PL211767B1

PL211767B1 - Sposób analizy strukturalnej fosfatydylocholiny

Info

Publication number: PL211767B1
Application number: PL387893A
Authority: PL
Inventors: Grzegorz Kiełbowicz; Witold Gładkowski; Paweł Mituła; Czesław Wawrzeńczyk
Original assignee: Univ Przyrodniczy We Wrocławiu
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2012-06-29

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób analizy fosfatydylocholiny, pod kątem składu kwasów tłuszczowych, z podziałem na pozycje sn-1 oraz sn-2.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym oraz kosmetycznym, w szeroko stosowanych precyzyjnych analizach fosfatydylocholiny,

Znanych jest kilka metod pozycyjnej analizy fosfatydylocholiny. Jedna z nich polega na enzymatycznej hydrolizie fosfatydylocholiny, za pomocą fosfolipazy A2, z jadu kobry królewskiej (Ophiophagus hannah). Produkty tej reakcji, to jest: 1-acylo-lizofosfatydylocholinę oraz wolne kwasy tłuszczowe uwolnione z pozycji sn-2 cząsteczki, rozdziela się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Kwasy tłuszczowe wchodzące w skład cząsteczki 1-acylo-lizofosfatydylocholiny przeprowadza się w estry metylowe w procesie transestryfikacji metanolanem sodu. Wolne kwasy tłuszczowe uwolnione w czasie reakcji enzymatycznej z pozycji sn-2, również estryfikuje się do estrów metylowych, za pomocą eterowego roztworu diazometanu i metanolu. Otrzymane estry kwasów tłuszczowych analizuje się za pomocą chromatografii gazowej (L. Cossignani, F. Santinelli, M. Rosi, M.S. Simonetti, F. Valfre, P. Damiani, Incorporation of n-3 PUFA into hen egg yolk lipids. II: Structural analysis of triacylglycerols, phosphatidylcholines and phosphatidylethanolamines Ital. J. Food Sci. n. 3, 1994).

W innej metodzie wykorzystuje się fosfolipazę A2 z jadu pszczoły, jako biokatalizator reakcji hydrolizy fosfatydylocholiny. Reakcja ta przebiega w układzie eter dietylowy/bufor boranowy (pH 8,9). Produkty reakcji: 1-acylolizo-fosfatydylocholinę oraz kwasy tłuszczowe uwolnione z pozycji sn-2 fosfatydylocholiny, ekstrahuje się w układzie chloroform:metanol, w stosunku objętościowym 2:1, a następnie rozdziela się na poszczególne frakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (Amate L., Ramirez M., Gil A., Positional Analysis of Triglycerides and Phospholipids Rich in Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids. Lipids, 34, ss. 865-871,1999).

W innej opisanej metodzie, pozycyjna analiza fosfatydylocholiny polegał a na wykorzystaniu dwóch enzymów w dwóch różnych układach reakcyjnych. Jednym z enzymów jest lipozyme, katalizujący reakcje etanolizy w pozycji sn-1.

Drugim biokatalizatorem jest fosfolipaza A2 katalizująca hydrolizę wiązania estrowego w pozycji sn-2 fosfatydylocholiny, rozpuszczonej w mieszaninie eteru dietylowego i etanolu. W reakcjach powstają lizofosfatydylocholiny, różniące się położeniem reszt acylowych w cząsteczce. Związki te hydrolizuje się chemicznie a uwolnione kwasy tłuszczowe estryfikuje i analizuje za pomocą chromatografii gazowej (D. Adlercreutz, E. Wehtje, An Enzymatic Method for the Synthesis of Mixed-Acid Phosphatidylcholine, JAOCS, Vol. 81, no. 6,2004).

Istota wynalazku polega na tym, że uzyskaną, w znany sposób na drodze enzymatycznej etanolizy mieszaninę, składającą się z 2-acylo-lizofosfatydylocholiny, estrów etylowych kwasów tłuszczowych i kwasów tłuszczowych uwolnionych z pozycji sn-1 poddaje się ekstrakcji w układzie woda:heksan, przez co uzyskuje się rozdział wspomnianej mieszaniny na frakcje heksanową zawierającą estry etylowe i wolne kwasy z pozycji sn-1 oraz frakcję wodną zawierającą 2-acylo-lizofosfatydylocholinę. 2-acylo-lizofosfatydylocholinę precypituje się, a następnie poddaje się hydrolizie chemicznej, przez co uzyskuje się wolne kwasy z pozycji sn-2. Uzyskane kwasy z pozycji sn-1 oraz sn-2, poddaje się estryfikacji eteratem BF3 do estrów etylowych, które analizuje się za pomocą chromatografii gazowej.

Korzystnie jest, gdy do ekstrakcji produktów reakcji enzymatycznej stosuje się układ rozpuszczalników woda:heksan w stosunku objętościowym 2:3.

Korzystnie też jest, że do precypitacji 2-acylo-lizofosfatydylocholiny stosuje się aceton schłodzony do temperatury poniżej 283 K.

Podstawową zaletą wynalazku jest wyeliminowanie długotrwałego etapu oczyszczania produktów regioselektywnej hydrolizy fosfatydylocholiny, w procesie cieczowej chromatografii kolumnowej, jak też chromatografii cienkowarstwowej, poprzez wykorzystanie prostej metody ekstrakcyjnej.

Zaletą wynalazku jest także wykorzystanie jednego prostego trójskładnikowego układu reakcyjnego substratu, którym jest fosfatydylocholina i biokatalizatora, którym jest lipozym, które zawieszone są w etanolu. W reakcji tej nie występuje migracja reszt acylowych, co znacznie zwiększa wiarygodność uzyskanych wyników.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d.

Fosfatydylocholinę w ilości 0,05 g rozpuszcza się w 2 mL 95% etanolu i dodaje się 0,4 g immobilizowanego lizozymu o aktywności 86,8 U/g. Reakcję prowadzi się przez 8 godzin, intensywnie wytrząsając.

PL 211 767 B1

Fosfatydylocholina ulega całkowitej regioselektywnej hydrolizie do 2-acylo-lizofosfatydylocholiny. Po tym czasie enzym oddziela się przez filtracje a etanol odparowuje. Pozostałość po odparowaniu rozpuszcza się w 2 mL wody. Uzyskane kwasy tłuszczowe i estry kwasów tłuszczowych z pozycji sn-1 fosfatydylocholiny, ekstrahuje się 3 mL heksanu, łagodnie mieszając przez 15 minut. Proces ekstrakcji powtarza się trzykrotnie. Ekstrakty heksanowe łączy się i odparowuje na próżniowej wyparce rotacyjnej. Mieszaninę estrów etylowych kwasów tłuszczowych oraz kwasów tłuszczowych z frakcji heksanowej, estryfikuje się za pomocą eteratu BF3 w 0,5M roztworze NaOH w etanolu. Uzyskane estry etylowe kwasów tłuszczowych ekstrahuje się heksanem i analizuje za pomocą chromatografii gazowej. Na tej podstawie określa się skład kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 fosfatydylocholiny. Frakcję wodną również odparowuje się, pozostałość rozpuszcza w 0,5 mL heksanu i przenosi do probówki wirówkowej. Następnie dodaje się schłodzonego do temperatury 277 K acetonu w celu wytrącenia 2-acylo-lizofosfatydylocholiny. Uzyskany precypitat odwirowuje się i usuwa supematant. Uzyskaną w ten sposób 2-acylo-lizofosfatydylocholinę hydrolizuje się w 0,5M roztworze NaOH w etanolu, a uwolnione kwasy tłuszczowe estryfikuje poprzez dodanie eteratu BF3. Uzyskane estry etylowe ekstrahuje się heksanem i analizuje za pomocą chromatografii gazowej. Na podstawie tej analizy, określa się skład kwasów tłuszczowych w pozycji sn-2 badanej fosfatydylocholiny.

Claims

1. Sposób analizy strukturalnej fosfatydylocholiny na drodze enzymatycznej etanolizy stosując, jako biokatalizator lipozym, znamienny tym, że uzyskaną mieszaninę składającą się z 2-acylo-lizofosfatydylocholiny, estrów etylowych kwasów tłuszczowych i kwasów tłuszczowych uwolnionych z pozycji sn-1 poddaje się ekstrakcji w układzie woda:heksan, przez co uzyskuje się rozdział wspomnianej mieszaniny na frakcje heksanową zawierającą estry etylowe i wolne kwasy z pozycji sn-1 oraz frakcję wodną zawierającą 2-acylo-lizofosfatydylocholinę, którą precypituje się, a następnie poddaje się hydrolizie chemicznej, przez co uzyskuje się wolne kwasy z pozycji sn-2, po czym kwasy z pozycji sn-1 oraz sn-2, poddaje się estryfikacji eteratem BF3 do estrów etylowych, które analizuje się za pomocą chromatografii gazowej.

2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że do ekstrakcji produktów reakcji enzymatycznej stosuje się układ rozpuszczalników woda:heksan w stosunku objętościowym 2:3.

3. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że do precypitacji 2-acylo-lizofosfatydylocholiny stosuje się aceton schłodzony do temperatury poniżej 283 K.