PL214397B1 - Nośnikowy preparat białkowy, sposób jego otrzymywania oraz zastosowanie - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214397 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 380011 (22) Data zgłoszenia: 23.06.2006 (51) Int.Cl.

C12P 21/00 (2006.01) C12Q 1/37 (2006.01) C07K 1/12 (2006.01) C12N 11/02 (2006.01) (54) Nośnikowy preparat białkowy, sposób jego otrzymywania oraz zastosowanie (73) Uprawniony z patentu:

INSTYTUT MEDYCYNY DOŚWIADCZALNEJ I KLINICZNEJ IM. MIROSŁAWA MOSSAKOWSKIEGO PAN, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

24.12.2007 BUP 26/07 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.07.2013 WUP 07/13 (72) Twórca(y) wynalazku:

ANDRZEJ W. LIPKOWSKI, Warszawa, PL MARCIN JURGA, Włodawa, PL KRYSTYNA DOMAŃSKA-JANIK, Warszawa, PL BARBARA ŁUKOMSKA, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Rafał Witek

PL 214 397 B1

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku stanowią nowe preparaty białkowe do zastosowania w medycynie jako szkieletowy mikromateriał do hodowli komórek macierzystych oraz sposób otrzymywania tych preparatów oraz ich zastosowanie w hodowli komórek macierzystych.

Ośrodkowy oraz obwodowy układ nerwowy tworzy zintegrowaną sieć regulującą funkcje całego organizmu człowieka i zwierzęcia. Zaburzenia w jego funkcjonowaniu stanowią jeden z najpoważniejszych problemów współczesnej medycyny. Uszkodzenia fizyczne układu nerwowego, jak na przykład rdzenia kręgowego jest częstą przyczyną trwałego kalectwa po wypadkach samochodowych lub urazach w uprawianiu sportów ekstremalnych. Do nieodwracalnego kalectwa prowadzą również uszkodzenia wynikające z neuropatologicznych zmian powodowanych przez choroby nowotworowe lub autodegeneracyjne (na przykład choroba Parkinsona lub choroba Alzheimera lub stwardnienie rozsiane). W odróżnieniu od innych tkanek organizmu, układ nerwowy ma małą zdolność do samoregeneracji. Wykazana w ostatnich latach możliwość przekształcania się komórek macierzystych w wyspecjalizowane komórki dorosłego organizmu, w tym również komórki nerwowe daje szanse na medyczne korekcje neuropatalogii wynikającej z fizycznych lub biologicznych uszkodzeń lub starczej degeneracji organizmu. Jednakże prowadzone hodowle komórek macierzystych in vitro wymagają w perspektywie transplantacyjnej zastosowania szkieletowego mikromateriału pozwalającego na trójwymiarowy wzrost komórek.

Bożenna Baranowska, Andrzej Lipkowski, Ewa Marczak, Irmina Makulec, Hanna Rybak, Joanna Pastuszak, Anna Szulc, Aleksandra Szczucińska, Wiesława Wasilewicz-Niedbalska, Zofia Grabska opatentowali Sposób otrzymywania ściernego środka do preparatów do oczyszczania i peelingu skóry, Patent Polski PL 179302 otrzymywanie preparatów białkowych do zastosowania jako materiał pilingowy do kosmetyków. Metoda otrzymywania preparatu według opisu patentowego polegała na enzymatyczym trawieniu naturalnych surowców białek strukturalnych, w tym włosów, szczeciny, wełny lub pierza a następnie mieleniu pozostałości stałej do określonej wielkości cząstek białkowego preparatu. Przeprowadzone badania wykazały, że kosmetyki zawierające preparaty białkowe otrzymane według patentu, nie wywołują uczuleń w stosowaniu jako środek peelingowy w kremie.

Dalsze badania nieoczekiwanie wykazały, że jednorazowe enzymatyczne trawienie wymienionych, naturalnych surowców białkowych według dotychczasowej metody jest tylko częściowe i pozostawia część białek podatnych na trawienie w formie niestrawionej. W wyniku mielenia preparatu do wielkości zamierzonej, enzymy trawienne uzyskują dostęp do białek podatnych na trawienie, do których nie miały dostępu enzymy trawienne w trakcie trawienia niezmielonych włosów, szczeciny, wełny lub pierza. Można przewidzieć, że zastosowanie zmielonego preparatu otrzymywanego według patentu w układach biologicznych spowoduje, że białka takie będą uwalniane w oddziaływaniu z żywymi tkankami lub komórkami. Przy stosowaniu w medycynie, uwalniane białka mogą wywoływać szereg reakcji niepożądanych, w tym potencjalne niebezpieczeństwo uczuleń. Celem niniejszego wynalazku było zaproponowanie nowej metody otrzymywania ulepszonego szkieletowego preparatu białkowego, który byłby pozbawiony opisanych powyżej mankamentów.

Nieoczekiwanie cel ten został osiągnięty w przedmiotowym wynalazku.

Nieoczekiwanie okazało się, że powtórzenie enzymatycznego trawienia uprzednio otrzymanego preparatu znanymi metodami prowadzi do usunięcia większości białek rozpuszczalnych, w stopniu pozwalającym na zastosowanie preparatu jako szkieletowego materiału białkowego do hodowli komórek macierzystych. Zastosowanie jako surowca włosów ludzkich pozwala na prowadzenie zindiwidualizowanej terapii polegającej na zastosowaniu u pacjenta komórek macierzystych hodowanych na szkieletowym preparacie białkowym otrzymanym według przedstawionych przykładów, z włosów pochodzących od danego pacjenta.

Przedmiotem wynalazku jest nośnikowy preparat białkowy charakteryzujący się tym, że stanowi szkieletowy preparat białkowy otrzymany z naturalnych wytworów nabłonka kręgowców, zwłaszcza ptaków lub ssaków, składający się z oczyszczonych białek niepodatnych na trawienie enzymatyczne, przy czym poziom zanieczyszczenia białkami podatnymi na hydrolizę enzymatyczną nie przekracza 0,5% wagowych jego suchej masy. Korzystnie jest on otrzymywany z wytworu nabłonka wybranego spośród: sierści, szczeciny, wełny, włosów, zwłaszcza włosów ludzkich, lub ptasich piór, korzystnie spośród szczeciny wieprzowej lub włosów ludzkich.

PL 214 397 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nośnikowego preparatu białkowego charakteryzujący się tym, że z wytworów nabłonka kręgowców wypłukuje się stopniowo białka podatne na trawienie enzymatyczne, przy czym prowadzi się następujące etapy:

a) wytwory nabłonka kręgowców traktuje się ługiem sodowym lub potasowym o stężeniu od 0,1% do 4% wagowych,

b) trawi się enzymem proteolitycznym wybranym z grupy obejmującej: pepsynę, chymotrypsynę, trypsynę, pankreatynę lub ich dowolną kombinację,

c) przemywa się wodą,

d) rozdrabnia się mechanicznie, przy czym etapy od a) do c) wykonuje się co najmniej dwukrotnie, a następnie

e) izoluje się nośnikowy preparat białkowy o zawartości zanieczyszczeń białkami ulegającymi hydrolizie enzymatycznej nie przekraczającej 0,5% wagowych jego suchej masy.

Korzystnie, jako wytwór nabłonka kręgowców stosuje się surowiec wybrany spośród sierści, szczeciny, wełny, włosów, zwłaszcza włosów ludzkich, lub ptasich piór, korzystnie spośród szczeciny wieprzowej lub włosów ludzkich.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nośnikowego preparatu białkowego jak określono powyżej albo otrzymanego sposobem jak określono powyżej do wytwarzania nośnika dla somatycznych komórek macierzystych.

Korzystnie, wytwarzany nośnik stosuje się w hodowli somatycznych komórek macierzystych jako substancję szkieletową w tworzeniu konglomeratów somatycznych komórek macierzystych przeznaczonych do stosowania w regeneracji komórek i tkanek organizmu człowieka.

Równie korzystnie, konglomeraty komórek pochodzących z somatycznych komórek macierzystych hodowanych na szkieletowym materiale białkowym stosuje się jako implanty przywracające funkcje uszkodzonych komórek układu nerwowego, mięśniowego albo endokrynnego.

Równie korzystnie, do wytwarzania nośnika dla implantów konglomeratów komórkowych wykorzystuje się włosy chorego otrzymującego implant.

Równie korzystnie, wytwarzany nośnik stosuje się w hodowli somatycznych komórek macierzystych w warunkach pozbawionych materiałów hodowlanych pochodzenia zwierzęcego, zwłaszcza surowicy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konglomerat komórkowy charakteryzujący się tym, że zawiera komórki somatyczne oraz nośnikowy preparat białkowy jak określono powyżej.

Korzystnie jako komórki zawiera somatyczne komórki macierzyste lub ich pochodne.

Jako „zasadniczo pozbawiony białek rozpuszczalnych” rozumie się taki preparat białkowy według wynalazku, który poddawany kolejnej próbie dowolnej hydrolizy enzymatycznej nie traci w jej wyniku więcej niż własnej 0,5% masy suchej.

Jako „pochodne komórek macierzystych” rozumie się dowolne komórki rozwijające się z komórek macierzystych, które mogą znajdować się w różnym stadium rozwoju i/lub zróżnicowania, zawarte w konglomeracie uzyskanym na nośniku zawierającym nośnikowy preparat białkowy według wynalazku.

Przedmiotem szczególnej realizacji wynalazku są nowe szkieletowe preparaty białkowe otrzymywane z włosów lub pierza lub szczeciny lub wełny pozbawione białek ulegających trawieniu enzymami proteolitycznymi ssaków do zastosowania w medycynie jako materiał nośny w hodowli komórek macierzystych oraz sposób otrzymywania nowych szkieletowych preparatów białkowych.

Szkieletowe preparaty białkowe pozbawione białek ulegających trawieniu enzymami proteolitycznymi ssaków do zastosowania w medycynie jako materiał nośny w hodowlach komórek macierzystych oraz sposób otrzymywania tych szkieletowych preparatów białkowych według wynalazku polega na zastosowaniu w hodowli komórkowej preparatu otrzymanego w wyniku kilkakrotnej przemiennie, chemicznej aktywacji, trawieniu enzymatycznym i mieleniu otrzymywanych szkieletowych preparatów białkowych.

Dla lepszego zilustrowania przedmiotowego wynalazku nowe szkieletowe preparaty białkowe oraz sposób otrzymywania nowych szkieletowych preparatów białkowych oraz sposób otrzymywania tych szkieletowych preparatów białkowych oraz zastosowanie tych preparatów w hodowli komórek macierzystych, przedstawiono w przykładach. Nie należy jednak ograniczać zakresu wynalazku jedynie do treści poniższych przykładów.

PL 214 397 B1

P r z y k ł a d I.

kg wełny owczej zalano 1% ługiem sodowym i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie odsączono ług sodowy i wełnę przemyto dwukrotnie wodą i zalano wodą. Zawiesinę wełny w wodzie zakwaszono kwasem solnym do pH 2,2 i dodano pepsyny. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze 35°C, a następnie odsączono stały preparat wełny, przemyto dwukrotnie wodą i wysuszono. Suchy preparat mielono i przesiano zbierając produkt mniejszy od 1 mm długości. Otrzymany preparat zalano 1% ługiem sodowym, a następnie po 1 godzinie produkt odsączono, przemyto wodą, a następnie 1% kwasem solnym i odsączono. Pozostałość zawieszono w wodzie, a powstałą zawiesinę zakwaszono do pH 2,2 i dodano pepsyny. Zawiesinę mieszano przez 2 godziny w temperaturze 35°C, a następnie odsączono, przemyto trzykrotnie wodą i wysuszono. Otrzymano 500 g szkieletowego materiału białkowego z wełny owczej skrótowo oznaczany SSP-2.

Otrzymany materiał SSP-2 dodano do hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych o gęstości 10 milionów komórek w 1 mL. Proces hodowli prowadzono w znanych warunkach poprzednio opisanych dla hodowli tych komórek macierzystych bez materiału szkieletowego. W ciągu pierwszego dnia hodowli w pożywce z 30% FBS ludzkie neuralne komórki macierzyste dzielą się i osiadają równomiernie, wielowarstwowo na całej długości białkowego materiału szkieletowego. Komórki hodowane na białkowym materiale szkieletowym tworzą trwałe konglomeraty pozwalające na ich przenoszenie do innych hodowli tkanek tworząc hodowle heterogenne lub do implantowania do tkanek organizmów żywych.

P r z y k ł a d II.

100 g włosów ludzkich zalano 1% ługiem sodowym i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie odsączono ług sodowy i włosy przemyto dwukrotnie wodą i zalano wodą. Zawiesinę włosów w wodzie zakwaszono kwasem solnym do pH 2,2 i dodano pepsyny. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze 35°C, a następnie odsączono stały preparat wełny, przemyto dwukrotnie wodą i wysuszono. Suchy preparat mielono i przesiano zbierając produkt mniejszy od 1 mm długości. Otrzymany preparat zalano 1% ługiem sodowym, a następnie po 1 godzinie produkt odwirowano, przemyto wodą, odwirowano, pozostałość przemyto 1% kwasem solnym i odwirowano. Pozostałość zawieszono w wodzie, a powstałą zawiesinę zakwaszono do pH 2,2 i dodano pepsyny. Zawiesinę mieszano przez 2 godziny w temperaturze 35°C, a następnie odsączono, przemyto trzykrotnie wodą i wysuszono. Suchy preparat ponownie mielono i przesiano zbierając produkt mniejszy od 0.25 mm długości. Otrzymany preparat zalano 1% ługiem sodowym, a następnie po 1 godzinie produkt odwirowano, przemyto wodą, odwirowano, pozostałość przemyto 1% kwasem solnym i odwirowano. Pozostałość zawieszono w wodzie, a powstałą zawiesinę zakwaszono do pH 2,2 i dodano pepsyny. Zawiesinę mieszano przez 2 godziny w temperaturze 35°C, a następnie odwirowano, część nierozpuszczalną w wodzie przemyto przez zawieszanie w wodzie i wirowanie, a następnie pozostałość nierozpuszczalną w wodzie wysuszono. Otrzymano 25 g szkieletowego materiału białkowego z ludzkich włosów, skrótowo oznaczanego jako HSP-2.

Do ludzkich neuralnych komórek macierzystych hodowanych w warunkach typowych w pożywce z surowicą dodano szkieletowy materiał białkowy z włosów ludzkich HSP-2. Hodowlę komórek prowadzono w inkubatorze w warunkach standardowych (powietrze o wilgotności 95%, 5% zawartości CO2 oraz temperaturze 37°C). Dwa razy w tygodniu wymieniano połowę pożywki hodowlanej. Namnażające się komórki osiadały na szkieletowym materiale białkowym. Tworzące się konglomeraty namnażających się komórek na szkielecie białkowym można utrzymywać w hodowli przez miesiąc. Powstałe konglomeraty można zastosować do implantowania namnożonych komórek do układów tkankowych hodowanych in vitro lub implantować do organów organizmów żywych.

P r z y k ł a d III g włosów zalano 1% ługiem sodowym i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i następnie odsączono ług sodowy i włosy przemyto dwukrotnie wodą i zalano wodą. Zawiesinę włosów w wodzie zakwaszono kwasem solnym do pH 2,2 i dodano pepsyny, a następnie mieszano przez 3 godziny w temperaturze 35°C. Odsączono stały preparat wełny, przemyto dwukrotnie wodą i wysuszono. Suchy preparat mielono i przesiano zbierając produkt o długości od 1 do 13 mm. Przesiany preparat zalano 1% ługiem sodowym, a następnie po 1 godzinie produkt odwirowano, przemyto wodą, odwirowano, pozostałość przemyto 1% kwasem solnym i odwirowano. Pozostałość zawieszono w wodzie, a powstałą zawiesinę zakwaszono do pH 2,2 i dodano pepsyny. Zawiesinę mieszano przez 2 godziny w temperaturze 35°C, a następnie odsączono, przemyto trzykrotnie wodą i wysuszono.

PL 214 397 B1

Otrzymano 2,0 g szkieletowego materiału białkowego z ludzkich włosów, skrótowo oznaczanego jako HSP-3.

Do ludzkich neuralnych komórek macierzystych hodowanych w warunkach typowych w pożywce pozbawionej surowicy dodano szkieletowy materiał białkowy z włosów ludzkich HSP-3. Dalszą hodowlę prowadzono w inkubatorze w warunkach standardowych (powietrze o wilgotności 95%, 5% zawartości CO2 oraz temperaturze 37°C). Dwa razy w tygodniu wymieniano połowę pożywki hodowlanej. W ciągu pierwszego tygodnia hodowli w pożywce bez surowicy pojedyncze komórki hodowli osiadały równomiernie (jednowarstwowo) na całej długości pływającego cytoszkieletu. W ciągu kolejnych 7 dni komórki te tworzyły lokalne, wielowarstwowe skupiska wokół centralnego rdzenia cytoszkieletu. Podczas trzeciego i czwartego tygodnia hodowli lokalne skupiska komórek łączyły się, tworząc jednolity wielowarstwowy agregat zbudowany wokół centralnie położonego cytoszkieletu. Komórki wewnątrz agregatu wytwarzają pomiędzy sobą połączenia typu „gap junction”. Grubość warstwy komórek osiąga do 300 μm. Utworzone, pływające konglomeraty komórek na szkieletach białkowych można utrzym ywać w hodowli, co najmniej przez kolejny miesiąc bez widocznych zmian morfologicznych. Z upływem czasu wewnętrzny cytoszkielet zostaje trawiony przez otaczające i wnikające weń komórki.

Claims (11)

1. Nośnikowy preparat białkowy, znamienny tym, że stanowi szkieletowy preparat białkowy otrzymany z naturalnych wytworów nabłonka kręgowców, zwłaszcza ptaków lub ssaków, składający się z oczyszczonych białek niepodatnych na trawienie enzymatyczne, przy czym poziom zanieczyszczenia białkami podatnymi na hydrolizę enzymatyczną nie przekracza 0,5% wagowych jego suchej masy.

2. Preparat białkowy według zastrz. 1, znamienny tym, że jest otrzymywany z wytworu nabłonka wybranego spośród: sierści, szczeciny, wełny, włosów, zwłaszcza włosów ludzkich, lub ptasich piór, korzystnie spośród szczeciny wieprzowej lub włosów ludzkich.

3. Sposób otrzymywania nośnikowego preparatu białkowego, znamienny tym, że z wytworów nabłonka kręgowców wypłukuje się stopniowo białka podatne na trawienie enzymatyczne, przy czym prowadzi się następujące etapy:

a) wytwory nabłonka kręgowców traktuje się ługiem sodowym lub potasowym o stężeniu od

0,1% do 4% wagowych,

b) trawi się enzymem proteolitycznym wybranym z grupy obejmującej: pepsynę, chymotrypsynę, trypsynę, pankreatynę lub ich dowolną kombinację,

c) przemywa się wodą,

d) rozdrabnia się mechanicznie, przy czym etapy od a) do c) wykonuje się co najmniej dwukrotnie, a następnie

e) izoluje się nośnikowy preparat białkowy o zawartości zanieczyszczeń białkami ulegającymi hydrolizie enzymatycznej nie przekraczającej 0,5% wagowych jego suchej masy.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako wytwór nabłonka kręgowców stosuje się surowiec wybrany spośród sierści, szczeciny, wełny, włosów, zwłaszcza włosów ludzkich, lub ptasich piór, korzystnie spośród szczeciny wieprzowej lub włosów ludzkich.

5. Zastosowanie nośnikowego preparatu białkowego jak określono w zastrz. 1-2 albo otrzymanego sposobem jako określono w zastrz. 3-4 do wytwarzania nośnika dla somatycznych komórek macierzystych.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wytwarzany nośnik stosuje się w hodowli somatycznych komórek macierzystych jako substancję szkieletową w tworzeniu konglomeratów somatycznych komórek macierzystych przeznaczonych do stosowania w regeneracji komórek i tkanek organizmu człowieka.

7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że konglomeraty komórek pochodzących z somatycznych komórek macierzystych hodowanych na szkieletowym materiale białkowym stosuje się jako implanty przywracające funkcje uszkodzonych komórek układu nerwowego, mięśniowego albo endokrynnego.

PL 214 397 B1

8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że do wytwarzania nośnika dla implantów konglomeratów komórkowych wykorzystuje się włosy chorego otrzymującego implant.

9. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że wytwarzany nośnik stosuje się w hodowli somatycznych komórek macierzystych w warunkach pozbawionych materiałów hodowlanych pochodzenia zwierzęcego, zwłaszcza surowicy.

10. Konglomerat komórkowy, znamienny tym, że zawiera komórki somatyczne oraz nośnikowy preparat białkowy jak określono w zastrz. 1-2.

11. Konglomerat według zastrz. 10, znamienny tym, że jako komórki zawiera somatyczne komórki macierzyste lub ich pochodne.