PL212796B1 - Diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny preparat immunologiczny do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych, charakteryzujący się tym, że zawiera poliwalentnego oczyszczonego z białek bakteryjnych faga lub oczyszczony z białek bakteryjnych zespół białek fagowych, który to zespół zawiera białka immunoreaktywne, korzystnie w immunoblotingu z surowicą ludzką, osoczem lub innymi płynami ustrojowymi oraz zastosowanie preparatu do testów immunochemicznych, przykładowo testu ELISA.

Description

Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny preparat immunologiczny oraz jego zastosowanie do wykrywania i/lub oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych. Preparat ma szerokie zastosowanie w badaniu patogenezy chorób zakaźnych i w terapii fagowej.

Wzrost zainteresowania terapią bakteriofagami lub białkami izolowanymi z fagów jest związany z wykazaną ich skutecznością w zwalczaniu zakażeń nie dających się leczyć antybiotykami [1,2]. Bakteriofagi mają szereg innych zalet w porównaniu do konwencjonalnych antybiotyków, głównie swoistość pozwalającą niszczyć bakterie patogenne bez zabijania bakterii symbiotycznych, przez co nie narusza się subtelnej równowagi mikrobiologicznej organizmu [1,3-6]. Stężenie bakteriofagów w płynach chorego organizmu nie maleje od momentu podania, lecz podlega samoregulacji, liczba fagów rośnie ekspotencjalnie w obecności bakterii i szybko spada w przypadku ich braku. Znacznie rzadziej obserwuje się selekcję opornych bakterii, co często ma miejsce w przypadku antybiotyków; ponadto w przypadku wystąpienia oporności na danego faga u danej bakterii można dobrać innego faga zdolnego infekować oporną bakterię. Wreszcie mogą być stosowane równolegle z antybiotykami w terapii kombinowanej. Bakteriofagi stanowią naturalny czynnik regulujący liczebność populacji bakteryjnych w przyrodzie. Prawdopodobnie dla każdej bakterii istnieje swoisty fag, zdolny ją zakażać, jednak szczególnie interesujące są tzw. fagi wieloważne, czyli poliwalentne, swoiste dla szerokiego spektrum bakterii. Wprowadzenie terapii fagami do powszechnego zastosowania w lecznictwie wymaga opracowania metod szybkiego, skutecznego typowania odpowiednich fagów, monitorowania przebiegu namnażania fagów i penetracji przez nie ludzkiego organizmu, uwalniania przez niszczone bakterie toksyn mogących powodować wstrząs septyczny i usuwania fagów z organizmu oraz analizy obecności przeciwciał przeciwfagowych [7,8].

Podczas prób klinicznych obserwowano obecność przeciwciał antyfagowych przed rozpoczęciem leczenia fagami [1,11-13]. Dane te jednak nie były jednoznaczne ze względu na brak wówczas metod oczyszczania i analizy stopnia czystości preparatów fagowych [1,11-13]. Terapia niektórych pacjentów była nieskuteczna, co mogło wynikać z obecności w zakażających bakteriach fagów lizogennych, jednocześnie zdolnych do indukcji przeciwciał [11], Obecność takich przeciwciał może mieć istotne znaczenie dla przebiegu choroby i skuteczności terapii fagowej. W przypadku wystąpienia tych samych determinant antygenowych u zastosowanego w leczeniu faga litycznego, co u faga lizogennego, który wywołał immunizację u danego pacjenta, oczekiwany efekt terapeutyczny może nie zostać osiągnięty. Ponieważ w przypadku fagów mamy do czynienia z antygenami białkowymi, jednorazowa immunizacja danym fagiem, np. w wyniku przebytej choroby o bakteryjnym podłożu, może wywołać długotrwałą odpowiedź. Należy też wziąć pod uwagę to, że fagi lityczne mogą w naturalny sposób odpowiadać za przypadki ozdrowienia z zakażeń bakteryjnych. W takim wypadku obecność przeciwciał antyfagowych w surowicy może być również skutkiem przebytej choroby, jednakże brakuje danych literaturowych analizujących te zagadnienia.

W zgłoszeniu patentowym P 381 730 opracowano procedury wydajnego namnażania bakteriofagów i ich dokładnego oczyszczania, co pozwoliło uzyskiwać duże ilości czystych fagów o wysokim mianie aktywności, bez zanieczyszczeń endotoksynami i innymi składnikami bakteryjnymi, uniemożliwiających szereg aplikacji [9]. Dalsze badania doprowadziły do oryginalnych obserwacji będących przedmiotem niniejszego zgłoszenia, które dotyczą diagnostycznego preparatu i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych z użyciem specyficznego testu immunochemicznego. Celem wynalazku jest dostarczenie swoistego preparatu diagnostycznego do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych, który dzięki swojej formule pozbawiony jest wad istniejących w stanie techniki i pozwala tym sposobem na skuteczną diagnostykę i przeprowadzenie efektywnej terapii fagowej. Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny preparat immunologiczny, charakteryzujący się tym, że zawiera faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymane z niego oczyszczone z białek bakteryjnych immunoreaktywne białka fagowe.

Korzystnie, wspomniane białka immunoreaktywne wykazują immunorektywność w immunoblotingu z surowicą ludzką, osoczem ludzkim lub innymi płynami ustrojowymi.

PL 212 796 B1

Bardziej korzystnie, fag jest fagiem poliwalentnym.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymanych z niego immunoreaktywnych białek fagowych oczyszczonych z białek bakteryjnych do wytwarzania preparatu diagnostycznego do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych. Korzystnie, diagnostyczny preparat immunologiczny stosuje się do testów immunochemicznych obejmujących test ELISA i służy do wykrywania i/lub oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych w surowicy, osoczu i innych płynach ustrojowych.

Bakteriofagi posiadają kilka do kilkunastu rodzajów białek tworzących osłonkę, czyli kapsyd. Białka fagowe tworzą struktury morfologiczne pozwalające wyróżnić takie elementy faga jak głowa, ogonek, płytka adhezyjna, witki itd. [3,4]. Niektóre z tych białek wykazują aktywność enzymatyczną np. konieczną do rozpuszczenia ściany bakteryjnej czy otoczki. Zatem niektóre, oczyszczone białka faga są również potencjalnym czynnikiem bakteriobójczym [5], zwłaszcza fagów poliwalentnych o szerokiej swoistości. Fagi poliwalentne rozpoznają receptory wspólne dla większej grupy szczepów bakteryjnych, takie jak kwasy tejchojowe, peptydoglikan, część wspólna rdzeniowa endotoksyn, kwas kolominowy i inne struktury powierzchniowe [14]. Badania według wynalazku wykazały, że poziom przeciwciał przeciwfagowych w surowicy jest znacznie niższy niż przeciwbakteryjnych, dlatego śladowe zanieczyszczenia białkami bakteryjnymi są przyczyną znacznego błędu oznaczeń. Wobec tego do oznaczania przeciwciał przeciwfagowych konieczne są czyste fagi, czy najkorzystniej otrzymane z nich białka lub frakcje białek immunogennych. W celu analizy ich czystości proponuje się kompleksowe użycie SDS-PAGE, immunoblotingu i LAL/GLC-MS do analizy czystości frakcji białkowych jako antygenów do testu. Badania wykazały ponadto, że indywidualne surowice ludzkie immunoreaktywne rozpoznają kilka do kilkunastu różnych białek danego faga, zazwyczaj nie białek głównych, tworząc kilka wzorów reaktywności. Dlatego stosowanie jednego immunogennego białka faga jako antygenu jest niewłaściwe, gdyż należy używać zestawu białek fagowych jako antygenu do testu. Znane są rozwiązania wykrywające i stosujące jeden peptyd lub przeciwciało swoiste, np. dla Chlamydia, jednak mają one szereg ograniczeń, poza wzmiankowanym, takie rozwiązanie jest możliwe tylko dla wysoce swoistego układu jednego patogenu, pod warunkiem dysponowania specyficznym dla tego faga peptydem i nie dotyczy fagów wieloważnych. Wyniki dalszych badań, z zastosowaniem przeciwciał przeciwfagowych użytych jako standard, otrzymanych w chromatografii powinowactwa na immobilizowanych czystych białkach fagowych, wskazały na obecność reaktywności krzyżowych przeciwciał przeciwfagowych, co oznacza konieczność kontrolowanego doboru immunoreaktywnych frakcji białek fagowych jako antygenów i niezbędnej standaryzacji testów na oznaczanie przeciwciał przeciwfagowych, co jest kolejnym nowym elementem naszego rozwiązania i potwierdza konieczność zastosowania w preparacie zespołów (frakcji) białek fagowych. Tak więc rozwiązanie testu polega na użyciu jako antygenu frakcji immunogennych białek pochodzących z czystego faga, użyciu proponowanych w niniejszym rozwiązaniu kryteriów czystości faga oraz oparciu testu i jego wystandaryzowaniu na przeciwciałach referencyjnych otrzymanych docelowo do danego testu.

W pierwszym etapie otrzymano oczyszczone preparaty fagowe według znanych metod, jak z użyciem detergentu i membran ultrafiltracyjnych [9] lub w przypadku, kiedy detergent inaktywuje bakteriofaga, na kolumnie powinowactwa z immobilizowaną polilizyną [10], Uzyskanie dużych ilości cząstek fagowych pozwala na rozdzielenie ich poszczególnych składników białkowych. Dalej, uzyskane dane w teście immunoblotingu z ludzkimi surowicami pozwoliły na opracowanie testów ELISA, służących do ilościowego monitorowania stopnia immunizacji przeciwko bakteriofagom. W związku z zaobserwowaną przez nas obecnością w surowicy ludzkiej przeciwciał na te składniki, konieczne jest dokładne i powtarzalne oczyszczanie cząstek bakteriofaga celem uzyskania wiarygodnych wyników ich analiz.

Niniejszy wynalazek oparto na wynikach badań trzech fagów wieloważnych [14]: 1) swoistego dla wielu serotypów E. coli faga K1, gdyż kwas kolominowy stanowiący antygen K1 występuje z wieloma O-antygenami E. coli często notowanymi w raportach epidemiologicznych, równocześnie dogodnego do eksperymentów ułatwiając opracowanie metod i testów, 2) faga wieloważnego T4, zdolnego zakażać szerokie spektrum szczepów E. coli, Shigella i Salmonella, gdyż jego receptorem jest konserwatywna domena w enterobakteryjnej endotoksynie, stosunkowo często typowanego w prowadzonej terapii eksperymentalnej, oraz 3) faga poliwalentnego Hafnia alvei, swoistego dla całego rodzaju Hafnia. Bakterie te są częstą przyczyną wielu schorzeń.

PL 212 796 B1

Czystość preparatu diagnostycznego według wynalazku mierzy się metodami chromatograficznymi, w elektroforezie SDS-PAGE, testami na zawartość endotoksyn i składników ściany bakteryjnej, jak testem LAL i metodami analiz chemicznych przy pomocy systemu GLC-MS. Immunoreaktywne białko fagowe stosowane w preparacie według wynalazku izoluje się na przykład metodą elektroforezy preparatywnej w obecności siarczanu dodecylu. Preparat diagnostyczny według wynalazku stosuje się do testu immunologicznego celem wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał surowiczych antyfagowych poliwalentnych, które odgrywają istotną rolę w patogenezie chorób zakaźnych.

W celu przygotowania preparatu diagnostycznego według wynalazku izoluje się określone frakcje białek fagowych, jak też wykorzystuje się całego oczyszczonego faga, do ilościowego testu immunoenzymatycznego ELISA celem oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych. Uzyskane z fagów frakcje białkowe analizowano przy pomocy spulowanej surowicy ludzkiej w immunoblotingu, by do standaryzacji testu ELISA wybrać frakcje immunoreaktywne. Elektroforeza SDS-PAGE w warunkach denaturujących połączona z immunoblotingiem posłużyła do ustalenia, które z białek fagowych reagują z przeciwciałami obecnymi w surowicy. Nieoczekiwanie preparaty pełnego faga były równie dobrymi antygenami służącymi do wykrywania przeciwciał antyfagowych i nie ustępowały oczyszczonym frakcjom białkowym. Jednakże frakcje białkowe stanowią preparaty o zdefiniowanym składzie cząsteczkowym i łatwiejszym do określenia stopniu czystości. Z kolei cały fag stanowi pełny zestaw antygenowy i może być niezbędny do wstępnego zobrazowania i oceny kompletnej odpowiedzi organizmu na danego faga, co często obserwowano w prowadzonych badaniach. Oczyszczanie białek prowadzono także za pomocą rutynowych technik chromatograficznych jak sitowa, jonowymienna, oddziaływań hydrofobowych, jednak elektroforeza preparatywna okazała się korzystnie najwygodniejsza. Niniejszy wynalazek wykorzystuje izolację antygenów fagowych i ich pochodnych białkowych do uzyskania preparatów diagnostycznych do testu ilościowego dla oznaczania przeciwciał antyfagowych w surowicy, osoczu i innych płynach ustrojowych. Analiza antygenów fagowych dotyczyła wpierw testu immunoblotingu z surowicą ludzką, aby określić immunoreaktywność otrzymanych frakcji białkowych (przykład 3), porównując je z frakcjami otrzymanymi inną metodą, mianowicie ultrawirowaniem w gradiencie sacharozy (przykład 2). Oczyszczone białka reagujące z przeciwciałami wykorzystane w teście ELISA służą do analiz ilościowych próbek surowicy ludzkiej. Opracowano ilościowy test ELISA, w którym oczyszczone fagi poliwalentne albo oczyszczone lub sklonowane białka jako antygeny reagujące z przeciwciałami są wykorzystane do analiz poziomu przeciwciał antyfagowych.

Zastosowanie białek fagowych do testu pozwoliło po raz pierwszy wykryć przeciwciała antyfagowe w surowicy, gdyż uprzednie dane [1,11-13] nie były jednoznaczne ze względu na brak metod oczyszczania i analizy stopnia czystości preparatów fagowych. Białka fagowe otrzymywane w niniejszym wynalazku można użyć w szeregu innych aplikacji, w biotechnologii i medycynie. Podkreślić należy korzystne wprowadzenie testu do oznaczania przeciwciał wobec fagów poliwalentnych, który nadaje się do monitorowania przeciwciał antyfagowych przed, w trakcie i po terapii fagowej, co będzie możliwe dzięki zaproponowaniu nowego podejścia i niniejszym rozwiązaniom. Dysponowanie metodą analizy ilościowej aktywności antyfagowej, proponowane w niniejszym wynalazku, może posłużyć także do wdrożenia norm analizy preparatów krwiopochodnych. Metoda analizy przeciwciał posłuży do monitorowania i prognozowania efektów terapeutycznych, jako ważny czynnik prognostyczny. Wysoki poziom aktywności antyfagowej u osób zdrowych i chorych pozwala ocenić, które z badanych fagów najczęściej wywołują taką odpowiedź, oraz mogą wskazać na relację między odpowiedzią antyfagową i jednostką chorobową, co może być w przyszłości przydatne w doborze odpowiednich fagów do terapii. Uzyskiwanie nowych, przydatnych terapeutycznie szczepów fagowych, a także przygotowanie preparatów leczniczych jest wielokrotnie tańsze niż poszukiwanie nowych antybiotyków oraz terapia nimi. Rozwiązania proponowane w niniejszym wynalazku są proste, nie wymagają kosztownych odczynników, oparte są na trzech różnych preparatach, dlatego mają zastosowanie dla szerszego zakresu fagów poliwalentnych. Fagi bardzo specyficzne mają znikomą wartość ze względu na dużą zmienność szczepów, natomiast fagi poliwalentne mają wysoką wartość ze względu na ich obecność w przyrodzie, w organizmach żywych. Z tego też wynika obserwowana w naszych badaniach obecność przeciwciał przeciwko fagom poliwalentnym w populacji ludzkiej. Ze względu na znaczenie kliniczne tych przeciwciał, należy podkreślić wartość praktyczną preparatu diagnostycznego będącego przedmiotem niniejszego wynalazku.

Niniejszy wynalazek przedstawiono w przykładach nie ograniczających jego zakresu ochrony.

PL 212 796 B1

P r z y k ł a d 1

Elektroforeza preparatywna białek faga T4

Izolację białek faga T4 przeprowadzano z użyciem elektroforezy preparatywnej w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS (od góry 2 cm 5% żelu zagęszczającego, 4 cm 8% żelu rozdzielającego i 6 cm 10% żelu rozdzielającego) w warunkach denaturujących. Elektroforezę prowadzi się przy pomocy aparatu Pep Cell model 491 (Bio Rad), w tubie o średnicy 37 mm i 12 cm długości żelu. Żel rozdzielający i zagęszczający wylano i tubę z żelem pozostawiono w 4°C przez noc. Na żel nanoszono preparat białkowy faga T4 oczyszczanego metodą PDL [9] zawierający 25 mg białka całkowitego. Zliofilizowany preparat do rozdziału rozpuszczono w 1 ml buforu do denaturacji białek i gotowano przez 15 minut. Po naniesieniu preparatu prowadzono elektroforezę przez dobę przy odpowiednim natężeniu prądu. Zbierano 1,5 ml frakcje z przepływem 1 ml/1,5 minuty. Po 10 godzinach natężenie zmieniono z 40 mA/257V na 74mA/300V. Białko eluowano wodą i zebrano 280 frakcji. Do analizy pobrano co czwartą frakcję w celu połączenia tych, które przedstawiały ten sam rozkład prążków na elektroforogramie analitycznym. Ogółem zebrano 15 spulowanych frakcji, które analizowano w elektroforezie w warunkach denaturujących. Preparaty białek faga T4 zebrane po rozdziale w elektroforezie preparatywnej dializowano do wody, liofilizowano i rozpuszczano w 1 ml wody mili Q i oznaczono stężenie białka. Białkowe frakcje analizowano w immunoblotingu z ludzkimi surowicami w celu określenia obecności immunoreaktywnych prążków białkowych i z kolei określenia przydatności odpowiedniej frakcji białkowej jako odczynnika diagnostycznego do immunochemicznego testu ELISA celem ilościowego oznaczania przeciwciał antyfagowych w płynach ustrojowych i preparatach biologicznych.

P r z y k ł a d 2

Izolacja białek faga T4 poprzez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy

W celu rozdziału poszczególnych białek faga T4 zastosowano również ultra wirowanie w gradiencie sacharozy, jako metody referencyjnej o znaczeniu tylko na skalę laboratoryjną.

W probówkach wirówkowych sporządzono skokowy gradient sacharozy: 40, 31,75, 22,5, 13,4 i 4% (w/v). Gradient sacharozy ustalał się przez noc w 4°C. Ilość oczyszczanego faga wynosiła 10 10

1,0 x 10¹⁰ pfu/ml w 1,5 ml, czyli 1,5 x 10¹⁰ cząstek faga, co stanowiło 1,08 mg białka całkowitego. Do dwóch probówek z sacharozą nawarstwiono po 0,75 ml preparatu fagowego i poddano ultrawirowaniu w ultrawirówce Beckmann L7-55 z rotorem 70Ti, przez 5 godzin, przy 50 000 obr/min, w 5°C. Zebrano 45 frakcji po 1 ml i dializowano je do wody. Analizowano frakcje metodą elektroforezy SDS-PAGE i zlano frakcje dające ten sam rozkład prążków w żelu. Ogółem zebrano 7 spulowanych frakcji po ultrawirowaniu. Analiza preparatów faga T4 uzyskanych po ultrawirowaniu w gradiencie sacharozy pozwoliła częściowo rozdzielić poszczególne białka fagowe. W uzyskanych preparatach białkowych oznaczono stężenie białka metodą Lowrego. Ponadto elektroforeza SDS-PAGE w warunkach denaturujących w 12,5% żelu nanoszonego 20 μg białka potwierdziła czystość faga i brak zanieczyszczeń w postaci białek bakteryjnych lub endotoksyny.

P r z y k ł a d 3

Immunobloting fagowych frakcji białkowych z surowicą ludzką.

Immunobloting wykonywano po elektroforezie SDS-PAGE z użyciem żelu trzymanego 15 minut w buforze do transferu. Membranę Immobilon-P moczono 15 sekund w 100% MeOH, 2 minuty w wodzie milli Q i 2 minuty w buforze do transferu. Transfer rozdzielonych białek fagowych prowadzono przez 1 h przy napięciu 100 V w aparacie do transferu [BioRad]. Membranę po transferze barwiono w Ponceau S, a następnie odbarwiono w wodzie milli Q do momentu całkowitego zaniku koloru różowego. Membranę suszono na bibule Whatman 1 i przechowywano. Suchą membranę moczono w 100% MeOH i płukano w wodzie milli Q, następnie blokowano 1% BSA w buforze TBS-T (5 ml) (TBS + 0,05% Tween 20 z 0,5 ml 1% BSA) w 37°C przez 1 h, po czym membranę (Immobilon-P) płukano buforem TBS-T 1 x 15 minut i 2 x 5 minut. Następnie Immobilon-P inkubowano z roztworem spulowanej ludzkiej surowicy rozcieńczonej 250 x (5 ml TBS-T z 1% BSA + 20 μΐ surowicy). Pierwsza faza inkubacji przebiegała w 37°C przez 1 h z wytrząsaniem, a następnie w 4°C przez noc. Niezwiązane przeciwciała odmywano buforem TBS-T (raz przez 15 minut i 2 razy po 5 minut). Przygotowano roztwór kozich przeciwciał anty-ludzkie IgG znakowanych fosfatazą zasadową (0,5 μΐ przeciwciał w 10 ml TBS-T z 1% BSA) i inkubowano w nim membranę w temp. 37°C, przez 1 h. Nadmiar przeciwciał odmyto buforem TBS. Obraz wywoływano w roztworze 5 ml buforu TBS-Mg²+ z 50 μl BCIP (30 mg/ml w 70% DMF) i 50 μl NBT (15 mg/ml w 100% DMF).

PL 212 796 B1

P r z y k ł a d 4

Oznaczanie poziomu przeciwciał anty fagowych w surowicy ludzkiej.

Poziom przeciwciał antyfagowych w surowicy lub osoczu krwi ludzkiej oznaczano w teście ELISA, na płytkach opłaszczonych preparatem oczyszczonego faga poliwalentnego lub frakcji białkowej zawierającej białka immunoreaktywne. W celu uniknięcia reakcji krzyżowych, każda próbka sprawdzana była w reakcji z samym białkiem bez surowicy lub z samą surowicą, po czym odejmowano wartości kontrolne. Płytki opłaszczano preparatem fagowym T4 lub frakcją pochodną zawierającą białka immunoreaktywne (1 μg/dołek, 2,7 x 10⁴ pfu/dołek, w buforze węglanowym o pH 9,6). Płytkę blokowano i płukano trzykrotnie przy pomocy TBS-T (245 μΙ/dołek). Surowicę ludzką rozcieńczoną 250 razy, nakładano po 100 μΐ na dołek w 4 powtórzeniach i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odpłukano niezwiązane do płytki przeciwciała (3 x 245 μl TBS-T/dołek) i nakładano po 100 μl/dołek koniugatu kozich przeciwciał anty-ludzkie IgG skoniugowane z alkaliczną fosfatazą (1:30 000). Płytkę inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej, po czym płukano trzykrotnie przy pomocy TBS-T (245 μl/dołek). Dodano substratu dla alkalicznej fosfatazy (p-nitrophenyl-disodiumphosphate) w stężeniu 1 mg/ml w buforze węglanowym z jonami magnezu i chloru. Nanoszono po 100 μl na dołek, czyli 100 μg substratu. Reakcję zatrzymywano przez dodanie wody mili Q. Intensywność reakcji mierzono przez pomiar absorpcji w 405 nm przy pomocy czytnika do płytek Opsys MR (Dynex Technologies). Poziom przeciwciał anty-fag w surowicy pacjentów wyrażano, jako średnia absorpcja próbki przy 405 nm po odjęciu średniej absorpcji przy 405 nm, dla próbki w dołkach kontrolnych.

Źródła

1. Kucharewicz-Krukowska A., Ślopek S. (1987): Immunogenic effect of bacteriophage in patients subjected to phage therapy. Arch. Immunol. Ther. Exp. 35: 553-561

2. Sulakvelidze A., Morris J.G. (2001): Bacteriophages as therapeutic agents. Ann Med. 33(8):507-509

3. Zaremba M. L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska, Warszawa (1997) Wydawnictwo Lekarskie PZWL

4. Ross F. C.: Introductory Microbiology, (1983), Merril C. E. Publishing Co., A. Bell and Howell Company

5. Loeffler J.M., Nelson D., Fischetti V.A. (2001): Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with bacteriophage cell wall hydrolase. Science 294 (5549): 2170-2172

6. Carlton R. M. (1999): Phage therapy: past history and future prospects. Arch. Immunol. Ther. Exp., 47, 267-274

7. Merril CR., Biswas B., Carlton R., Jensen NC., Creed GJ., Zullo S. and Adhya S. (1996): Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3188-3192

8. Górski A., Weber-Dąbrowska B., The potential role of endogenous bacteriophages in controlling invading pathogens, Cellular Molec. Life Sci., 62, 2005, 511-519.

9. Lipiński T., Gamian A., Zuziak E., Korzeniowska-Kowal A., Górski A., “Oczyszczony preparat bakteriofagowy, sposób jego otrzymywania i zastosowania” zgłoszenie patentowe P 381 730.

10. Sundberg L., Hoglund S., Purification of T4 phage by adsorption on polylysine agarose, FEBS Letters, 37, (1), 1973, 70-73.

11. Hedstrom S.A., Kamme C. (1973) Antibodies against staphylococcal bacteriophages in human sera. Acta Path. Microbiol. Scand. Section B. 81,749-752

12. Ślopek S., Durlakowa I., Weber-Dąbrowska B., Kucharewicz-Krukowska A., Dąbrowski M., Bisikiewicz R. (1981) Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections I. General evaluation of the results. Arch. Immunol. Ther. Exp. 31:267-291.

13. Ślopek S., Weber-Dąbrowska B., Dąbrowski M. and Kucharewicz-Krukowska A. (1987) Results of bacteriophage treatment of suppurative bacterial infections in the years 1981-1986. Arch. Immunol. Ther. Exp. 35:569-583.

14. Lindberg A.A. Bacterial surface carbohydrates and bacteriophage adsorption, W: Surface Carbohydrates of the Prokaryotic Cell, Sutherland L. ed., Acad. Press, London, 1977, 289-356.

Claims (5)

1. Diagnostyczny preparat immunologiczny, znamienny tym, że zawiera faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymane z niego oczyszczone z białek bakteryjnych immunoreaktywne białka fagowe.

2. Diagnostyczny preparat immunologiczny według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane białka immunoreaktywne wykazują immunorektywność w immunoblotingu z surowicą ludzką, osoczem ludzkim lub innymi płynami ustrojowymi.

3. Diagnostyczny preparat immunologiczny według zastrz. 1, znamienny tym, że fag jest fagiem poliwalentnym.

4. Zastosowanie faga oczyszczonego z białek bakteryjnych lub otrzymanych z niego immunoreaktywnych białek fagowych oczyszczonych z białek bakteryjnych do wytwarzania preparatu diagnostycznego do wykrywania i oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych.

5. Zastosowanie, według zastrz. 4, znamienne tym, że diagnostyczny preparat immunologiczny stosuje się do testów immunochemicznych obejmujących test ELISA i służy do wykrywania i/lub oznaczania poziomu przeciwciał antyfagowych poliwalentnych w surowicy, osoczu i innych płynach ustro-