Poprawną integrację obu kaset ekspresyjnych LC i HC mAb B10D2 w uzyskanym plazmidzie pBINPA-LC-HC potwierdzono poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi i analizę wielkości produktów na żelu agarozowym. Otrzymany plazmid pBINPA-HC-LC (Fig. 13) wprowadzono na drodze elektroporacji do Agrobacterium tumefaciens szczepu LBA4404.

P r z y k ł a d 9

Transformowanie tytoniu z użyciem Agrobacterium tumefaciens zawierającym wektor kodujący rekombinowane przeciwciało B10D2 oraz regeneracja transgenicznego tytoniu

Do kompetentnych komórek Agrobacterium tumefaciens szczepu LBA4404 wprowadzono na drodze elektroporacji plazmid pBINPA-HC-LC. Obecność plazmidu w komórkach Agrobacterium analizowano przy pomocy reakcji PCR, a następnie poprzez rozdział elektroforetyczny otrzymanych produktów amplifikacji. W celu przeprowadzenia reakcji PCR zastosowano następujące startery RHCcF: 5'- GCC ATG GTC GAC GCA GCT ACA ACA ACA GCC -3', HCcR: 5'- GAG CTC TCA AAG TTC ATC TTT ACC CGG AGT CCG GGA GAA GCT- 3' (Fig. 14A). Bakterie zmieszano i użyto do transformacji tytoniu. Agrobacterium hodowano na pożywce YEB+kan 50 przez noc. Przed transformacją pomierzono OD kultury Agrobacterium przy długości fali γ₅₉₅=0,790. Pomiar przeprowadzono przy użyciu czytnika mikropłytek dla 200 μl zawiesiny bakterii względem próby ślepej, którą stanowiła nieinokulowana bakteriami płynna pożywka YEB. Bakterie wirowano przez 10 min w +4°C przy

PL 222 084 B1

000 rpm, a następnie zawieszono w MS0 (pożywka wg Murashiga i Skoog MS - Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497) z witaminami z dodatkiem 30 g/l sacharozy. Eksplantaty tytoniu odmiany Wisconsin 38 hodowanego na pożywce MS bez regulatorów wzrostu, cięto na fragmenty o wymiarach ok 5/5 mm i umieszczano w płynnej zawiesinie Agrobacterium. Po kilku minutach inkubacji zawiesinę agrobakterii usunięto, natomiast eksplantaty umieszczono na okres 3 dni na pożywce MS0, tj. bez regulatorów wzrostu. Początkowo przez okres 48 h eksplantaty poddawano ko-kulturze w ciemności w temperaturze 25°C, a następnie przez dalsze 24 h hodowano na świetle przy fotoperiodzie 16 h światła na poziomie ok. 3000 1x i 8 h ciemności. Po fazie ko-kultury materiał przeszczepiano na pożywkę MST1 ^{T330, K100} zawierającą mikro i makroelementy MS, hormony: kinetynę - 1 mg/litr oraz IAA - 0,1 mg/litr, a ponadto antybiotyki hamujące wzrost Agrobacterium - Thimentin - 330 mg/l oraz kanamycynę w stężeniu 50 mg/litr. Antybiotyk kanamycyna wykazuje toksyczne działanie na nie transformowane komórki tytoniu. Regenerację i selekcję tytoniu prowadzono w pokoju hodowlanym, przy temperaturze ok. 25°C w warunkach fotoperiodu jak wyżej.

Eksplantaty przeszczepiano na świeżą pożywkę MST1^{T330, K100} co 7 dni. Po upływie 3-4 tygodni fragmenty liści na których zachodziła regeneracja przeszczepiano na pożywkę MST^{T330, K100}, która zawierała obniżoną do 0,1 mg/litr koncentrację kinetyny oraz antybiotyki do selekcji jak wyżej. Ukorzenione regeneranty przenoszono do podłoża glebowego w multiplacie, a następnie do doniczek zawierających ok. 2,5 litra wzbogaconego podłoża do uprawy roślin. Zregenerowano, ukorzeniono i przesadzono do gleby 350 roślin stanowiących potencjalnie jednostkowe transformanty. W celu wstępnego potwierdzenia transgenicznego charakteru pierwotnych regenerantów tytoniu pobierano próbki z których izolowano genomowy DNA. Na DNA genomowym, izolowanym z potencjalnych transformantów, nietransformowanej rośliny kontrolnej oraz kontroli pozytywnej, którą stanowił plazmid pBINPA-LC-HC, przeprowadzono reakcję PCR przy wykorzystaniu starterów RHCcF oraz HCcR, a następnie produkt PCR rozdzielano na żelu agarozowym (Fig. 14B). Analiza potwierdziła, że większość zregenerowanych roślin zawiera sekwencję łańcucha ciężkiego przeciwciała IgG2a.

Analiza PCR nie stanowi jednak rozstrzygającego wyniku ponieważ w metodzie tej z różnych przyczyn może mieć miejsce fałszywy wynik pozytywny bądź negatywny. W badaniach nad ekspresją rekombinowanych białek istotne znaczenie ma poziom ekspresji białka, stąd potwierdzenie wyniku ilościową analizą immunoenzymatyczną ELISA pozwala ocenić praktycznie potencjalną wartość poszczególnych genotypów transgenicznych roślin.

P r z y k ł a d 10

Jakościowa oraz ilościowa detekcja rekombinowanego przeciwciała B10D2P w transgenicznym tytoniu pokolenia T0

Przeciwciała, w szczególności monoklonalne, same przez się stanowią dogodne narzędzie do analiz jakościowych oraz ilościowych z uwagi na ich nominalnie wysoką homogeniczność jako cząsteczka. Analizę ułatwia ponadto komercyjna dostępność szerokiego wachlarza przeciwciał II rzędowych specyficznych wobec innych przeciwciał. W celu przystosowania właściwej metody oznaczania ilościowego Mab B10D2-P przetestowano kilka układów detekcji. Na podstawie prób przyjęto zoptymalizowany w danych warunkach protokół do oznaczeń ilościowych.

Płaskodenną płytkę maxisorb opłaszczano przeciwciałami goat anti-Mouse IgG typu heavy chain specific IgG2a (Sigma, Nr katalogowy M-4434) w buforze węglanowym pH 9,6 w stężeniu 0,5 μg/ml przez noc w 4°C. Następnego dnia płytkę płukano w PBST (PBS + 0,05% Tween 20), po czym blokowano w 5% mlekiem w PBS przez 3 h w temp. 25°C. W celu oznaczenia przeciwciał w materiale roślinnym próbki liści transgenicznego tytoniu TTA2 i tytoniu kontrolnego ekstrahowano poprzez rozcieranie w moździerzu w 20 obj./wagowych buforu PBS. Ekstrakty wirowano 10 min. przy 10000 rpm, a następnie supernatant w objętości 50 μl nakładano do dołków zawierających 150 μl PBS i seryjnie czterokrotnie rozcieńczano w stosunku 1:1. W efekcie uzyskano następujące rozcieńczenia: 1:80, 1:160, 1:320 oraz 1:640. Próbę ślepą stanowił bufor PBS. Na płytkę nakładano równolegle standard przeciwciała monoklonalnego izotypu IgG2a dodawany do ekstraktu otrzymanego z nietransgenicznej rośliny kontrolnej w następujących stężeniach: 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 oraz 1,56. Próbki inkubowano 45 min. na wytrząsarce przy 400 rpm w temp. pokojowej. Płytkę płukano jw., a następnie dodawano w rozcieńczeniu 1:2000 II rzędowe przeciwciało anti-Mouse IgG, Fc specyficzne, znakowane alkaliczną fosfatazą AP (Sigma A1418), inkubowano na wytrząsarce jak uprzednio i płukano trzykrotnie w PBST. Finalnie na płytkę nakładano substrat dla alkalicznej fosfatazy pNPP (Sigma) i po 1 h

PL 222 084 B1 inkubacji w ciemności w temperaturze 25°C odczytywano na czytniku mikropłytek przy długości fali przy 405 nm.

Protokół w oparciu o krzywą standardową (Fig. 15) umożliwia ilościowe oznaczenie koncentracji przeciwciał w badanych próbkach przeciwciał z dokładnością ok. 1-2 ng/ml. Analizę zawartości przeciwciał wykonano przy użyciu oprogramowania Microplate Manager, stanowiącego standardowe oprogramowanie czytnika mikropłytek firmy BioRad model 680. Program na podstawie koordynat nałożonych próbek standardu, kontroli odniesienia (próba ślepa), i badanych próbek wraz ze współczynnikiem rozcieńczenia, wykreśla krzywą standardową stanowiącą podstawę obliczeń (Fig. 15, panel C) oraz dokonuje kalkulacji zawartości stężenia przeciwciał w badanych próbkach (Fig. 15, panel B). Absorbancja dla badanych próbek i kontroli negatywnej oraz krzywej standardowej pozwala na ocenę poprawności wykonanych rozcieńczeń oraz ‘wizualną' ocenę względnego miana przeciwciał. Program Microplate Manager uwzględniając współczynnik rozcieńczenia pozwala na wyliczenie zawartość Mab w badanej próbce i jej powtórzeniach. Na rycinie 15 przedstawiono graficznie wynik kalkulacji poziomu ekspresji Mab B10D2-P w jednej serii analiz (Fig. 15, panel B). Z uwagi na spodziewane zróżnicowanie poziomu ekspresji rekombinowanego przeciwciała Mab B10D2-P zregenerowano i wyizolowano ok. 350 potencjalnych transformantów. Wśród zregenerowanych roślin pokolenia T0 pierwotnych transformantów, które w wieku 4-10 tygodni od wysadzenia do gleby badano na poziom ekspresji Mab B10D2-P, jedynie u 10% roślin stwierdzono ekspresję na poziomie > 2000 ng/g świeżej masy (max. genotyp TTA2-132, ok. 6230 ng/g). Wstępna ocena wpływu warunków uprawy transgenicznych roślin na poziom ekspresji wskazała, że wielkość ekspresji można modyfikować poprzez zastosowanie odpowiednich warunków uprawy roślin. Badania przeprowadzone na liściach w różnym wieku wykazały, że młode liście o aktywności merystematycznej (dane nie załączone) wykazują znacząco wyższy poziom ekspresji niż liście starsze.

Analiza western blot roślin transgenicznych pokolenia T1

Równoległą metodą która pozwoliła na jakościowe potwierdzenia ekspresji Mab B10D2-P w tytoniu TTA2 jest metoda western blot. Badania przeprowadzono na młodych siewkach roślin tytoniu pokolenia T1 trzech genotypów uprzednio oznaczonych metodą ELISA oraz za pomocą PCR. Z roślin pobrano próbki tkanki, które ekstrahowano w trzech objętościach/wagowych 0,05M buforu fosforanowego. Próbki poddano denaturacji w wyniku inkubacji w buforze Laemmli z dodatkiem 5% β-merkaptoetanolu w łaźni przy temp. 99°C. Próbki nakładano na 12,5% żel poliakrylamidowy i rozdzielano w warunkach denaturujących. Białka z żelu poddawano elektroblotowaniu na mokro na błonę nitrocelulozową. Membranę blokowano przez 1 h w buforze TBS zawierającym 1% mleka odtłuszczonego. Płukano 3-krotnie w buforze TBS (TBS z dodatkiem 0,05% Tween 20). Blot inkubowano następnie przez 1 h w buforze TBS z przeciwciałem anty-mysim typu „whole molekule” znakowanym alkaliczną fosfatazą (Sigma) w rozcieńczeniu 1:1000. Membranę płukano jw., a następnie wywoływano poprzez dodanie substratu dla alkalicznej fosfatazy BCIP/NBT (Sigma).

Analiza sygnałów rozpoznawanych na blocie przez anty-mysie przeciwciała znakowane alkaliczną fosfatazą (Fig. 16) wskazuje na pewną dozę heterogenności łańcucha lekkiego. Heterogenność przeciwciał i innych białek ekspresowanych w roślinach jest między innymi konsekwencją skali i zakresu posttranskrypcyjnej modyfikacji. Inną z przyczyn heterogenności łańcuchów lekkich przeciwciał może być obecność w strukturze łańcucha lekkiego dodanych sekwencji liderowych, kotwiczących cząsteczki przeciwciał w retikulum endoplazmatycznym.

Ocena specyficzności przeciwciał B10D2-P względem natywnego antygenu PA83

Istotnym elementem oceny jakości przeciwciał monoklonalnych B10D2-P tj. przeciwciał produkowanych przez rośliny transgeniczne jest ocena specyficzności względem natywnego antygenu. W celu potwierdzenia aktywności eksprymowanych tytoniu Mab B10D2-P przeprowadzono test ELISA w którym płytkę opłaszczano antygenem PA83. Oznaczanie przeprowadzono wg poniższego protokołu. Opłaszczanie płytki Nunc polisorb antygenem PA83 kD w stężeniu 1 μg/ml w PBS pH 7,4 przez 1 h w temp. 37°C. Płukanie trzykrotne w PBST (PBS + 0,05% Tween 20), Blokowanie 5% mlekiem w PBS przez 1 h w temp. 25°C. Kolejne płukanie jak wyżej w PBST. Następnie na płytkę nanoszono próbki ekstrahowane z transgenicznego tytoniu TTA2 i tytoniu kontrolnego. W celu uzyskania wyjściowego rozcieńczenia badanej próbki materiału roślinnego, wycinki liści ważono na wadze analitycznej i fragmenty o ustalonej masie ok. 8-15 mg rozcierano w odpowiedniej objętości PBS z dodatkiem 0,5% Tween 20, w celu uzyskania rozcieńczenia początkowego, wagowo/objętościowego 1:40. Próbki ekstraktu worteksowano, wirowano 10 min. przy 10000 rpm, a następnie nakładano do dołków po 100 pi, do których uprzednio napipetowano po 100 μl PBS, co dawało rozcieńczenie początkowe

PL 222 084 B1

1:80. Następnie w kolejnych dołkach próbki rozcieńczano seryjnie uzyskując rozcieńczenia 1:160; 1:320 oraz 1:640. Próbę ślepą stanowił bufor PBS z dodatkiem 0,5% Tween 20. W jednej z kolumn płytki nakładano serię standardów przeciwciała izotypu IgG2a w zakresie stężeń: od 0,0 do 100 ng/ml. Próbki standardu przeciwciała mieszano z ekstraktem rośliny nietransgenicznej stanowiącej kontrolę negatywną. Jedną z kontroli stanowiła seria rozcieńczeń identyczna jak ekstraktów z transgenicznych roślin tj. od 1:80 do 1:640 którą wykonano w oparciu o nadsącze z 4-dniowych kultur hybrydomy B10D2 wytwarzających przeciwciało B10D2 anty-PA izotopu IgG1. Próbki inkubowano na wytrząsarce 40 min. przy 400 rpm. Płytki płukano 3x w PBST. W kolejnym etapie nakładano w rozcieńczeniu 1:10000 przeciwciała II rzędowe anti-mouse IgG2a skoniugowane z peroksydazą chrzanową (Boehringer), inkubowano na wytrząsarce przez 40 min przy 400 rpm. Zastosowano kolejną rundę płukania i finalnie nakładano substrat TMB dla peroksydazy chrzanowej (Sigma), inkubowano w ciemności w temperaturze 25°C przez 30 min. Wynik reakcji odczytywano przy użyciu czytnika mikropłytek przy długości fali 450 nm. W oparciu o powyższą metodę oznaczania przeciwciał badano ekstrakty białkowe pozyskane od kilku roślin pierwotnych transformantów TTA2 w wieku ok. 3-4 tygodni od wysadzenia do gleby. Wykazano, że w teście w którym II rzędowe przeciwciało detekcyjne stanowi skoniugowane z peroksydazą chrzanową anty-IgG2a, uzyskuje się dla roślin transgenicznych, wyraźny sygnał spadku absorbancji stosownie do wzrastającego rozcieńczenia próby (Fig. 17). W odniesieniu do niektórych badanych prób obserwuje się tzw. ‘efekt tłoku' (ang. hook effect), który jest odpowiedzialny za zjawisko wzrostu absorbancji w pewnym przedziale rozcieńczeń, a następnie spadku w miarę dalszego rozcieńczania. Nie stwierdzono obecności przeciwciał w ekstraktach kontroli negatywnej (ekstrakt tytoniu nie transformowanego). Nie wykryto przeciwciał IgG2a w kontroli doświadczenia, w której na płytkę nałożono rozcieńczone próbki nadsączy z hybrydomy B10D2 wytwarzającej przeciwciało antyPA izotopu IgG1.

P r z y k ł a d 11

Wpływ warunków uprawy transgenicznego tytoniu TTA2 na poziom ekspresji przeciwciał monoklonalnych B10D2-P

Ekspresja zarówno białek endogennych jak również heterologicznych podlega regulacji przez szeroki wachlarz czynników. Podstawowym jest mechanizm determinowany specyfiką promotora. Z uwagi na fakt, że sekwencje łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego w plazmidzie pBINPA-LC-HC kontrolowane są przez promotor małej podjednostki rubisco, ekspresja w roślinie transgenicznej podlega bardzo zbliżonym mechanizmom regulacyjnym które kontrolują proces fotosyntezy.

Podjęto wstępne badania oceny poziomu ekspresji Mab B10D2-P w trakcie rozwoju roślin transgenicznych i wyniki wskazują, że w miarę starzenia się liści poziom wykrywalnych przeciwciał ulega obniżeniu kilka do kilkunastu razy w stosunku do obserwowanego w młodych regeneratach (Fig. 18). Zaindukowanie intensywnego wzrostu rośliny pod wpływem dużej dawki zbalansowanego nawożenia mineralnego, jakim jest pożywka MS, połączonego z kompletnym usunięciem istniejących liści (ogłowieniem), wywołuje pozytywny bodziec fizjologiczny wyrażający się wzrostem ekspresji Mab B10D2-P, w niektórych przypadkach kilkudziesięciokrotnym w stosunku do poziomu z przed zabiegu (Fig. 18). Powyższy rezultat wskazuje, że można wpływać na poziom ekspresji heterologicznych białek modyfikując warunki wzrostu i rozwoju roślin transgenicznych.

Wiadomo jest również, że poziom aktywności promotora małej podjednostki Rubisco podlega ujemnej regulacji zwrotnej w wyniku nagromadzenia się między innymi produktu fotosyntezy jakim jest glukoza. Stymulująco na aktywność promotora wpływają z kolei sygnały powiązane z podwyższeniem w pewnym zakresie dostępności różnych form niezredukowanego azotu mineralnego.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Rekombinowane przeciwciało monoklonalne o wysokim powinowactwie do natywnego antygenu bakteryjnego laseczki wąglika (Bacillus anthracis), znamienne tym, że zawiera regiony CDR1, CDR2 i CDR3 w zmiennym regionie łańcucha ciężkiego i CDR1, CDR2 i CDR3 w zmiennym regionie łańcucha lekkiego, pochodzące z dowolnych przeciwciał uzyskanych w efekcie użycia jako immunogenu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych zawierających bakteryjny antygen protekcyjny PA laseczki wąglika, w szczególności C-końcową domenę antygenu protekcyjnego laseczki wąglika PA4D.
2. 2. Rekombinowane przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że ciałka inkluzyjne zawierające bakteryjny antygen protekcyjny PA, w szczególności C-końcową domenę PA4D

   PL 222 084 B1 są wyprodukowane w systemie bakteryjnym, w szczególności w E. coli, korzystnie w E. coli szczepu BL21(DE3), która zawiera epitopy wchodzące w interakcje z receptorami komórkowymi gospodarza, w szczególności interakcje z receptorami ATR/TEM8 oraz CMG2, przy czym masa cząsteczkowa białka wynosi co najmniej 16 kDA.
3. 3. Rekombinowane przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera regiony CDR1, CDR2 i CDR3 w zmiennym regionie łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała B10D2 oraz region stały łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała lgG2a.
4. 4. Sposób otrzymywania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych, określonych w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, znamienny tym, że immunizuje się parenteralnie myszy lub komórki in vitro przy użyciu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych zawierających bakteryjny antygen protekcyjny PA laseczki wąglika, w szczególności C-końcową domenę antygenu protekcyjnego laseczki wąglika PA4D, przy czym pierwszy etap polega na wywołaniu wystarczająco silnej odpowiedzi immunologicznej poprzez zastosowanie jako immunogenu bakteryjnych ciałek inkluzyjnych będących produktem nadekspresji białka PA.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w następstwie immunizacji wywołana zostaje funkcjonalna odpowiedź immunologiczna zapewniająca neutralizację natywnych toksyn laseczki wąglika.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje sposób klonowania do plazmidu ekspresyjnego genu kodującego łańcuch ciężki przeciwciała lgG2a oraz genu kodującego łańcuch lekki, przy czym łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała lgG2a zawierają determinanty antygenowe przeciwciała B10D2, w którym obydwa geny znajdują się w dowolnym plazmidzie ekspresyjnym.
7. 7. Zastosowanie ciałek inkluzyjnych jako nośnika immunogenu bakteryjnego do otrzymania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych określonych w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, charakteryzujących się zdolnością neutralizacji toksyn wąglika.