PL212796B1 - Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie - Google Patents
Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanieInfo
- Publication number
- PL212796B1 PL212796B1 PL386483A PL38648308A PL212796B1 PL 212796 B1 PL212796 B1 PL 212796B1 PL 386483 A PL386483 A PL 386483A PL 38648308 A PL38648308 A PL 38648308A PL 212796 B1 PL212796 B1 PL 212796B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phage
- proteins
- antibodies
- polyvalent
- preparation
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 claims abstract description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 238000001066 phage therapy Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 108700010777 T4 phage proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710194518 T4 protein Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000588731 Hafnia Species 0.000 description 1
- 241000588729 Hafnia alvei Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Chemical group OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Chemical group 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 chlorine ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- CJNBYAVZURUTKZ-UHFFFAOYSA-N hafnium(IV) oxide Inorganic materials O=[Hf]=O CJNBYAVZURUTKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 230000005960 long-lasting response Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011155 quantitative monitoring Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/245—Escherichia (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/25—Shigella (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/255—Salmonella (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/275—Hafnia (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny preparat immunologiczny do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych, charakteryzujący się tym, że zawiera poliwalentnego oczyszczonego z białek bakteryjnych faga lub oczyszczony z białek bakteryjnych zespół białek fagowych, który to zespół zawiera białka immunoreaktywne, korzystnie w immunoblotingu z surowicą ludzką, osoczem lub innymi płynami ustrojowymi oraz zastosowanie preparatu do testów immunochemicznych, przykładowo testu ELISA.
Description
Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie do wykrywania i/lub oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych. Preparat ma szerokie zastosowanie w badaniu patogenezy chorób zakaźnych i w terapii fagowej.
Wzrost zainteresowania terapią bakteriofagami lub białkami izolowanymi z fagów jest związany z wykazaną ich skutecznością w zwalczaniu zakażeń nie dających się leczyć antybiotykami [1,2]. Bakteriofagi mają szereg innych zalet w porównaniu do konwencjonalnych antybiotyków, głównie swoistość pozwalającą niszczyć bakterie patogenne bez zabijania bakterii symbiotycznych, przez co nie narusza się subtelnej równowagi mikrobiologicznej organizmu [1,3-6]. Stężenie bakteriofagów w płynach chorego organizmu nie maleje od momentu podania, lecz podlega samoregulacji, liczba fagów rośnie ekspotencjalnie w obecności bakterii i szybko spada w przypadku ich braku. Znacznie rzadziej obserwuje się selekcję opornych bakterii, co często ma miejsce w przypadku antybiotyków; ponadto w przypadku wystąpienia oporności na danego faga u danej bakterii można dobrać innego faga zdolnego infekować oporną bakterię. Wreszcie mogą być stosowane równolegle z antybiotykami w terapii kombinowanej. Bakteriofagi stanowią naturalny czynnik regulujący liczebność populacji bakteryjnych w przyrodzie. Prawdopodobnie dla każdej bakterii istnieje swoisty fag, zdolny ją zakażać, jednak szczególnie interesujące są tzw. fagi wieloważne, czyli poliwalentne, swoiste dla szerokiego spektrum bakterii. Wprowadzenie terapii fagami do powszechnego zastosowania w lecznictwie wymaga opracowania metod szybkiego, skutecznego typowania odpowiednich fagów, monitorowania przebiegu namnażania fagów i penetracji przez nie ludzkiego organizmu, uwalniania przez niszczone bakterie toksyn mogących powodować wstrząs septyczny i usuwania fagów z organizmu oraz analizy obecności przeciwciał przeciwfagowych [7,8].
Podczas prób klinicznych obserwowano obecność przeciwciał antyfagowych przed rozpoczęciem leczenia fagami [1,11-13]. Dane te jednak nie były jednoznaczne ze względu na brak wówczas metod oczyszczania i analizy stopnia czystości preparatów fagowych [1,11-13]. Terapia niektórych pacjentów była nieskuteczna, co mogło wynikać z obecności w zakażających bakteriach fagów lizogennych, jednocześnie zdolnych do indukcji przeciwciał [11], Obecność takich przeciwciał może mieć istotne znaczenie dla przebiegu choroby i skuteczności terapii fagowej. W przypadku wystąpienia tych samych determinant antygenowych u zastosowanego w leczeniu faga litycznego, co u faga lizogennego, który wywołał immunizację u danego pacjenta, oczekiwany efekt terapeutyczny może nie zostać osiągnięty. Ponieważ w przypadku fagów mamy do czynienia z antygenami białkowymi, jednorazowa immunizacja danym fagiem, np. w wyniku przebytej choroby o bakteryjnym podłożu, może wywołać długotrwałą odpowiedź. Należy też wziąć pod uwagę to, że fagi lityczne mogą w naturalny sposób odpowiadać za przypadki ozdrowienia z zakażeń bakteryjnych. W takim wypadku obecność przeciwciał antyfagowych w surowicy może być również skutkiem przebytej choroby, jednakże brakuje danych literaturowych analizujących te zagadnienia.
W zgłoszeniu patentowym P 381 730 opracowano procedury wydajnego namnażania bakteriofagów i ich dokładnego oczyszczania, co pozwoliło uzyskiwać duże ilości czystych fagów o wysokim mianie aktywności, bez zanieczyszczeń endotoksynami i innymi składnikami bakteryjnymi, uniemożliwiających szereg aplikacji [9]. Dalsze badania doprowadziły do oryginalnych obserwacji będących przedmiotem niniejszego zgłoszenia, które dotyczą diagnostycznego preparatu i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych z użyciem specyficznego testu immunochemicznego. Celem wynalazku jest dostarczenie swoistego preparatu diagnostycznego do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych, który dzięki swojej formule pozbawiony jest wad istniejących w stanie techniki i pozwala tym sposobem na skuteczną diagnostykę i przeprowadzenie efektywnej terapii fagowej. Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny preparat immunologiczny, charakteryzujący się tym, że zawiera faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymane z niego oczyszczone z białek bakteryjnych immunoreaktywne białka fagowe.
Korzystnie, wspomniane białka immunoreaktywne wykazują immunorektywność w immunoblotingu z surowicą ludzką, osoczem ludzkim lub innymi płynami ustrojowymi.
PL 212 796 B1
Bardziej korzystnie, fag jest fagiem poliwalentnym.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymanych z niego immunoreaktywnych białek fagowych oczyszczonych z białek bakteryjnych do wytwarzania preparatu diagnostycznego do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych. Korzystnie, diagnostyczny preparat immunologiczny stosuje się do testów immunochemicznych obejmujących test ELISA i służy do wykrywania i/lub oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych w surowicy, osoczu i innych płynach ustrojowych.
Bakteriofagi posiadają kilka do kilkunastu rodzajów białek tworzących osłonkę, czyli kapsyd. Białka fagowe tworzą struktury morfologiczne pozwalające wyróżnić takie elementy faga jak głowa, ogonek, płytka adhezyjna, witki itd. [3,4]. Niektóre z tych białek wykazują aktywność enzymatyczną np. konieczną do rozpuszczenia ściany bakteryjnej czy otoczki. Zatem niektóre, oczyszczone białka faga są również potencjalnym czynnikiem bakteriobójczym [5], zwłaszcza fagów poliwalentnych o szerokiej swoistości. Fagi poliwalentne rozpoznają receptory wspólne dla większej grupy szczepów bakteryjnych, takie jak kwasy tejchojowe, peptydoglikan, część wspólna rdzeniowa endotoksyn, kwas kolominowy i inne struktury powierzchniowe [14]. Badania według wynalazku wykazały, że poziom przeciwciał przeciwfagowych w surowicy jest znacznie niższy niż przeciwbakteryjnych, dlatego śladowe zanieczyszczenia białkami bakteryjnymi są przyczyną znacznego błędu oznaczeń. Wobec tego do oznaczania przeciwciał przeciwfagowych konieczne są czyste fagi, czy najkorzystniej otrzymane z nich białka lub frakcje białek immunogennych. W celu analizy ich czystości proponuje się kompleksowe użycie SDS-PAGE, immunoblotingu i LAL/GLC-MS do analizy czystości frakcji białkowych jako antygenów do testu. Badania wykazały ponadto, że indywidualne surowice ludzkie immunoreaktywne rozpoznają kilka do kilkunastu różnych białek danego faga, zazwyczaj nie białek głównych, tworząc kilka wzorów reaktywności. Dlatego stosowanie jednego immunogennego białka faga jako antygenu jest niewłaściwe, gdyż należy używać zestawu białek fagowych jako antygenu do testu. Znane są rozwiązania wykrywające i stosujące jeden peptyd lub przeciwciało swoiste, np. dla Chlamydia, jednak mają one szereg ograniczeń, poza wzmiankowanym, takie rozwiązanie jest możliwe tylko dla wysoce swoistego układu jednego patogenu, pod warunkiem dysponowania specyficznym dla tego faga peptydem i nie dotyczy fagów wieloważnych. Wyniki dalszych badań, z zastosowaniem przeciwciał przeciwfagowych użytych jako standard, otrzymanych w chromatografii powinowactwa na immobilizowanych czystych białkach fagowych, wskazały na obecność reaktywności krzyżowych przeciwciał przeciwfagowych, co oznacza konieczność kontrolowanego doboru immunoreaktywnych frakcji białek fagowych jako antygenów i niezbędnej standaryzacji testów na oznaczanie przeciwciał przeciwfagowych, co jest kolejnym nowym elementem naszego rozwiązania i potwierdza konieczność zastosowania w preparacie zespołów (frakcji) białek fagowych. Tak więc rozwiązanie testu polega na użyciu jako antygenu frakcji immunogennych białek pochodzących z czystego faga, użyciu proponowanych w niniejszym rozwiązaniu kryteriów czystości faga oraz oparciu testu i jego wystandaryzowaniu na przeciwciałach referencyjnych otrzymanych docelowo do danego testu.
W pierwszym etapie otrzymano oczyszczone preparaty fagowe według znanych metod, jak z użyciem detergentu i membran ultrafiltracyjnych [9] lub w przypadku, kiedy detergent inaktywuje bakteriofaga, na kolumnie powinowactwa z immobilizowaną polilizyną [10], Uzyskanie dużych ilości cząstek fagowych pozwala na rozdzielenie ich poszczególnych składników białkowych. Dalej, uzyskane dane w teście immunoblotingu z ludzkimi surowicami pozwoliły na opracowanie testów ELISA, służących do ilościowego monitorowania stopnia immunizacji przeciwko bakteriofagom. W związku z zaobserwowaną przez nas obecnością w surowicy ludzkiej przeciwciał na te składniki, konieczne jest dokładne i powtarzalne oczyszczanie cząstek bakteriofaga celem uzyskania wiarygodnych wyników ich analiz.
Niniejszy wynalazek oparto na wynikach badań trzech fagów wieloważnych [14]: 1) swoistego dla wielu serotypów E. coli faga K1, gdyż kwas kolominowy stanowiący antygen K1 występuje z wieloma O-antygenami E. coli często notowanymi w raportach epidemiologicznych, równocześnie dogodnego do eksperymentów ułatwiając opracowanie metod i testów, 2) faga wieloważnego T4, zdolnego zakażać szerokie spektrum szczepów E. coli, Shigella i Salmonella, gdyż jego receptorem jest konserwatywna domena w enterobakteryjnej endotoksynie, stosunkowo często typowanego w prowadzonej terapii eksperymentalnej, oraz 3) faga poliwalentnego Hafnia alvei, swoistego dla całego rodzaju Hafnia. Bakterie te są częstą przyczyną wielu schorzeń.
PL 212 796 B1
Czystość preparatu diagnostycznego według wynalazku mierzy się metodami chromatograficznymi, w elektroforezie SDS-PAGE, testami na zawartość endotoksyn i składników ściany bakteryjnej, jak testem LAL i metodami analiz chemicznych przy pomocy systemu GLC-MS. Immunoreaktywne białko fagowe stosowane w preparacie według wynalazku izoluje się na przykład metodą elektroforezy preparatywnej w obecności siarczanu dodecylu. Preparat diagnostyczny według wynalazku stosuje się do testu immunologicznego celem wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał surowiczych antyfagowych poliwalentnych, które odgrywają istotną rolę w patogenezie chorób zakaźnych.
W celu przygotowania preparatu diagnostycznego według wynalazku izoluje się określone frakcje białek fagowych, jak też wykorzystuje się całego oczyszczonego faga, do ilościowego testu immunoenzymatycznego ELISA celem oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych. Uzyskane z fagów frakcje białkowe analizowano przy pomocy spulowanej surowicy ludzkiej w immunoblotingu, by do standaryzacji testu ELISA wybrać frakcje immunoreaktywne. Elektroforeza SDS-PAGE w warunkach denaturujących połączona z immunoblotingiem posłużyła do ustalenia, które z białek fagowych reagują z przeciwciałami obecnymi w surowicy. Nieoczekiwanie preparaty pełnego faga były równie dobrymi antygenami służącymi do wykrywania przeciwciał antyfagowych i nie ustępowały oczyszczonym frakcjom białkowym. Jednakże frakcje białkowe stanowią preparaty o zdefiniowanym składzie cząsteczkowym i łatwiejszym do określenia stopniu czystości. Z kolei cały fag stanowi pełny zestaw antygenowy i może być niezbędny do wstępnego zobrazowania i oceny kompletnej odpowiedzi organizmu na danego faga, co często obserwowano w prowadzonych badaniach. Oczyszczanie białek prowadzono także za pomocą rutynowych technik chromatograficznych jak sitowa, jonowymienna, oddziaływań hydrofobowych, jednak elektroforeza preparatywna okazała się korzystnie najwygodniejsza. Niniejszy wynalazek wykorzystuje izolację antygenów fagowych i ich pochodnych białkowych do uzyskania preparatów diagnostycznych do testu ilościowego dla oznaczania przeciwciał antyfagowych w surowicy, osoczu i innych płynach ustrojowych. Analiza antygenów fagowych dotyczyła wpierw testu immunoblotingu z surowicą ludzką, aby określić immunoreaktywność otrzymanych frakcji białkowych (przykład 3), porównując je z frakcjami otrzymanymi inną metodą, mianowicie ultrawirowaniem w gradiencie sacharozy (przykład 2). Oczyszczone białka reagujące z przeciwciałami wykorzystane w teście ELISA służą do analiz ilościowych próbek surowicy ludzkiej. Opracowano ilościowy test ELISA, w którym oczyszczone fagi poliwalentne albo oczyszczone lub sklonowane białka jako antygeny reagujące z przeciwciałami są wykorzystane do analiz poziomu przeciwciał antyfagowych.
Zastosowanie białek fagowych do testu pozwoliło po raz pierwszy wykryć przeciwciała antyfagowe w surowicy, gdyż uprzednie dane [1,11-13] nie były jednoznaczne ze względu na brak metod oczyszczania i analizy stopnia czystości preparatów fagowych. Białka fagowe otrzymywane w niniejszym wynalazku można użyć w szeregu innych aplikacji, w biotechnologii i medycynie. Podkreślić należy korzystne wprowadzenie testu do oznaczania przeciwciał wobec fagów poliwalentnych, który nadaje się do monitorowania przeciwciał antyfagowych przed, w trakcie i po terapii fagowej, co będzie możliwe dzięki zaproponowaniu nowego podejścia i niniejszym rozwiązaniom. Dysponowanie metodą analizy ilościowej aktywności antyfagowej, proponowane w niniejszym wynalazku, może posłużyć także do wdrożenia norm analizy preparatów krwiopochodnych. Metoda analizy przeciwciał posłuży do monitorowania i prognozowania efektów terapeutycznych, jako ważny czynnik prognostyczny. Wysoki poziom aktywności antyfagowej u osób zdrowych i chorych pozwala ocenić, które z badanych fagów najczęściej wywołują taką odpowiedź, oraz mogą wskazać na relację między odpowiedzią antyfagową i jednostką chorobową, co może być w przyszłości przydatne w doborze odpowiednich fagów do terapii. Uzyskiwanie nowych, przydatnych terapeutycznie szczepów fagowych, a także przygotowanie preparatów leczniczych jest wielokrotnie tańsze niż poszukiwanie nowych antybiotyków oraz terapia nimi. Rozwiązania proponowane w niniejszym wynalazku są proste, nie wymagają kosztownych odczynników, oparte są na trzech różnych preparatach, dlatego mają zastosowanie dla szerszego zakresu fagów poliwalentnych. Fagi bardzo specyficzne mają znikomą wartość ze względu na dużą zmienność szczepów, natomiast fagi poliwalentne mają wysoką wartość ze względu na ich obecność w przyrodzie, w organizmach żywych. Z tego też wynika obserwowana w naszych badaniach obecność przeciwciał przeciwko fagom poliwalentnym w populacji ludzkiej. Ze względu na znaczenie kliniczne tych przeciwciał, należy podkreślić wartość praktyczną preparatu diagnostycznego będącego przedmiotem niniejszego wynalazku.
Niniejszy wynalazek przedstawiono w przykładach nie ograniczających jego zakresu ochrony.
PL 212 796 B1
P r z y k ł a d 1
Elektroforeza preparatywna białek faga T4
Izolację białek faga T4 przeprowadzano z użyciem elektroforezy preparatywnej w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS (od góry 2 cm 5% żelu zagęszczającego, 4 cm 8% żelu rozdzielającego i 6 cm 10% żelu rozdzielającego) w warunkach denaturujących. Elektroforezę prowadzi się przy pomocy aparatu Pep Cell model 491 (Bio Rad), w tubie o średnicy 37 mm i 12 cm długości żelu. Żel rozdzielający i zagęszczający wylano i tubę z żelem pozostawiono w 4°C przez noc. Na żel nanoszono preparat białkowy faga T4 oczyszczanego metodą PDL [9] zawierający 25 mg białka całkowitego. Zliofilizowany preparat do rozdziału rozpuszczono w 1 ml buforu do denaturacji białek i gotowano przez 15 minut. Po naniesieniu preparatu prowadzono elektroforezę przez dobę przy odpowiednim natężeniu prądu. Zbierano 1,5 ml frakcje z przepływem 1 ml/1,5 minuty. Po 10 godzinach natężenie zmieniono z 40 mA/257V na 74mA/300V. Białko eluowano wodą i zebrano 280 frakcji. Do analizy pobrano co czwartą frakcję w celu połączenia tych, które przedstawiały ten sam rozkład prążków na elektroforogramie analitycznym. Ogółem zebrano 15 spulowanych frakcji, które analizowano w elektroforezie w warunkach denaturujących. Preparaty białek faga T4 zebrane po rozdziale w elektroforezie preparatywnej dializowano do wody, liofilizowano i rozpuszczano w 1 ml wody mili Q i oznaczono stężenie białka. Białkowe frakcje analizowano w immunoblotingu z ludzkimi surowicami w celu określenia obecności immunoreaktywnych prążków białkowych i z kolei określenia przydatności odpowiedniej frakcji białkowej jako odczynnika diagnostycznego do immunochemicznego testu ELISA celem ilościowego oznaczania przeciwciał antyfagowych w płynach ustrojowych i preparatach biologicznych.
P r z y k ł a d 2
Izolacja białek faga T4 poprzez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy
W celu rozdziału poszczególnych białek faga T4 zastosowano również ultra wirowanie w gradiencie sacharozy, jako metody referencyjnej o znaczeniu tylko na skalę laboratoryjną.
W probówkach wirówkowych sporządzono skokowy gradient sacharozy: 40, 31,75, 22,5, 13,4 i 4% (w/v). Gradient sacharozy ustalał się przez noc w 4°C. Ilość oczyszczanego faga wynosiła 10 10
1,0 x 1010 pfu/ml w 1,5 ml, czyli 1,5 x 1010 cząstek faga, co stanowiło 1,08 mg białka całkowitego. Do dwóch probówek z sacharozą nawarstwiono po 0,75 ml preparatu fagowego i poddano ultrawirowaniu w ultrawirówce Beckmann L7-55 z rotorem 70Ti, przez 5 godzin, przy 50 000 obr/min, w 5°C. Zebrano 45 frakcji po 1 ml i dializowano je do wody. Analizowano frakcje metodą elektroforezy SDS-PAGE i zlano frakcje dające ten sam rozkład prążków w żelu. Ogółem zebrano 7 spulowanych frakcji po ultrawirowaniu. Analiza preparatów faga T4 uzyskanych po ultrawirowaniu w gradiencie sacharozy pozwoliła częściowo rozdzielić poszczególne białka fagowe. W uzyskanych preparatach białkowych oznaczono stężenie białka metodą Lowrego. Ponadto elektroforeza SDS-PAGE w warunkach denaturujących w 12,5% żelu nanoszonego 20 μg białka potwierdziła czystość faga i brak zanieczyszczeń w postaci białek bakteryjnych lub endotoksyny.
P r z y k ł a d 3
Immunobloting fagowych frakcji białkowych z surowicą ludzką.
Immunobloting wykonywano po elektroforezie SDS-PAGE z użyciem żelu trzymanego 15 minut w buforze do transferu. Membranę Immobilon-P moczono 15 sekund w 100% MeOH, 2 minuty w wodzie milli Q i 2 minuty w buforze do transferu. Transfer rozdzielonych białek fagowych prowadzono przez 1 h przy napięciu 100 V w aparacie do transferu [BioRad]. Membranę po transferze barwiono w Ponceau S, a następnie odbarwiono w wodzie milli Q do momentu całkowitego zaniku koloru różowego. Membranę suszono na bibule Whatman 1 i przechowywano. Suchą membranę moczono w 100% MeOH i płukano w wodzie milli Q, następnie blokowano 1% BSA w buforze TBS-T (5 ml) (TBS + 0,05% Tween 20 z 0,5 ml 1% BSA) w 37°C przez 1 h, po czym membranę (Immobilon-P) płukano buforem TBS-T 1 x 15 minut i 2 x 5 minut. Następnie Immobilon-P inkubowano z roztworem spulowanej ludzkiej surowicy rozcieńczonej 250 x (5 ml TBS-T z 1% BSA + 20 μΐ surowicy). Pierwsza faza inkubacji przebiegała w 37°C przez 1 h z wytrząsaniem, a następnie w 4°C przez noc. Niezwiązane przeciwciała odmywano buforem TBS-T (raz przez 15 minut i 2 razy po 5 minut). Przygotowano roztwór kozich przeciwciał anty-ludzkie IgG znakowanych fosfatazą zasadową (0,5 μΐ przeciwciał w 10 ml TBS-T z 1% BSA) i inkubowano w nim membranę w temp. 37°C, przez 1 h. Nadmiar przeciwciał odmyto buforem TBS. Obraz wywoływano w roztworze 5 ml buforu TBS-Mg2+ z 50 μl BCIP (30 mg/ml w 70% DMF) i 50 μl NBT (15 mg/ml w 100% DMF).
PL 212 796 B1
P r z y k ł a d 4
Oznaczanie poziomu przeciwciał anty fagowych w surowicy ludzkiej.
Poziom przeciwciał antyfagowych w surowicy lub osoczu krwi ludzkiej oznaczano w teście ELISA, na płytkach opłaszczonych preparatem oczyszczonego faga poliwalentnego lub frakcji białkowej zawierającej białka immunoreaktywne. W celu uniknięcia reakcji krzyżowych, każda próbka sprawdzana była w reakcji z samym białkiem bez surowicy lub z samą surowicą, po czym odejmowano wartości kontrolne. Płytki opłaszczano preparatem fagowym T4 lub frakcją pochodną zawierającą białka immunoreaktywne (1 μg/dołek, 2,7 x 104 pfu/dołek, w buforze węglanowym o pH 9,6). Płytkę blokowano i płukano trzykrotnie przy pomocy TBS-T (245 μΙ/dołek). Surowicę ludzką rozcieńczoną 250 razy, nakładano po 100 μΐ na dołek w 4 powtórzeniach i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odpłukano niezwiązane do płytki przeciwciała (3 x 245 μl TBS-T/dołek) i nakładano po 100 μl/dołek koniugatu kozich przeciwciał anty-ludzkie IgG skoniugowane z alkaliczną fosfatazą (1:30 000). Płytkę inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej, po czym płukano trzykrotnie przy pomocy TBS-T (245 μl/dołek). Dodano substratu dla alkalicznej fosfatazy (p-nitrophenyl-disodiumphosphate) w stężeniu 1 mg/ml w buforze węglanowym z jonami magnezu i chloru. Nanoszono po 100 μl na dołek, czyli 100 μg substratu. Reakcję zatrzymywano przez dodanie wody mili Q. Intensywność reakcji mierzono przez pomiar absorpcji w 405 nm przy pomocy czytnika do płytek Opsys MR (Dynex Technologies). Poziom przeciwciał anty-fag w surowicy pacjentów wyrażano, jako średnia absorpcja próbki przy 405 nm po odjęciu średniej absorpcji przy 405 nm, dla próbki w dołkach kontrolnych.
Źródła
1. Kucharewicz-Krukowska A., Ślopek S. (1987): Immunogenic effect of bacteriophage in patients subjected to phage therapy. Arch. Immunol. Ther. Exp. 35: 553-561
2. Sulakvelidze A., Morris J.G. (2001): Bacteriophages as therapeutic agents. Ann Med. 33(8):507-509
3. Zaremba M. L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska, Warszawa (1997) Wydawnictwo Lekarskie PZWL
4. Ross F. C.: Introductory Microbiology, (1983), Merril C. E. Publishing Co., A. Bell and Howell Company
5. Loeffler J.M., Nelson D., Fischetti V.A. (2001): Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with bacteriophage cell wall hydrolase. Science 294 (5549): 2170-2172
6. Carlton R. M. (1999): Phage therapy: past history and future prospects. Arch. Immunol. Ther. Exp., 47, 267-274
7. Merril CR., Biswas B., Carlton R., Jensen NC., Creed GJ., Zullo S. and Adhya S. (1996): Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3188-3192
8. Górski A., Weber-Dąbrowska B., The potential role of endogenous bacteriophages in controlling invading pathogens, Cellular Molec. Life Sci., 62, 2005, 511-519.
9. Lipiński T., Gamian A., Zuziak E., Korzeniowska-Kowal A., Górski A., “Oczyszczony preparat bakteriofagowy, sposób jego otrzymywania i zastosowania” zgłoszenie patentowe P 381 730.
10. Sundberg L., Hoglund S., Purification of T4 phage by adsorption on polylysine agarose, FEBS Letters, 37, (1), 1973, 70-73.
11. Hedstrom S.A., Kamme C. (1973) Antibodies against staphylococcal bacteriophages in human sera. Acta Path. Microbiol. Scand. Section B. 81,749-752
12. Ślopek S., Durlakowa I., Weber-Dąbrowska B., Kucharewicz-Krukowska A., Dąbrowski M., Bisikiewicz R. (1981) Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections I. General evaluation of the results. Arch. Immunol. Ther. Exp. 31:267-291.
13. Ślopek S., Weber-Dąbrowska B., Dąbrowski M. and Kucharewicz-Krukowska A. (1987) Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections in the years 1981-1986. Arch. Immunol. Ther. Exp. 35:569-583.
14. Lindberg A.A. Bacterial surface carbohydrates and bacteriophage adsorption, W: Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell, Sutherland L. ed., Acad. Press, London, 1977, 289-356.
Claims (5)
1. Diagnostyczny preparat immunologiczny, znamienny tym, że zawiera faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymane z niego oczyszczone z białek bakteryjnych immunoreaktywne białka fagowe.
2. Diagnostyczny preparat immunologiczny według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane białka immunoreaktywne wykazują immunorektywność w immunoblotingu z surowicą ludzką, osoczem ludzkim lub innymi płynami ustrojowymi.
3. Diagnostyczny preparat immunologiczny według zastrz. 1, znamienny tym, że fag jest fagiem poliwalentnym.
4. Zastosowanie faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymanych z niego immunoreaktywnych białek fagowych oczyszczonych z białek bakteryjnych do wytwarzania preparatu diagnostycznego do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych.
5. Zastosowanie, według zastrz. 4, znamienne tym, że diagnostyczny preparat immunologiczny stosuje się do testów immunochemicznych obejmujących test ELISA i służy do wykrywania i/lub oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych w surowicy, osoczu i innych płynach ustro-
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL386483A PL212796B1 (pl) | 2008-11-07 | 2008-11-07 | Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie |
| PCT/PL2009/050033 WO2010053390A1 (en) | 2008-11-07 | 2009-11-07 | Diagnostic immunological preparation and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL386483A PL212796B1 (pl) | 2008-11-07 | 2008-11-07 | Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL386483A1 PL386483A1 (pl) | 2010-05-10 |
| PL212796B1 true PL212796B1 (pl) | 2012-11-30 |
Family
ID=41735413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL386483A PL212796B1 (pl) | 2008-11-07 | 2008-11-07 | Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL212796B1 (pl) |
| WO (1) | WO2010053390A1 (pl) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9803993D0 (sv) * | 1998-11-23 | 1998-11-23 | Bjoern Carlsson | New reagent and use thereof |
| US7306925B2 (en) * | 2001-11-09 | 2007-12-11 | Vanderbilt University | Phage antibodies to radiation-inducible neoantigens |
| FI20060946A0 (fi) * | 2006-10-26 | 2006-10-26 | Glykos Finland Oy | Influenssaviruksen nukleiinihappoja ja peptidejä |
| PL212099B1 (pl) * | 2007-02-09 | 2012-08-31 | Inst Immunologii I Terapii Doświadczalnej Pan | Oczyszczony preparat bakteriofagowy, sposób jego otrzymywania i zastosowanie |
-
2008
- 2008-11-07 PL PL386483A patent/PL212796B1/pl unknown
-
2009
- 2009-11-07 WO PCT/PL2009/050033 patent/WO2010053390A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010053390A1 (en) | 2010-05-14 |
| PL386483A1 (pl) | 2010-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yu et al. | Sensitive and rapid detection of Staphylococcus aureus in milk via cell binding domain of lysin | |
| EP2117568B1 (en) | Purified bacteriophage, its preparation and application | |
| Diallo et al. | Recent developments in the diagnosis of rinderpest and peste des petits ruminants | |
| JP2770877B2 (ja) | ヘモフィラス・インフルエンザワクチン | |
| Liu et al. | Comparative research on nucleocapsid and spike glycoprotein as the rapid immunodetection targets of COVID-19 and establishment of immunoassay strips | |
| CN106432440B (zh) | 羊布鲁氏菌抗体ppa-elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
| JP2012514453A (ja) | 高速生物発光検出システム | |
| US9063141B2 (en) | Listeria bacteriophage tailspike protein and uses thereof | |
| Thongsukkaeng et al. | Development and evaluation of latex agglutination test coating with recombinant antigen, LipL32 for serodiagnosis of human leptospirosis | |
| KR20210106181A (ko) | 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염 진단을 위한 항원 단백질 조성물 및 이의 용도 | |
| Gupta et al. | Comparative evaluation of recombinant BP26 protein for serological diagnosis of Brucella melitensis infection in goats | |
| Yang et al. | A phage-displayed single domain antibody fused to alkaline phosphatase for detection of porcine circovirus type 2 | |
| Sinha et al. | Antioxidant potentials of Parthenium hysterophorus L. leaf extracts | |
| JP6676464B2 (ja) | クラミジア・ニューモニエを検出する方法及びキット | |
| PL212796B1 (pl) | Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie | |
| Ehricht et al. | Application of protein arraytubes to bacteria, toxin, and biological warfare agent detection | |
| Tsang et al. | Immunochemical characterization of a haemagglutinating antigen of Arcobacter spp. | |
| CN111458498A (zh) | 一种手足口ev71抗原检测试剂盒 | |
| JPH11346768A (ja) | イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質の抗原性を有する蛋白質及び抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬 | |
| CN100519759C (zh) | 一种制备用于快速检测伤寒的凝集试剂的方法 | |
| Seleim et al. | ELISA and other tests in the diagnosis of Pasteurella multocida infection in camels | |
| Chen et al. | Use of LPS Extracts to Validate Phage Oligopeptide That Binds All Salmonella enterica Serovars | |
| Taş et al. | Evaluation of Oxidative Stress Parameters in Leptospira Infected Sheep | |
| EP1575520A2 (en) | A process for preparation of an agglutination reagent for rapid detection of typhoid | |
| Lyubavina et al. | Methods of express analysis of staphylococcal enterotoxin a in food products |