PL221216B1

PL221216B1 - 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-2-ylo)-1,3,4-tiadiazol, sposób jego wytwarzania oraz zastosowanie medyczne

Info

Publication number: PL221216B1
Application number: PL401992A
Authority: PL
Inventors: Agata Siwek; Monika Wujec; Anna Bielawska; Krzysztof Bielawski
Original assignee: Univ Medyczny W Białymstoku; Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2016-03-31
Also published as: PL401992A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-2-ylo)-1,3,4-tiadiazol, o wzorze 1, sposób jego wytwarzania oraz zastosowanie medyczne.

Znane są z literatury pochodne tiadiazolu, które wykazują aktywność przeciwnowotworową [Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 1980, 4, 275; Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 1986, 16, 287; Farmaco 1991, 46, 1489]. Należą do nich pochodne imidazo[2,1-b][1,3,4]tiadiazolu, które wykazują aktywność wobec nowotworowych komórek białaczki [European Journal of Medicinal Chemistry 2011, 46, 2109], pochodne [1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]tiadiazolu, które wykazują aktywność wobec linii komórek nowotworowych piersi, płuc, ośrodkowego układu nerwowego, nerek, czerniaka, białaczki [European Journal of Medicinal Chemistry 2009, 44, 2776], pochodne [1,2,4]triazolo[3,4-b]-[1,3,4]tiadiazolu które wykazują aktywność wobec linii komórek nowotworowych wątroby [Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 4471].

W wyniku prowadzonych badań okazało się, że będąca przedmiotem wynalazku pochodna 1,3,4-tiadiazolu, podstawiona w pozycji 2 podstawnikiem benzoiloaminowym zaś w pozycji 5 podstawnikiem izochinolinowym, wykazuje wysoką aktywność cytotoksyczną wobec komórek ludzkiego raka piersi linii MCF-7 i MDA-MB-231.

Nowotwory złośliwe, obok chorób układu krążenia, są głównymi przyczynami przedwczesnych zgonów wśród Polaków. Zgodnie z danymi podanymi przez Centrum Onkologii Instytutu im. M. Skłodowskiej-Curie, w 2006 roku do rejestrów nowotworów złośliwych wpłynęły informacje o prawie 126 tys. nowych zachorowań i stwierdzono ponad 91500 zgonów z tego powodu, zaś 390 tys. Polaków żyje z chorobą nowotworową. Najczęściej rejestrowanymi nowotworami u mężczyzn były nowotwory złośliwe płuca - 23.6%, jelita grubego - 12% i gruczołu krokowego - 11.2%. U kobiet zaś najczęściej rejestrowany był nowotwór złośliwy piersi - 21.5%, jelita grubego - 10.1% oraz płuca 8.2% (Świątek, Aptekarz Polski 2009, 31/9 online).

Niezadowalające wyniki leczenia większości nowotworów złośliwych wynikają zarówno z braku skutecznych metod, toksyczności, jak i z narastającej oporności wielolekowej. Ograniczenia te wymuszają poszukiwania innych, bardziej skutecznych i mniej toksycznych leków.

Badania naukowe ukierunkowane są na modyfikację form farmaceutycznych obecnie stosowanych leków onkologicznych, poszukiwanie leków przeciwnowotworowych wśród leków obecnie stosowanych z innych wskazań oraz poszukiwanie nowych związków chemicznych pochodzenia naturalnego lub syntetycznych o działaniu przeciwnowotworowym. Największe nadzieje wiązane są z substancjami przeciwnowotworowych o precyzyjnym działaniu w oparciu o selektywne mechanizmy biologiczne (Świątek, Aptekarz Polski 2009, 31/9 online).

Przedmiotem wynalazku jest 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol o wzorze 1.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania związku o wzorze 1 polegający na tym, że 4-benzoilo-1-(izochinolin-3-ylokarbonylo)tiosemikarbazyd poddaje się reakcji wewnątrz wewnątrzcząsteczkowej cyklokondensacji, przy czym reakcję prowadzi się w temperaturze wrzenia w środowisku bezwodnego kwasu octowego przez 18-20 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną odparowuje się do początkowej objętości. Wytrącony produkt reakcji krystalizuje się z rozpuszcza lnika organicznego, korzystnie z metanolu lub etanolu.

Przedmiotem wynalazku jest także 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol o wzorze 1 do zastosowania jako lek do leczenia nowotworów piersi.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-2-ylo)-1,3,4-tiadiazolu o wzorze 1 do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia nowotworów piersi.

P r z y k ł a d:

Mieszaninę 4-benzoilo-1-(izochinolin-3-ylokarbonylo)tiosemikarbazydu (0.01 mola) i bezwodnego kwasu octowego (20 ml) ogrzewano w kolbce okrągłodennej zaopatrzonej w chłodnicę wodną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 20 godzin. Po tym czasie 15 ml kwasu octowego odparowano. Wydzielony osad odsączono a następnie przekrystalizowano z 96% etanolu. Otrzymano 1.50 g (45% wydajności teoretycznej) 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazolu o temperaturze topnienia 364-366°C (Tabela 1). Właściwą budowę związku oraz jego czystość potwierdzono na pod₁ stawie analizy widma ¹H oraz analizy elementarnej (Tabela 2).

PL 221 216 B1

T a b e l a 1. Czas i wydajność reakcji otrzymywania 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazolu

nazwa związku	czas reakcji [godz.]	wydajność [g = %]
2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol	20	1.50 = 45

T a b e l a 2. Parametry fizykochemiczne 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazolu

związek	parametry fizykochemiczne
analiza elementarna [%]1	¹H NMR	temp. top. [°C]
2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol	Teoretycznie: C 65.0 H 3.6 N 16.9 Oznaczono: C 65.3 H 3.7 N 16.8	(DMSO-d6) δ (ppm): 7.57-8.24 (m, 9H), 8.78 (s, 1H) 9.46 (s, 2H) 13.15 (s, 1H)	364-6

2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol badano pod kątem jego wpływu na żywotność komórek ludzkiego raka piersi linii MCF-7 i MDA-MB-231 za pomocą testu MTT.

Zasada testu MTT

Oznaczenie żywotności komórek linii MCF-7 i MDA-MB-231 wykonano przy użyciu testu MTT, zgodnie z Normą Europejską: ISO 10993-5:2009(E), Biological evaluation of medical devices, Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Test MTT oparty jest na przekształceniu żółtej soli MTT (bromku 3-[4,5-dimetylotiazolo-2-ilo]-2,5-difenylotetrazoliowego) do fioletowo-niebieskiego, nierozpuszczalnego formazanu.

Stężenie niebieskiego produktu jest wprost proporcjonalne do liczby żywych komórek w próbce i może być mierzone spektrofotometrycznie.

Część doświadczalna

Komórki raka piersi (MCF-7 i MDA-MB231) hodowano w podłożu DMEM (Dulbecco's minima ₃

Essentials medium)- GIBCO) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mmol/dm gluta33 miny, 50 U/cm peniciliny, 50 μg/cm streptomycyny w temperaturze (37°C, 5% CO₂). Następnie komórki liczono w hemocytometrze i przenoszono w ilości 1x10⁶ komórek na „oczko” zawieszonych w 1 ml pożywki hodowlanej do 6-oczkowych płytek. W ciągu kolejnych 24 godzin wzrostu komórki pokrywały co najmniej 80% powierzchni każdego „oczka”. Następnie komórki inkubowano z badanym związkiem przez 24 godziny. Po inkubacji usuwano podłoże znad komórek i każde „oczko” płukano ml PBS-u, czynność powtarzając 3 razy. Następnie do każdego „oczka” dodawano po 50 μl MTT ₃ o stężeniu 5 mg/cm³ i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Po upływie wymaganego czasu podłoże usunięto, a do komórek dodano 1 ml 0,1 M kwasu solnego w absolutnym izopropanolu i pozostawiono na 10 minut. W tak przygotowanym lizacie komórek mierzono absorbancję przy 570 nm. Wynik absorbancji uzyskany w hodowlach komórek kontrolnych przyjęto za 100%. Natomiast żywotność komórek inkubowanych w obecności badanych leków przedstawiono jako procent wartości kontrolnych.

Poziom istotności p wyznaczono nieparametrycznym testem U Manna-Whitney'a za pomocą programu SigmaStat. Wyniki przy poziomie istotności p<0,05 uznano za znamienne statystycznie. Wartości IC₅₀ (inhibitory concentration 50 - powodujące 50-procentową redukcję przeżywalności komórek linii MCF-7 i MDA-MB-231) wyznaczono na podstawie analizy zależności zastosowanych stężeń badanego związku i stopnia przeżywalności komórek (Statistica 10 PL).

Wyniki

W doświadczeniu oceniono wpływ testowanego związku na żywotność komórek nowotworowych linii MCF-7 i MDA-MB-231 przy pomocy testu MTT. Za kontrolę przyjęto hodowle komórkowe, bez dodatku badanych związków i rozpuszczalnika (DMSO). Żywotność komórek obliczono według wzoru:

Żywotność =

Wartość absorbancji próby badanej Wartość absorbancji próby kontrolnej x 100%

PL 221 216 B1

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol wykazuje wysoką cytotoksyczność. Oszacowano, że dawka IC₅₀ powodująca 50-procentową redukcję przeżywalności komórek linii MCF-7 wynosi 28 μM, zaś dawka IC₅₀ powodująca 50-procentową redukcję przeżywalności komórek linii MDA-MB-231 wynosi 14 μΜ. Dla porównania aktywności związku według wynalazku, wyznaczono wartości IC₅₀ dla znanego i stosowanego leku - chlorambucilu. Wynosiły one odpowiednio 97 μM dla linii MCF-7 i 92 μM dla linii MDA-MB-231.

Badanie wpływu 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazolu na proces biosyntezy DNA komórek linii MCF-7 i MDA-MB-231.

Badany związek dodawano do podłoża hodowlanego i inkubowano przez 24 godziny.

₃

Po tym czasie do podłoża dodawano 0,5 μφ [H]-tymidyny (aktywność właściwa 6,7 Ci/mmol) i dalej inkubowano komórki przez 4 godziny, w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO₂ (lub bez CO₂ - komórki MDA-MB-231), w temperaturze 37°C. Po tym czasie pożywkę usuwano, a powierzchnię komórek przemywano trzy razy (3 x 1 ml) 0,05 M Tris-HCl o pH 7,4, zawierającym 0,11M

NaCl. Następnie komórki przemywano dwa razy (2 x 1 ml) 5% roztworem kwasu trichlorooctowego ₃ (TCA) i rozpuszczono w 1 cm 0,1M NaOH zawierającym 1% SDS. Po 5 minutach uzyskany lizat ko₃ mórkowy przeniesiono do fiolek scyntylacyjnych zawierających 2 cm płynu scyntylacyjnego i mierzono radioaktywność. Intensywność biosyntezy DNA w komórkach kontrolnych, wyrażoną w dpm radioaktywnej tymidyny wbudowanej do DNA badanych komórek i przyjmowano za 100%. Wartości z prób badanych wyrażano jako procent wartości kontrolnej.

Wyznaczono wartość IC₅₀ (inhibitory concentration 50 - stężenie hamujące wbudowywanie tymidyny o 50%).

Wyniki

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol wykazuje zdolność inhibicji syntezy DNA proliferujących komórek nowotworowych. Oszacowano, że dawki IC₅₀ powodujące 50-procentową inhibicję syntezy DNA komórek linii MCF-7 wynosi 26 μΜ natomiast dla komórek linii MDA-MB-231 wynosi 32 μΜ. Dla porównania aktywności związku według wynalazku, wyznaczono wartości IC₅₀ dla znanego i stosowanego leku - chlorambucylu. Wynosiły one odpowiednio 65 μM dla linii MCF-7 i 56 μM dla linii MDA-MB-231. Tak więc, związek według wynalazku jest silniejszym inhibitorem biosyntezy DNA w komórkach linii MCF-7 i MDAMB-231 niż chlorambucyl.

Claims

1. Związek 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol o wzorze 1.

2. Sposób otrzymywania 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazolu o wzorze 1, znamienny tym, że 4-benzoilo-1-(izochinolin-3-ylokarbonylo)tiosemikarbazyd poddaje się reakcji wewnątrzcząsteczkowej cyklokondensacji w środowisku bezwodnego kwasu octowego, przy czym reakcję prowadzi się w temperaturze wrzenia bezwodnego kwasu octowego przez 18-20 godzin, po czym otrzymany produkt reakcji krystalizuje z rozpuszczalnika organicznego, korzystnie metanolu lub etanolu.

3. Związek 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazol o wzorze 1 do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu piersi.

4. Zastosowanie 2-benzoiloamino-5-(izochinolin-3-ylo)-1,3,4-tiadiazolu o wzorze 1 jako substancji aktywnej do wytwarzania środków farmaceutycznych do leczenia nowotworu piersi.