PL220468B1

PL220468B1 - Method for determining the concentration of polyhexamethylene biguanide (PHMB) in aqueous solutions

Info

Publication number: PL220468B1
Application number: PL401588A
Authority: PL
Inventors: Dorota Ziółkowska; Ewelina Nowińska; Aleksander Shyichuk
Original assignee: Univ T Przyrodniczy Im Jana I Jędrzeja Śniadeckich
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2012-11-13
Publication date: 2015-10-30
Also published as: PL401588A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób spektrofotometrycznego oznaczania stężeń biguanidu poliheksametylenowego w roztworach wodnych metodą spektrofotometryczną, przydatny szczególnie do kontroli procesów uzdatniania wody.The subject of the invention is a method of spectrophotometric determination of polyhexamethylene biguanide concentrations in aqueous solutions by spectrophotometric method, useful especially for the control of water treatment processes.

W ostatnich dwóch dekadach rośnie zainteresowanie kationowymi polimerami wodorozpuszczalnymi. Najczęściej są one stosowane w przemyśle papierniczym jako dodatki zwiększające wytrzymałość, czy też jako flokulanty w procesach oczyszczania ścieków [1] lub usuwania substancji humusowych (tj. kwasów huminowych i fulwowych) z wody [2]. Wykorzystuje się je również w wielu procesach przemysłowych jako zagęszczacze i emulgatory, stabilizatory zawiesin [3-5], a także modyfikatory powierzchni [6, 7]. Ostatnio zaproponowano zastosowanie kationowych polielektrolitów do kontroli zarodkowania i wzrostu cząsteczek oraz jako składników polielektrolitowych wielowarstw do pokrywania płaskich podłoży [4, 8]. Liczne są też zastosowania w medycynie i biotechnologii, np. jakościowe i ilościowe oznaczanie enzymów [9], otrzymywanie membran rozdzielczych, unieruchamianie enzymów lub komórek, przenoszenie leków, czy też oczyszczanie protein [10]. Z kolei w praktyce analitycznej polielektrolity kationowe służą jako odczynniki do oznaczania stężenia polimerów anionowych [11].In the last two decades, there has been a growing interest in cationic water-soluble polymers. They are most often used in the paper industry as additives increasing strength, or as flocculants in the processes of wastewater treatment [1] or removal of humic substances (ie humic and fulvic acids) from water [2]. They are also used in many industrial processes as thickeners and emulsifiers, suspension stabilizers [3-5], as well as surface modifiers [6, 7]. Recently, the use of cationic polyelectrolytes to control the nucleation and growth of molecules and as components of polyelectrolyte multilayers for covering flat substrates has been proposed [4, 8]. There are also numerous applications in medicine and biotechnology, eg qualitative and quantitative determination of enzymes [9], preparation of separating membranes, immobilization of enzymes or cells, drug transfer or protein purification [10]. In turn, in analytical practice, cationic polyelectrolytes are used as reagents for determining the concentration of anionic polymers [11].

Do powszechnie stosowanych polimerów wodorozpuszczalnych zalicza się biguanid poliheksametylenowy (PHMB), którego strukturę przedstawiono na rys. 1. PHMB jest szybko działającym biocydem. Już w niskich stężeniach niszczy bakterie Gram dodatnie i Gram ujemne, a także szerokie spektrum wirusów. Słabo się pieni i nie zostawia widocznych śladów na powierzchniach różnych materiałów. Jest odporny na działanie światła słonecznego, temperatury oraz fluktuacje pH, jego właściwości nie zależą też od twardości wody. Z wymienionych względów jest stosowany w zakresie zdrowia publicznego jako środek dezynfekujący lub środek konserwujący. Mechanizm działania PHMB polega na tym, że z zanieczyszczeniami tworzy nierozpuszczalne kompleksy, które następnie można z łatwością odfiltrować z roztworu lub zmyć z czyszczonej powierzchni. Jako środek dezynfekujący jest stosowany głównie w medycynie (do zapobiegania skażeniu mikrobiologicznemu mokrych ran i jałowych opatrunków, dezynfekowania naczyń medycznych i twardych powierzchni, dezodoryzowania toalet), w przemyśle spożywczym (jako efektywny bezchlorowy środek dezynfekcyjny o szerokim spektrum działania, dopuszczony do kontaktu z żywnością), w rolnictwie (do odkażania urządzeń rolniczych oraz wody pitnej dla zwierząt), w rekreacji (jako aktywny składnik preparatów do uzdatniania wody w basenach i spa). Wśród innych zastosowań można wymienić kontrolę zapachu tkanin, zabezpieczanie wilgotnych chusteczek czy konserwację filtrów powietrza. Z kolei jako konserwant jest używany w produkcji kosmetyków, środków ochrony osobistej, zmiękczaczy do tkanin, płynów do szkieł kontaktowych i innych. [12-16]Commonly used water-soluble polymers include polyhexamethylene biguanide (PHMB), the structure of which is shown in Fig. 1. PHMB is a fast-acting biocide. Already in low concentrations, it destroys Gram positive and Gram negative bacteria, as well as a wide spectrum of viruses. Low foaming and leaves no visible traces on the surfaces of various materials. It is resistant to sunlight, temperature and pH fluctuations, its properties do not depend on water hardness. For these reasons, it is used in public health as a disinfectant or preservative. The mechanism of action of PHMB is that it forms insoluble complexes with impurities, which can then be easily filtered from the solution or washed off the cleaned surface. As a disinfectant, it is mainly used in medicine (to prevent microbial contamination of wet wounds and sterile dressings, disinfect medical vessels and hard surfaces, deodorize toilets), in the food industry (as an effective chlorine-free disinfectant with a broad spectrum of activity, approved for contact with food) , in agriculture (for decontamination of agricultural equipment and drinking water for animals), in recreation (as an active ingredient in water treatment preparations in swimming pools and spas). Other applications include controlling the smell of fabrics, protecting wet wipes and maintaining air filters. In turn, as a preservative, it is used in the production of cosmetics, personal protective equipment, fabric softeners, liquids for contact lenses and others. [12-16]

PHMB w formie skoncentrowanej jest szkodliwy dla zdrowia człowieka. Szczególne zagrożenie stanowi jego połknięcie oraz kontakt z oczami. Jest też bardzo toksyczny dla ryb, wodnych bezkręgowców i roślin. PHMB w postaci rozcieńczonej (poniżej 1%), a także końcowe produkty jego działania, nie powodują dużego zagrożenia dla ludzi i środowiska. W małych stężeniach polimer ten w niewielkim stopniu działa drażniąco na skórę i oczy. [15, 17]Concentrated PHMB is harmful to human health. Swallowing and contact with eyes are of particular risk. It is also very toxic to fish, aquatic invertebrates and plants. PHMB in diluted form (less than 1%), as well as the final products of its action, do not pose a great risk to people and the environment. At low concentrations, this polymer is slightly irritating to the skin and eyes. [15, 17]

Ze względu na możliwość szkodliwego oddziaływania na organizmy żywe dawkowanie PHMB musi być ściśle kontrolowane. Precyzyjne oznaczanie resztkowych stężeń tego polimeru (np. w wodzie po jej dezynfekcji) jest możliwe tylko wtedy, gdy dysponujemy wystarczająco czułą, a przy tym prostą procedurą analityczną. Do ilościowej analizy PHMB w roztworach wodnych stosuje się głównie metody spektrofotometryczne. Wśród nich znajduje się procedura oparta na pomiarze absorbancji roztworu w świetle widzialnym, wykorzystująca eozynę Y jako wskaźnik, znana jako metoda Dawsona i Browna [18]. Inna polega na bezpośrednim pomiarze absorbancji w zakresie nadfioletu [19]. Wymienione metody są nieskomplikowane, jednak charakteryzują się ograniczoną czułością.Due to the possibility of harmful effects on living organisms, the dosage of PHMB must be strictly controlled. Precise determination of the residual concentration of this polymer (e.g. in water after its disinfection) is possible only if we have a sufficiently sensitive and simple analytical procedure. For the quantitative analysis of PHMB in aqueous solutions, mainly spectrophotometric methods are used. Among them there is a procedure based on the measurement of the absorbance of a solution in visible light, using eosin Y as an indicator, known as the Dawson and Brown method [18]. Another is the direct measurement of ultraviolet absorbance [19]. The methods listed are simple, but have a limited sensitivity.

W niniejszym rozwiązaniu wykorzystano metodę Bradford (stosowanej w biochemii do oznaczania stężenia białka [20]) do ilościowej analizy PHMB w roztworach wodnych. Metoda Bradford jest procedurą spektrofotometryczną i opiera się na zmianie absorbancji barwnika, błękitu brylantowego Coomassie G-250 (rys. 2), w trakcie jego wiązania się z białkiem w środowisku kwaśnym.This solution uses the Bradford method (used in biochemistry to determine protein concentration [20]) for the quantitative analysis of PHMB in aqueous solutions. The Bradford method is a spectrophotometric procedure and is based on a change in the absorbance of the Coomassie G-250 brilliant blue dye (Fig. 2) during its binding to the protein in an acidic environment.

Kolor błękitu brylantowego Coomassie G-250 (BBC) zależy od kwasowości roztworu, determinującej stan naładowania cząsteczki barwnika. Przy pH poniżej 0 barwnik jest kationem o całkowitym ładunku +1 i ma czerwony kolor (maksimum absorpcji znajduje się przy długości fali 470 nm). Gdy pH wynosi około 1, barwnik BBC występuje w postaci cząsteczek bez ogólnego ładunku i przybiera kolorThe color of Coomassie G-250 brilliant blue (BBC) depends on the acidity of the solution, which determines the state of charge of the dye molecule. At a pH below 0, the dye is a cation with a total charge of +1 and has a red color (the maximum absorption is at a wavelength of 470 nm). When the pH is around 1, the BBC dye appears as particles with no overall charge and takes on color

PL 220 468 B1 zielony (maksimum absorpcji znajduje się przy 620 nm). Przy pH powyżej 2 cząsteczka barwnika jest anionem o całkowitym ładunku -1 i kolorze jasno niebieskim (maksimum absorpcji przy 595 nm). Z kolei w warunkach alkalicznych barwnik BBC staje się różowy. Pomimo wyraźnej zależności koloru barwnika od odczynu roztworu duża zawartość kwasu ortofosforowego znajdującego się w odczynniku Bradford zapewnia stałość pH i eliminuje konieczność używania buforu w trakcie oznaczenia białek. Barwnik tworzy kompleksy z cząsteczkami białka, powodując przesunięcie długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji barwnika BBC z 465 do 595 nm. Wartość absorbancji jest proporcjonalna do stężenia białka, co stanowi podstawę oznaczenia.Green (absorption maximum is at 620 nm). At a pH above 2, the dye molecule is an anion with a total charge of -1 and a light blue color (absorption maximum at 595 nm). On the other hand, under alkaline conditions, the BBC dye turns pink. Despite the clear dependence of the color of the dye on the pH of the solution, the high content of orthophosphoric acid in the Bradford reagent ensures pH stability and eliminates the need to use a buffer during protein determination. The dye complexes with protein molecules, shifting the wavelength corresponding to the maximum absorption of the BBC dye from 465 to 595 nm. The absorbance value is proportional to the protein concentration and is used as the basis for the determination.

Istota rozwiązania wynalazku, polega na zastosowaniu odczynnika Bradford do spektrofotomerycznego oznaczania stężeń biguanidu poliheksametylenowego (wg lUPAC: Poly(iminoimidocarbonyl)-iminohexamethylene hydrochloride) w roztworach wodnych. Odczynnik Bradford jest kwaśnym wodno-alkoholowym roztworem barwnika Błękitu Brylantowego Coomassie G-250 (C,I. 42655). Standardowy przepis na przygotowanie tego odczynnika został opisany w oryginalnej pracy M. Bradford [20]. Barwnik wchodzący w skład odczynnika Bradford tworzy z PHMB kompleksy, których stężenie rośnie ze wzrostem ilości polimeru w roztworze. Podstawę oznaczenia stanowi pomiar absorbancji układu złożonego z określonej ilości odczynnika Bradford oraz próbki analitu zawierającego PHMB.The essence of the invention is based on the use of the Bradford reagent for the spectrophotomeric determination of the concentration of polyhexamethylene biguanide (according to IUPAC: Poly (iminoimidocarbonyl) -iminohexamethylene hydrochloride) in aqueous solutions. The Bradford reagent is an acidic hydroalcoholic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 (C, I. 42655) dye. A standard recipe for the preparation of this reagent was described in the original work of M. Bradford [20]. The dye included in the Bradford reagent forms complexes with PHMB, the concentration of which increases with the increase in the amount of polymer in the solution. The basis of the determination is the measurement of the absorbance of a system consisting of a certain amount of Bradford reagent and a sample of the analyte containing PHMB.

W sposobie wg wynalazku do wodnego roztworu biguanidu poliheksametylenowego dodaje się odczynnik Bradford rozcieńczony wodą destylowaną w proporcji 1:1, w ilości 1 część objętościowa na części objętościowe analitu, a następnie mierzy absorbancję roztworu. Odczynnik Bradford sporzą₃ dza się korzystnie poprzez rozpuszczenie 87,7 mg barwnika Błękit Brylantowy Coomassie G-250 w 50 cm³3In the method according to the invention, the Bradford reagent diluted with distilled water in the proportion 1: 1 is added to the aqueous solution of polyhexamethylene biguanide in the amount of 1 part by volume per part by volume of the analyte, and then the absorbance of the solution is measured. Bradford Reagent ₃ spends drawing up preferably by dissolving 87.7 mg of the dye Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 cm ^{3 of} 3

95% metanolu lub etanolu, dodanie 100 cm³ 85% kwasu fosforowego i rozcieńczenie, mieszaniny w/w ₃ odczynników do objętości 200 cm . Ilość biguanidu poliheksametylenowego w roztworze wzorcowym lub badanym wynosi korzystnie od 0,5 do 20 μΜ meru. Absorbancję korzystnie mierzy się względem wody destylowanej w probówce w której przygotowano próbkę, przy długości fali 600 nm, natychmiast po przygotowaniu próbki.95% methanol or ethanol, adding 100 cm ^{3 of} 85% phosphoric acid and diluting the mixture of the above- _{mentioned 3} reagents to a volume of 200 cm. The amount of polyhexamethylene biguanide in the standard or test solution is preferably from 0.5 to 20 µm. The absorbance is preferably measured against distilled water in a sample preparation tube at a wavelength of 600 nm immediately after sample preparation.

Roztwory wzorcowe do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej, jak również próbki do badań, przygotowuje się w następujący sposób:Standard solutions for the determination of the calibration curve, as well as the test samples, are prepared as follows:

₃₃

Do zakręcanej probówki o średnicy 16 mm wprowadza się 1 cm³ odczynnika Bradford rozcień₃ czonego wodą destylowaną w stosunku 1:1 oraz 4 cm³ badanego roztworu. Dopuszczalne stężenie polimeru w badanym roztworze wynosi od 0,5 do 20 μM meru. Po wymieszaniu układu probówkę umieszcza się w komorze spektrofotometru i dokonuje pomiaru absorbancji względem wody destylowanej przy wybranej długości fali z zakresu 590-610 nm (optymalnie 600 nm).To a screw-capped test tube with a diameter of 16 mm is introduced into a 1 cm ^{3 of} Bradford reagent ₃ czonego diluted with distilled water in the ratio 1: 1, and 4 cm ³ of test solution. The acceptable polymer concentration in the test solution is from 0.5 to 20 μM mer. After mixing the system, the test tube is placed in the spectrophotometer chamber and the absorbance is measured against distilled water at the selected wavelength in the range 590-610 nm (optimally 600 nm).

W oznaczeniu przeszkadzają sole. Jeżeli ich stężenia przekraczają 8,8 mM w przeliczeniu na NaCl, zakres stężeń PHMB ulega zawężeniu do 14 μM meru. Ponadto przeszkadzają surfaktanty niejonowe, kationowe i anionowe, jeżeli ich stężenia przekraczają odpowiednio 0,020, 0,006 oraz 0,012 mM, a także alkohol etylowy w stężeniach przekraczających 10% obj. W zakresie dopuszcza lnych stężeń substancji przeszkadzających krzywa kalibracyjna powinna być wyznaczona w obecności takich ilości tych substancji, jakie stwierdzono w roztworze analitu.Salts interfere with marking. If their concentrations exceed 8.8 mM converted into NaCl, the concentration range of PHMB is narrowed down to 14 μM mer. Moreover, non-ionic, cationic and anionic surfactants, if their concentrations exceed 0.020, 0.006 and 0.012 mM, respectively, as well as ethyl alcohol in concentrations exceeding 10% vol., Are also disturbing. Within the range of permitted concentrations of interfering substances, the calibration curve should be established in the presence of such interfering substances as found in the analyte solution.

Metoda pozwala na dokonanie oznaczenia przy pomocy nieskomplikowanego przyrządu pomiarowego (spektrofotometry Vis są zaliczane do podstawowego wyposażenia każdego laboratorium).The method allows for the determination with an uncomplicated measuring instrument (Vis spectrophotometers are included in the basic equipment of each laboratory).

Metoda cechuje się niskim stopniem komplikacji (wymaga wprowadzenia do próby tylko jednego odczynnika - odczynnika Bradford oraz eliminuje konieczność regulacji pH roztworu PDDA przed oznaczeniem).The method is characterized by a low degree of complication (requires the introduction of only one reagent to the test - the Bradford reagent and eliminates the need to adjust the pH of the PDDA solution before the determination).

Metoda cechuje się wysoką czułością (umożliwia oznaczanie stężeń PHMB w zakresie od 0,5 do 20 μM meru).The method is characterized by high sensitivity (it enables the determination of PHMB concentrations in the range from 0.5 to 20 μM mer).

Oznaczenie można przeprowadzić w krótkim czasie oraz w szerokim zakresie długości fali.The determination can be carried out in a short time and over a wide wavelength range.

Odczynnik Bradford sporządzono poprzez rozpuszczenie 87,7 mg barwnika Błękitu Brylantoo o wego Coomassie G-250 (M = 854,04) w 50 cm³ 95%-owego metanolu z dodatkiem 100 cm³ 85-87%₃ Bradford reagent was prepared by dissolving 87.7 mg of Coomassie's Diamond Blue G-250 dye (M = 854.04) in 50 cm ^{3 of} 95% methanol with the addition of 100 cm ³ 85-87% ₃

-owego H3PO4 i uzupełnienie wodą destylowaną do 200 cm³. Po dokładnym wymieszaniu odczynnik rozcieńczono wodą destylowaną w stosunku 1:1.H3PO4 and topping up with distilled water to 200 cm ³ . After thorough mixing, the reagent was diluted 1: 1 with distilled water.

Dziesięć wzorcowych roztworów wodnych PHMB o stężeniach od 0,5 do 20 μM meru otrzymano przez rozcieńczenie handlowego biguanidu poliheksametylenowego ( M meru = 219,5, C = 20%, d = ₃ Ten standard PHMB aqueous solutions with concentrations from 0.5 to 20 μM were obtained by diluting commercial polyhexamethylene biguanide (M = 219.5, C = 20%, d = ₃

1,04 g/cm³) wodą destylowaną.1.04 g / cm ³ ) with distilled water.

Krzywe kalibracyjne wyznaczono w następujący sposób:The calibration curves were determined as follows:

₃₃

Do zakręcanych probówek o średnicy 16 mm wprowadzono po 1 cm³ rozcieńczonego odczyn₃ nika Bradford oraz po 4 cm³ wzorcowego roztworu PHMB (zawierającego ewentualnie substancjeTo a screw-capped test tube with a diameter of 16 mm was put on a 1 cm ³ of dilute reaction media Bradford ₃ and 4 cm ^{3 of} the standard solution of PHMB (optionally containing substances

PL 220 468 B1 przeszkadzające). Po wymieszaniu układu probówkę niezwłocznie umieszczano w komorze spektrofotometru i dokonywano pomiaru absorbancji wobec wody destylowanej przy długości fali 600 nm, korzystając ze spektrofotometru Spectroquant Pharo 300 (Merck).PL 220 468 B1 disturbing). After the system was mixed, the tube was immediately placed in the spectrophotometer chamber and the absorbance was measured against distilled water at a wavelength of 600 nm using a Spectroquant Pharo 300 spectrophotometer (Merck).

Próbki do badań przygotowywano w następujący sposób:The test samples were prepared as follows:

₃₃

Do zakręcanej probówki o średnicy 16 mm wprowadzano 1 cm³ rozcieńczonego odczynnika ₃ Into a screw cap tube with a diameter of 16 mm, 1 cm ^{3 of} diluted reagent _{3 was introduced}

Bradford oraz 4 cm³ badanego roztworu. Po wymieszaniu układu przeprowadzano pomiar absorbancji analogicznie, jak w przypadku wyznaczania krzywej wzorcowej.Bradford and 4 cm ^{3 of the} test solution. After the system was mixed, the absorbance was measured in the same way as for the determination of the standard curve.

Względny błąd oznaczenia (δ, %) obliczano ze wzoru:The relative error of determination (δ,%) was calculated from the formula:

δ = (Co-Cexp) · 100/Co gdzie:δ = (Co-Cexp) 100 / What where:

C_o, μΜ meru - rzeczywiste stężenie PHMB w roztworze analitu,C _o , μΜ meru - the actual concentration of PHMB in the analyte solution,

C_exp, μΜ meru - stężenie PHMB wyznaczone doświadczalnie.C _exp , μΜ meru - the concentration of PHMB determined experimentally.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

T a b e l a 1. Wyniki oznaczenia stężenia PHMB w roztworach nie zawierającychT a b e l a 1. Results of determination of PHMB concentration in solutions containing no

C_o, μΜC _o , μΜ ^Cexp^{, μM} ^C exp ^{, μM} δ, % δ,% 4,80 4.80 4,54 4.54 5,52 5.52 9,60 9.60 9,03 9.03 5,90 5.90 19,20 19.20 19,62 19.62 -2,18 -2.18

P r z y k ł a d 2 T a b e l a 2. Wyniki oznaczenia stężenia PHMB w roztworach zawierających 8,8 mM chlorku sodu P r z k ł a d 2 T a b e l a 2. Results of PHMB concentration determination in solutions containing 8.8 mM sodium chloride C_o, μMC _o , μM ^Cexp^{, μM} ^C exp ^{, μM} δ, % δ,% 4,80 4.80 4,71 4.71 1,87 1.87 9,60 9.60 8,44 8.44 12,10 12.10 19,20 19.20 19,10 19.10 0,51 0.51

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

T a b e l a 3. Wyniki oznaczenia stężenia PHMB w roztworach zawierających alkohol etylowyT a b e l a 3. Results of determination of PHMB concentration in solutions containing ethyl alcohol

C_o, μMC _o , μM 1% EtOH 1% EtOH 10% EtOH 10% EtOH ^Cexp^{, μM} ^C exp ^{, μM} δ, % δ,% ^Cexp^, P-^M ^C exp ^, P- ^M δ, % δ,% 2,40 2.40 2,49 2.49 -3,63 -3.63 2,89 2.89 -20,58 -20.58 9,60 9.60 9,56 9.56 0,44 0.44 9,87 9.87 -2,77 -2.77 21,60 21.60 21,08 21.08 2,42 2.42 20,96 20.96 2,96 2.96

P r z y k ł a d 4P r z k ł a d 4

T a b e l a 4. Wyniki oznaczenia stężenia PHMB w roztworach zawierających surfaktantyT a b e l a 4. Results of PHMB concentration determination in solutions containing surfactants

C_o, μMC _o , μM Rokanol T18, 0,004 mM Rokanol T18, 0.004 mM Hyamine, 0,003 mM Hyamine, 0.003 mm ABSNa, 0,003 mM ABSNa, 0.003 mm ^Cexp^{, μM} ^C exp ^{, μM} δ, % δ,% ^Cexp^, P-^M ^C exp ^, P- ^M δ, % δ,% ^Cexp^{, μM} ^C exp ^{, μM} δ, % δ,% 4,80 4.80 4,71 4.71 1,79 1.79 5,4 5.4 -14,07 -14.07 3,58 3.58 25,35 25.35 9,60 9.60 9,63 9.63 -0,27 -0.27 10,8 10.8 -13,42 -13.42 10,60 10.60 -10,38 -10.38 19,20 19.20 20,12 20.12 -4,78 -4.78 19,0 19.0 0,88 0.88 17,77 17.77 7,46 7.46

* eter polioksyetylenoglikolowy nasyconego alkoholu tłuszczowego (niejonowy) ** chlorek benzotioniowy (kationowy) *** sól sodowa kwasu alkilo(C10-C13)benzenosulfonowego (anionowy)* polyoxyethylene glycol ether of saturated fatty alcohol (non-ionic) ** benzothionium chloride (cationic) *** sodium salt of alkyl (C10-C13) benzene sulphonic acid (anionic)

Wzór 1 przedstawia wzór strukturalny biguanidu poliheksametylenowego, (C8H17H5)mFormula 1 shows the structural formula of polyhexamethylene biguanide, (C8H17H5) m

Wzór 2 przedstawia wzór strukturalny barwnika Błękitu Brylantowego Coomassie G-250, ^C47^H50^N3^NaO7^S2Formula 2 shows the structural formula of Coomassie Diamond Blue G-250, ^C 47 ^H 50 ^N 3 ^NaO 7 ^S 2

PL 220 468 B1PL 220 468 B1

LITERATURALITERATURE

[1] Hou Sijan, Ha Runhua, The Electrochemical Analysis of Cationic Water Soluble Polymer,[1] Hou Sijan, Ha Runhua, The Electrochemical Analysis of Cationic Water Soluble Polymer,

Eur. Polym. J., Vol. 34, No. 2, 283-286, 1998Eur. Polym. J., Vol. 34, No. 2, 283-286,1998

[2] Sang-Kyu Kam, John Gregory, The Interaction Of Humic Substances with Cationic Polyelectrolytes, Wat. Res., Vol. 35, No. 15, 3557-3566, 2001[2] Sang-Kyu Kam, John Gregory, The Interaction Of Humic Substances with Cationic Polyelectrolytes, Wat. Res., Vol. 35, No. 15, 3557-3566, 2001

[3] Chalothorn Soponvuttikul, John F. Scamehorn and Chinatana Saiwan, Aqueous Dispersion Behavior of Barium Chromate Crystals: Effect of Cationic Polyelectrolyte, Langmuir, 19, 4402-4410, 2003[3] Chalothorn Soponvuttikul, John F. Scamehorn and Chinatana Saiwan, Aqueous Dispersion Behavior of Barium Chromate Crystals: Effect of Cationic Polyelectrolyte, Langmuir, 19, 4402-4410, 2003

[4] lone! Popa, Brian P. Cahill, Plinio Maroni, Georg Papastavrou, Michal Borkovec, Thin adsorbed films of a strong cationic polyelectrolyte on silica substrates, Journal of Colloid and Interface Science, 309, 28-35, 2007[4] lone! Popa, Brian P. Cahill, Plinio Maroni, Georg Papastavrou, Michal Borkovec, Thin adsorbed films of a strong cationic polyelectrolyte on silica substrates, Journal of Colloid and Interface Science, 309, 28-35, 2007

[5] Yu-Jen SMn, Chia-Chi Su, Yun-Hwei Shen, Dispersion of aqueous nano-sized alumina suspensions using cationic polyelectrolyte, Materials Research Bulletin, 41, 1964-1971, 2006[5] Yu-Jen SMn, Chia-Chi Su, Yun-Hwei Shen, Dispersion of aqueous nano-sized alumina suspensions using cationic polyelectrolyte, Materials Research Bulletin, 41, 1964-1971, 2006

[6] Adi Radian, Yael G. Mishael, Characterizing and Designing Polycation-Clay Nanocomposites As a Basis for Imazapyr Controlled Release Formulations, Environ. Sci. Technol, 42, 1511-1516, 2008[6] Adi Radian, Yael G. Mishael, Characterizing and Designing Polycation-Clay Nanocomposites As a Basis for Imazapyr Controlled Release Formulations, Environ. Sci. Technol, 42, 1511-1516, 2008

[7] Mihaela Rusu, Dirk Ruckling, Helmuth Mohwald, Monika Schonhoff, Adsorption of novel thermosensitive graft-copolymers: Core-shell particles prepared by polyelectrolyte multilayer self-assembly, Journal of Colloid and Interface Science, 298, 124-131, 2006[7] Mihaela Rusu, Dirk Ruckling, Helmuth Mohwald, Monika Schonhoff, Adsorption of novel thermosensitive graft-copolymers: Core-shell particles prepared by polyelectrolyte multilayer self-assembly, Journal of Colloid and Interface Science, 298, 124-131, 2006

[8] Zarui Sara Chickneyan, Alejandro L. Briseno, Xiangyang Shi, Shubo Han, Jiaxing Huang, Feimeng Zhou, Polyelectrolyte-Mediated Assembly of Copper Phthalocyanine Tetrasulfonate Multilayers and the Subsequent Production of Nanoparticulate Copper Oxide Thin Films, J. Nanosci. Nanotech., Vol, 4, No, 6, 628-634, 2004[8] Zarui Sara Chickneyan, Alejandro L. Briseno, Xiangyang Shi, Shubo Han, Jiaxing Huang, Feimeng Zhou, Polyelectrolyte-Mediated Assembly of Copper Phthalocyanine Tetrasulfonate Multilayers and the Subsequent Production of Nanoparticulate Copper Oxide Thin Films, J. Nanosci. Nanotech., Vol. 4, No, 6, 628-634, 2004

[9] Chi-Shen Chen, Michael H. Penner, Turbidity-Based Assay for Polygalacturonic Acid Depolymerase Activity, J. Agric. Food Chem,, 55, 5907-5911, 2007[9] Chi-Shen Chen, Michael H. Penner, Turbidity-Based Assay for Polygalacturonic Acid Depolymerase Activity, J. Agric. Food Chem, 55, 5907-5911, 2007

[10] Nicholas A. D. Burke, M. A. Jafar Mazumder, Mark Hanna, Harald D. H, Stover, Polyelectrolyte Complexation Between Poly(methacrylic acid, sodium salt) and Poly(diallyldimethylammonium chloride) or Poly[2-(methacryloyloxyethyl) trimethylammonium chloride], Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 45, 4129-4143, 2007[10] Nicholas AD Burke, MA Jafar Mazumder, Mark Hanna, Harald D. H, Stover, Polyelectrolyte Complexation Between Poly (methacrylic acid, sodium salt) and Poly (diallyldimethylammonium chloride) or Poly [2- (methacryloyloxyethyl) trimethylammonium chloride], Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 45, 4129-4143, 2007

[11] Xianhua Feng, Marc Leduc, Robert Pelton, Polyelectrolyte complex characterization with isothermal titration calorimetry and colloid titration, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 317, 535-542, 2008[11] Xianhua Feng, Marc Leduc, Robert Pelton, Polyelectrolyte complex characterization with isothermal titration calorimetry and colloid titration, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 317, 535-542, 2008

[12] D.M. Goeresa, T. Palysb, B.B. Sandelb, J. Geigerb, Evaluation of disinfectant efficacy against biofilm and suspended bacteria in a laboratory swimming pool model, Water Research. 38, 3103-3109, 2004[12] D.M. Goeres, T. Palysb, B.B. Sandelb, J. Geigerb, Evaluation of disinfectant efficacy against biofilm and suspended bacteria in a laboratory swimming pool model, Water Research. 38, 3103-3109, 2004

[13] Linyan Feng, Fuwang Wu, ling Li, Yueming Jiang, Xuewu Duan, Antifungal activities of polyhexamethylene biguanide and polyhexamethylene guanide against the citrus sour rot pathogen Geotrichum citri-aurantii in vitro and in vivo, Posthaiv'est Biology and Technology, 61, 160-164, 2011[13] Linyan Feng, Fuwang Wu, ling Li, Yueming Jiang, Xuewu Duan, Antifungal activities of polyhexamethylene biguanide and polyhexamethylene guanide against the citrus sour rot pathogen Geotrichum citri-aurantii in vitro and in vivo, Posthaiv'est Biology and Technology, 61 , 160-164, 2011

[14] Michael J. Martin, M. Rezanur Rahman, Gordon J. Johnson, M. Srinivasan, Yvonne M. Clayton, Mycotic keratitis; susceptibility to antiseptic agents, International Ophthalmology, 19, 299-302, 1996[14] Michael J. Martin, M. Rezanur Rahman, Gordon J. Johnson, M. Srinivasan, Yvonne M. Clayton, Mycotic keratitis; susceptibility to antiseptic agents, International Ophthalmology, 19, 299-302, 1996

[15] Shin OHTA, Yuka MISAWA, Hidekazu MIYAMOTO, Masahiro MARINO, Katsuhiro NAGAI, Tadashi SHIRAISHI, Yoshito NAKAGAWA, Susumu YAMATO, Eiichi TACHIKAWA, Hiroshi ZEND A, A Comparative Study of Characteristics of Current-Type and Conventional-Type Cationic Bactericides, Biol. Pharm, Bull., 24, 9, 1093-1096, 2001[15] Shin OHTA, Yuka MISAWA, Hidekazu MIYAMOTO, Masahiro MARINO, Katsuhiro NAGAI, Tadashi SHIRAISHI, Yoshito NAKAGAWA, Susumu YAMATO, Eiichi TACHIKAWA, Hiroshi ZEND A, A Comparative Study of Biotic-Type and Characterization of Conversion and Characterization of Current Cultural Characterization Biol. Pharm, Bull., 24, 9, 1093-1096, 2001

[16] Larisa Timofeeva, Natalia Kleshcheva, Antimicrobial polymers; mechanism of action, factors of activity, and applications, AppL Microbiol. Biotechnol., 89, 475-492, DOI 10.1007/S00253-0102920-9, 2011[16] Larisa Timofeeva, Natalia Kleshcheva, Antimicrobial polymers; mechanism of action, factors of activity, and applications, AppL Microbiol. Biotechnol., 89, 475-492, DOI 10.1007 / S00253-0102920-9, 2011

[17] Jean-Francois Gehanno, Anne-Emmanuelle Priot, Xavier Balguerie, Jean-Francois Gaillard, Polyhexamethylenebiguanide hydrochloride exposure and erythema multiforme in a physician, International Journal of Occupational Medicine and Environmental Health, 19, 1, 81-82, DOI 10.2478/v10001-006-0002-0, 2006[17] Jean-Francois Gehanno, Anne-Emmanuelle Priot, Xavier Balguerie, Jean-Francois Gaillard, Polyhexamethylenebiguanide hydrochloride exposure and erythema multiforme in a physician, International Journal of Occupational Medicine and Environmental Health, 19, 1, 81-82, DOI 10.2478 / v10001-006-0002-0, 2006

[18] Mark W. Dawson, Tim J. Brown, Desmond G. Till, The effect of Baquacil on pathogenic free living amoebae (PFLA) 1. In axenic conditions, New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research, 17, 3, 305-311, 1983[18] Mark W. Dawson, Tim J. Brown, Desmond G. Till, The effect of Baquacil on pathogenic free living amoebae (PFLA) 1. In axenic conditions, New Zealand Journal of Marine and Freshwater Research, 17, 3, 305 -311, 1983

PL 220 468 B1PL 220 468 B1

[19] A. Kawabata, J.A. Taylor, The effect of reactive dyes upon the uptake and anti bacterial action of poly(hexamethylene biguanide) on cotton. Part 2: Uptake of poly(hexamethylene biguanide) on cotton dyed with b-sulphatoethylsulphonyl reactive dyes, Dyes and Pigments, 68, 197-204, 2006[19] A. Kawabata, J.A. Taylor, The effect of reactive dyes upon the uptake and anti bacterial action of poly (hexamethylene biguanide) on cotton. Part 2: Uptake of poly (hexamethylene biguanide) on cotton dyed with b-sulphatoethylsulphonyl reactive dyes, Dyes and Pigments, 68, 197-204, 2006

[20] Bradford, M.M., Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, 1976.[20] Bradford, M.M., Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976.

Claims

1. Method for determining the concentration of polyhexamethylene biguanide in aqueous solutions by spectrophotometric method, characterized in that the Bradford reagent diluted with distilled water in the proportion 1: 1 is added to the aqueous solution of polyhexamethylene biguanide in the amount of 1 part by volume for 4 parts by volume of the analyte, and then the absorbance solution.

2. The method according to p. _{3. A} method according to claim 1, characterized in that the Bradford reagent is prepared by dissolving 87.7 mg of the Coomassie G-250 Diamond Blue dye in 50 cm ^{3 of} 95% methanol or _{3 of} ethanol, adding 100 cm ^{3 of} 85% phosphoric acid and diluting the mixture of the above-mentioned reagents up to ₃ volumes of 200 cm ³ .

3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the amount of polyhexamethylene biguanide in the standard or test solution is 0.5 to 20 pM of mer.

4. The method according to p. The method of claim 1, wherein the absorbance is measured against distilled water in a sample preparation tube at a wavelength of 600 nm.

5. The method according to p. The method of claim 4, wherein the absorbance is measured immediately after preparation of the sample.