PL215832B1 - Diestry arylowe kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich peptydowe pochodne oraz sposób ich wytwarzania i zastosowanie - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe diestry arylowe kwasów 1-aminoalkano-fosfonowe i ich peptydowe pochodne, które są analogami leucyny i fenyloalaniny, sposób wytwarzania diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie do wytwarzania preparatów inhibitujących chymotrypsyny.

W literaturze patentowej i naukowej nie są opisane podstawione diestry kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, poza kilkoma przykładami pochodnych fenyloalaniny podstawionych chlorowcem w estrowych pierścieniach fenylowych znanych z publikacji Boduszek B, Brown A.D, Powers J.C, J. Enz. Inhib. Med. Chem., 1994, 8, 147-158. Nie są też znane właściwości biologiczne i sposoby wytwarzania związków z innymi niż halogenowe podstawnikami w pierścieniu fenylowym diestrów. Znany jest z publikacji Oleksyszyn J, Powers JC, Biochemistry, 1991, 30, 485-493 oraz ze zgłoszenia w trybie PCT nr PCT/JP2004/006384 inhibitor chymotrypsyny z grupy pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosonowych, Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)2, w którym symbol Phe^p oznacza fosfonowy analog fenyloalaniny, czyli kwas 1-amino-2-benzylo-etanofosfonowy, a Phe^p(OPh)2 oznacza ester difenylowy kwasu 1-amino-2-benzylo-etanofosfonowego.

Diestry arylowe kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich peptydowe pochodne, o wzorze ogólnym 1, w którym W oznacza grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), albo resztę peptydową składającą się z jednego, dwóch lub trzech aminokwasów, R1 oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów, w szczególności leucyny lub fenyloalaniny, zaś X1, X2, X3, X4 i X5 są takie same lub rożne i oznaczają metyl, etyl, benzyl, O-metyl i S-metyl.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich peptydowych pochodnych, o wzorze ogólnym 1, do wytwarzania preparatów do hamowania aktywności chymotrypsyny i subtylizyny.

Inhibitory subtylizyny mogą stanowić nową generację skutecznych leków przeciw gruźlicy. Subtylizyna jest bakteryjną serynową proteazą o specyficzności chymotrypsyny. Niektóre bakterie jak np. gram dodatnie Bacillus subtilis produkują subtilizynę i jej inhibitory posiadają silne właściwości bakteriostatyczne. Mutanty Bacillus subtilis wydzielające duże ilości proteaz mają zwiększoną tolerancję do antybiotyków β-laktamowych. Inhibitory tych proteaz, należących do rodziny subtilizyny zwiększają wrażliwość tych szczepów na β-laktamy. Bakterie z rodzaju Mycobacterium tuberculosis odpowiedzialne za gruźlicę produkują aż pięć subtylizyno-podobnych serynowych proteaz, mycosyny 1-5.

Sposób wytwarzania podstawionych diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich peptydowych pochodnych o wzorze ogólnym 1, polega na tym, że w pierwszym etapie na drodze syntezy z fenolu zawierającego jeden z podstawników: 4-S-metylowy, 3,4,5-trietylowy, 4-metylowy, 3-metoksylowy, 4-etylowy, 4-metoksylowy, 2,3-dimetylowy bądź 2-naftol w acetonitrylu bądź benzenie i w obecności chlorku fosforu (III) w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika otrzymuje się fosforyn trifenylowy zawierający jeden z podstawników w każdym pierścieniu aromatycznym: 4-S-metylowy, 3,4,5-trietylowy, 4-metylowy, 3-metoksylowy, 4-etylowy, 4-metoksylowy, 2,3-dimetylowy bądź fosforyn tri(2-naftylowy). Następnie otrzymany fosforyn triarylowy poddaje się reakcji amidoalkilowania z karbaminianem benzylu, aldehydem izowalerianowym bądź aldehydem fenylooctowym w lodowatym kwasie octowym w temperaturze 90°C i w otrzymanym w wyniku przeprowadzonej reakcji diarylowym estrze N-benzyloksykarbonylowym kwasu 1-aminofosfonowego odblokowuje się grupę aminową przy użyciu roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym, a następnie sprzęga go z proliną zawierającą zablokowaną N-końcową grupą aminową przez grupę tert-butoksykarbonylową (t-Boc), przy użyciu heksafluorofosforanu O-benzotriazoI-1-ylo-N,N,N,N-tetra-metylo-uroniowego (HBTU), trójetyloaminy i acetonitrylu jako rozpuszczalnika, a po reakcji sprzęgania w temperaturze pokojowej, mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, ekstrahuje octanem etylu i przemywa się kolejno siarczanem potasu (5%), solanką, wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Przy czym w celu syntezy pochodnych tripeptydowych w otrzymanych fosfonowych dipeptydach, zawierających N-końcową resztę N-Boc-proliny oraz jeden z podstawników w każdym estrowym pierścieniu aromatycznym pochodnej kwasu 1-aminoalkanofosfonowego, z grupy: 4-S-metylowy, 3,4,5-trietylowy, 4-metylowy, 3-metoksylowy, 4-etylowy, 4-metoksylowy, 2,3-dimetylowy bądź estry naftyIowe, usuwa się grupę N-Boc, przy użyciu roztworu kwasu trófluorooctowego (TFA) i dichlorometanu po prowadzonej w temperaturze pokojowej reakcji sprzęgania, mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, ekstrahuje dwukrotnie octanem etylu i przemywa kolejno siarczanem potasu (5%), solanką, wodorowęglanem sodu (5%) i solanką.

PL 215 832 B1

Zgodnie wynalazkiem w przypadku wytwarzania estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych z nowymi podstawnikami przy aromatycznych pierścieniach fenylowych, prowadzi się reakcję syntezy fosforynu triarylowego z karbaminianem benzylu, aldehydem fenylooctowym bądź izowalerianowym w kwasie octowym. Reakcje prowadzi się w temperaturze 90°C.

W przypadku wytwarzania dipeptydowych pochodnych diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych stosuje się bromowodorki estrów difenylowych pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych jako substraty reakcji, które uzyskuje się uprzednio w reakcji syntezy estrów difenylowych pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych z roztworem kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadza się reakcję sprzęgania bromowodorków estrów difenylowych pochodnych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych z proliną z zablokowaną N-końcową grupą aminową przez grupę tert-butoksykarbonylową (t-Boc), przy użyciu heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-W,W,W',W-tetrametylouroniowego (HBTU), trójetyloaminy i acetonitrylu jako rozpuszczalnika. Reakcje sprzęgania przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, ekstrahuje dwukrotnie octanem etylu i przemywa się kolejno dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Do warstwy octanowej dodaje się siarczanu magnezu i powstały produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej. W efekcie otrzymuje się odpowiednie dipeptydy, zawierające w swej strukturze resztę estru difenylowego fosfonowego analogu leucyny lub fenyloalaniny, z zablokowaną grupą a-aminową.

W przypadku wytwarzania pochodnych tripeptydowych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych stosuje się dipeptydowe pochodne diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych jako substraty reakcji. Następnie usuwa się z pochodnych dipeptydowych grupę blokującą tert-butoksykarbonylową (t-Boc), przy użyciu roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) i dichlorometanu (CH2CI2) w stosunku objętościowym 1:1 i prowadzi się reakcję addycji kolejnego aminokwasu -waliny z zablokowaną grupą α-aminową przy użyciu odczynnika sprzęgającego heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylo-uroniowego (HBTU), trójetyloaminy i acetonitrylu jako rozpuszczalnika. Reakcje sprzęgania przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, ekstrahuje dwukrotnie octanem etylu i przemywa kolejno dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Do warstwy octanowej dodaje się siarczanu magnezu i powstały produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej.

Nowe związki są mieszaninami racemicznymi w przypadku prostych analogów fosfonowych fenyloalaniny i leucyny oraz mieszaninami diastereoizomerów w przypadku pochodnych di- i tri-peptydowych.

Zasadnicze korzyści wynikające z wynalazku polegają na otrzymaniu związków, które wykazują silną aktywność biologiczną hamującą aktywność chymotrypsyny takich jak ludzka sercowa chymaza, katepsyna G i subtylizyna. Niekontrolowana aktywność tych enzymów jest związana z stanami patologicznymi prowadzącymi do chorób. Dla przykładu aktywność chymotrypsyny w przewodzie trawiennym ludzi prowadzi do szybkiej inaktywacji guanyliny. Guanylina jest jelitowym peptydem produkowanym jako 115 aminokwasów proproteina. Wiąże się ona z transmembranowym receptorem aktywującym cyklazę guanylową. Receptor ten obecny jest w membranie enterocytów jelitowych. Aktywacja receptora prowadzi do wzrostu stężenia c-GMP. Wzrost stężenia c-GMP powoduje zmniejszenie absorpcji wody i wzrost wydzielania jonów chlorkowych i potasowych prowadząc do zmian w transporcie płynów i elektrolitów jelitowych oraz skutkuje normalizacją pracy jelit.

Aktywna forma guanyliny składająca się tylko z 15 aminokwasów, stymuluje uwalnianie jonów chlorkowych i jest szybko hydrolizowana w przewodzie pokarmowym przez znajdującą się tam chymotrypsynę. Inhibitory chymotrypsyny zapobiegając hydrolizie aktywnej guanyliny wydłużają i poprawiają jej działanie, prowadząc do efektów terapeutycznych w szeregu schorzeń jelitowych.

Inhibitory chymazy z ludzkiego serca mają własności protekcyjne dla ludzkiego serca i mogą być używane jako leki przy całym szeregu komplikacji kardiologicznych np. przy arteriosklerozie, po ataku serca lub operacjach serca. Nowe związki będące przedmiotem wynalazku charakteryzują się znacznie lepszą efektywnością w inhibitowaniu chymotrypsyny, dlatego mogą znaleźć zastosowanie terapeutyczne w chorobach sercowych, komplikacjach układu trawiennego i jako nowe substancje antybakteryjne. Stwierdzono, że z enzymami reaguje tylko jedna forma optyczna - ta, która opowiada izomerowi L-fenyloalaniny czy L-leucyny. Nowe związki można z łatwością rozdzielić na enancjomery lub diastereoizomery jedną z dobrze znanych metod: na przykład przy zastosowaniu HPLC,

PL 215 832 B1 wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej i korzystnie stosować tylko jeden, reaktywny izomer optyczny.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach otrzymywania wybranych estrów difenylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych z nowymi podstawnikami przy aromatycznych pierścieniach fenolowych, bez ograniczania jego zakresu.

P r z y k ł a d I

Wytwarzanie estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)izobutylometanofosfonowego, przedstawionego wzorem 2, prowadzi się w dwóch etapach.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metylomerkaptofenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej dodaje się 4,20 g (30 mmola) 4-metylomerkaptofenolu i rozpuszcza w 100 ml benzenu. Do powstałego, lekko różowego roztworu dodaje się 4,15 ml (30 mmola) trójetyloaminy (Et3N) i mieszając wkrapla 0,87 ml (10 mmola) chlorku fosforu (III). Początkowo reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej. Jednakże, gdy roztwór zaczyna się samoistnie ogrzewać chłodzi się go wodą z lodem. Powstałą galaretowatą zawiesinę miesza się przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie całość ekstrahuje się czterokrotnie wodą i suszy z 3 g siarczanu sodu (Na2SO4). Lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje mleczny olej, który wykorzystuje się bezpośrednio (bez oczyszczania) do reakcji syntezy estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-izobutylo-metano-fosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(henzyloksy-karbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - wyposażonej w mieszadło magnetyczne, wprowadza się fosforyn trój-4-metylomerkapto-fenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 i dodaje 1,34 g (8,8 mmola) karbaminianu benzylu i 1 ml (9,2 mmola) aldehydu izowalerianowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 20 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 4,5 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem z lekko zielonego roztworu usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza się w 200 ml metanolu i umieszcza w temperaturze -20°C na 12 godzin w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt przesącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa metanolem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 1,6 g (38% wagowo) śnieżnobiałego produktu w postaci estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-izobutylo-metano-fosfonowego, przedstawionego 31 wzorem 2. Wzór sumaryczny: C27H32O5S2NP. Masa cząsteczkowa: 545,645g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI₃, δ [ppm]): 20.37(s). Widmo ¹HNMR (roztwór W CDCl₃, δ [ppm]): 0,98 (d, J=5,79 Hz,

6H, 2xCH3), 1,61-2,16 (m, 3H, CH2, CH), 2,47 (s, 6H, 2xCH3), 4,61 (m, 1H, CHP), 5,18 (s, 1H, NH), 5,06 (m, 2H, ArCH2O), 6,9-7,3 (m, 13H, aromat.). Temperatura topnienia: 126°C.

P r z y k ł a d II

Sposób wytwarzania estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego przedstawionego wzorem 3.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-3,4,5-trimetylofenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 11,3 g (76 mmol) 3,4,5-trimetylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 10 minut. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się

2,36 ml (25 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylometano-fosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-3,4,5-trimetylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 3,88 g (25 mmol) karbaminianu benzylu i 2,64 ml (25 mmol) aldehydu izowalerianowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 2 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 250 ml metanolu i umieszcza w temperaturze -20°C na 15 godzin w celu krystalizacji produktu.

PL 215 832 B1

Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu. Uzyskuje się 5,72g (51% wagowo) surowego estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego, przedstawionego wzorem 3 w postaci białego osadu.

Od

Wzór sumaryczny: C31H38O5NP. Masa cząsteczkowa: 537,633 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, 5[ppm]): 18,75 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 0,99 (d, J=5,52 Hz, 6H, 2xCH3), 1,83 (m, 3H, CH2, CH), 2,41 (d, J=13,92 Hz, 18H, 6xCH3), 4,58 (m, 1H, CHP), 5,11 (s, 1H, NH), 5,03 (m, 2H, ArCH₂O), 6,50-7,37 (m, 9H, aromat.). Temperatura topnienia: 111°C.

P r z y k ł a d III

Sposób wytwarzania estru di-4-metylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego przedstawionego wzorem 4.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metylofenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 8,97 g (83 mmol) 4-metylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80°C przez 10 minut. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 2,55 ml (28 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-metylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 4,23 g (28 mmol) karbaminianu benzylu i 2,92 ml (28 mmol) aldehydu izowalerianowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 2,5 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 200 ml metanolu i całość umieszcza w temperaturze 20°C na 12 godzin w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt przesącza się i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 3,43 g (38% wagowo) surowego estru di-4-metylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego przedstawionego wzorem 4 w postaci białego proszku. Wzór sumaryczny: C27H32O5NP. Masa cząsteczkowa: 467,50 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 18,82 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): (d, J=5,86 Hz, 6H, 2xCH3), 1,77 (m, 3H, CH2, CH), 2,31 (t, J=19,79 Hz, 6H, 2xCH3), 4,61 (m, 1H, CHP), 5,11 (s, 1H, NH), 5,14 (m, 1H, 2H, ArCH2O), 6,96-7,35 (m, 13H, aromat.). Temperatura topnienia: 118°C.

P r z y k ł a d IV

Sposób wytwarzania estru di-3-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego przedstawionego wzorem 5.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-3-metoksyfenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 7,5 g (60 mmola) 3-metoksyfenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 10 minut. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1,8 ml (20 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-3-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metano-fosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-3-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-3-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 3,05 g (20 mmola) karbaminianu benzylu i 2,3 ml (21 mmola) aldehydu izowalerianowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 200 ml metanolu i umieszcza w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Uzyskuje się 2,31 g (31% wagowo) surowego estru di-3-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego przed6

PL 215 832 B1 stawionego wzorem 5, w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C27H32O7NP. Masa cząsteczkowa: 513,525 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI₃, δ [ppm]): 18,76 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 0,98 (d, 1=5,68 Hz, 6H, 2xCH), 1,69-2,3 (m, 3H, CH2, CH), 3,80 (dd, 1=16,06/11,17 Hz, 6H, 2xCH3), 4,65 (m, 1H, CHP), 5,19 (s, 1H, NH), 5,13 (m, 2H, ArCH2O), 6,4-7,33 (m, 13H, aromat.). Temp. topnienia: 59°C.

P r z y k ł a d V

Sposób wytwarzania estru di-4-etylofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-benzyloetanofosfonowego przedstawionego wzorem 6.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-etylofenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 10,2 g (83 mmola) 4-etylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 10 minut. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 2,55 ml (28 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-etylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-etylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzyloetanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-etylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 4,23 g (28 mmola) karbaminianu benzylu i 3,12 ml (28 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 20-30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 4 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w około 200 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 12 godzin w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 4,79 g (47% wagowo) surowego estru di-4-etylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego, przedstawionego wzorem 6 w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C24H29O5NP. Masa cząsteczkowa: 543,596. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 17,58 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 1,18 (m, 6H, 2 x CH3), 1,32 (m, 4H, 2 xCH2,), 2,8-3,3 (m, 2H, CH2), 4,7 (dd, 1=4,44 Hz, 1=4,53 Hz, 1H, CHP), 5,14 (d, 1=10,2 Hz, 1H, NH), 4,92 (s, 2H, ArCH2O), 6,91-7,23 (m, 18H, aromat.). Temperatura topnienia: 112°C.

P r z y k ł a d VI

Sposób wytwarzania estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego przedstawionego wzorem 7.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 10,3 g (83 mmola) 4-metoksyfenolu i 30 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 2 minuty. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się

2,55 ml (28 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne rozpuszczalniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-etylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)benzylo-etanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)benzylo-etanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 4,23 g (28 mmola) karbaminianu benzylu i 3,12 ml (28 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 5 godzin. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza się w 150 ml metanolu i całość umieszcza w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Uzyskuje się 0,91 g (8,8% wagowo) surowego estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego przedstaPL 215 832 B1 wionego wzorem 7 w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C23H27O6NP. Masa cząsteczkowa:

547,541. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18,11 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 2,09 (s, 3H, CH3), 3,30 (m, 2H, CH2), 3,69 (d, J=8,24 Hz, 6H, 2xCH3), 4,70 (m, 1H, CHP), 5,12 (d, J=10,57 Hz, 1H, NH), 4,92 (s, 2H, ArCH2O), 6,65-7,23 (m, 18H, aromat.). Temperatura topnienia: 99-102°C.

P r z y k ł a d VII

Sposób wytwarzania estru di-2,3-dimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego przedstawionego wzorem 8.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-2,3-dimetylofenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 10,26 g (83 mmola) 2,3-dimetylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 2 minuty. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się

2,55 ml (28 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-2,3-dimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-2,3-dimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)benzylo-etanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-2,3-metylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 4,23 g (28 mmola) karbaminianu benzylu i 3,12 ml (28 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 5 godzin. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza się w 200 ml metanolu i całość umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Uzyskuje się 3,64 g produktu. Z uzyskanego przesączu odparowuje się metanol na wyparce rotacyjnej. Powstały olej ponownie rozpuszcza się w metanolu i pozostawia do rekrystalizacji. Wówczas otrzymuje się osad o masie 0,44 g. Po połączeniu produktów otrzymuje się 4,08 g (40% wagowo) estru di-2,3-dimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego, przedstawionego wzorem 8, w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C24H29O5NP. Masa cząsteczkowa: 549,982 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 17,08 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 2,17 (m, 12H, 4xCH3), 2,9-3,4 (m, 2H, CH2), 4,8 (m, 1H, CHP), 5,15 (d, J=20,42 Hz, 1H, NH), 4,90 (m, 2H, ArCH2O), 6,86-7,28 (m, 16H, aromat.). Temperatura topnienia: 103°C.

P r z y k ł a d VIlI

Sposób wytwarzania estru di-2-naftalenowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzyloetanofosfonowego przedstawionego wzorem 9.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-2-naftalenowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 12 g (83 mmola) 2-naftolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 3 minuty. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się

2,55 ml (28 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez dwie godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-2-naftalenowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)benzylo-etanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-2-naftalenowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzyloetanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-2-naftalenowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 4,23 g (28 mmola) karbaminianu benzylu i 3,12 ml (28 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 20-30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 4,5 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza się w 200-250 ml metanolu i prowadzi krystalizację produktu w temperaturze -20°C przez 24 godziny. Uzyskany produkt odsącza się pod

PL 215 832 B1 zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. W celu rekrystalizacji produkt rozpuszcza się w minimalnej ilości chloroformu na gorąco, po czym zalewa metanolem (około 200 ml) i ponownie krystalizuje w temperaturze - 20°C. Produkt sączy się i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 0,63 g (5,2% wagowo) surowego estru di-2-naftalenowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)benzyloetanofosfonowego przedstawionego wzorem 9, w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C₃₆H₃₀O₅NP. Masa cząsteczkowa: 587,608 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI₃, δ [ppm]): 17.77 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 2,98-3,82 (m, 2H, CH2), 4,79 (m, 1H, CHP), 5,18 (d, J=10,16 Hz, 1H, NH), 4,94 (m, 2H, ArCH2O), 6,91-7,73 (m, 24H, aromat). Temperatura topnienia: 122°C.

P r z y k ł a d IX

Sposób wytwarzania estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)benzylo-etanofosfonowego przedstawionego wzorem 10.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metylomerkaptofenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wprowadza się 1,8 g (13 mmola) 4-metylo-merkaptofenolu i rozpuszcza w 100 ml benzenu. Do powstałego roztworu dodaje się 1,8 ml (13 mmola) trójetyloaminy (Et3N) i mieszając wkrapla 0,38 ml (4,5 mmola) chlorku fosforu (III). Początkowo reakcje prowadzi się w temperaturze pokojowej. Jednakże, gdy roztwór zaczyna się samoistnie ogrzewać chłodzi się go wodą z lodem. Powstałą galaretowatą zawiesinę miesza się przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie całość ekstrahuje się czterokrotnie wodą i suszy z 3 g siarczanu sodu (Na2SO4). Lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje się olej, który wykorzystuje się bezpośrednio (bez oczyszczania) do reakcji syntezy estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonyl-amino)-benzylo-etanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metylomerkaptofenyIowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 0,67 g (4,5 mmola) karbaminianu benzylu i 0,58 ml (4,5 mmola) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 80-90°C przez 4 godziny. Po przeprowadzeniu reakcji z jasnożółtego roztworu powstaje ciemnopomarańczowy olej. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w około 200 ml metanolu i umieszcza w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Produkt przesącza się i suszy na powietrzu do stałej wagi. Uzyskuje się 0,72 g (40% wagowo) surowego estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etanofosfonowego, przedstawionego wzorem 10, w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C30H30O5S2NP. Masa cząsteczkowa: 564,623. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18,98 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 2,40 ( d, J=6,52 Hz, 6H, 2xCH3), 2,9-3,36 (m, 2H, CH2), 4,7 (m, 1H, CHP), 4,93 (s, 2H, CH2O), 5,07 (s, 1H, NH), 6,69-7,28 (m, 18H, aromat). Temperatura topnienia: 97-99°C.

P r z y k ł a d X

Sposób wytwarzania dipeptydowej pochodnej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(Bocproliloamino)-izobutylo-metanofosfonowego: Boc-Pro-Leu^p(-O-C6H4-4-O-CH3)2) przedstawionego wzorem 11.

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-4-metoksyfenylowego.

W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 10,3 g (83 mmola) 4-metoksyfenolu i 30 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 2 minuty. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 2,55 ml (28 mmola) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez trzy godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci zielonego oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylometanofosfonowego.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne wprowadza się 4,3 g (28 mmola) karbaminianu benzylu i 2,9 ml (28 mmola) aldehydu izowalerianowego. Po rozpuszczeniu wszystkich

PL 215 832 B1 składników w 30 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 4 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza się w 200-250 ml metanolu i umieszcza w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Uzyskuje się 7,9 g surowego produktu (77% wagowo) w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C27H32O7NP. Masa cząsteczkowa: 513,525 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 19,52 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 0,88 (m, 6H, 2xCH3), 1,37 (s, 9H, 3xCH3), 1,65-1,90 (m, 6H, 3xCH2), 3,70 (m, 3H, CH2, CH), 4,40 (m, 1H, CHP), 4,9 (s, 1H, NH), 6,72-7,19 (m, 8H, aromat.). Temperatura topnienia: 116-118°C.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-amino-izobutylometanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 2,04 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego (4 mmola) i dodaje się 5,08 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza w minimalnej ilości metanolu i dodaje eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,02 g (99% wagowo) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-amino-izobutylo-metanofosfo31 nowego. Wzór sumaryczny: C19H27O5NPBr. Masa cząsteczkowa: 460,302 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 13,70 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 0,93 (m, 6H, 2xCH3), 1,9-2,2 (m, 3H, CH2, CH), 3,66 (d, J=3,47 Hz, 6H, 2xCH3), 4,01 (m, 1H, CHP), 6,62-7,37 (m, 8H, aromat), 8,97 (s, 3H, NH3⁺Br). Temperatura topnienia: 159°C.

Etap 4. Reakcja syntezy pochodnej dipeptydowej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(Bocproliloamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 1 g (2,2 mmola) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-amino-izobutylo-metanofosfonowego i dodaje się 0,51 g Boc-Pro-OH (2,4 mmola). Całość zalewa się acetonitrylem (5-10 ml), i po 2 minutach dodaje się 0,75 ml trójetyloaminy (5,4 mmola). Po 10 minutach dodaje się 0,86 g (2,3 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-yloN,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodo rowęglanem sodu (5%) i solanką. Frakcje octanowe suszy się w 3 g bezwodnego siarczanu magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Następnie powstały produkt rozpuszcza się w dichlorometanie i odparowuje się do spienienia na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się dipeptydową pochodną estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-izobutylometanofosfonowego: BocPro-Leu^p(-O-C6H4-4-O-CH3)2) przedstawioną wzorem 11, o masie 0,9 g (90% wagowo). Wzór sumaryczny: C29H41O8N2P. Masa cząsteczkowa: 562,598 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 19,57 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 0,88 (m, 6H, 2xCH3), 1,37 (s, 9H, 3xCH3), 1,65-1,90 (m, 6H, 3xCH2), 3,70 (m, 3H, CH2, CH), 4,40 (m, 1H, CHP), 4,9 (s, 1H, NH), 6,727,19 (m, 8H, aromat.). Temperatura topnienia: 96°C.

P r z y k ł a d XI

Sposób wytwarzania dipeptydowej pochodnej estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego: Boc-Pro-Phe^p(OC6H4-4-SCH3)2 przedstawionego wzorem 12. Sposób wykonania syntezy fosforynu 4-metylomerkaptofenylowego i estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzyloetanofosfonowego jest analogiczny do przykładu X (Etap I i etap II). Kolejnym etapem jest synteza bromowodorku estru 4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-amino-benzylo-etanofosfonowego.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-aminobenzylo-etanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej wprowadza się 1,57 g (2,7 mmola) estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-benzylo-etano-fosfonowego i dodaje się 8 ml roztworu

PL 215 832 B1 kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w eterze dietylowym do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,15 g białego proszku (73% wagowo) - bromowodorku estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-amino-benzyloetano31 fosfonowego. Wzór sumaryczny: C22H25O3S2NPBr. Masa cząsteczkowa: 526,441. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 15,55 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 2,35 (d, J=7,36 Hz, 6H, 2xCH3), 3,23 (m, 2H, CH2), 4,44 (m, 1H, CHP), 6,90-7,36 (m, 13H, aromat), 8,76 (s, 3H, NH3⁺Br).

Etap 4. Reakcja syntezy pochodnej dipeptydowej estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się 0,8 g (1,5 mmola) bromowodorku estru di-4-metylosulfidofenylowego kwasu N-amino-benzylo-etanofosfonowego i dodaje się 0,36 g (1,65 mmola) Boc-Pro-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (5-10 ml) i po 2 minutach dodaje się 0,53 ml trójetyloaminy (3,75 mmola). Po 10 minutach dodaje się 0,61 g (1,57 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką i po przeniesieniu do rozdzielacza, ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się w 3 g bezwodnego siarczanu magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej otrzymując dipeptydową pochodną estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-benzyloetanofosfonowego: Boc-Pro-Phe^p(OC6H4-4-SCH3)2, przedstawioną wzorem 12 w postaci spienionego oleju o masie 0,75 g (90% wagowo). Wzór sumaryczny: C32H39O6S2N2P. Masa cząsteczkowa: 645,582 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18,24 (s), 18,16 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 1,4 (s, 9H, 3 x CH3), 1,65-1,90 (m, 6H, 3xCH2), 2,35 (s, 6H, 2xCH3), 412 (m, 3H, CH2, CH), 5,00 (m, 1H, CHP), 5,19 (s, 1H, NH), 6,94-7,18 (m, 13H, aromat.). Temperatura topnienia: 49-52°C.

P r z y k ł a d XII

Sposób wytwarzania trójpeptydowej pochodnej estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino-izobutylo-metanofosfonowego: Boc-Val-Pro-Leu^p(-O-C6H3-3,4,5-(CH3)3)2 przedstawionego wzorem 13. Sposób wykonania syntezy fosforynu trój-3,4,5-trimetylofenylowego i estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego jest analogiczny do przykładu III (Etap I i etap II). Kolejnym etapem jest synteza bromowodorku estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-amino-izobutylo-metanofosfonowego.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-amino-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne odważa się 2,01 g (3,7 mmola) esteru di-3,4,5-trimetylofenylowy kwasu N-(benzyloksy-karbonylamino)-izobutylo-metanofosfonowego i dodaje się 5 ml (5,02 mmola) roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia.

Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Uznaje się, że substrat w 100% został odblokowany, dlatego powstały produkt w postaci bromowodorku estru di3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-amino-izobutylo-metanofosfonowego używa się bezpośrednio do rekcji syntezy dipeptydowej pochodnej estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)izobutylo-metanofosfonowego.

Etap 4. Reakcja syntezy pochodnej dipeptydowej estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej zawierającej 1,7 g (3,76 mmola) bromowodorku estru di-3,4,5-trimetylo-fenylowego kwasu N-amino-izobutylo-metanofosfonowego (powstałego w etapie 3) dodaje się 0,81 g (3,76 mmola) Boc-Pro-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (5-10 ml), a po 2 minutach dodaje się 1,56 ml (11,3 mmola) trójetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 1,49 g (3,95 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się

PL 215 832 B1 w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się w 3 g bezwodnego siarczanu magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Następnie produkt rozpuszcza się w dichlorometanie i ponownie odparowuje się lotny rozpuszczalnik, aż do spienienia produktu.

Otrzymuje się spieniony olej o masie 1,18 g (65% wagowo). Wzór sumaryczny: C33H49O6N2P.

Masa cząsteczkowa: 600,73 g/mol .Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl₃, δ [ppm]): 18,76 (s), 18,58 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCL, δ [ppm]): 0,85 (dd, J=8,56/3,29 Hz, 6H, 2xCH3), 1,33 (s, 9H, 3xCH3), 1,6-1,8 (m, 6H, 2xCH2), 2,21 (s,18H, 6xCH3), 3,3 (m, 3H, CH2, CH), 4,18 (s, 1H, NH), 4,8 (m, 1H, CHP), 5,2 (t, J=5,47 Hz, 1H, CHO), 6,67-7,3 (m, 4H, aromat.). Temperatura topnienia:

48-52°C.

Etap V. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej dipeptydowej estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-izobutylo-metano-fosfonowego i rozpuszcza się ją w dichlorometanie (10 ml), a następnie dodaje się powoli 50% roztwór kwasu trójfluoroctowego w dichlorometanie (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje rozpuszczalnik, a czynność tą powtarza się dwukrotnie. Powstały olej o kolorze żółtym - o masie 1,02 g - wykorzystuje się jako substrat wyjściowy do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino)izobutylo-metanofosfonowego.

Etap VI. Reakcja syntezy pochodnej trójpeptydowej estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino)-izobutylo-metanofosfonowego.

Do powstałego w etapie V produktu TFA*Pro-Leu^p(OC6H3-3,4,5-(CH3)3)2 (m=1,02 g, n=1,66 mmola) dodaje się 0,38g (1,82 mmola) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (5-10 ml), a po 2 minutach dodaje się 0,51 ml (4,14 mmola) trójetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,66 g (1,74 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1 -ylo-N,N,N',N''-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi się do rozdzielacza i ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Warstwę octanową zlewa się do kolby stożkowej i dodaje 3 g siarczanu magnezu. Następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując eluent octan etylu/chloroform w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Powstały olej rozpuszcza się w dichlorometanie i odparowuje się na wyparce rotacyjnej, aż do spienienia produktu, otrzymuje się trójpeptydową pochodną estru di-3,4,5-trimetylofenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino)-izobutylo-metanofosfonowego: Boc-Val-Pro-Leu^p(-O-C6H3-3,4,5-(CH3)3)2 przedstawionego wzorem 13 o masie 0,44 g (43% wagowo). Wzór sumaryczny: C38H59O7N3P. Masa cząsteczkowa : 699,863 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18,51 (s). Widmo ¹HNMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 0,84 (m, 12H, 4xCH3), 1,34 (s, 9H, 3xCH3), 1,65-1,80 (m, 6H, 3xCH2), 2,13 (m, 18H, 6xCH3), 3,50 (m, 3H, CH2, CH), 4,20 (m, 1H, CHCO), 4,36 (m, 1H, NH), 4,7 (m, 1H, CHP), 5,2 (t, J=5,48 Hz, 1H, CHCO[Pro]), 6,70-7,0 (m, 4H, aromat.), 7,1 (d, J=10,05 Hz, 1H, NH). Temperatura topnienia: 59°C.

P r z y k ł a d XIII

Sposób wytwarzania tripeptydowej pochodnej estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu

N-(Boc-walino-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego: Boc-Pro-Phe^p(OC6H4-4-SCH3)2 przedstawionego wzorem 14. Etap I, II, III, IV syntezy prowadzi się analogicznie do przykładu X. Kolejny etap polega na usunięciu grupy blokującej, tert-butoksykarbonylowej z aminowego końca dipeptydu.

Etap V. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej dipeptydowej estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego.

PL 215 832 B1

Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego i rozpuszcza się ją w dichlo rometanie (10 ml), a następnie dodaje się powoli 50% roztwór kwasu trójfluoroctowego w dichlo rometanie (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje, a czynność tą powtarza się dwukrotnie. Powstały olej (masa=0,80 g) o kolorze szarym wykorzystuje się jako substrat wyjściowy do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego.

Etap VI. Reakcja syntezy pochodnej trójpeptydowej estru di-4-metylomerkaptofenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego

Do 0,80 g (1,3 mmola) powstałego w etapie V produktu TFA*Pro-Phe^p(OC6H4-4-S-CH3)2 dodaje się 0,27 g (1,43 mmoal) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (5-10 ml) po 2 minutach dodaje się 0,43 ml (3,25 mmola) trójetyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,49 g (1,36 mmola) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametyIouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi się do rozdzielacza i ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywano kolejno: dwukrotnie siarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Warstwę octanową zlewa się do kolby stożkowej i dodaje się 3 g siarczanu magnezu. Następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Powstały olej rozpuszcza się w dichlorometanie i odparowuje się na wyparce rotacyjnej, aż do spienienia produktu. Otrzymuje się 0,64 g (80% wagowo) tripeptydowej pochodnej estru di-4-metylomerkapto-fenylowego kwasu N-(Boc-walino-proliloamino)-benzylo-etanofosfonowego: Boc-Pro-Phe^p(OC6H4-4-SCH3)2 przedstawionego wzorem 14 Wzór sumaryczny: C37H48O7N3S2P. Masa cząsteczkowa: 741,91 1 g/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18,30 (s), 18,26 (s). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 0,88 (m, 12H, 4xCH3), 1,37 (s, 9H, 3xCH3), 1,65-1,80 (m, 6H, 3xCH2), 2,35 (s, 6h, 2xCH3), 3,5-3,6 (m, 3H, CH2, CH), 4,20 (m, 1H, CHCO), 4,36 (m, 1H, NH), 4,73 (m, 1H, CHP), 5,2 (t, 1=5,48 Hz, 1H, CHCO[Pro]), 6,79-7,01 (m, 8H, aromat.), 7,2 (d, J=0,7 Hz, 1H, NH). Temperatura topnienia: 72-76°C.

Aktywność biologiczną estrów difenylowych fosfonowych analogów fenyloalaniny oraz leucyny, a także ich peptydowych pochodnych otrzymanych w przykładach II-XIV przebadano pod kątem zdolności do hamowania proteolitycznej aktywności chymotrypsyny z trzustki wołowej i subtylizyny pochodzącej z bakterii B. subtillis. Wszystkie badania sporządzono na czytniku mikropłytek Molecular Devices Spectramax Gemini XP. Badania rozpoczęto od wyznaczania Km dla substratu w warunkach prowadzonych testów (temperatura 37°C, długość fali ekstynkcji 350 nm i emisji 460 nm). Pomiaru dokonano przy różnych stężen iach substratu w zakresie od 10 μΜ do 500 μΜ przy stałym stężeniu enzymu 25 nM. Odpowiednio, wartości Km dla chymotrypsyny i subtylizyny wynosiły 70 μΜ i 60 μΜ w podanych warunkach. Pomiary aktywności inhibitorowej wykonano przy różnych stężeniach inhibi-torów w zakresie od 50 nM do 2000 nM. W badaniach wykorzystano handlowo dostępny substrat N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC, którego używano zarówno przy pomiarach względem chymotrypsyny jak i subtylizyny. Końcowe stężenie substratu wynosiło zarówno dla chymotrypsyny jak i subtylizyny 20 μΜ. Do każdej studzienki odmierzono 100 μΙ enzymu, 50 μl substratu i 50 μl inhibitora. Przy obliczaniu wartości K-ι i k₂ wykorzystano dwa modele inhibicji: model regresji hiperbolicznej Salvessena i model klasycznej regresji liniowej według Dorita. Uzyskane wartości K1 i k2 wyliczone dwiema metodami różniły się nieznacznie, dlatego podano ich uśrednioną wartość. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabelach, z których tabela 1 przedstawia wyniki badania aktywności inhibitorowej otrzymanych estrów difenylowych analogów fenyloalaniny i leucyny wobec chymotrypsyny i subtylizyny, tabela 2 - wy-niki badania aktywności inhibitorowej otrzymanych dipeptydowych pochodnych estrów difenylowych analogów fenyloalaniny i leucyny wobec chymotrypsyny i subtylizyny, a tabela 3 - wyniki badania aktywności inhibitorowej otrzymanych tripeptydowych pochodnych estrów difenylowych analogów fenyloalaniny i leucyny wobec chymotrypsyny i subtylizyny.

PL 215 832 B1

Tabela 1

Tabela 2

	subtylizyna	chymotrypsyna
Ki [μΜ]	k2/K, [M^s'1]	Ki [μΜ]	k2/K, [M s ]
Boc-Pro-Lcup	°~G~°		7.7	1700	0.09	250 000
Boc-Pro-Phe1’	θ-Ο-®	2	5.4	1700	0.14	120 000

PL 215 832 B1

Tabela 3

	subtylizyna	chymotrypsyna
Ki [μΜ]	k2/K, [M^s'1]	Ki [μΜ]	k2/Ki [MA1]
Boc-y.l-Pio-Leu1’-		>20	<50	0.3	9 000
Boc-VaJ-Pro-Phep		0.098	110 000	0.05	94 600

Zastrzeżenia patentowe

Claims (4)

1. Diestry arylowe kwasów 1-aminoalkano-fosfonowych i ich peptydowe pochodne, o wzorze ogólnym 1, w którym W oznacza grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), albo resztę peptydową składającą się z jednego, dwóch lub trzech aminokwasów, R1 oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów, w szczególności leucyny lub fenyloalaniny, zaś X1, X2, X3, X4 oraz X5 są takie same lub różne i oznaczają metyl, etyl, benzyl, O-metyl i S-metyl.

2. Zastosowanie diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich peptydowych pochodnych, o wzorze ogólnym 1 do wytwarzania preparatów do hamowania aktywności chymotrypsyny i subtylizyny.

3. Sposób wytwarzania diestrów arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i ich peptydowch pochodnych, o wzorze ogólnym 1, znamienny tym, że w pierwszym etapie na drodze syntezy z fenolu zawierającego jeden z podstawników, takich jak: 4-5-metylowy, 3,4,5-trietylowy, 4-metylowy, 3-metoksylowy, 4-etylowy, 4-metoksylowy, 2,3-dimetylowy bądź 2-naftol w acetonitrylu bądź benzenie i w obecności chlorku fosforu(III) w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika otrzymuje się fosforyn trifenylowy, zawierający w każdym pierścieniu aromatycznym jeden podstawnik wybrany z grupy obejmującej:

4-S-metylowy, 3,4,5-trietylowy, 4-metylowy, 3-metoksylowy, 4-etylowy, 4-metoksylowy, 2,3-dimetylowy bądź fosforyn tri(2-naftylowy), a następnie otrzymany fosforyn triarylowy poddaje się reakcji amidoalkilowania z karbaminianem benzylu, aldehydem izowalerianowym bądź aldehydem fenylooctowym, w lodowatym kwasie octowym w temperaturze 90°C i w otrzymanym w wyniku przeprowadzonej reakcji diarylowym estrze N-benzyloksykarbonylowym kwasu 1-aminofosfonowego odblokowuje się grupę aminową przy użyciu roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym, a następnie sprzęga go z proliną zawierającą zablokowaną N-końcową grupą aminową przez grupę tert-butoksykarbonylową (t-Boc), przy użyciu heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'tetrametylouroniowego (HBTU), trójetyloaminy i acetonitrylu jako rozpuszczalnika, a po reakcji sprzęgania w temperaturze pokojowej, mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, ekstrahuje octanem etylu i przemywa się kolejno siarczanem potasu (5%), solanką, wodorowęglanem sodu (5%) i solanką albo w otrzymanych fosfonowych dipeptydach zawierających N-końcową resztę N-Boc-proliny oraz jeden z podstawników w każdym estrowym pierścieniu aromatycznym pochodnej kwasu 1-aminoalkanofosfonowego: 4-S'-metylowy, 3,4,5-trietylowy, 4-metylowy, 3-metoksylowy, 4-etylowy, 4-metoksylowy, 2,3-dimetylowy bądź estry 2-naftylowe usuwa się grupę N-Boc przy użyciu roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) i dichlorometanu (CH2Cl2) w stosunku objętościowym 1:1 i prowadzi się reakcję addycji kolejnego aminokwasu - waliny z N-Boc zablokowaną grupą a-aminową przy użyciu odczynnika sprzęgającego heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-yIo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego (HBTU), trójetyloaminy i acetonitrylu jako rozpuszczalnika, po prowadzonej w temperaturze pokojowej reakcji sprzęgania, mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, ekstrahuje dwukrotnie octanem etylu i przemywa kolejno siarczanem potasu (5%), solanką, wodorowęglanem sodu (5%) i solanką.