PL213856B1

PL213856B1 - Zestaw inkubacyjny do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii, w szczególności Clavibacter michiganensis sepedonicus

Info

Publication number: PL213856B1
Application number: PL383365A
Authority: PL
Inventors: Wlodzimierz Przewodowski
Original assignee: Inst Hodowli I Aklimatyzacji Roslin
Priority date: 2007-09-16
Filing date: 2007-09-16
Publication date: 2013-05-31
Also published as: PL383365A1

Abstract

Zestaw do wykrywania obecności bakterii w analizowanej próbce charakteryzuje się tym, że zawiera płytki posiadające powierzchnię aktywowaną aniliną modyfikowaną aldehydem glutarowym z immoblilizowanymi przeciwciałami specyficznymi wobec wybranego antygenu bakteryjnego. Ujawniono zastosowanie zestawu do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zestaw inkubacyjny do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii, w szczególności Clavibacter michiganensis sepedonicus mający zastosowanie w przemyśle spożywczym oraz rolnictwie.

Znany jest sposób chemicznej polimeryzacji aniliny (Stejskal i in. 1999) oraz sposób jej modyfikacji przy pomocy aldehydu glutarowego (Fernandes i in. 2003) polegające na tym, że tworzenie polimeru aniliny zachodzi poprzez oksydatywną polimeryzację aniliny. W tym celu sporządzano 0,002 - 2 M roztwór aniliny w 0,01 - 5 N HCl, do którego dodawano 0,01 - 2 M (NH4)2S2O8 w stosunku objętościowym 10:1 (v/v) i po dokładnym wymieszaniu pozostawiano na 2 - 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie nanoszono 1-50 μΐ krople na powierzchnię membran poliwęglanowych i inkubowano 10 - 120 minut w temperaturze pokojowej. Po godzinie trzykrotnie przepłukiwano 2 x dest. H2O, dwukrotnie 0,1 N NaOH, dwukrotnie 0,1 N HCl i pięciokrotnie 2 x dest. H2O, następnie suszono ok. 30 minut w temperaturze pokojowej. Obecnie stosowane testy detekcji bakterii Cms bazują na koncentracji bakterii przy wykorzystaniu siły odśrodkowej - poprzez zwirowywanie zawiesiny bakteryjnej, immunosorbcję na płytkach do testu ELISA (Baer i Gudmestadt 1993), na mikrosferach aktywowanych magnetycznie mikrosferach krzemionkowych pokrytych odpowiednimi przeciwciałami (test LUMINEX) tudzież utrwalenie niewielkiej porcji zawiesiny na szkiełkach mikroskopowych - test IF (OEPP/EPPO 2006).

Celem wynalazku jest znalezienie szybkiego i prostego testu z wykorzystaniem jako immunosorbenta odpowiednio zaprojektowanego urządzenia testowego, korzystnie uzyskanego na bazie szalek Petriego, pozwalającego na koncentrację komórek identyfikowanych bakterii, korzystnie Cms, na małej powierzchni z dużej objętości tkanki roślinnej.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zestaw inkubacyjny mający postać szalek Petriego, korzystnie zbudowany z materiału wybranego spośród: polistyrenu, polietylenu, poliwęglanu lub szkła charakteryzujący się tym, że zawiera płytki z polianiliną aktywowane aldehydem glutarowym i imobilizowane przeciwciała uzyskane poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii Clavibacter michiganensis sepedonicus, poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH do wykrywania obecności bakterii w analizowanej próbce, przy czym polianilina znajdująca się na płytce jest opłaszczona przeciwciałami, przypadkowo albo w sposób zorientowany, wyznakowane znacznikiem, specyficznymi wobec bakterii pozbawionych otoczek śluzowych. Równie korzystnie zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że znacznik jest wybranym spośród: złota koloidalnego, enzymu, barwnika fluorescencyjnego lub fluorochromu. Równie korzystnie zestaw według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera dodatkowo składniki pokarmowe dla immobilizowanych komórek bakteryjnych. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku zestaw charakteryzuje się tym, że składniki pokarmowe wybiera się spośród: pożywek selektywnych, półselektywnych lub mineralnych.

Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zestawu przedstawionego w pierwszym przedmiocie wynalazku do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii, w szczególności Clavibacter michiganensis sepedonicus.

W niniejszym wynalazku aktywację przy pomocy polimeru aniliny wykorzystano jako sposób uzyskania funkcjonalnego immuno-biochip'a. Poddawane zgodnej z wynalazkiem modyfikacji chemicznej oraz immunoaktywacji powierzchni urządzeń testowych, korzystnie szalek Petriego, mogą być wytworzone z różnego rodzaju materiałów (z polistyrenu, polietylenu, poliwęglanu i szkła). Wynalazek pozwolił na uzyskanie funkcjonalnego podłoża o nowych właściwościach chemicznych, optycznych oraz sorpcyjnych zdolnego do aktywacji przeciwciałami (np. skierowanymi na nowego rodzaju antygen - komórki bakteryjne pozbawione śluzów bakteryjnych do wykorzystania w detekcji bakterii Cms). Uniwersalizm i funkcjonalność tego rodzaju immunosorbenta polega na możliwości zastosowania w stosunku do każdej innej bakterii zależnie od przeciwciał, które się zastosuje.

P r z y k ł a d 1

Polimeryzację aniliny na powierzchni szalek Petriego prowadzano dobierając warunki pozwalające na powtarzalne i równomierne pokrycie polimerem aniliny aktywowanej powierzchni.

Anilinę polimeryzowano zarówno na określonych obszarach w postaci plamek o średnicy ok. 5 mm lub na całej powierzchni szalki Petriego. Następnie chcąc uzyskać odpowiednie grupy funkcyjne zdolPL 213 856 B1 ne do przyłączania przeciwciał, powierzchnię wytworzonego polimeru aniliny modyfikowano chemicznie aldehydem glutarowym.

W tym celu sporządzano 0,002 - 2 M roztwór aniliny w 0,01 - 5 N HCl, do którego dodawano

0,01 - 2 M (NH4)2S2O8 w stosunku objętościowym 10:1 (v/v) i po dokładnym wymieszaniu pozostawiano na 2 - 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie nanoszono 1-50 μΐ krople na powierzchnię membran poliwęglanowych i inkubowano 10 - 120 minut w temperaturze pokojowej. Po godzinie trzykrotnie przepłukiwano 2 x dest. H2O, dwukrotnie 0,1 N NaOH. dwukrotnie 0,1 N HCl i pięciokrotnie 2 x dest, H2O, następnie suszono ok. 30 minut w temperaturze pokojowej.

Polianilinę równoważono 0,01-1,5 M buforem fosforanowym pH 5,0 - 9,0. Następnie inkubowano 15-120 minut z 2,5% roztworem aldehydu glutarowego w buforze równoważącym, płukano trzykrotnie buforem równoważącym bez aldehydu glut arowego, suszono i przechowywano w 4°C.

Przygotowanie podłoża

Do testu wykorzystano szalki Petriego z poliwęglanu lub polistyrenu lub polietylenu lub szkła aktywowane chemicznie, a następnie aktywowano przeciwciałami skierowanymi na bakterie Cms.

IgG unieruchamiano kowalencyjnie na powierzchni polianiliny w sposób zorientowany i przypadkowy. W pierwszym przypadku stosowano przeciwciała uprzednio poddane procesowi oksydacji oraz polianilinę niemodyfikowaną chemicznie, natomiast w drugim przeciwciała niemodyfikowane chemicznie oraz polianilinę aktywowaną aldehydem glutarowym.

Sposób zorientowany

Szalki Petriego aktywowane polianiliną analogicznie jak w przykładzie 1 pokrywano 20 μΐ roztworu uprzednio oksydowanych przeciwciał anty-Cms o stężeniu 0,001-10 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 5-70% glicerolem. Powierzchnię szalek inkubowano 15-120 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 20 μΐ 0,1-30% roztworu NaCNBH₄ w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 15-120 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 15-120 minut w 37°C z buforem do blokowania (0,1-1,5% żelatyna w 1xPBS, pH 7,4), po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

Sposób przypadkowy

Szalki Petriego modyfikowane chemicznie polianiliną i aldehydem glutarowym analogicznie jak w przykładzie 1, immobilizowano 1 - 50 μl roztworu przeciwciał anty-Cms o stężeniu 0,001-1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20-60% glicerolem. Szalki Petriego inkubowano 15-120 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 20 μl 0,1-30% roztworu NaCNBH4 w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 15-120 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 15-120 minut w 37°C z buforem do blokowania (0,1-1,5% żelatyna lun 1-15% albumina wołowa w 1xPBS, pH 7,4), po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

P r z y k ł a d 2

Test z bakteriami Cms

Sporządzono zawiesinę bakterii Cms w zbuforowanym ekstrakcie z bulw ziemniaka (bufor 1xPBS pH 7,4 lub inny) w rozcieńczeniach od 100 do 25000 CFU/ml (w Polsce częściej stosuje się jtk/ml jednostek tworzących kolonie na 1 ml zawiesiny). Mieszaninę umieszczano w przygotowanej wcześniej immunoaktywnej szalce Petriego z polianiliną i inkubowano od 15 minut do doby w temperaturze 4°C, pokojowej lub 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii odpłukiwano trzykrotnie buforem 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms oceniano różnymi technikami sposobami:

a) obserwowano po ich wyznakowaniu:

- koniugatem złota koloidalnego z przeciwciałami skierowanymi na wyłapane bakterie i następnie wzmacniać uzyskany sygnał przez redukcję srebra na złocie koloidalnym, a następnie obserwować pod mikroskopem optycznym,

- koniugatem przeciwciał z enzymem (np. alkaliczną fosfatazą),

- koniugatem przeciwciał znakowanych fluorochromem (np. indokarbocyjaniną Cy3 lub FITC) i obserwację pod mikroskopem epifluorescencyjnym. W tym przypadku wykorzystuje się nie tylko właściwości mechaniczne i chemiczne - sorpcyjne polianiliny, ale również jej właściwości optyczne. Polimer ten posiada zdolność wytłumiania światła wzbudzającego świecenie fluorochromu, którym wyznakowane są bakterie. Uzyskany obraz staje się przez to bardziej kontrastowy. Standardowo do tego celu stosuje się albo ciemne (czarne) podłoże, albo odpowiedni filtr,

PL 213 856 B1 albo alternatywnie

b) oceniano przyżyciowo poprzez zmywanie bakterii przy użyciu odpowiedniego buforu alkalicznego (np. 0,1 M roztworu glicyna-NaOH pH 10,5) i następnie wykonywano posiew zdesorbowanych komórek na podłożu selektywnym. Uzyskane w ten sposób bakterie mogą być użyte w bioteście z udziałem roślin indykatorowych (wskaźnikowych). Ma to ogromne znaczenie w stwierdzeniu zjadliwości danego szczepu bakteryjnego, ponieważ pozwala stwierdzić, czy i jaki jest stopień zjadliwości (wirulencji) wyizolowanego szczepu bakteryjnego.

Opisany test może być również realizowany w innych wariantach:

P r z y k ł a d 3

Szalki Petriego modyfikowane chemicznie polianiliną i aldehydem glutarowym analogicznie jak w przykładzie 1, powlekano 25 μΐ roztworu przeciwciał skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus o stężeniu 1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20% glicerolem. Szalki Petriego inkubowano 30 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 25 μΐ 0,5% roztworu NaCNBH4 w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 10 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 30 minut w 37°C z buforem do blokowania z 5% albuminą wołową w 1xPBS, pH 7,4, po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

Ekstrakt z bulw ziemniaka rozcieńczano w stosunku 1:1 buforem 1xPBS pH 7,4. Mieszaninę umieszczano w przygotowanej szalce Petriego z polianiliną pokrytą przeciwciałami anty-Cms i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii usunięto przez trzykrotnie płukanie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms znakowano techniką pośredniej immunofluorescencji stosując jako znacznik koniugat przeciwciał kozich antykróliczych znakowanych indokarbocyjaniną Cy3. Wyznakowane komórki bakteryjne obserwowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

P r z y k ł a d 4

Szalki Petriego modyfikowane chemicznie polianiliną i aldehydem glutarowym analogicznie jak w przykładzie 1, powlekano 25 μl roztworu przeciwciał skierowanych na bakterie Erwinia carotovora subsp. atroseptica o stężeniu 1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20% glicerolem. Szalki Petriego inkubowano 30 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 25 μl 0,5% roztworu NaCNBH₄ w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 10 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 30 minut w 37°C z buforem do blokowania z 5% albuminą wołową w 1xPBS, pH 7,4, po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

Ekstrakt z bulw ziemniaka rozcieńczano w stosunku 1:1 buforem 1xPBS pH 7,4. Mieszaninę umieszczano w przygotowanej szalce Petriego z polianiliną pokrytą przeciwciałami anty-Eca i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii usunięto przez trzykrotnie płukanie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Eca znakowano techniką pośredniej immunofluorescencji stosując jako znacznik koniugat przeciwciał kozich antykróliczych znakowanych indokarbocyjaniną Cy3. Wyznakowane komórki bakteryjne obserwowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

P r z y k ł a d 5

Szalki Petriego modyfikowane chemicznie polianiliną i aldehydem glutarowym analogicznie jak w przykładzie 1, powlekano 25 μl roztworu przeciwciał skierowanych na bakterie Erwinia carotovora subsp. carotovora o stężeniu 1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20% glicerolem. Szalki Petriego inkubowano 30 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 25 μl 0,5% roztworu NaCNBH₄ w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 10 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 30 minut w 37°C z buforem do blokowania z 5% albuminą wołową w 1xPBS, pH 7,4, po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

Ekstrakt z bulw ziemniaka rozcieńczano w stosunku 1:1 10 mM buforem fosforanowym pH 7,2 z 0,9% NaCl. Mieszaninę umieszczano w przygotowanej szalce Petriego z polianiliną pokrytą przeciwciałami anty-Ecc i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii usunięto przez trzykrotne płukanie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Ecc znakowano techniką pośredniej immunofluorescencji stosując jako znacznik koniugat przeciwciał kozich antykróliczych znakowanych indokarbocyjaniną Cy3. Wyznakowane komórki bakteryjne obserwowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

PL 213 856 B1

Test daje również możliwość zarówno oceny przyżyciowej, jak i optycznej oceny morfologii identyfikowanych komórek bakteryjnych.

P r z y k ł a d 6

Szalki Petriego modyfikowane chemicznie polianiliną i aldehydem glutarowym analogicznie jak w przykładzie 1, powlekano 25 μΐ roztworu przeciwciał skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus o stężeniu 1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20% glicerolem. Szalki Petriego inkubowano 30 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 25 μΐ 0,5% roztworu NaCNBH₄ w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 10 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 30 minut w 37°C z buforem do blokowania z 5% albuminą wołową w 1xPBS, pH 7,4, po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

Ekstrakt z bulw ziemniaka rozcieńczano w stosunku 1:1 buforem 1xPBS pH 7,4. Mieszaninę umieszczano w przygotowanej szalce Petriego z polianiliną pokrytą przeciwciałami anty-Cms i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii usunięto przez trzykrotne płukanie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms znakowano techniką pośredniej immunofluorescencji stosując jako znacznik koniugat przeciwciał kozich antykróliczych znakowanych indokarbocyjaniną Cy3. Wyznakowane komórki bakteryjne obserwowano pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

P r z y k ł a d 7

Szalki Petriego modyfikowane chemicznie polianiliną i aldehydem glutarowym analogicznie jak w przykładzie 1, powlekano 25 μl roztworu przeciwciał skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus o stężeniu 1 mg/ml w buforze 1xPBS pH 7,4 z 20% glicerolem. Szalki Petriego inkubowano 30 minut w 37°C i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Następnie nanoszono 25 μl 0,5% roztworu NaCNBH₄ w buforze 1xPBS pH 7,4, umieszczano na 10 minut pod dygestorium i trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4. Aktywowane powierzchnie inkubowano 30 minut w 37°C z buforem do blokowania z 5% albuminą wołową w 1xPBS, pH 7,4, po czym trzykrotnie przemywano buforem 1xPBS pH 7,4 z detergentem 0,05% Tween 20.

Ekstrakt z bulw ziemniaka rozcieńczano w stosunku 1:1 buforem 1xPBS pH 7,4. Mieszaninę umieszczano w przygotowanej szalce Petriego z polianiliną pokrytą przeciwciałami anty-Cms i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii usunięto przez trzykrotne płukanie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms znakowano koniugatem złota koloidalnego z przeciwciałami anty-Cms i następnie uzyskany sygnał optyczny wzmacniano poprzez redukcję srebra na złocie koloidalnym. Tak uwidocznione komórki bakteryjne obserwowano przy wykorzystaniu mikroskopu optycznego.

P r z y k ł a d 8

Ekstrakt z bulw ziemniaka rozcieńczano w stosunku 1:1 buforem 1xPBS pH 7,4. Mieszaninę umieszczano w przygotowanej szalce Petriego z polianiliną pokrytą przeciwciałami anty-Cms i inkubowano 2 godziny w temperaturze 37°C. Nadmiar niezwiązanych bakterii usunięto przez trzykrotne płukanie buforem - 1xPBS pH 7,4 z 0,05% Tween 20, natomiast immunopułapkowane bakterie Cms znakowano immunoenzymatycznie koniugatem przeciwciał anty-Cms z alkaliczną fosfatazą stosując jako substrat dla enzymu NBT/BCIP dający nierozpuszczalny produkt na powierzchni komórek bakterii Cms. Tak uwidocznione komórki bakteryjne obserwowano przy wykorzystaniu mikroskopu optycznego.

Claims

1. Zestaw inkubacyjny mający postać szalek Petriego, korzystnie zbudowany z materiału wybranego spośród: polistyrenu, polietylenu, poliwęglanu lub szkła, znamienny tym, że zawiera płytki z polianiliną aktywowane aldehydem glutarowym i imobilizowane przeciwciała uzyskane poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii Clavibacter michiganensis sepedonicus, poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH do wykrywania obecności bakterii w analizowanej próbce, przy czym polianilina znajdująca się na płytce jest opłaszczona przeciwciałami, przypadkowo albo w sposób zorientowany, wyznakowane znacznikiem, specyficznymi wobec bakterii pozbawionych otoczek śluzowych.

2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że znacznik jest wybranym spośród: złota koloidalnego, enzymu, barwnika fluorescencyjnego lub fluorochromu.

3. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo składniki pokarmowe dla immobilizowanych komórek bakteryjnych.

4. Zestaw według zastrz. 3, znamienny tym, że składniki pokarmowe wybiera się spośród: pożywek selektywnych, półselektywnych lub mineralnych.

5. Zastosowanie zestawu jak określono w jakimkolwiek zastrz. od 1 do 4 do wykrywania albo przeżyciowego izolowania wybranych bakterii, w szczególności Clavibacter michiganensis Sepedonicus.