PL212529B1 - Sposób otrzymywania preparatu o właściwościach antymikrobiologicznych z białka jajka kurzego - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu wykazującego właściwości zarówno bakteriobójcze/bakteriostatyczne, jak i grzybobójcze. Preparat otrzymany sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie jako konserwant produktów spożywczych oraz jako półprodukt do oczyszczania poszczególnych jego składników, zwłaszcza cystatyny i Iizozymu dla celów farmaceutycznych.

Powszechnie wiadomo, że proteinazy to bardzo liczna i zróżnicowana grupa enzymów powszechnie występujących zarówno w organizmach wyższych, jak i w mikroorganizmach i wirusach. Pełnią one kluczową rolę w wielu podstawowych procesach fizjologicznych. Ich aktywność nie ogranicza się jednak wyłącznie do funkcji regulatorowych, ale również decyduje o wirulentości wielu patogennych mikroorganizmów ludzi i zwierząt. Z uwagi na znaczenie w patologii oraz gospodarce enzymy proteolityczne, a wśród nich proteinazy sulfhydrylowe oraz serynowe są przedmiotem szczególnego zainteresowania zarówno klinicystów jak i technologów żywności. Uważa się, że funkcję regulatorów ich aktywności pełnią naturalne białkowe inhibitory występujące równie powszechnie, jak ich docelowe enzymy. Dla proteinaz tiolowych mocnymi inhibitorami ich aktywności są cystatyny, które obok aktywności antyproteolitycznej wykazują często również aktywność bakterio i grzybobójczą a dla proteinaz serynowych liczne inhibitory trypsyny i chymotrypsyny. Kolejnym białkiem o aktywności bakteriocydnej jest Iizozym hamujący wzrost zarówno Gram-dodatnich, jak i niektórych Gram-ujemnych bakterii i z tego powodu powszechnie stosowany w przemyśle spożywczym jako konserwant żywności, jak i w przemyśle farmaceutycznym.

Wymienione powyżej substancje o aktywnościach bakteriocydnych obecne są w białku jaja.

Ze stanu techniki znane są sposoby sporządzania preparatów o właściwościach antymikrobiologicznych. W zgłoszeniu patentowym P377369 ujawniono metodę wydzielania cystatyny z białka jaja wykorzystującą diafiltrację membranową rozcieńczonych roztworów białka. Zwiększenie efektywności procesu uzyskuje się poprzez obróbkę termiczną białka w obecności kwasu oraz jego dalsze oczyszczanie przez wysalanie. Dokument US4504583 opisuje metodę izolacji Iizozymu z białka jaja poprzez krystalizację. W opisie wynalazku US4552845 ujawniono sposób separacji preparatu Iizozymu z białka jaj posiadającego dwie frakcje: Iizozymu i albuminy. Lizozym jest oddzielany od frakcji z albuminą przez wykorzystanie powinowactwa tego enzymu do nośnika (np. żel agarozowy). Związany Iizozym jest następnie wymywany z nośnika.

Choć istnieje wiele metod pozyskiwania substancji o aktywnościach bakteriocydnych to zwykle są one czasochłonne i nastawione raczej na preparacje pojedynczych substancji.

W związku z powyższym celem wynalazku jest opracowanie szybkiej i efektywnej metody otrzymywania preparatu wykazującego właściwości zarówno bakteriobójcze/bakteriostatyczne jak i grzybobójcze.

Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu antymikrobiologicznego, w którym czynnikiem aktywnym preparatu jest mieszanka Iizozymu oraz inhibitorów proteinaz tiolowych i serynowych wydzielona z białka jaja, zwłaszcza kurzego, z zastosowaniem nowej metody preparacji polegającej na wybiórczej ekstrakcji substancji czynnych przy pomocy alkoholi jedno wodorotlenowych, korzystnie etanolu, w kwaśnym zakresie pH, korzystnie w pH 4,0. Sposób otrzymywania preparatu antymikrobiologicznego z białka jaja polega na tym, że białko jaja po rozcieńczeniu, korzystnie dwiema objętościami, 0,25% NaCI poddaje się krótkiej homogenizacji, a następnie zakwasza do pH 4,0, korzystnie 1 M kwasem octowym. Następnie, do roztworu białka dodaje się kroplami, przy stałym mieszaniu, równą objętość 60% etanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej, przez okres 1 do 6 godzin, korzystnie 4 godziny i wytrącone białka balastowe usuwa się przez wirowanie i/lub sączenie. Uzyskany supernatant zagęszcza się w wyparce próżniowej w temperaturze 30 do 60°C korzystnie do połowy objętości wyjściowej, alkalizuje do pH 7,2 do 7,4 i poddaje liofilizacji. Celem uzyskania preparatu wolnego od soli, roztwór przed suszeniem poddaje się dializie do wody przez błony o przepuszczalności granicznej poniżej 5 kDa w temperaturze korzystnie 4°C przez okres co najmniej 24 godzin z kilkukrotną zmianą wody, lub poddaje ultrafiltracji z użyciem modułów filtracyjnych o przepuszczalności granicznej 5 kDa.

Mając na uwadze uzyskanie preparatu zawierającego kilka substancji działających synergistycznie wobec mikroorganizmów, przedmiotem wynalazku jest propozycja nowego sposobu jego otrzymywania z naturalnego źródła jakim jest białko jaja kurzego. Białka jaj rozcieńcza się kilkukrotnie,

PL 212 529 B1 najkorzystniej dwiema objętościami 0,25% NaCI lub wody i homogenizuje przez 5 sekund przy niskich obrotach w homogenizatorze nożowym. Homogenat, po zgaszeniu piany, zakwasza się najkorzystniej do pH 4,0 przy pomocy kwasu, najkorzystniej 1 M kwasu octowego. Następnie do roztworu białka dodaje się kroplami, przy stałym mieszaniu, równą objętość 60% etanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej przez okres 1 do 6 godzin, korzystnie 4 godziny. Podczas stania tworzy się zawiesina białek balastowych, które usuwa się przez wirowanie (4200 obr/min, 15 min, 20°C) i/lub sączenie. Uzyskany supernatant zawierający około 70-90% aktywności cystatyny i całą aktywność lizozymu, dodatkowo sączy się przez bibułę filtracyjną i następnie zagęszcza się w wyparce próżniowej w temperaturze 30 do 60°C korzystnie do połowy objętości wyjściowej, celem usunięcia etanolu. Uzyskany roztwór, alkalizuje się do pH 6,0 do 8,0 korzystnie do pH 7,2 i poddaje liofilizacji. Celem uzyskania preparatu wolnego od soli, roztwór przed suszeniem poddaje się dializie do wody przez błony o przepuszczalności granicznej poniżej 5 kDa w temperaturze korzystnie 4°C przez okres co najmniej 24 godzin z kilkukrotną zmianą wody lub poddaje ultrafiltracji z użyciem modułów filtracyjnych o przepuszczalności granicznej 5 kD.

P r z y k ł a d 1

Do 150 ml białka jaj świeżych dodano 300 ml 0,25% roztworu NaCI. Roztwór po 5 sekundowej homogenizacji zakwaszono 1 M kwasem octowym do pH 4,0. Następnie do roztworu białka dodawano stopniowo, przy stałym mieszaniu, równą objętość 60% etanolu i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez okres 4 godzin. Wytrącone białka balastowe odwirowano (4200 obr./min, 15 min, 20°C). Uzyskany supernatant zawierający 91% aktywności cystatyny i całą aktywność Iizozymu, dodatkowo przesączono przez bibułę filtracyjną i następnie zagęszczono w wyparce próżniowej w temperaturze 30°C do około połowy objętości wyjściowej. Uzyskany roztwór zalkalizowano do pH 7,2 i poddano liofilizacji. Uzyskano 3,6 g preparatu.

P r z y k ł a d 2

Do 300 ml białka jaj uzyskanego z OVOPOLU dodano 600 ml 0,25% roztworu NaCI. Roztwór po 5 sekundowej homogenizacji zakwaszono 1 M kwasem octowym do pH 4,0. Następnie do roztworu białka dodawano stopniowo, przy stałym mieszaniu, równą objętość 60% etanolu i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez okres 4 godzin. Wytrącone białka balastowe odwirowano (4200 obr/ /min, 15 min, 20°C). Uzyskany supernatant zawierający 71% aktywności cystatyny i całą aktywność lizozymu, dodatkowo przesączono przez bibułę filtracyjną i następnie zagęszczono w wyparce próżniowej w temperaturze 30°C do około połowy objętości wyjściowej. Uzyskany roztwór zalkalizowano do pH 7,2 i poddano liofilizacji. Uzyskano 6,0 g preparatu.

P r z y k ł a d 3

Do 40 gramów Iiofilizatu białka jaj kurzych dodano 360 ml wody (w stosunku 1:9 w/v) i po 30 min. wolnego mieszania w temperaturze pokojowej do roztworu dodano 800 ml 0,25% roztworu NaCI. Roztwór po 5 sekundowej homogenizacji zakwaszono 1 M kwasem octowym do pH 4,0. Dalej postępowano jak w przykładzie 2. Uzyskano 7,6 g preparatu który zawierał około 70% aktywności wyjściowej cystatyny i prawie całą aktywność lizozymu.

P r z y k ł a d 4

Do 40 gramów suszonego przemysłowo białka (OVOPOL) niepasteryzowanego dodano 400 wody (1:10 w/v) i po 30 minutach wolnego mieszania w temperaturze pokojowej do roztworu dodano równą objętość 0,25% roztworu NaCI. Roztwór po 5 sekundowej homogenizacji zakwaszono 1 M kwasem octowym do pH 4,0 i dalej postępowano analogicznie do przykładu 2. Uzyskano 7,2 g preparatu zawierającego 72% aktywności inhibitorowej wykazanej w surowcu i ponad 90% aktywności litycznej.

P r z y k ł a d 5

Do 40 gramów suszonego przemysłowo białka (OVOPOL) po pasteryzacji dodano 400 wody (1:10 w/v) i po 30 minutach wolnego mieszania w temperaturze pokojowej do roztworu dodano równą objętość 0,25% roztworu NaCI. Roztwór po 5 sekundowej homogenizacji zakwaszono 1 M kwasem octowym do pH 4,0 i dalej postępowano jak w przykładzie 2. Uzyskano 7,0 g preparatu który zawierał 65% aktywności inhibitorowej i ponad 90% aktywności litycznej w stosunku do surowca.

Claims (4)

1. Sposób otrzymywania preparatu antymikrobiologicznego, w którym substancją czynną jest mieszanka lizozymu oraz inhibitorów proteinaz tiolowych i serynowych wydzielona z białka jaja, zwłaszcza kurzego, znamienny tym, że białko jaja po rozcieńczeniu roztworem soli poddaje się homogenizacji a następnie zakwasza do pH 4,0, po czym do roztworu białka dodaje się kroplami, przy stałym mieszaniu, równą objętość 60% etanolu i pozostawia w temperaturze pokojowej, przez okres 1 do 6 godzin, wytrącone białka balastowe usuwa się przez wirowanie i/lub sączenie, kolejno uzyskany supernatant zagęszcza się w temperaturze 30 do 60°C korzystnie do połowy objętości wyjściowej, alkalizuje do pH 7,2 do 7,4 i poddaje liofilizacji, roztwór przed suszeniem poddaje się dializie do wody przez błony o przepuszczalności granicznej poniżej 5 kDa w temperaturze korzystnie 4°C przez okres co najmniej 24 godzin z kilkukrotną zmianą wody, lub poddaje ultrafiltracji z użyciem modułów filtracyjnych o przepuszczalności granicznej 5 kDa.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko jaja rozcieńcza się dwiema objętościami 0,25% NaCI.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór białka zakwasza się 1 M kwasem octowym.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór białka po wkropleniu etanolu pozostawia się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.