PL221798B1

PL221798B1 - Deproteinisation method of animal bones

Info

Publication number: PL221798B1
Application number: PL403805A
Authority: PL
Inventors: Maciej Pawlikowski; Łukasz Wdowczyk; Andrzej Pietrasz; Władysław Kamusiński
Original assignee: Władysław Kamusiński; Maciej Pawlikowski; Andrzej Pietrasz; Łukasz Wdowczyk
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2016-05-31
Also published as: PL403805A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób odbiałczania kości zwierzęcych, zwłaszcza z cieląt lub młodych świń w wieku około jednego roku, z których po odbiałczeniu wykonuje się kształtki nadające się do wszczepiania, zwłaszcza ludziom, w miejsca ubytków kostnych, spowodowanych różnymi przyczynami, między innymi zabiegami operacyjnymi.The subject of the invention is a method for deproteinizing animal bones, in particular from calves or young pigs of about one year of age, from which, after deproteinization, moldings suitable for implantation, especially in humans, in bone defects caused by various reasons, including surgical procedures, are made.

Znane są materiały syntetyczne wykorzystywane do wykonywania kształtek przeznaczonych do wszczepiania u ludzi. Między innymi znany jest syntetyczny fosforan trójwapniowy (TCP) lub bioszkła. Wykazują one jednak wyraźnie mniejszy współczynnik porowatości i mikrostruktury od struktury nat uralnej kości. Opisywane w literaturze wyniki badań zastosowania tych produktów w celu regeneracji tkanki kostnej nie były zadowalające.Synthetic materials used to make moldings intended for implantation in humans are known. Among other things, synthetic tricalcium phosphate (TCP) or bioglass are known. However, they show a clearly lower porosity and microstructure coefficient than the natural bone structure. The results of studies on the use of these products for the regeneration of bone tissue reported in the literature were not satisfactory.

Dużo lepsze właściwości wykazują pod tym względem materiały biologiczne, wytwarzane z surowców pochodzenia zwierzęcego, na przykład z kości zwierząt, w tym cieląt lub świń, jednakże przed ich zastosowaniem wymagają one skutecznego oczyszczenia.In this respect, biological materials produced from raw materials of animal origin, for example from the bones of animals, including calves or pigs, exhibit much better properties, but they require effective cleaning before their use.

Podstawową metodą oczyszczania kości zwierząt jest ich odbiałczanie polegające na pozbawieniu kości wszystkich substancji biologicznych występujących pomiędzy tzw. beleczkami kostnymi (szpik, naczynia, system nerwowy), jak też komórek kostnych obecnych w jamkach kostnych (ost eoblasty, osteoklasty i osteocyty). W efekcie odbiałczenia kości otrzymuje się produkt w postaci szkiel etu kolagenowo-apatytowego, z którego wykonuje się kształtki nadające się do wszczepiania operacyjnego w miejsce ubytków kostnych. Obróbce i późniejszemu wszczepianiu podlega wyłącznie tak zwana kość gąbczasta.The basic method of cleansing animal bones is their deproteinization, which consists in removing all biological substances between the so-called bones. trabeculae (bone marrow, vessels, nervous system) as well as bone cells present in the bone cavities (osteoclasts, osteoclasts and osteocytes). As a result of bone deproteinization, a product is obtained in the form of collagen-apatite skeletons, which are used to make shapes suitable for surgical implantation in the place of bone defects. Only the so-called spongy bone is processed and later implanted.

W sprzedaży są dostępne kości odbiałczone znanymi sposobami, które wykorzystywane są w medycynie. Przykładowo z publikacji P. Myciński, J. Zarzecka: Przegląd materiałów do rekonstrukcji kości stosowanych w chirurgii jamy ustnej, Poradnik Stomatologiczny, 2011 .XI.10; 426-431, znane są materiały ksenogenne (heterogenne), które są często stosowanymi w stomatologii wszczepami kostnymi. Materiały te pozyskiwane są z kości wołowych i wieprzowych i są praktycznie nieresorbowalne, biokompatybilne i bezpieczne w stosowaniu. Są produkowane w formie bloków lub granulatu zarówno kości gąbczastej, jak i zbitej, czasami z domieszką kolagenu. Przygotowanie takiego materiału polega na całkowitym odbiałczaniu pod wpływem wysokiej temperatury i promieniowania jonizującego. Pozostała matryca nieorganiczna stanowi rusztowanie dla nowej kości. W wyniku tego procesu dochodzi do usunięcia czynników wzrostowych, a tym samym właściwości osteoindukcyjnych. Odbiałczone kości zwierzęce stosowane do przeszczepów mają strukturę i powierzchnię zbliżoną do kości i dlatego wykazują potencjał osteokondukcyjny. Możliwe jest też otrzymywanie materiałów z wapniejących korali i alg, jednak są one rzadko stosowane ze względu na ryzyko późnych powikłań i gorsze właściwości osteokondukcyjne.Bones deproteinized by known methods, which are used in medicine, are available for sale. For example, from the publication of P. Myciński, J. Zarzecka: Review of materials for bone reconstruction used in oral surgery, Poradnik Stomatologiczny, 2011.XI.10; 426-431, there are known xenogeneous (heterogeneous) materials, which are often used in dentistry bone implants. These materials are obtained from beef and pork bones and are practically non-resorbable, biocompatible and safe to use. They are produced in the form of blocks or granules of both spongy and compact bone, sometimes with an admixture of collagen. The preparation of such material consists in complete deproteinization under the influence of high temperature and ionizing radiation. The remaining inorganic matrix forms the scaffold for the new bone. As a result of this process, the growth factors and thus the osteoinductive properties are removed. The deproteinized animal bones used for transplantation have a bone-like structure and surface and therefore have osteoconductive potential. It is also possible to obtain materials from calcifying corals and algae, but they are rarely used due to the risk of late complications and poorer osteoconductive properties.

Znany jest również preparat kostny pochodzenia bydlęcego Bio-Oss® (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Szwajcaria), który wykazuje bardzo wysoki stopień podobieństwa do ludzkiej kości, zarówno pod względem powierzchni, składu chemicznego jak i struktury materiału. Stanowi on jeden z najczęściej stosowanych obecnie substytutów kostnych w stomatologii. Do produkcji preparatu Bio-Oss® używa się jako surowca specjalnie dobranego materiału w postaci kości kończyn bydlęcych, które spełniają konieczne wymogi dotyczące struktury i dojrzałości tkanki kostnej, jak również umożliwiają uzyskanie odpowiedniej ilości surowca. Proces produkcyjny preparatu Bio-Oss® obejmuje kilka etapów, które wykazują wysoką skuteczność w zakresie inaktywacji prionów 10: produkt poddawany jest między innymi działaniu wysokich temperatur przez okres ponad 15 godzin, a także specyficznym procesom oczyszczania chemicznego, które obejmują poddawanie produktu działaniu roztworów si lnych zasad przez okres kilku godzin. Zróżnicowane procesy chemiczne, jak również działanie wysokich temperatur wywierają silny efekt na inaktywację prionów, osiągając wysoką skuteczność usuwania potencjalnych czynników patogenetycznych.A bone preparation of bovine Bio-Oss® (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland) is also known, which shows a very high degree of similarity to human bone, both in terms of surface, chemical composition and material structure. It is one of the most commonly used bone substitutes in dentistry. For the production of Bio-Oss®, a specially selected material in the form of bovine limb bones is used as a raw material, which meet the necessary requirements for the structure and maturity of bone tissue, as well as enable obtaining the appropriate amount of raw material. The production process of Bio-Oss® consists of several steps which are highly effective in prion inactivation 10: the product is subjected to, inter alia, high temperatures for more than 15 hours, as well as specific chemical purification processes that involve treating the product with strong solutions rules over a period of several hours. Diverse chemical processes as well as the action of high temperatures have a strong effect on prion inactivation, achieving high efficiency in removing potential pathogenetic factors.

Stopień oczyszczenia produktu może posiadać decydujący wpływ na jego biozgodność tkankową oraz właściwości immunologiczne. W skład preparatu Bio-Oss® wchodzi mineralna frakcja kości. W celu wyodrębnienia tej frakcji kostnej stosuje się szereg procesów chemicznego oraz fizycznego oczyszczania.The degree of purification of a product may have a decisive influence on its biocompatibility and immunological properties. Bio-Oss® contains the bone mineral fraction. A number of chemical and physical cleansing processes are used to extract this bone fraction.

Ze względu na odnotowane ostatnio na kontynencie europejskim przypadki BSE oraz pojawienie się nowej postaci choroby Creutzfeldta-Jakoba (CJD), związanej z zakażeniem BSE u ludzi, wielu lekarzy oraz pacjentów w sposób uzasadniony domaga się przedstawienia analizy możliwych czynniPL 221 798 B1 ków ryzyka związanych ze stosowaniem biomateriałów u ludzi, stąd konieczne jest stosowanie skutecznych i wiarygodnie potwierdzonych metod oczyszczania kości zwierząt.Due to the recently reported cases of BSE on the European continent and the emergence of a new form of BSE-related Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans, many physicians and patients are reasonably requesting an analysis of possible risk factors associated with use of biomaterials in humans, hence it is necessary to use effective and reliably proven methods of cleaning animal bones.

Celem wynalazku było opracowanie skutecznego sposobu oczyszczania (odbiałczania) kości zwierzęcych, nadających się do wytworzenia bezpiecznych dla organizmu człowieka kształtek przeznaczonych do wszczepiania operacyjnego w miejsce ubytków kostnych.The aim of the invention was to develop an effective method of cleansing (deproteinizing) animal bones, suitable for the production of fittings that are safe for the human body, intended for surgical implantation in place of bone defects.

Sposób odbiałczania kości zwierzęcych, zwłaszcza z cieląt lub młodych świń w wieku około jednego roku, pobranych korzystnie z miednicy, stanowiący przedmiot niniejszego wynalazku charakteryzuje się tym, że w pierwszym etapie oczyszcza się pobraną kość z przylegających tkanek zewnętrznych, w tym przede wszystkim z pozostałości mięsa, a następnie w dowolnej kolejności kość tnie się mechanicznie, korzystnie za pomocą piły diamentowej, na plastry o grubości od 1 do 10 cm oraz mechanicznie pozbawia się ją zewnętrznej kości korowej, korzystnie poprzez jej odcięcie za p omocą piły diamentowej, otrzymując plastry kości gąbczastej.The method of deproteinizing animal bones, especially from calves or young pigs of about one year old, preferably taken from the pelvis, which is the subject of the present invention, is characterized in that in a first step, the removed bone is cleaned of adjacent external tissues, including primarily meat residues. and then, in any order, the bone is mechanically cut, preferably with a diamond saw, into slices of 1 to 10 cm thick, and the outer cortex is mechanically stripped, preferably by cutting it with a diamond saw to obtain spongy bone slices.

W drugim, korzystnie równolegle prowadzonym etapie przygotowuje się od 1,0 N do 0,5 N roztwór NaOH lub KOH oraz wodny roztwór perhydrolu w proporcji od 1:1 do 1:5 do wody destylowanej (stosowany jako utleniacz w temp. około 36,6°C), po czym z tak otrzymanych roztworów wykonuje się mieszaninę do odbiałczania kości, o proporcjach objętościowych 20-50%, korzystnie 35% NaOH lub KOH, 20-30%, korzystnie 25% wodnego roztworu perhydrolu i 20-60%, korzystnie 40% wody destylowanej.In the second, preferably in parallel, stage, a 1.0 N to 0.5 N NaOH or KOH solution is prepared and an aqueous perhydrol solution in a ratio of 1: 1 to 1: 5 to distilled water (used as an oxidant at a temperature of about 36, 6 ° C), and then the bone deproteinization mixture is prepared from the solutions thus obtained, with a volume ratio of 20-50%, preferably 35% NaOH or KOH, 20-30%, preferably 25% aqueous perhydrol solution and 20-60%, preferably 40% distilled water.

W trzecim etapie, w naczyniach, korzystnie szklanych prowadzi się zasadniczy proces odbiałczania kości polegający na tym, że przygotowane w pierwszym etapie plastry kości gąbczastej zanurza się w przygotowanej w drugim etapie mieszaninie roztworów. Naczynia umieszcza się na podgrzewanych mieszadłach, korzystnie magnetycznych, w których mieszaninę roztworów z zanurzonymi w niej plastrami kości gąbczastej miesza się intensywnie i podgrzewa stopniowo od temperatury około 20°C do temperatury nie przekraczającej 60°C, w czasie niezbędnym do zupełnego odbiałczenia kości. Zabieg odbiałczania plastrów kości gąbczastej prowadzi się do zupełnego wyczyszczenia kości i otrzymania wyłącznie czystego, biokompatybilnego szkieletu kolagenowo-apatytowego. Proces kontroluje się poprzez obserwację odbiałczanej kości, prowadzoną korzystnie za pomocą lupy binokularnej lub mikroskopu skaningowego. Kości mogą mieć różny stopień upakowania beleczek, stąd czas ich odbiałczania może być różny.In the third step, the main process of bone deproteinization is carried out in the vessels, preferably glass ones, in which the spongy bone slices prepared in the first step are immersed in the solution mixture prepared in the second step. The dishes are placed on heated stirrers, preferably magnetic, in which the mixture of solutions with slices of spongy bone immersed in it is intensively mixed and heated gradually from a temperature of about 20 ° C to a temperature not exceeding 60 ° C, for the time necessary for complete bone deproteinization. The treatment of deproteinization of spongy bone patches leads to a complete cleansing of the bones and obtaining only a clean, biocompatible collagen-apatite skeleton. The process is monitored by observing the deproteinized bone, preferably carried out with a binocular magnifier or a scanning microscope. Bones may have different degrees of trabecula packing, hence their deproteinization time may vary.

Korzystnie, przed zanurzeniem plastrów kości gąbczastej w mieszaninie roztworów, zawiesza się je na uchwytach, korzystnie na hakach wykonanych z drutu miedzianego izolowanego poliuretanem lub PCV.Preferably, before immersing the spongy bone slices in the solution mixture, they are hung on holders, preferably on hooks made of copper wire insulated with polyurethane or PVC.

Po zakończeniu zasadniczego procesu odbiałczania, plastry kości przemywa się kilkukrotnie, korzystnie pięciokrotnie wodą destylowaną i kilkukrotnie, korzystnie trzykrotnie spirytusem, zwłaszcza etanolem 99%-owym.After completion of the main deproteinization process, the bone slices are washed several times, preferably five times with distilled water, and several times, preferably three times, with spirit, especially ethanol 99%.

Tak odbiałczone kości lub wycięte z nich kształtki przeznaczone do wszczepiania przechowuje się w spirytusie, zwłaszcza etanolu 99%-owym.The bones deproteinized in this way or the specimens cut from them intended for implantation are stored in spirit, especially ethanol 99%.

Proces wycinania pożądanych kształtek przeznaczonych do zabiegów wszczepiania może n astąpić w różnych momentach, na przykład po zasadniczym procesie odbiałczania a przed przemywaniem plastrów lub po procesie przemywania plastrów. W obu przypadkach w spirytusie przechowuje się już wycięte kształtki do czasu ich wszczepiania. Można również przechowywać w spirytusie odbiałczone plastry kości, z których kształtki wycina się tuż przed procesem wszczepiania.The process of cutting out the desired shapes for implantation procedures may occur at various times, for example, after the substantial deproteinization process and prior to washing the patches or after the washing process of the patches. In both cases, the already cut shapes are kept in the alcohol until they are implanted. You can also store in alcohol the deproteinized bone slices, the shapes of which are cut out just before the implantation process.

Eksperymenty prowadzone na królikach potwierdzają akceptację przez ich organizm tak spreparowanej kości. Na dziesięć zabiegów zastosowanych na królikach, w dziewięciu przypadkach wszczepy się przyjęły.Experiments conducted on rabbits confirm the acceptance by their bodies of the prepared bone. Out of ten treatments performed on rabbits, nine of them were implanted.

Zaletą sposobu według wynalazku jest jej wysoka skuteczność, zapewniająca otrzymanie w pełni oczyszczonych (odbiałczonych) kości, nadających się do wytworzenia bezpiecznych dla organizmu człowieka, biokompatybilnych kształtek przeznaczonych do wszczepiania operacyjnego w miejsce ubytków kostnych. Tak otrzymana kość ma strukturę i powierzchnię zbliżoną do naturalnej kości człowieka, dzięki czemu wykazuje wysoki potencjał osteokondukcyjny. Ponadto wykazuje dobre właściwości jako podłoże, na którym następuje prawidłowe odbudowywanie kości osoby, u której dokonano wszczepienia.The advantage of the method according to the invention is its high efficiency, ensuring the receipt of fully purified (deproteinized) bones, suitable for the production of safe for the human body, biocompatible moldings intended for surgical implantation in the place of bone defects. The bone obtained in this way has a structure and surface similar to that of the natural human bone, thanks to which it exhibits a high osteoconductive potential. In addition, it has good properties as a substrate on which the correct reconstruction of the bones of the implanted person takes place.

Sposób według wynalazku ze względu na samą technologię jak i użyte odczynniki jest stosunkowo niedrogi i szybki, co jest kolejną jego zaletą wpływającą na to, że produkt otrzymywany tym sposobem będzie znacznie tańszy od produktów dostępnych dotychczas na rynku, nie tracąc przy tym wysokiej jakości.The method according to the invention, due to the technology itself and the reagents used, is relatively inexpensive and fast, which is another advantage of the method, which means that the product obtained in this way will be much cheaper than the products available on the market so far, without losing high quality.

PL 221 798 B1PL 221 798 B1

Efekt realizacji sposobu według wynalazku zobrazowano na fig. 1 przedstawiającej jeden raz powiększone zdjęcie fragmentu kości w stanie finalnym po procesie odbiałczania, na którym widoczny jest system beleczek kolagenowo-apatytowych całkowicie pozbawiony szpiku i innych tkanek wypełniających przestrzenie pomiędzy beleczkami.The effect of the implementation of the method according to the invention is illustrated in Fig. 1 showing a once enlarged photo of a bone fragment in its final state after the deproteinization process, which shows a system of collagen-apatite trabeculae completely devoid of marrow and other tissues filling the spaces between the trabeculae.

Sposób według wynalazku zostanie bliżej przedstawiony na poniższym przykładzie.The method according to the invention will be illustrated in the following example.

W pierwszym etapie kość pobraną z miednicy jednorocznej świni oczyszczono mechaniczne za pomocą noża z przylegających tkanek zewnętrznych, w tym przede wszystkim z pozostałości mięsa, po czym kość pocięto piłą diamentową na plastry o grubości 2 cm. Plastry kostne za pomocą piły diamentowej mechanicznie pozbawiono kości korowej. W drugim, równolegle prowadzonym etapie przygotowano 1,0 N roztwór NaOH oraz wodny roztwór perhydrolu w proporcji 1:1 do wody destylowanej, po czym z tak otrzymanych roztworów wykonano mieszaninę roztworów do odbiałczania kości, o proporcjach objętościowych 35% NaOH, 25% wodnego roztworu perhydrolu i 40% wody destylowanej.In the first stage, the bone taken from the pelvis of a one-year-old pig was cleaned mechanically with a knife from the adjacent external tissues, including mainly meat residues, and then the bone was cut into slices 2 cm thick with a diamond saw. Bone slices were mechanically removed from the cortex with a diamond saw. In the second, parallel stage, a 1.0 N NaOH solution and an aqueous solution of perhydrol in the proportion of 1: 1 to distilled water were prepared, and then a mixture of solutions for bone deproteinization was prepared from such solutions, with the volume proportions of 35% NaOH, 25% aqueous solution. perhydrol and 40% distilled water.

W trzecim etapie, uprzednio przygotowany materiał kostny zawieszono na hakach wykonanych z drutu miedzianego pokrytego izolacją z polichlorku winylu i umieszczono w szklanej zlewce, w przygotowanej uprzednio mieszaninie roztworów. Zlewkę umieszczono na podgrzewanym mieszadle m agnetycznym, w którym mieszaninę roztworów wraz z zanurzonymi w niej plastrami kości mieszano intensywnie i podgrzewano stopniowo od temperatury około 20°C do temperatury nie przekraczającej 60°C. Proces ten prowadzono - pod ciągłą obserwacją odbiałczanej kości za pomocą lupy binokularnej - aż do momentu zupełnego wyczyszczenia kości z materiału biologicznego wypełniającego przestrzenie między beleczkami kostnymi i otrzymania czystego, biokompatybilnego szkieletu kolagenowo-apatytowego.In the third step, the previously prepared bone material was suspended on hooks made of copper wire covered with polyvinyl chloride insulation and placed in a glass beaker in the previously prepared solution mixture. The beaker was placed on a heated magnetic stirrer, in which the mixture of solutions together with the bone slices immersed in it was intensively mixed and heated gradually from a temperature of about 20 ° C to a temperature not exceeding 60 ° C. This process was carried out - under continuous observation of the deproteinized bone with a binocular magnifier - until the biological material filling the spaces between the trabeculae was completely cleaned of the bone and a clean, biocompatible collagen-apatite skeleton was obtained.

Tak otrzymaną kość przemyto trzykrotnie wodą destylowaną oraz trzykrotnie etanolem 99%-owym, a następnie przechowywano w etanolu 99%-owym, w warunkach septycznych, do zabiegów wszczepiania.The bone obtained in this way was washed three times with distilled water and three times with ethanol 99%, and then stored in ethanol 99%, under septic conditions, until implantation procedures.

Przed zabiegiem wszczepiania istnieje możliwość wykonania z odbiałczonej kości kształtki lub kształtek o formie niezbędnej do wypełnienia ubytku kostnego.Before the implantation procedure, it is possible to make a molding of the deproteinized bone in the form necessary to fill the bone defect.

Claims

Patent claims

A method of deproteinizing animal bones, in particular from calves or young pigs about one year old, preferably taken from the pelvis, characterized in that in the first step, the removed bone is cleaned of adjacent external tissues, including primarily meat residues, and then in any order, the bone is mechanically cut, preferably with a diamond saw, into slices with a thickness of 1 to 10 cm and the outer cortex is mechanically removed, preferably by cutting it with a diamond saw, obtaining spongy bone slices, while in the second , preferably a 1.0 N to 0.5 N NaOH or KOH solution and an aqueous perhydrol solution in the proportion of 1: 1 to 1: 5 to distilled water are prepared in a parallel stage, and then the solution is prepared for deproteinization. bones, with a volume ratio of 20-50%, preferably 35% NaOH or KOH, 20-30%, preferably 25% of an aqueous solution of perhydrol and 20-60%, preferably 40 % of distilled water, then in the third stage, in the vessels, preferably glass, the basic process of bone deproteinization is carried out, which consists in immersing the spongy bone slices prepared in the first stage in the mixture of solutions prepared in the second stage, and then the vessels are placed on heated stirrers , preferably magnetic, in which the mixture of solutions with patches of spongy bone immersed in it is intensively mixed and heated gradually from a temperature of about 20 ° C to a temperature not exceeding 60 ° C, for the time necessary to completely deproteinize the bone and obtain only a pure collagen-apatite skeleton this time is monitored by observation of the deproteinized bone, preferably carried out with a binocular magnifier or a scanning microscope.

2. The method according to p. The process of claim 1, characterized in that prior to immersion of the spongy bone slices in the solution mixture, they are hung on holders, preferably on hooks made of copper wire insulated with polyurethane or PVC.

3. The method according to p. A method according to claim 1, characterized in that, after completion of the main deproteinization process, the bone slices are washed several times, preferably five times with distilled water, and several times, preferably three times, with spirit, especially ethanol 99%.