PL215619B1 - Zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro rakowych komórek wolnych i wchodzących w skład tkanek nowotworowych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro komórek wolnych lub wchodzących w skład tkanek nowotworowych, w badaniach cytologicznych i histopatologicznych.

Z powodu chorób nowotworowych umiera w Polsce od 70 do 100 tysięcy chorych rocznie. Największe nadzieje w oparciu o znane sposoby leczenia wiąże się z jak najwcześniejszym wykryciem zmian nowotworowych. Wprowadzenie nowoczesnych, dokładnych metod diagnostycznych, pozwoliłoby na wykrycie choroby we wczesnym jej stadium i umożliwiłoby wprowadzenie odpowiedniej metody terapii.

Wstępem do każdego postępowania leczniczego jest zebranie, w oparciu o dostępne metody diagnostyczne, jak największej ilości informacji o rozwijającej się chorobie nowotworowej.

Diagnozowanie nowotworów jest zadaniem bardzo trudnym ze względu na ich duże zróżnicowanie. Niekiedy metody są ogólne - wspólne dla wielu typów nowotworów lub służą identyfikacji poszczególnych rodzajów raka. W przypadku diagnozowania za pomocą obrazowania guzów nowotworowych ważne jest jak najwyraźniejsze rozróżnienie komórek prawidłowych od nowotworowych.

Znane dotychczas metody diagnostyczne nie są w stanie w sposób jednoznaczny określić granicę pomiędzy nowotworem, a tkanką zdrową. Ocena rozległości nacieku w tkance zdrowej przez nowotwór, zwłaszcza w formie zaawansowanych procesów, sprawia operującym poważne trudności. Znane metody wykrywania guza nowotworowego można podzielić na trzy główne typy: badania laboratoryjne, cytologiczne i diagnostyka obrazowa.

Najczęściej w diagnozowaniu nowotworów wykorzystuje się markery krążące w płynach ustrojowych, w tym głównie we krwi. Substancje te są uwalniane do układu krążenia chorego przez komórki i tkanki nowotworowe, a w przypadku wysokiego zaawansowania w ilościach pozwalających na ich pomiar, które można oznaczać laboratoryjnie, najczęściej w próbce krwi. Oznaczona wartość jest cechą osobniczo zmienną i zależy od wielu czynników. Nie można jednoznacznie stwierdzić, że konkretna osoba choruje na nowotwór, biorąc pod uwagę jednokrotne oznaczenie, w którym poziom danego markera jest powyżej normy. Potwierdzono, że bardziej istotne są zmiany miana danego markera mierzone w czasie. Systematyczny ciągły ich wzrost świadczy najprawdopodobniej o rozroście masy nowotworowej. Nagły skok z poziomu normalnego, do wysokich wartości przekraczających ustalone normy, niekoniecznie świadczy o procesie nowotworowym, a wręcz może sugerować ostry proces zapalny danego narządu, z którego badane markery zostają uwolnione.

W wykrywaniu raka możliwe jest też zastosowanie wysoko specyficznych metod genetycznych. Laboratoryjne testy genetyczne w próbkach krwi umożliwiają znalezienie mutacji w genach mogących spowodować powstanie i rozwój nowotworu. Z informacji tych można wnioskować jedynie o zwiększonym ryzyku wystąpienia nowotworu, gdy jeszcze brak konkretnych objawów, które kwalifikowałyby wprowadzenie rutynowych metod leczenia. W komórkach nowotworowych, już nawet we wczesnych stadiach, obserwuje się zmiany genetyczne, które są możliwe do zidentyfikowania.

Szczególne znaczenie przy wyborze metody leczenia, rozległości planowanego zabiegu operacyjnego i ich rokowań ma ustalenie typu histopatologicznego nowotworu i stopnia jego złośliwości. W niektórych przypadkach wystarcza tylko stwierdzenie obecności komórek nowotworowych, bez określenia ich typu, ale dla podjęcia dalszych decyzji terapeutycznych potrzebne jest wprowadzanie coraz to doskonalszych metod. Współczesne zasady onkologii zabraniają podejmowania decyzji terapeutycznych bez wcześniejszego rozpoznania histopatologicznego.

Ze względu na rodzaj ocenianego materiału badania można podzielić na badania cytologiczne i histopatologiczne. Badania cytologiczne polegają głównie na badaniu mikroskopowym materiału komórkowego, w tym przez ocenę rozmazów. Oprócz badań histopatologicznych, które mają decydujące znaczenie w postawieniu ostatecznej diagnozy, w poszukiwaniu niektórych nowotworów wykonuje się mikroskopowe badanie pojedynczych komórek w tzw. cytologii. Pozwalają one ocenić cechy pojedynczych komórek znajdujących się w pobranym materiale, np. w płynach puchlinowych i wysiękowych, w próbkach wymazów pobieranych głównie w badaniach ginekologicznych. Przy użyciu mikroskopu bada się zarówno zmiany w cytoplazmie jak i jądrze komórkowym. Obserwowane zmiany, szczególnie w jądrze, pozwalają podjąć decyzję o zmianach nowoPL 215 619 B1 tworowych w komórkach. Badania cytologiczne mają charakter wspomagający, w wielu przypadkach skryningowy i nie mogą zastąpić badań histopatologicznych.

Rozpoznanie nowotworu stanowi w dużym stopniu podstawę do podjęcia decyzji o wyborze metody leczenia choroby. Bardzo istotne znaczenie ma określenie stopnia zaawansowania nowotworu. Od uzyskanych wyników badań zależy jaką zastosuje się strategię leczenia. Współczesna klasyfikacja nowotworów uwzględnia parametry anatomiczne, to jest usytuowanie, wielkość guza, główny kierunek naciekania, egzofityczność czy endofityczność i zasięg choroby określany trzema literami TNM, gdzie T - tumor - oznacza guza pierwotnego, N - nodes - obecność lub nieobecność przerzutów w węzłach chłonnych, M - metastases - obecność lub nieobecność przerzutów w odległych anatomicznie od guza pierwotnego narządach.

W procesach szeroko pojętego rozwoju nowotworu i powstawania przerzutów ważną rolę odgrywają patogenne endopeptydazy, w tym posiadające w swoim centrum aktywnym resztę cysteinową, do których zalicza się takie enzymy jak katepsyny B i L lub kalpainę. Enzymy te katalizują inwazyjny rozwój nowotworu oraz powstawanie przerzutów. Aktywność tych enzymów równoważona jest in vivo przez ich specyficzne autogenne białkowe inhibitory. Inhibitory te znajdują się w kręgu zainteresowań wielu zespołów zajmujących się poznaniem zmian nowotworowych - jako białka mogące znaleźć zainteresowanie w poznaniu sposobów kontroli zmian agresywności i ewentualnego hamowania choroby nowotworowej. Wysoki poziom aktywnych cysteinowych endopeptydaz jest czynnikiem prognostycznym charakterystycznym dla określenia agresji nowotworu w organizmie konkretnego pacjenta. Aktywność cysteinowych peptydaz określa się jako markery agresji nowotworu, natomiast ich autogenne inhibitory jako w markery obronności organizmu. (Siewiski M. i inni 1996: Cancer Bioth. & Pharm. 11, 169 - 179). Obecność patogennych cysteinowych peptydaz takich jak katepsyny B i L lub kalpainy oraz ich autogennych inhibitorów występuje nie tylko w płynach ustrojowych, ale również w tkankach i komórkach rakowych. Oznaczanie aktywności tych białek w płynach ustrojowych znalazło zastosowanie w oznaczeniach prognostycznych zmian nowotworowych w organizmie pacjenta.

Wynalazek dotyczy zastosowania inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania komórek wolnych lub wchodzących w skład tkanek nowotworowych, pozyskiwanych z różnych źródeł, w tym z białka jaja kurzego, roślin, łożyska i wód płodowych ludzkich zwierzęcych lub z mikroorganizmów.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro rakowych komórek wolnych i wchodzących w skład tkanek nowotworowych, pozyskiwanych z różnych źródeł, w tym z białka jaja kurzego, roślin, łożyska i wód płodowych ludzkich i zwierzęcych lub z mikroorganizmów, przy czym zawiesinę komórek z próbek przeznaczonych do badań cytologicznych, z tkanek uzyskiwanych pooperacyjnie lub z bioptatów, rozdrabnia się, umieszcza w buforze używanym do hodowli komórek, najkorzystniej w medium hodowlanym Minimum Essential Medium Eagla w modyfikacji alfa (MEM alfa ) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Gibco), 2 mM glutaminy oraz 100 IU/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny, po czym do zawartych w płynie hodowlanym komórek w ilości 0,6 - 2,5 x 10^6/ml zawiesiny dodaje się co najmniej 10 μΐ roztworu cysteinowych peptydaz, o aktywności 20 - 50 pCi/pg białka, znakowanego izotopem promieniotwórczym takim jak Technet, jod lub inny, po czym zawiesinę komórek wraz ze znakowanym inhibitorem inkubuje się przez 20 - 40 minut w temperaturze 25 - 40°C i poddaje się przynajmniej jednokrotnemu płukaniu solą fizjologiczną (PBS), a następnie mierzy się radioaktywność badanych komórek przy użyciu licznika scyntylacyjnego i oblicza się ilość inhibitora związanego z komórkami nowotworowymi z bilansu radioaktywności dodanego inhibitora i radioaktywności komórek po ich przepłukaniu, z uwzględnieniem radioaktywności supernatantów.

Korzystnie, w przypadku, gdy komórki przeznacza się do przechowywania, stosuje się medium hodowlane z dodatkiem 10% dwumetylosulfotlenku (DMSO) i zamraża w ciekłym azocie, a przed wykonaniem oznaczania są one rozmrażane.

Znakowanie izotopem białkowych inhibitorów cysteinowych peptydaz pozwala na poznanie nowych form białkowych służących do monitorowania rozwoju guza i zastosowania ich w diagnostyce nowotworowej.

W rozwiązaniu według wynalazku proponuje się użycie wysoko oczyszczonych inhibitorów, w tym głównie izolowanych z białka jaja kurzego, związanych z radioaktywnymi pierwiastkami, które z kolei wiążą się wysoko specyficznie z katepsynami B i L, będącymi enzymami występującymi wewnątrz lub w membranach komórek nowotworowych.

PL 215 619 B1

Tak opracowany test pozwala w sposób szybki i precyzyjny określić czy oraz w jakiej ilości w badanych preparatach obecne są komórki posiadające cysteinowe peptydazy, czyli nowotworowe. Oznaczenie pozwala określić też ilość zdrowych komórek nie zawierających tych enzymów. Wykorzystanie wysoce specyficznego sposobu wiązania egzogennych inhibitorów cysteinowych peptydaz czyli cystatyn ze znajdującymi się w komórkach rakowych katepsynami B i L pozwala na wykrycie w ten sposób wyłącznie komórek rakowych. Obecność tych enzymów oraz podane znakowane cystatyny umożliwiają rozróżnienie komórek nowotworowych od prawidłowych, co jest nową metodą cytologiczną. Zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do znakowania komórek wolnych i obecnych w tkankach nowotworowych według wynalazku daje możliwość oceny zmian nowotworowych w próbkach tkanek in vitro przy użyciu scyntygrafu. W badaniach tych inkubacja komórek rakowych razem z prawidłowymi ze znakowanym pierwiastkiem radioaktywnym inhibitorem cysteinowych peptydaz, pozwala na określenie ich wybiórczego wiązania się do komórek nowotworowych.

W badaniach nad rakiem krtani potwierdzono, że ilość związanego inhibitora znakowanego np. jodem-125 zależy od czasu inkubacji oraz od ilości komórek rakowych. Dowodem na to, że znakowany inhibitor wiąże się specyficznie z komórkami nowotworowymi było doświadczenie, w którym po preinkubacji z nieznakowanym inhibitorem spowodowano zmniejszenie wiązania znakowanego inhibitora. W badaniach in vivo na zwierzętach doświadczalnych, z wszczepionym ludzkim rakiem krtani, podana dożylnie radioaktywna cystatyna łączyła się z narządami wewnętrznymi zaatakowanymi zmianami nowotworowymi, jak i z pojedynczymi komórkami rakowymi. Bardzo istotną okazała się informacja, w której badanie scyntygraficzne uwidoczniło wyraźnie narządy wewnętrzne, jak i obrysy guzów. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że endopeptydaza cysteinowa raka krtani wiąże się z cystatyną znakowaną jodem-125. Po przeszczepieniu histologicznie zróżnicowanego raka płaskonabłonkowego uzyskano jednolity charakter rosnącego guza, radioaktywność znakowanej cystatyny stwierdzono zarówno w tkance nowotworowej jak i narządach wewnętrznych, a wiązanie radioaktywnej cystatyny przez komórki raka krtani pozwoliło na jego obrazowanie (Czecior E. i inni 2002; Otolaryng. Pol. 2002, LVI, 5, 573-576; Czecior E. i inni Eur. Arch. Oto-Rhino-Iaryngol. 2003, 260, 2 103.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d: Zawiesinę komórek z pobranych tkanek uzyskiwanych pooperacyjnie lub z bioptatów, otrzymaną przez rozdrobnienie, poddaje się inkubacji w celu utworzenia hodowli komórek. Do hodowli komórek nowotworowych i prawidłowych stosuje się specjalne medium hodowlane o składzie: Minimum Essential Medium Eagla w modyfikacji alfa, według katalogu firmy Sigma (MEM alfa) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Gibco), plus 2 mM glutaminy oraz 100 IU/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. W przypadku, gdy komórki przeznacza się do przechowywania, stosuje się medium hodowlane z dodatkiem 10% dwumetylosulfotlenku (DMSO) i zamraża w ciekłym azocie, a przed wykonaniem oznaczania rozmraża.

Przystępując do oznaczania komórek nowotworowych w zawiesinie, w stosunku do liczby komórek zawartych w płynie hodowlanym w ilości 0,6 - 2,5 x 10⁶, dodaje się 10 μΐ roztworu inhibitorów cysteinowych peptydaz, pozyskiwanych z białka jaja kurzego, znakowanych jodem radioaktywnym I-125 o aktywności 22 μφ/μρ białka. Zawiesinę komórek wraz ze znakowanym inhibitorem inkubuje się przez 30 minut w temperatu rze 37°C, po czym poddaje dwukrotnemu przepłukaniu solą fizjologiczną (PBS). Następnie mierzy się radioaktywność badanych komórek na liczniku scyntylacyjnym komórek i eluentów. Ilość inhibitora związanego z komórkami nowotworowymi oblicza się z bilansu radioaktywności dodanego inhibitora, radioaktywności komórek oraz po ich dwukrotnym przepłukaniu, z uwzględnieniem radioaktywności supernatantów.

Claims (2)

1. Zastosowanie inhibitorów cysteinowych peptydaz do oznaczania in vitro rakowych komórek wolnych i wchodzących w skład tkanek nowotworowych, pozyskiwanych z różnych źródeł, w tym z białka jaja kurzego, roślin, łożyska i wód płodowych ludzkich i zwierzęcych lub z mikroorganizmów, przy czym zawiesinę komórek z próbek przeznaczonych do badań cytologicznych, z tkanek uzyskiwanych pooperacyjnie lub z bioptatów, rozdrabnia się, umieszcza w buforze używanym do hodowli komórek, najkorzystniej w medium hodowlanym Minimum Essential Medium

PL 215 619 B1

Eagla w modyfikacji alfa (MEM alfa) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (Gibco), 2 mM glutaminy oraz 100 IU/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny, po czym do zawartych w płynie hodowlanym komórek w ilości 0,6 - 2,5 x 10⁶/ml zawiesiny dodaje się co najmniej 10 μΐ roztworu cysteinowych peptydaz, o aktywności 20 - 50 pCi/pg białka, znakowanego izotopem promieniotwórczym takim jak Technet, jod lub inny, po czym zawiesinę komórek wraz ze znakowanym inhibitorem inkubuje się przez 20 - 40 minut w temperaturze 25 - 40°C i poddaje się przynajmniej jednokrotnemu płukaniu solą fizjologiczną (PBS), a następnie mierzy się radioaktywność badanych komórek przy użyciu licznika scyntylacyjnego i oblicza się ilość inhibitora związanego z komórkami nowotworowymi z bilansu radioaktywności dodanego inhibitora i radioaktywności komórek po ich przepłukaniu, z uwzględnieniem radioaktywności supernatantów.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że w przypadku, gdy komórki przeznacza się do przechowywania, stosuje się medium hodowlane z dodatkiem 10% dwumetylosulfotlenku (DMSO) i zamraża w ciekłym azocie, a przed wykonaniem oznaczania są one rozmrażane.