PL210988B1

PL210988B1 - Sposoby oznaczania u roślin Brassica tolerancji na herbicyd imidazolinonowy uwarunkowanej przez mutację PM1 i PM2 oraz sposób hodowania roślin z rodzaju Brassica z wykorzystaniem znacznika

Info

Publication number: PL210988B1
Application number: PL376616A
Authority: PL
Inventors: Stephen Barnes; Sigrid Vanstraelen
Original assignee: Monsanto Canada Inc
Priority date: 2002-10-29
Filing date: 2003-10-28
Publication date: 2012-03-30
Also published as: PL376616A1; DE60335645D1; US7595177B2; CA2501957A1; EP1556519A1; EP1556519B1; US20040171027A1; WO2004040011A1; US8829169B2; AU2003275857A1; CA2501957C; US20110034681A1; AU2003275857B2

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów oznaczania u roślin Brassica tolerancji na herbicyd imidazolinonowy uwarunkowanej przez mutację PM1 i PM2 oraz sposobu hodowania roślin z rodzaju Brassica z wykorzystaniem znacznika.

Rzepak jest rośliną pochodzącą od któregokolwiek z gatunków Brassica, B. napus, B. campestris/rapa i określonych odmian B. junsea. Olej z rzepaku zawiera duże ilości jednonienasyconych tłuszczów, średnią ilość wielonienasyconych tłuszczów i niewielką ilość nasyconych tłuszczów, zawierając najmniej nasyconych tłuszczów ze wszystkich olejów roślinnych. Co za tym idzie, olej z rzepaku jest ważną alternatywą dietetyczną dla obniżenia u ludzi poziomu cholesterolu w surowicy. Ponadto, pokarm białkowy, który jest produktem ubocznym w procesie wytwarzania oleju z rzepaku posiada wysoką wartość odżywczą i jest stosowany w paszach dla zwierząt.

Herbicydy imidazolinonowe i sulfonylomocznikowe są powszechnie używane w nowoczesnym rolnictwie z uwagi na ich skuteczność w bardzo małych dawkach i względny brak toksyczności u zwierząt. Oba te herbicydy działają przez hamowanie syntazy kwasu hydroksyoctowego (AHAS; EC 4.1.3.18, znanej również jako syntaza acetomleczanu lub ALS), pierwszego enzymu w szlaku syntezy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu - waliny, leucyny i izoleucyny. Szereg przykładów handlowo dostępnych herbicydów imidazolinonowych obejmuje PURSUIT^® (imazetapir), SCEPTER^® (imazachin) i ARSENAL^® (imazapir). Przykładami herbicydów sulfonylomocznikowych są chlorsulfuron, metsulfuron metylu, sulfometuron metylu, chlorymuron etylu, tiofenosulfuron metylu, tribenuron metylu, benzosulfuron metylu, nikosulfuron, etametsulfuron metylu, rimsulfuron, triflusulfuron metylu, triasulfuron, primisulfuron metylu, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etylu i halosulfuron.

Z uwagi na ich wysoką skuteczność i niską toksyczność herbicydy imidazolinonowe są korzystne do zastosowania w wielu uprawach, włącznie z rzepakiem, przez opryskiwanie z góry dużego obszaru upraw. Możliwość oprysku herbicydem szerokiej gamy roślin zmniejsza koszt związany z zakładaniem plantacji i jej utrzymaniem oraz zmniejsza potrzebę przygotowania takich odczynników chemicznych, na miejscu, bezpośrednio przed użyciem. Powierzchniowy oprysk pożądanych, odpornych gatunków, daje również możliwość uzyskania maksymalnego potencjalnego plonu pożądanych gatunków, z uwagi na brak gatunków z nimi konkurujących. Jednakowoż, możliwość użycia takich sposobów powierzchniowego oprysku zależy od występowania, w określonej uprawie na obszarze, na którym prowadzony jest oprysk, gatunków odpornych na imidazolinon. Ponadto, ponieważ resztki imidazolinonu pozostają na opryskanym polu, dla płodozmianu korzystne jest posiadanie różnych odpornych gatunków.

Gatunki Brassica będące źródłem oleju rzepakowego są blisko spokrewnione z szeregiem chwastów o dużych liściach, należących do kapustnych, przykładowo tobołki polnej, ożętki groniastej, pszonaka drobnokwiatowego, pszonacznika wschodniego, tasznika pospolitego, pieprzycy wirgińskiej, stulichy psiej i podobnych. Co za tym idzie, konieczne jest opracowanie hodowlanych form Brassica, które tolerują lub są odporne na herbicydy imidazolinonowe. Swanson i wsp. (1989) Theor. Appl. 78, 525-530 ujawniają mutanty P1 i P2 B. napus, otrzymane przez mutagenezę mikrospor B. napus (cv „Topas”), które wykazują tolerancję w stosunku do herbicydów imidazolinonowych PURSUIT^®i ASSERT^® na poziomie przewyż szają cym dziesię ciokrotnie poziom polecany dla upraw polowych. Homozygotyczny mutant P2 wytwarza enzym AHAS, który 500 razy lepiej tolerował PURSUIT^® niż enzym typu dzikiego, podczas gdy enzym AHAS z homozygotycznego mutanta P1 wykazywał tylko nieznacznie lepszą tolerancję w porównaniu z enzymem typu dzikiego. W testach polowych P1, P2 i hybryda P1xP2 opierał y się działaniu ASSERT^® podanego w iloś ci do 800 g/ha, bez obniż enia plonu. Mutacje P1 i P2 nie są sprzężone i są współdominujące, mieszańce P1xP2 tolerują PURSUIT^® w ilościach wyższych niż tolerowane przez oba homozygotyczne mutanty. Tolerujące imidazolinon odmiany uprawne B. napus otrzymano w wyniku krzyżówki mutantów P1xP2 i są one sprzedawane jako rzepak CLEARFIELD^®. Patrz również, kanadyjskie zgłoszenie patentowe 2,340,282; kanadyjski dokument patentowy nr 1,335,412 i europejski dokument patentowy nr 284419.

Rutledge i wsp. (1991) Mol. Gen. Genet. 229, 31-40) ujawniają sekwencję kwasu nukleinowego trzech z pięciu genów kodujących u B. napus izozymy AHAS: AHAS1, AHAS2 i AHAS3. Rutledge i wsp. opisują mutanty z publikacji Swanson i wsp. i przewidują, że dwa allele warunkujące odporność na herbicydy imidazolinonowe odpowiadają AHAS1 i AHAS3. Hattori i wsp. (1995) Mol. Gen. Genet. 246, 419-425 ujawniają zmutowany allel AHAS3 z zawiesiny komórek linii komórkowej mutanta

PL 210 988 B1

B. napus cv Topas, w którym zmiana pojedynczego nukleotydu w kodonie 557 prowadzi do zamiany aminokwasu tryptofanu w leucynę, warunkując odporność na herbicydy sulfonylomocznikowe, imidazolinonowe i triazolopirymidynowe. Kodon 557 u Hattori i wsp. odpowiada kodonowi 556 z sekwencji AHAS3 ujawnionej przez Rutledge i wsp., powyżej, i kodonowi 556 z sekwencji AHAS3 podanej w GENBANK pod numerem dostępu gi/17775/emb/Z11526/.

Jednonukleotydowa mutacja w kodonie 173 genu ALS z B. napus, odpowiadająca AHAS2 u Rutledge i wsp., powyż ej, prowadzi do zmiany Pro w Ser (Wiersman i wsp. (1989) Mol. Gen. Genet. 219, 413-420). Zmutowany gen AHAS2 z B. napus wprowadzono przez transformację do tytoniu otrzymując fenotyp tolerujący chlorosulfuron.

Patenty U.S. nr 6,114,116 i 6,358,686 ujawniają sekwencje kwasu nukleinowego z B. napus i B. oleracea zawierają ce polimorfizmy, z których ż aden nie wydaje się odpowiadać polimorfizmowi ujawnionemu przez Hattori i wsp., powyżej.

W przypadku handlowo odpowiednich odmian Brassica niezbędnym jest upewnienie się, że każda partia nasion roślin odpornych na herbicyd zawiera wszystkie mutacje niezbędne dla ustanowienia tolerancji herbicydu. Potrzebny jest sposób wykrywania mutacji w genach AHAS1 AS1 i AHAS3 Brassica, które warunkują zwiększoną tolerancję na imidazolinon u odmian dostępnych handlowo.

Niniejszy wynalazek opisuje lokalizację i tożsamość jednonukleotydowego polimorfizmu w pozycji 1874 genu AHAS1 B. napus, jak podano na Fig. 1, polimorfizm jest oznaczony jako mutacja PM1. Mutacja PM1 warunkuje około 15% tolerancji na herbicydy imidazolinonowe występującej w rzepaku CLEARFIELD^®. Rzepak CLEARFIELD^® posiada również drugi jednonukleotydowy polimorfizm w pozycji 1712 genu AHAS3 z B. napus, jak podano na fig. 2, który odpowiada podstawieniu tryptofanu leucyną opisanemu przez Hattori i wsp., powyżej. Dla celów niniejszego wynalazku polimorfizm ten jest oznaczony jako mutacja PM2. Mutacja PM2 warunkuje około 85% tolerancji na herbicydy imidazolinonowe wykazywanej przez rzepak CLEARFIELD^®. Obie mutacje PM1 i PM2 są wymagane dla uzyskania rośliny Brassica o odpowiedniej tolerancji na herbicyd tak, aby była odpowiednia handlowo, jak rzepak CLEARFIELD^®.

Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów identyfikowania rośliny o zwiększonej tolerancji na herbicyd imidazolinonowy przez wykrywanie obecności lub braku, u tych roślin, mutacji PM1 i PM2 z B. napus. Jedną z korzyści niniejszego wynalazku jest, że dostarcza wiarygodnego i szybkiego sposobu wykrywania roś lin o handlowo odpowiedniej tolerancji na imidazolinon.

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania u roślin Brassica tolerancji na herbicyd imidazolinonowy uwarunkowanej przez mutację PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego w genie AHAS1 z B. napus, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) izolowanie z rośliny genomowego DNA;

b) wybiórcze amplifikowanie genu AHAS1 z genomowego DNA przy pomocy lewego startera AHAS1 i prawego startera AHAS1 w pierwszym etapie amplifikacji, co za tym idzie wytworzenie mieszaniny reakcyjnej AHAS1;

c) usuwanie starterów AHAS1 z mieszaniny reakcyjnej AHAS1 do wytworzenia oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS1;

d) w drugim etapie amplifikowania, dalsze amplifikowanie części namnożonego genu AHAS1 zawierającego miejsce mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, przez połączenie oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS1 z lewym starterem PM1 i prawym starterem PM1, gdzie lewy starter PM1 i prawy starter PM1 są zakotwiczone w lewym i prawym starterze AHAS1;

e) denaturowanie produktu drugiego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i do przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe; i

f) wykrywanie obecności lub braku miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, na podstawie ruchliwoś ci w substracie wspomnianych konformerów jednoniciowego polinukleotydu otrzymanego w etapie e).

Korzystnie lewy starter AHAS1 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 9.

Korzystnie prawy starter AHAS1 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 10.

Korzystnie lewy starter PM1 w etapie d) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 11.

Korzystnie prawy starter PM1 w etapie d) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 12.

Korzystnie etap c) obejmuje wbudowanie znacznika do namnożonej części genu AHAS1.

PL 210 988 B1

Korzystnie znacznik jest wybrany z grupy obejmującej znacznik radioaktywny, znacznik fluorescencyjny, znacznik luminescencyjny i znacznik paramagnetyczny.

Korzystnie substrat jest wybrany z grupy obejmującej poliakrylamid, liniowy poliakrylamid, poli(N,N-dimetyloakrylamid), celulozę hydroksylakilową, glikol polietylenowy, F127, agarozę, celulozę dietyloaminoetylową, sefarozę, POP4 i POP6. Korzystnie sposób wykrywania jest wybrany z grupy obejmującej elektroforezę i chromatografię.

Korzystnie sposób obejmuje ponadto etap wykrywania w roślinie obecności lub braku miejsca mutacji PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji polinukleotydowej AHAS3 typu dzikiego, warunkującego odporność na imidazolinon.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób oznaczania u roślin Brassica tolerancji na herbicyd imidazolinonowy uwarunkowanej przez mutację PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji polinukleotydowej AHAS3 typu dzikiego w genie AHAS3 z B. napus, charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) izolowanie z rośliny genomowego DNA;

b) wybiórcze amplifikowanie genu AHAS3 z genomowego DNA przy pomocy lewego startera AHAS3 i prawego startera AHAS3 w pierwszym etapie amplifikacji, co za tym idzie wytworzenia mieszaniny reakcyjnej AHAS3;

c) usuwanie starterów AHAS3 z mieszaniny reakcyjnej AHAS3 do wytworzenia oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS3;

d) w drugim etapie amplifikowania, dalsze amplifikowanie namnożonego genu AHAS3, przez połączenie pierwszego roztworu oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS3 z lewym starterem PM2 i prawym starterem PM2 i starterem selektywnym PM2 dla allelu typu dzikiego, regionu PM2 w pozycji 1712 genu AHAS3, jak przedstawiono na SEQ ID NO: 5 i 8;

e) w trzecim etapie amplifikacji dalsze amplifikowanie namnożonego genu AHAS3 przez połączenie drugiego roztworu oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS3 z lewym starterem PM2, prawym starterem PM2 i starterem selektywnym dla mutacji PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego; i

f) analizowanie namnożonej pierwszej próbki otrzymanej w etapie d) i namnożonej drugiej próbki otrzymanej w etapie e) pod względem występowania lub braku mutacji PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego;

g) wybiórcze amplifikowanie genu AHAS1 z genomowego DNA przy pomocy lewego startera AHAS1 i prawego startera AHAS1 w dalszym etapie amplifikacji;

h) usunięcie starterów AHAS1 z produktu etapu g);

i) w piątym etapie amplifikacji dalsze amplifikowanie części namnożonego genu AHAS1 zawierającej miejsce mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, przez połączenie produktu etapu h) z lewym starterem PM1 i prawym starterem PM1, gdzie lewy starter PM1 i prawy starter PM1 są zakotwiczone w lewym i prawym starterze AHAS1;

j) denaturowanie produktu piątego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe; i

k) wykrywanie obecności lub braku miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, na podstawie ruchliwoś ci w substracie wspomnianego jednoniciowego konformera polinukleotydów.

W powyż ej okreś lonym sposobie korzystnie lewy starter AHAS3 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 13.

W powyż ej okreś lonym sposobie korzystnie prawy starter AHAS3 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 14.

W powyż ej okreś lonym sposobie korzystnie lewy starter PM2 w etapach d) do e) ma sekwencj ę podaną na SEQ ID NO: 15.

W powyż ej okreś lonym sposobie korzystnie prawy starter PM2 w etapach d) do e) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 16.

W powyż ej okreś lonym sposobie korzystnie dziki allel miejsca mutacji PM2, któr ą jest substytucja nukleotydowa „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej typu dzikiego, ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 17.

PL 210 988 B1

W powyż ej określonym sposobie korzystnie starter wybiórczy dla mutacji PM2, którą jest substytucja nukleotydowa „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej typu dzikiego, ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 18.

W powyż ej okreś lonym sposobie korzystnie etapy c) i d) obejmują wbudowanie znacznika do namnożonej części genu AHAS3.

W powyżej okreś lonym sposobie korzystnie znacznik jest wybrany z grupy obejmującej znacznik radioaktywny, znacznik fluorescencyjny, znacznik luminescencyjny i znacznik paramagnetyczny.

W powyżej okreś lonym sposobie korzystnie etap analizowania wykorzystuje technikę wybraną z grupy obejmującej elektroforezę i chromatografię.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób hodowania roślin z rodzaju Brassica z wykorzystaniem znacznika, stosując jako znacznik mutację PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego w genie AHAS1 z B. napus; charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) izolowanie genomowego DNA z rośliny Brassica;

b) wybiórcze amplifikowanie genu AHAS1 na matrycy genomowego DNA przy pomocy lewego startera AHAS1 i prawego startera AHAS1 w pierwszym etapie amplifikacji, co za tym idzie wytworzenia mieszaniny reakcyjnej AHAS1;

c) usuwanie starterów AHAS1 z mieszaniny reakcyjnej AHAS1 dla wytworzenia oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS1;

e) denaturowanie produktu drugiego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe;

f) wykrywanie obecności lub braku miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, na podstawie ruchliwości w substracie wspomnianych konformerów jednoniciowego polinukleotydu otrzymanego w etapie e); i

g) selekcjonowanie wspomnianej rośliny rodzicielskiej dla dalszej hodowli rośliny, w której występowanie miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego została wykryta w etapie f).

Przedmiotem wynalazku jest również sposób hodowania roślin z rodzaju Brassica z wykorzystaniem znacznika, stosując jako znacznik mutację PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego sekwencji polinukleotydowej w genie AHAS3 z B. napus; charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) izolowanie z rośliny genomowego DNA;

c) usuwanie starterów AHAS3 z mieszaniny reakcyjnej AHAS3 dla wytworzenia oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS3;

d) w drugim etapie amplifikowania, dalsze amplifikowanie genu AHAS3, przez połączenie pierwszego roztworu oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS3 z lewym starterem PM2 i prawym starterem PM2 i starterem selektywnym dla allelu typu dzikiego regionu, w pozycji 1712 genu AHAS3, jak przedstawiono na SEQ ID NO: 5 i 8;

e) w trzecim etapie amplifikacji dalsze amplifikowanie namnożonego genu AHAS3 przez połączenie drugiego roztworu oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS3 z lewym starterem PM2, prawym starterem PM2 i starterem selektywnym dla miejsca mutacji PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji polinukleotydowej AHAS3 typu dzikiego;

f) analizowanie namnożonej pierwszej i drugiej próbki pod względem występowania lub braku miejsca mutacji PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego sekwencji polinukleotydowej; i

g) selekcjonowanie wspomnianej rośliny rodzicielskiej dla dalszej hodowli, jeśli występuje mutacja PM2, którą jest substytucja nukleotydowa „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego; oraz

PL 210 988 B1 następnie stosowanie mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” do „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego w genie B. napus AHAS1 jako znacznika, obejmujący następujące etapy:

h) wybiórcze amplifikowanie genu AHAS1 z genomowego DNA przy pomocy lewego startera AHAS1 i prawego startera AHAS1 w pierwszym etapie amplifikacji, co za tym idzie wytworzenia mieszaniny reakcyjnej AHAS1;

i) usuwanie starterów AHAS1 z mieszaniny reakcyjnej AHAS1 dla wytworzenia oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS1;

j) w drugim etapie amplifikowania, dalsze amplifikowanie części namnożonego genu AHAS1 zawierającego miejsce mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” do „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, przez połączenie oczyszczonej mieszaniny reakcyjnej AHAS1 z lewym starterem i prawym starterem, gdzie lewy starter i prawy starter są zakotwiczone w lewym i prawym starterze AHAS1;

k) denaturowanie produktu drugiego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe;

l) wykrywanie obecności lub braku miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” do „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, na podstawie ruchliwości w substracie wspomnianych konformerów jednoniciowego polinukleotydu otrzymanych w etapie e); i

m) selekcjonowanie dla dalszej hodowli rośliny, w której występowanie miejsce mutacji PM1, którą stanowi nukleotydowa substytucja „G” do „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego zostało wykryte w etapie f).

W niniejszym dokumencie ujawniono startery oligonukleotydowe dla specyficznej amplifikacji genu AHAS1 z B. napus i obszaru genu AHAS1 odpowiadającego mutacji PM1, dla specyficznej amplifikacji genu AHAS3 z B. napus i obszaru genu AHAS3 odpowiadającego mutacji PM3.

W niniejszym dokumencie ujawniono również kwasy nukleinowe otrzymane jako produkty reakcji specyficznej amplifikacji genu AHAS1 z B. napus i regionu genu AHAS1 odpowiadającego mutacji PM1 i wyizolowanych kwasów nukleinowych wytworzonych jako produkty reakcji specyficznej amplifikacji genu AHAS3 z B. napus i regionu genu AHAS3 odpowiadającego mutacji PM3.

Wynalazek dostarcza sposobu hodowania roślin rzepaku wykorzystującego marker, przez użycie oznaczeń PM1 i PM2, starterów oligonukleotydowych i ujawnionych tu produktów reakcji amplifikacji.

Opis rysunków:

Fig. 1 przedstawia zestawienie sekwencji kwasu nukleinowego AHAS1 wyizolowanego z szeregu odmian B. napus (SEQ ID NO: 1-4). Wskazana jest część mutacji PM1 (pozycja 1874), jako miejsca korzystnych starterów dla amplifikacji przez PCR.

Fig. 2 przedstawia zestawienie sekwencji kwasów nukleinowych AHAS3 z szeregu odmian B. napus (SEQ ID NO: 5-8). Wskazana jest część mutacji PM2 (pozycja 1712), jako miejsca korzystnych starterów dla amplifikacji przez PCR.

Fig. 3 jest diagramem jednej postaci sposobu z niniejszego wynalazku dla wykrywania mutacji

PM1.

Fig. 4 jest diagramem jednej postaci sposobu z niniejszego wynalazku dla wykrywania mutacji

PM2.

Fig. 5 przedstawia przyrównanie genów AHAS1 (SEQ ID NO: 19) i AHAS3 (SEQ ID NO: 20) i pozycji lewego startera AHAS1 dla amplifikacji (SEQ ID NO: 9); prawego startera AHAS1 dla amplifikacji (SEQ ID NO: 10); lewego startera AHAS3 dla amplifikacji (SEQ ID NO: 13); i prawego startera AHAS3 dla amplifikacji (SEQ ID NO: 14).

Niniejszy opis przedstawia sposoby identyfikowania roślin o zwiększonej tolerancji na herbicyd imidazolinonowy przez wykrycie występowania mutacji PM1 i PM2 w B. napus. Dokładniej, sposoby według niniejszego wynalazku pozwalają na identyfikowanie nasion i roślin Brassica posiadających odpowiednią handlowo tolerancję na imidazolinon, takich jak rzepak CLEARFIELD^®. W sposobach według wynalazku mogą być wykorzystane nowe startery polinukleotydowe łącznie z rozszerzonymi starterami PM1 i rozszerzonymi starterami PM2.

Użycie w opisie i zastrzeżeniach liczby pojedynczej może oznaczać jeden lub więcej, w zależności od kontekstu w jakim została użyta. Co za tym idzie, przykładowo, termin „komórka” może oznaczać, że użyto przynajmniej jedną komórkę.

PL 210 988 B1

Dla celów niniejszego wynalazku poziom tolerancji na herbicydy imidazolinonowe wykazywany przez rzepak CLEARFIELD^®, która posiada zarówno mutację PM1 jak i PM2, jest określony jako „100% tolerancji” lub „handlowo odpowiednia tolerancja na imidazolinon” lub „handlowa tolerancja w uprawie”. Terminy „tolerancja” i „odporno ść” są uż ywane tu wymiennie.

Oligonukleotyd, jak tu zdefiniowano, jest kwasem nukleinowym zbudowanym z około 8 do około 25 połączonych ze sobą kowalencyjnie nukleotydów. Polinukleotyd, jak tu zdefiniowano, jest kwasem nukleinowym zbudowanym z więcej niż 25 kowalencyjnie połączonych nukleotydów. Zgodnie z wynalazkiem, oligonukleotydy i polinukleotydy mogą obejmować analogi kwasu nukleinowego obejmując, bez ograniczeń, fosforotioniany, fosforoamidaty, peptydowe kwasy nukleinowe i podobne. „Wyizolowany” kwas nukleinowy jest zasadniczo wolny od składników normalnie mu towarzyszących w stanie naturalnym.

Jak tu określono, „mutacja PM1” określa jednonukleotydowy polimorfizm w genie AHAS1 z B. napus, w którym nukleotyd „G” jest zamieniony w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej typu dzikiego AHAS1, przedstawionej na Fig. 1, nukleotydem „A”, mutacja przedstawiona na SEQ ID NO: 1 i 3, która to substytucja prowadzi do zamiany seryny w asparaginę w pozycji 638 enzymu AHAS1 z B. napus.

Jak tu określono, „mutacja PM2” określa jednonukleotydowy polimorfizm w genie AHAS3 z B. napus, w którym nukleotyd „G” jest zamieniony w pozycji 1712 sekwencji polinukleotydowej typu dzikiego AHAS3, przedstawionej na Fig. 2, nukleotydem „T”, mutacja przedstawiona na SEQ ID NO: 6 i 7, która to substytucja prowadzi do zamiany tryptofanu w leucynę w pozycji 556 enzymu AHAS3 z B. napus.

Występowanie mutacji PM1 i PM2 w roślinach warunkuje tolerancję na takie herbicydy imidazolinonowe jak PURSUIT^® (imazetapir, kwas 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-5-etylo-3-pirydynokarboksylowy), CADRE® (imazapik, kwas 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-5-metylo-3-pirydynokarboksylowy), RAPTOR^® (imazamoks, kwas 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-5-(metoksymetylo)-3-pirydynokarboksylowy), SCEPTER^® (imazachin, kwas 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-3-chinolinokarboksylowy, ASSERT^® (imazetabenz, ester metylowy kwasu 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-4-metylobenzoesowego i kwasu 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-5-metylobenzoesowego, ARSENAL^® (imazapir, kwas 2-[4,5-dihydro-4-metylo-4-(1-metyloetylo)-5-keto-1H-imidazolo-2-il]-3-pirydynokarboksylowy i podobnych. Ponadto, mutacje PM1 i PM2 mogą warunkować odporność na herbicydy: sulfonylomocznik, triazolopirymidynę, pirymidynylo(tio)benzoesan i sulfonyloamino-karbonylo-triazolinonon.

Mutacje PM1 i PM2 mogą występować w roślinie w wyniku mutagenezy któregokolwiek z gatunków zawierających odpowiednio geny AHAS3 i AHAS1 z B. napus. Alternatywnie, mutacje PM1 i PM2 mogą występować w roślinie w wyniku transformacji genem AHAS1 PM1 z B. napus i genami AHAS3 PM2 z B. napus, przeprowadzonymi przy pomocy sposobów takich jak te, podane w patencie US nr 5,591,616; 5,767,368; 5,736,369; 6,020,539; 6,153,813; 5,036,006; 5,120;657; 5,969,213; 6,288,312; 6,258,999 i podobnych. Korzystnie, roślina jest rośliną oleistą z rodzaju Brassica. Korzystniej, gatunki roślin są wybrane z grup obejmujących B. napus, B. campestris / rapa i B. juncea. Najkorzystniej, roślina jest B. napus. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, termin „roślina” obejmuje nasiona, liście, łodygi, całe rośliny, organella, komórki i tkanki.

W pierwszym etapie sposobu oznaczania tolerancji według wynalazku, z rośliny wyizolowany jest genomowy DNA. Oczywiste jest, że przy stosowaniu sposobu według niniejszego wynalazku, genomowy DNA może być wyekstrahowany z rośliny przy pomocy jakiegokolwiek znanego sposobu. Genomowy DNA może być wyekstrahowany z całej rośliny, liścia, łodygi, nasiona lub jakiegokolwiek organellum rośliny, komórki lub tkanki. Jeden ze sposobów, nieograniczający sposób ekstrahowania DNA z liścia rośliny opisano w Przykładzie 1.

Gdy oznacza się występowanie lub brak mutacji PM1, w drugim etapie gen AHAS1 jest wybiórczo powielony na matrycy wyizolowanego, genomowego DNA. Amplifikacja może być uzyskana przy pomocy jakiegokolwiek sposobu znanego naukowcom, włącznie z PCR. Termin „PCR” w użytym tu znaczeniu określa amplifikowanie DNA przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy. Termin ten obejmuje również jakikolwiek lub wszystkie inne sposoby znane w dziedzinie dla namnażania kwasu nukleinowego, wymagające wyznaczonego celu amplifikacji, przynajmniej jednego startera i polimerazy. Przykładowo, gen AHAS1, lub jego część zawierająca miejsce mutacji PM1, może być namnożona przez połączenie wyizolowanego genomowego DNA z odpowiednim starterem zaprojektowanym dla

PL 210 988 B1 amplifikacji sekwencji polinukleotydowej zawierającej mutację PM1. Każdy zestaw startera zawiera starter lewy i starter prawy, z których każdy może być określony jako „starter dla amplifikacji”. W pewnej postaci niniejszego wynalazku gen AHAS1 może być powielony przy pomocy zestawu startera, gdzie lewy starter AHAS1 ma sekwencję 5' CACAAGTCTCGTGTTATAAAAC 3' (SEQ ID NO: 9) i starter prawy AHAS1 ma sekwencje 5' CATTGAGTGCCAAACATATGAA 3' (SEQ ID NO: 10). Znawca dostrzeże, że dla wybiórczej amplifikacji genu AHAS1 z B. napus użyte mogą być inne startery. Jak dobrze wiadomo, amplifikacja zachodzi gdy cykle inkubowania genomowego DNA, starterów, termostabilnej polimerazy DNA i nukleotydów są dogodne dla syntezy DNA, jak opisano w patencie US nr 4,683,195; 4,683,202; 4,965,188; 5,998,143 i podobnych. Aparaty i odczynniki użyteczne dla amplifikacji PCR są dostępne handlowo, przykładowo z Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA.

Po pierwszym etapie amplifikacji, produkt reakcji amplifikacji AHAS1 lub mieszanina są oczyszczone celem usunięcia specyficznych dla AHAS1 starterów dla amplifikacji. Dla przeprowadzenia etapu oczyszczania użyty może być jakikolwiek sposób. Korzystnie, handlowo dostępne sposoby oczyszczania PCR takie jak Wizard MagneSil PCR Cleanup System (ProMega, Madison, WI, USA) jest użyty dla usunięcia starterów dla amplifikacji AHAS1 z mieszaniny otrzymanej po amplifikacji AHAS1. Korzystniej, startery dla amplifikacji AHAS1 są usunięte przez trawienie egzonukleazą. Do trawienia użyta może być jakakolwiek egzonukleaza trawiąca specyficznie jednoniciowy DNA. Przykładowo, egzonukleaza T (RNAza T), nukleaza S1 z Aspergillus oryzae, nukleaza z fasoli Mung lub egzonukleaza I z Escherichia coli, mogą być uż yte dla usunięcia starterów dla amplifikacji AHAS1. Korzystnie, stosuje się egzonukleazę I dla usunięcia starterów dla amplifikacji AHAS1.

W trzecim etapie oznaczenia PM1 z wynalazku, część namnoż onego genu AHAS1 zawierająca miejsce z mutacją PM1, które jest w pozycji 1874 SEQ ID NO: 1-4, jest następnie namnożona w drugim etapie amplifikacji, przy pomocy startera lewego PM1 i startera prawego PM1. Starter lewy PM1 i starter prawy PM1 są komplementarne do części genu AHAS1, w obrębie fragmentu namnożonego przy pomocy startera lewego AHAS1 i startera prawego AHAS1, jak przedstawiono na Fig. 1 i są one „zakotwiczone” w obrębie starterów powielających gen AHAS1. W korzystnej postaci lewy starter PM1 zawiera sekwencję 5' CATACCTGTTGGATGTGATAT 3' (SEQ ID NO: 11) i prawy starter PM1 ma sekwencję 5' AAACAACAACAGCGAGTACGT 3' (SEQ ID NO: 12). Znawca dostrzeże, że oba startery mogą być użyte dla wybiórczej amplifikacji części genu AHAS1 odpowiadającej mutacji PM1. Zgodnie z wynalazkiem, część namnożonego genu AHAS1 zawierająca miejsce mutacji PM1 moż e warunkowo być wyznakowana przy pomocy znacznika radioaktywnego, barwnika fluorescencyjnego, znacznika luminescencyjnego, znacznika paramagnetycznego lub jakiegokolwiek innego znacznika dogodnego dla wykrywania kwasów nukleinowych.

W czwartym etapie oznaczenia PM1 z wynalazku, produkt drugiego etapu amplifikacji jest zdenaturowany i umieszczony w warunkach do przyjęcia specyficznej jednoniciowej konformacji, zależnie od jego sekwencji nukleotydowej. Różnorodne sposoby denaturowania i częściowego renaturowania kwasów nukleinowych są znane w dziedzinie i dowolny taki sposób może być użyty w tym etapie oznaczenia PM1 z wynalazku. Korzystnie, polinukleotydy są zdenaturowane przez ogrzewanie, przykładowo przez ogrzewanie w 90°C lub wyższej temperaturze przez około 10 min i częściową renaturację przez szybkie schłodzenie w lodzie. Alternatywnie, polinukleotydy zawierające miejsce mutacji PM1 mogą być zdenaturowane przez traktowanie alkaliami i częściowo zdenaturowane przez dodanie kwasu dla obniżenia pH.

W końcowym etapie oznaczenia PM1 wedł ug wynalazku wystę powanie lub brak mutacji PM1 jest wykryte na podstawie ruchliwości konformera polinukleotydowego w substracie. Jakikolwiek sposób wykrywania użyteczny dla rozdziału polinukleotydów może być użyty w tym etapie, przykładowo elektroforeza w żelu, wysoko wydajna chromatografia cieczowa, elektroforeza kapilarna i podobne. Substraty dla takich sposobów są dobrze znane i obejmują, bez ograniczeń, poliakryloamid, liniowy poliakryloamid, poli(N,N-dimetyloakryloamid), hydroksyalkilocelulozę, glikol polietylenowy, F127 (kopolimer glikolu polietylenowego i glikolu polioksypropylenowego, BASF, Ludwigshafen, Niemcy), agarozę, dietyloaminoetylocelulozę, sefarozę, GENESCAN (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), POP (Amersham Biosciences AB, Uppsala, SE) i podobne. Gdy namnożony kwas nukleinowy został oznakowany, następny etap obejmuje wykrywanie radioaktywnego, fluorescencyjnego, luminescencyjnego, paramagnetycznego lub innego znacznika. Gdy namnożony kwas nukleinowy nie był oznakowany, wykrywanie jednoniciowych polinukleotydowych konformerów w substracie może być przeprowadzone przy pomocy znanych sposobów, takich jak barwienie srebrem, fluorescencyjne i podobne.

PL 210 988 B1

Zgodnie z wynalazkiem występowanie mutacji PM2 może być wywnioskowane na podstawie odporności na herbicyd imidazolinonowy podany roślinie lub oznaczenie aktywności AHAS w obecności herbicydu imidazolinonowego. Rośliny mogą być następnie oznaczone przy pomocy podanego powyżej oznaczenia PM1 dla określenia czy roślina ujawnia komercyjnie odpowiednią handlowo tolerancję imidazolinonu.

Alternatywnie, roślina może być oznaczona z uwagi na obecność mutacji PM2 przy pomocy ujawnionego sposobu oznaczenia PM2, w którym gen AHAS3 jest wybiórczo namnożony na matrycy wyizolowanego genomowego DNA w pierwszym etapie amplifikacji. Dla tego etapu połączone są lewy starter AHAS3 i prawy starter AHAS3 z genomowym DNA i poddane amplifikacji PCR jak opisano powyżej. Korzystnie, lewy starter AHAS3 dla użycia w sposobie z wynalazku ma sekwencję 5' CACAAGCCTCGTGTTATAAAAA 3' (SEQ ID NO: 13) i preferowany prawy starter AHAS3 ma sekwencję 5' CATTGAGTGCCAAACATTATGTA 3' (SEQ ID NO: 14). Naukowiec dostrzeże, że dla wybiórczej amplifikacji genu AHAS3 z B. napus mogą być użyte inne startery.

Po pierwszym etapie amplifikacji produkt reakcji amplifikacji AHAS3 lub mieszanina są oczyszczone dla usunięcia starterów specyficznych dla amplifikacji AHAS3. Dla przeprowadzenia tego etapu może być użyty jakikolwiek ze sposobów oczyszczania opisanych powyżej. Korzystnie, dla usunięcia starterów dla amplifikacji AHAS3 użyta jest egzonukleaza I.

Po etapie oczyszczania, namnożony DNA zawierający AHAS3 jest podzielony na przynajmniej dwie porcje, z których każda jest niezależnie powielona na obszarze genu AHAS3 otaczającym pozycję 1712 z SEQ ID NO: 5-8 określaną dalej jako „region PM2”. Pierwsza porcja powielonego DNA AHAS3 jest dalej powielona w drugim etapie amplifikacji, przy pomocy przynajmniej jednego startera, który jest wybiórczy dla części genu AHAS3, która w pozycji 1712 wspomnianego genu jest typu dzikiego, tzn. która we wspomnianej pozycji 1712 zawiera nukleotyd „G”, jak przedstawiono na SEQ ID NO: 5 i 8. W preferowanej postaci drugi etap amplifikacji wykorzystuje selektywny starter lewy typu dzikiego w połączeniu z lewym i prawym starterami wybiórczo amplifikującymi rejon PM2. Wszystkie trzy startery są zakotwiczone w starterach użytych do amplifikacji genu AHAS3 w pierwszym etapie amplifikacji. W korzystnej postaci lewy starter dla amplifikacji rejonu PM2 ma sekwencję 5' ACTCGGAGCTATGGGTTC 3' (SEQ ID NO: 15) i prawy starter dla amplifikacji rejonu PM2 ma sekwencję 5' ATCCAACAGGTACGGTCCA 3' (SEQ ID NO: 16), wybiórczy starter dzikiego typu ma sekwencję 5' TGGGATGGTCATGCAATG 3' (SEQ ID NO: 17). Naukowiec dostrzeże, że dla amplifikacji rejonu PM2 użyte mogą być inne startery.

Druga próbka namnożonego i oczyszczonego DNA zawierającego AHAS3 jest następnie powielona w trzecim etapie amplifikacji przy pomocy przynajmniej jednego startera selektywnego dla mutacji PM2, tj. takiego który zawiera nukleotyd „T” we wspomnianej pozycji 1712 genu AHAS3, jak przedstawiono na SEQ ID NO: 6 i 7. Korzystnie, drugi etap amplifikacji wykorzystuje selektywny lewy starter PM2, w połączeniu z lewym i prawym starterem, które wybiórczo amplifikują rejon PM2. Wszystkie trzy startery są zakotwiczone w starterach użytych dla namnożenia genu AHAS3 w pierwszym etapie amplifikacji. W preferowanej postaci, selektywny starter PM2 ma sekwencję 5' CTTGGGATGGTCATGCAATT 3' (SEQ ID NO: 18), lewy starter dla amplifikacji rejonu PM2 ma sekwencję 5' ACTCGGAGCTATGGGTTTC 3' (SEQ ID NO: 16) i prawy starter dla amplifikacji rejonu PM2 ma sekwencję 5' ATCCAACAGGTACGGTCCA 3' (SEQ ID NO: 17). Naukowcy dostrzegą, że inne startery mogą być użyte dla amplifikacji rejonu PM2.

Drugi i trzeci etapy amplifikacji mogą być przeprowadzone kolejno lub równocześnie.

W drugim i trzecim etapie amplifikacji, część namnożonego genu AHAS3 zawierająca miejsce mutacji PM2 może warunkowo być wyznakowana przy pomocy znacznika radioaktywnego, znacznika fluorescencyjnego, znacznika luminescencyjnego, znacznika paramagnetycznego lub jakiegokolwiek innego użytecznego znacznika dla wykrywania kwasów nukleinowych.

W koń cowym etapie oznaczenia PM2, produkty drugiego i trzeciego etapu amplifikacji są zbadane z uwagi na występowanie lub brak mutacji PM2, przy pomocy znanych sposobów, takich jak elektroforeza w żelu, wysoko wydajna chromatografia cieczowa, elektroforeza kapilarna i podobne. Gdy namnożone kwasy nukleinowe są wyznakowane, etap analizy może obejmować wykrycie radioaktywnego, fluorescencyjnego, luminescencyjnego, paramagnetycznego lub innego znacznika. Gdy namnożone kwasy nukleinowe nie są wyznakowane, etap analizy może być przeprowadzony przy pomocy znanych sposobów, takich jak barwienie bromkiem etydyny i podobne.

Ujawnione są również wyizolowane kwasy nukleinowe utworzone jako produkty reakcji amplifikacji jaką tu opisano. Kwas nukleinowy będący produktem reakcji może odpowiadać rejonowi genu

PL 210 988 B1

AHAS1 pomiędzy lewym starterem dla amplifikacji AHAS1 i prawym starterem dla amplifikacji AHAS1 i ma sekwencję jaką przedstawiono od nukleotydu 96 do nukleotydu 2330 SEQ ID NO: 19. Dodatkowo kwas nukleinowy będący produktem reakcji może odpowiadać rejonowi genu AHAS1 pomiędzy lewym starterem PM1 i prawym starterem PM1 i jest podany przykładowo przez sekwencję jaką podano od nukleotydu 1817 do nukleotydu 2063 z SEQ ID NO: 1; sekwencję podaną od nukleotydu 1735 do nukleotydu 1980 SEQ ID NO: 2; sekwencję podaną od nukleotydu 1809 do nukleotydu 2054 SEQ ID NO: 3; i sekwencję podaną od nukleotydu 1720 do nukleotydu 1966 SEQ ID NO: 4.

Produkt reakcji będący kwasem nukleinowym może odpowiadać rejonowi genu AHAS3 pomiędzy lewym starterem dla amplifikacji AHAS3 i prawym starterem dla amplifikacji AHAS3 i ma sekwencję nukleotydową podaną od nukleotydu 64 do nukleotydu 2310 SEQ ID NO: 20 lub kwasowi nukleinowemu odpowiadającemu regionowi PM2 genu AHAS3, pomiędzy lewym starterem PM2 i prawym starterem PM2. Przykłady tych produktów reakcji obejmują kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1383 do nukleotydu 1770 SEQ ID NO: 5; kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1518 do nukleotydu 1905 SEQ ID NO: 6; kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1352 do nukleotydu 1739 SEQ ID NO: 7; i kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1308 do nukleotydu 1695 SEQ ID NO: 8. Ponadto, kwasy nukleinowe są uwzględnione jako produkty trzeciej reakcji amplifikacji z oznaczenia PM2, tj. kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1560 do nukleotydu 1770 SEQ ID NO: 5; kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1695 do nukleotydu 1905 SEQ ID NO: 6; kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1529 do nukleotydu 1739 SEQ ID NO: 7 i kwasy nukleinowe o sekwencji podanej od nukleotydu 1485 do nukleotydu 1695 SEQ ID NO: 8.

Oznaczenia PM1 i PM2, oligonukleotydy i kwasy nukleinowe będące produktami reakcji mogą być również użyte w programie hodowli wykorzystującym znacznik dla selekcji potomstwa roślin rzepaku. W takim programie wymagane będą inne poza polimorfizmami PM1 i PM2 markery, które znane są nauce. Sposoby selekcji na podstawie markera są opisane, przykładowo w patencie US nr 6,100,030.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, które nie mogą być interpretowane jako ograniczające jego zakres.

P r z y k ł a d 1

Materiały i izolacja genomowego DNA

Linie rzepaku użyte w tych doświadczeniach są wymienione poniżej w Tabeli 1. Sekwencje kwasu nukleinowego genów AHAS1, z każdej z tych linii przedstawiono na Fig. 1 i sekwencje kwasu nukleinowego genów AHAS3 dla każdej z tych linii przedstawiono na Fig. 2.

T a b e l a 1

Linie	Mutacje	Oznaczenie	Odporność na herbicyd
T9107	Mutacja punktowa 1 na AHAS1	PM1	Odporność częściowa
T9108	Mutacja punktowa 2 na AHAS3	PM2	Odporność częściowa
TR101	Mutacja punktowa 1 + 2	R	odporny
OPTION 501	Typ dziki	S	wrażliwy

Rośliny hodowano z nasion każdej linii rzepaku. Trzy do pięciu wycinków z liści każdej rośliny połączono w każdej próbce i próbki zliofilizowano. Zamrożone, wysuszone próbki roztarto dodając oczyszczony BB (BB przed użyciem wymyto mydłem i wodą i następnie wysuszono rozpuszczalnikiem organicznym) do każdej próbki i próbki wytrząsano do momentu uzyskania delikatnego proszku (ok.

min.). Do każdej próbki dodano 500 μΐ buforu do ekstrakcji (1300 μΐ 1 M Tris, 4,15 ml podwójnie destylowanej H₂O; 325 μl 0,5 M EDTA; 650 μl 10% SDS) i próbki obrócono kilkakrotnie. Następnie próbki umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 65°C na 60 minut, obracając co 20 minut. Podczas inkubacji próbki, drugi zestaw probówek testowych wypełniono 400 μl izopropanolu.

Po okresie inkubacji, próbki pozostawiono w lodzie na 5 minut i krótko odwirowano w mikrowirówce. Do każdej próbki dodano 5 μl RNAzy A (10 mg/ml) i próbki obrócono około 20 razy. Próbki ponownie krótko odwirowano w mikrowirówce i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 30 minut.

PL 210 988 B1

Do każdej próbki dodano 170 μΐ 7,5 M octanu amonu i próbki wytrząsano przez około 2 minuty do wytrącenia białka. Następnie próbki krótko odwirowano w mikrowirówce, pozostawiono w lodzie na 15 min. i następnie ponownie wirowano przez 15 minut. Nadsącze zachowano i umieszczono we wcześniej przygotowanych probówkach testowych zawierających izopropanol, które następnie delikatnie obrócono około 50 razy dla wytrącenia DNA. Próbki testowe odwirowano następnie przy maksymalnych obrotach przez 15 minut. Nadsącze z tego wirowania odrzucono i osady DNA wypłukano raz 300 pl 95% etanolu i dwukrotnie 300 μl 70% etanolu. Po wysuszeniu przez noc osady DNA wypłukano i zawieszono w 50 μl podwójnie destylowanej H₂O dla dalszej analizy.

P r z y k ł a d 2

Oznaczenie PM1

Analizę polimorfizmu konformacyjnego jednoniciowych cząsteczek (SSCP) przeprowadzono przez denaturację produktów dwóch rund PCR, co wybiórczo namnożyło obszar genu AHAS1 z Brassica, który odpowiada mutacji PM1, znajdującej się w obszarze otaczającym miejsce 1874 SEQ ID NO: 1-4 i pozwolono każdej jednoniciowej cząsteczce na częściowe wytworzenie dwuniciowej struktury. Konformacja każdej jednoniciowej cząsteczki, wraz z jej sekwencją nukleotydową, określa jej ruchliwość w nie denaturującym żelu.

A. Etap amplifikacji specyficzny dla AHAS1.

Warunki użyte dla pierwszej rundy amplifikacji przez PCR podano w Tabeli 2. Starter lewy specyficzny dla AHAS1, użyty w pierwszym etapie amplifikacji ma sekwencję 5' CACAAGTCTCGTGTTATAAAAC 3' (SEQ ID NO: 9) i użyty starter prawy specyficzny dla AHAS1 ma sekwencję 5' CATTGAGTGCCAAACATATGAA 3' (SEQ ID NO: 10). Do amplifikacji przez PCR użyto termocykler Tetrad (MJ Research). Pierwsza runda reakcji PCR obejmuje wstępną denaturację przez 5 minut w 94°C, a następnie 25 cykli (30 sek. w 94°C, 1 minuta w 60°C, 1 min. w 72°C) z ostatecznym wydłużeniem przez 10 min. w 72°C. Do 2 μl produktu pierwszej rundy amplifikacji, dodano 0,5 jednostki ExoI (egzonukleaza I) i inkubowano w 37°C przez 1 godzinę przed inaktywacją enzymu w 72°C przez 15 minut. Po reakcji ExoI dodano 100 μl dejonizowanej, destylowanej wody (DDH₂O).

T a b e l a 2

	Końcowe stężenie
Genomowy DNA	± 10 ng
Bufor (BRL - 10 x)	1 x
MgCl2 (BRL - 50 mM)	2,5 mM
DNTP	0,2 mM
Starter lewy	0,5 pM
Starter prawy	0,5 pM
Taq (BRL - 5 U/pl)	0,4 U
H2O	do 15 pl

B. Etap specyficznej amplifikacji PM1

Warunki zastosowane w drugiej rundzie amplifikacji PCR przedstawiono w Tabeli 3. Reakcja obejmuje początkową denaturację przez 5 minut w 94°C, a następnie 35 cykli (30 sek. w 94°C, 1 minuta w 65°C, 1 min. w 72°C) z ostatecznym wydłużeniem przez 10 min. w 72°C. Startery specyficzne dla PM1 są zakotwiczone w starterach użytych dla amplifikacji genu AHAS1 i co za tym idzie specyficznie amplifikują rejon otaczający pozycję 1874 SEQ ID NO: 1-4. Specyficzny dla PM1 starter lewy użyty w drugim etapie amplifikacji ma sekwencję 5' CATACCTGTTGGATGTGATAT 3' (SEQ ID NO: 11) i starter prawy specyficzny dla PM1 ma sekwencję 5' AAACAACAACAGCGAGTACGT 3' (SEQ ID NO: 12).

PL 210 988 B1

T a b e l a 3

	Końcowe stężenie
Rozcieńczony produkt PCR AHAS1	1 μΙ
Bufor (BRL - 10 x)	1 x
MgCl2 (BRL - 50 mM)	2 mM
DNTP	0,2 mM
Starter lewy	0,5 μΜ
Starter prawy	0,5 μΜ
Taq (BRL - 5 U/μ!)	0,4 U
H2O	do 15 μΙ

C. Analiza SSCP produktów amplifikacji PM1.

Dodano roztwór hamujący zawierający 8 M mocznik, błękit bromofenolowy, ksylen cyjanol i oranż G, do końcowego stężenia 5 M. Mieszaninę zdenaturowano przez 10 minut w 90°C i szybko schłodzono w lodzie. SSCP analizowano przez elektroforezę w 12% nie denaturującym żelu akrylamid/bisakrylamid (49:1) w 0,5 x buforze Tris, boran, EDTA (TBE). Rozdział w żelach prowadzono przy stałym natężeniu prądu 17 mA przez 20-24 godziny w 4°C. DNA uwidoczniono przez barwienie srebrem. Otrzymany żel jednoznacznie i dokładnie wykrywał występowanie lub brak odporności na imidazolinon (PM1) i wrażliwości (typ dziki) we wszystkich badanych szczepach.

P r z y k ł a d 3

Oznaczenie PM2

W oznaczeniu tym wykorzystano pierwszą rundę PCR amplifikującą wybiórczo gen AHAS3, a następnie produkt amplifikacji podzielono na dwie próbki. Każdą próbkę amplifikowano następnie niezależnie, przy pomocy zestawów trzech starterów zakotwiczonych w tych, użytych dla amplifikacji genu AHAS3. Trzy startery wybiórczo amplifikują obszar genu AHAS3 odpowiadający mutacji PM2, która jest w obszarze otaczającym pozycję 1712 w SEQ ID NO: 5-8. Oddzielne etapy PCR przeprowadzono dla każdej próbki, jeden z nich wybiórczo namnażał kwasy nukleinowe z mutacją PM2 i jeden wybiórczo namnażał kwasy nukleinowe typu dzikiego. Obecność typu dzikiego lub PM2 wykryto przez elektroforezę w żelu.

A. Etap specyficznej amplifikacji AHAS3.

Warunki użyte w pierwszej rundzie amplifikacji przedstawiono w Tabeli 4. Starter lewy specyficzny dla AHAS3 użyty w amplifikacji miał sekwencję 5' CACAAGCCTCGTGTTATAAAAA 3' (SEQ ID NO: 13) i starter prawy specyficzny dla AHAS3 miał sekwencję 5' CATTGAGTGCCAAACATTATGTA 3' (SEQ ID NO: 14). Reakcje PCR obejmują wstępną denaturację przez 5 minut w 94°C, a następnie 25 cykli (30 sek. w 94°C, 1 minuta w 60°C, 1 sek. w 72°C) z ostatecznym wydłużeniem przez 10 min.

w 72°C. Do 2 μ l produktu PCR dodano 0,5 jednostki ExoI i inkubowano w 37°C przez 1 h, przed inaktywacją enzymu w 72°C przez 15 minut. Po reakcji ExoI dodano 100 μΐ DDH₂O.

T a b e l a 4

	Końcowe stężenie
Genomowy DNA	±10 ng
Bufor (BRL - 10 x)	1 x
MgCl2 (BRL - 50 mM)	2,5 mM
DNTP	0,2 mM
Starter lewy	0,5 μM
Starter prawy	0,5 μM
Taq (BRL - 5 U/μΙ)	0,4 U
H2O	do 15 μΙ

PL 210 988 B1

B. Etapy amplifikacji specyficznej dla regionu PM2.

Warunki użyte dla drugiej rundy zakotwiczonego PCR z różnymi zestawami starterów opisano w Tabeli 5. Startery specyficzne dla regionu PM2 są zakotwiczone w starterach uż ytych dla amplifikacji genu AHAS3, co za tym idzie specyficznie amplifikują region otaczający pozycję 1712 SEQ ID NO: 5-8. Lewy starter specyficzny dla regionu PM2 (PM2 F w Tabeli 5) ma sekwencję 5' ACTCGGAGCTATGGGTTTC 3' (SEQ ID NO: 15) i starter prawy specyficzny dla regionu PM2 (PM2 R w Tabeli 5) ma sekwencję 5' ATCCAACAGGTACGGTCCA 3' (SEQ ID NO: 16). Starter dla amplifikacji specyficznej dla allelu typu dzikiego w pozycji 1712 (PM2 sus w Tabeli 5) ma sekwencję 5' TGGGATGGTCATGCAATG 3' (SEQ ID NO: 17) i starter specyficzny dla mutacji PM2 (PM2 res w Tabeli 5) ma sekwencję 5' CTTGGGATGGTCATGCAATT 3' (SEQ ID NO: 18). Warunki cykli dla etapów drugiej i trzeciej amplifikacji są jak następuje: wstę pna denaturacja przez 5 minut w 94°C, a nastę pnie 38 cykli (30 sek. w 94°C, 45 sek. w 65°C, 60 sek. w 72°C) z ostatecznym wydłużeniem przez 10 min. w 72°C.

T a b e l a 5

	Typ dziki	PM2
Rozcieńczony produkt PCR AHAS3	1 μί	1 μί
Bufor (BRL - 10 x)	1 x	1 x
MgCl2 (BRL - 50 mM)	2 mM	2 mM
dNTP	0,2 mM	0,2 mM
PM2 F	0,5 μΜ	0,5 μM
PM2 res		0,5 μM
PM2 sus	0,5 μΜ
PM2 R	0,5 μΜ	0,5 μM
Taq (BRL - 5 U/μί)	0,4 U	0,4 U
H2O	do 15 μί	do 15 μί

Po zakończeniu amplifikacji, do wszystkich reakcji dodano 6x bufor do nanoszenia (4 g sacharozy, 2,4 ml 0,5 M EDTA, błękit bromofenolowy, ksylen cyjanol i oranż G do końcowej objętości 10 ml). Produkty drugiego i trzeciego etapu amplifikacji rozdzielano w 3,5% żelu metaphor przez 4 godz. przy 92 V. Każda reakcja amplifikacji dała dwa fragmenty: większy fragment PCR otrzymany dla starterów specyficznych dla rejonu PM2 i mniejszy fragment PCR utworzony przez amplifikację przy pomocy startera specyficznego dla typu dzikiego lub startera specyficznego dla PM2, w kombinacji z prawym starterem specyficznym dla regionu PM2. Większy fragment użyto jako kontrolę pozytywną w reakcji PCR. Mniejszy fragment PCR był produktem PCR specyficznym dla allelu. Żel jasno i precyzyjnie określał obecność lub brak alleli odporności (PM2) i wrażliwości (typ dziki) na imidazolinon we wszystkich zbadanych szczepach.

PL 210 988 B1

Lista sekwencji <110> ADVANTA CANADA <120> Oznaczenie mutacji odporności na imidazolinon u gatunków Brassica <130> 200123-PCT <140>

<141>

<150> 60/421,994 <151> 2002-10-29 <160> 20

< 17 0 >	Patentln	version 3.2
<210>	1
<211>	2087
<212>	DNA
<213>	Brassica	napus

<220> <221> c222> <223>	modyf ikowana (13)..(14) a, c, g, t,	zasada
nieznana	lub inna
<220> <221>	modyfikowana	zasada
<222>	(29) . . (30)
<223>	a, c, g, t,	nieznana	lub inna

<220> <221> <222> <223>	modyfikowana	zasada
(34) . a, c,	. (35) g, t,
nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(44) .	. (45)
<223>	a, c,	g, t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(49) .	• (49)
<223>	a, c,	g, t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(51) .	. (51)
<223>	a, c,	g, t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(56) .	(56)
<223>	a, c,	g, t,	nieznana	lub	inna

PL 210 988 B1 <220>

<221>	modyfikowana zasada
<222>	(110)..(110)
<223>	a, c, g, t, nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana zasada
<222>	(557)..(657)
<223 >	a, c, g, t, nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana zasada
<222>	(749) . . (749)
<223>	a, c, g, t, nieznana	lub	inna

<400> 1

gctaaacctt	ctnncaaatc	ccctctacnn	attnncagat	tctnncttnc	nttctnctta	50
accccacaga	aagactcctc	ccgtctccac	cgtcctctcg	ccatctccgn	cgttctcaac	120
tcacccgtca	atgtcgcacc	tccttcccct	gaaaaaaccg	acaagaacaa	gactttcgtc	180
tcccgctacg	ctcccgacga	gccccgcaag	ggtgctgata	tcctcgtcga	agccctcgag	240
cgtcaaggcg	tcgaaaccgt	ctttgcttat	cccggaggtg	cttccatgga	gatccaccaa	300
gccttgactc	gctcctccac	catccgtaac	gtccttcccc	gtcacgaaca	aggaggagtc	350
ttcgccgccg	agggttacgc	tcgttcctcc	ggcaaaccgg	gaatctgcat	agcoacttcg	420
ggtcccggag	ctaccaacct	cgtcagcggg	ttagcagacg	cgatgcttga	cagtgttcct	480
cttgtcgcca	ttacaggaca	ggtccctcgc	cggatgatcg	gtactgacgc	cttccaagag	540
acaccaatcg	ttgaggtaac	gaggtctatt	acgaaacata	actatttggt	gatggatgtt	600
gatgacatac	ctaggatcgt	tcaagaagct	ttctttctag	ctacttccgg	tagaccngga	660
ccggttttgg	ttgatgttcc	taaggatatt	cagcagcagc	ttgcgattcc	taactgggat	720
caacctatgc	gcttacctgg	ctacatgtnt	aggttgcctc	agcctccgga	agtttctcag	780
ttaggtcaga	tcgttaggtt	gatctcggag	tctaagaggc	ctgttttgta	cgttggtggt	840
ggaagcttga	actcgagtga	agaactgggg	agatttgtcg	agcttactgg	gatccccgtt	900
gcgagtactt	tgatggggct	tggctcttat	ccttgtaacg	atgagttgtc	cctgcagatg	960
cttggcatgc	acgggactgt	gtatgctaac	tacgctgtgg	agcatagtga	tttgttgctg	1020
gcgtttggtg	ttaggtttga	tgaccgtgtc	acgggaaagc	tcgaggcttt	cgctagcagg	1080
gctaaaattg	tgcacataga	cattgattct	gctgagattg	ggaagaataa	gacacctcac	1140
gtgtctgtgt	gtggtgatgt	aaagctggct	ttgcaaggga	tgaacaaggt	tcttgagaac	1200
cgggcggagg	agctcaagct	tgatttcggt	gtttggagga	gtgagttgag	cgagcagaaa	12 6 0
cagaagttcc	ctttgagctt	caaaacgttt	ggagaagcca	ttcctccgca	gtacgcgatt	1320
cagatcctcg	acgagctaac	cgaagggaag	gcaattatca	gtactggtgt	tggacagcat	1380

PL 210 988 B1

cagatgtggg	cggcgcagtt	ttacaagtac	aggaagccga	gacagtggct	gtcgtcatca	1440
ggcctcggag	ctatgggttt	tggacttcct	gctgcgattg	gagcgtctgt	ggcgaaccct	1500
gatgcgattg	ttgtggatat	tgacggtgat	ggaagcttca	taatgaacgt	tcaagagctg	1560
gccacaatcc	gtgtagagaa	tcttcctgtg	aagatactct	tgttaaacaa	ccagcatctt	1620
gggatggtca	tgcaatggga	agatcggttc	tacaaagcta	acagagctca	cacttatctc	1680
ggggacccgg	caagggagaa	cgagatcttc	cctaacatgc	tgcagtttgc	aggagcttgc	1740
gggattccag	ctgcgagagt	gacgaagaaa	gaagaactcc	gagaagctat	tcagacaatg	1800
ctggatacac	caggaccata	cctgttggat	gtgatatgtc	cgcaccaaga	acatgtgtta	1860
ccgatgatcc	caaa;tggtgg	cactttcaaa	gatgtaataa	cagaagggga	tggtcgcact	1920
aagtactgag	agatgaagct	ggtgatcgat	catatggtaa	aagacttagt	ttcagtttcc	1980
agtttctttt	gtgtggtaat	ttgggtttgt	cagttgttgt	actacttttg	gttgttccca	2040
gacgtactcg	ctgttgttgt	tttgtttcct	ttttctttta	tatataa		2087
<210> 2 <211> 2003 <212> DNA <213> Brassica napus

<220>

<221> modyfikowana zasada <222> (25)..(25) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna < 2 2 0 >

<22l> modyfikowana zasada <222> (64) . . (64) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (98) . . (98) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1628) . . (1628) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1698) . . (1698) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1719)..(1719) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna

PL 210 988 B1 <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1733) . . (1733) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1969)..(1969) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <400> 2

gtctccaccg	tcctctcgcc	atctncgccg	ttctcaaotc	acccgtcaat	gtcgcacctc	60
cttnccctga	aaaaaccgac	aagaacaaga	ctttcgtntc	ccgotacgct	cccgacgagc	120
cccgcaaggg	tgctgatatc	ctcgtcgaag	ccctcgagcg	tcaaggcgtc	gaaaccgtct	180
ttgcttatcc	cggaggtgct	tccatggaga	tccaccaagc	cttgactcgc	tcctccacca	240
tccgtaacgt	ccttccccgt	cacgaacaag	gaggagtctt	cgccgccgag	ggttacgctc	300
gttcctccgg	caaaccggga	atctgcatag	ccacttcggg	tcccggagct	accaacctcg	360
tcagcgggtt	agcagacgcg	atgcttgaca	gtgttcctct	tgtcgccatt	acaggacagg	420
tccctcgccg	gatgatcggt	actgacgcct	tccaagagac	accaatcgtt	gaggtaacga	480
ggtctattac	gaaacataac	tatttggtga	tggatgttga	tgacatacct	aggatcgttc	540
aagaagcttt	ctttctagct	acttccggta	gacccggacc	ggttttggtt	gatgttccta	600
aggatattca	gcagcagctt	gcgattccta	actgggatca	acctatgcgc	ttacctggct	660
acatgtctag	gttgcctcag	cctccggaag	tttctcagtt	aggtcagatc	gttaggttga	720
tctcggagtc	taagaggcct	gttttgtacg	ttggtggtgg	aagcttgaac	togagtgaag	780
aactggggag	atttgtcgag	cttactggga	tccccgttgc	gagtactttg	atggggcttg	840
gctcttatcc	ttgtaacgat	gagttgtccc	tgcagatgct	tggcatgcac	gggactgtgt	900
atgctaacta	cgctgtggag	catagtgatt	tgttgctggc	gtttggtgtt	aggtttgatg	960
accgtgtcac	gggaaagctc	gaggctttcg	ctagcagggc	taaaattgtg	cacatagaca	1020
ttgattctgc	tgagattggg	aagaataaga	cacctcacgt	gtctgtgtgt	ggtgatgtaa	1080
agctggcttt	gcaagggatg	aacaaggttc	ttgagaaccg	ggcggaggag	ctcaagcttg	1140
atttcggtgt	ttggaggagt	gagttgagcg	agcagaaaca	gaagttccct	ttgagcttca	1200
aaacgtttgg	agaagccatt	cctccgcagt	acgcgattca	gatcctcgac	gagctaaccg	1260
aagggaaggc	aattatcagt	actggtgttg	gacagcatca	gatgtgggcg	gcgcagtttt	1320
acaagtacag	gaagccgaga	cagtggctgt	cgtcatcagg	cctcggagct	atgggttttg	1380
gacttcctgc	tgcgattgga	gcgtctgtgg	cgaaccctga	tgcgattgtt	gtggatattg	1440
acggtgatgg	aagcttcata	atgaacgttc	aagagctggc	cacaatccgt	gtagagaatc	1500

PL 210 988 B1

ttcctgtgaa	gatactcttg	ttaaacaacc	agcatcttgg	gatggtcatg	caatgggaag	1560
atcggttcta	caaagctaac	agagctcaca	cttatctcgg	ggacccggca	agggagaacg	1620
agatcttncc	taacatgctg	cagtttgcag	gagcttgcgg	gattccagct	gcgagagtga	1680
cgaagaaaga	agaactcnga	gaagctattc	agacaatgnt	ggatacacca	ggnccatacc	1740
tgttggatgt	gatatgtccg	caccaagaac	atgtgttacc	gatgatccca	agtggtggca	1800
ctttcaaaga	tgtaataaca	gaaggggatg	gtcgcactaa	gtactgagag	atgaagctgg	1860
tgatcgatca	tatggtaaaa	gacttagttt	cagtttccag	tttcttttgt	gtggtaattt	1920
gggtttgtca	gttgttgtac	tacttttggt	tgttcccaga	cgtactcgnt	gttgttgttt	1980

tgtttccttt ttcttttata tat 2003 <210> 3 <211> 2077 <212> DNA c213> Brassica napus <220>

c221> modyfikowana zasada <222> (74)..(74) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (83)..(83) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (97)..(97) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (103) . . (103) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (118)..(118) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1035) . . (1035) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <400> 3

ttcttccaaa	tcccctctac	ccatttccag	attctccctt	cccttctcct	taaccccaca	60
gaaagactcc	tccngtctcc	acngtcctct	cgccatntcc	gcngttctca	actcaccngt	120
caatgtcgca	cctccttccc	ctgaaaaaac	cgacaagaac	aagactttcg	tctcccgcta	180

PL 210 988 B1

cgctcccgac	gagccccgca	agggtgctga	tatcctcgtc	gaagccctcg	agcgtcaagg	240
cgtcgaaacc	gtctttgctt	atcccggagg	tgcttccatg	gagatccacc	aagccttgac	300
tcgctcctcc	accatccgta	acgtccttcc	ccgtcacgaa	caaggaggag	tcttcgccgc	360
cgagggttac	gctcgttcct	ccggcaaacc	gggaatctgc	atagccactt	cgggtcccgg	420
agctaccaac	ctcgtcagcg	ggttagcaga	cgcgatgctt	gacagtgttc	ctcttgtcgc	480
cattacagga	caggtccctc	gccggatgat	cggtactgac	gccttccaag	agacaccaat	540
cgttgaggta	acgaggtcta	ttacgaaaca	taactatttg	gtgatggatg	ttgatgacat	600
acctaggatc	gttcaagaag	ctttctttct	agctacttcc	ggtagacccg	gaccggtttt	660
ggttgatgtt	cctaaggata	ttcagcagca	gcttgcgatt	cctaactggg	atcaacctat	720
gcgcttacct	ggctacatgt	ctaggttgcc	tcagcctccg	gaagtttctc	agttaggtca	780
gatcgttagg	ttgatctcgg	agtctaagag	gcctgttttg	tacgttggtg	gtggaagctt	840
gaactcgagt	gaagaactgg	ggagatttgt	cgagcttact	gggatccccg	ttgcgagtac	900
tttgatgggg	cttggctctt	atccttgtaa	cgatgagttg	tccctgcaga	tgcttggcat	960
gcacgggact	gtgtatgcta	actacgctgt	ggagcatagt	gatttgttgc	tggcgtttgg	1020
tgttaggttt	gatgnccgtg	tcacgggaaa	gctcgaggct	ttcgctagca	gggctaaaat	1080
tgtgcacata	gacattgatt	ctgctgagat	tgggaagaat	aagacacctc	acgtgtctgt	1140
gtgtggtgat	gtaaagctgg	ctttgcaagg	gatgaacaag	gttcttgaga	accgggcgga	1200
ggagctcaag	cttgatttcg	gtgtttggag	gagtgagttg	agcgagcaga	aacagaagtt	1260
ccctttgagc	ttcaaaacgt	ttggagaagc	cattcctccg	cagtacgcga	ttcagatcct	1320
cgacgagcta	accgaaggga	aggcaattat	cagtactggt	gttggacagc	atcagatgtg	1380
ggcggcgcag	ttttacaagt	acaggaagcc	gagacagtgg	ctgtcgtcat	caggcctcgg	1440
agctatgggt	tttggacttc	ctgctgcgat	tggagcgtct	gtggcgaacc	ctgatgcgat	1500
tgttgtggat	attgacggtg	atggaagctt	cataatgaac	gttcaagagc	tggccacaat	1 560
ccgtgtagag	aatcttcctg	tgaagatact	cttgttaaac	aaccagcatc	ttgggatggt	1620
catgcaatgg	gaagatcggt	tctacaaagc	taacagagct	cacacttatc	tcggggaccc	1680
ggcaagggag	aacgagatct	tccctaacat	gctgcagttt	gcaggagctt	gcgggattcc	1740
agctgcgaga	gtgacgaaga	aagaagaact	ccgagaagct	attcagacaa	tgctggatac	1800
accaggacca	tacctgttgg	atgtgatatg	tccgcaccaa	gaacatgtgt	taccgatgat	1860
cccaaatggt	ggcactttca	aagatgtaat	aacagaaggg	gatggtcgca	ctaagtactg	1920
agagatgaag	ctggtgatcg	atcatatggt	aaaagactta	gtttcagttt	ccagtttctt	1980

PL 210 988 B1 ttgtgtggta atttgggttt gtcagttgtt gtactacttt tggttgttcc cagacgtact 2040 cgctgttgtt gttttgtttc ctttttcttt tatatat 2077 <210> 4 <211> 1990 <212> DNA <213> Brassica napus <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (2)..(2) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

c221> modyfikowana zasada <222> (8)..(8) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (29)..(29) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada e222> (32)..(32) <223> a, c, g, t, nieznana lub innar <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (80)..(80) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (89)..(89) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (98)..(98) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna c220>

<221> modyfikowana zasada <222> (652)..(652) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <220>

<221> modyfikowana zasada <222> (1350)..(1350) <223> a, c, g, t, nieznana lub inna <400> 4 tngccatntc cgccgttctc aactcaccng tnaatgtcgc acctccttcc cotgaaaaaa 60 ccgacaagaa caagactttn gtctcccgnt acgctccnga cgagccccgc aagggtgctg 120

PL 210 988 B1

atatcctcgt	cgaagccctc	gagcgtcaag	gcgtcgaaac	cgtctttgct	tatcccggag	180
gtgcttccat	ggagatccac	caagccttga	ctcgctcctc	caccatccgt	aacgtccttc	240
cccgtcacga	acaaggagga	gtcttcgccg	ccgagggtta	cgctcgttcc	tccggcaaac	300
cgggaatctg	catagccact	tcgggtcccg	gagctaccaa	cctcgtcagc	gggttagcag	360
acgcgatgct	tgacagtgtt	cctct tgtcg	ccattacagg	acaggtccct	cgccggatga	420
tcggtactga	cgccttccaa	gagacaccaa	tcgttgaggt	aacgaggtct	attacgaaac	480
ataactattt	ggtgatggat	gttgatgaca	tacctaggat	cgttcaagaa	gctttctttc	540
tagctacttc	cggtagaccc	ggaccggttt	tggttgatgt	tcctaaggat	attcagcagc	600
agcttgcgat	tcctaactgg	gatcaaccta	tgcgcttacc	tggctacatg	tntaggttgc	660
ctcagcctcc	ggaagtttct	cagttaggtc	agatcgttag	gttgatctcg	gagtctaaga	720
ggcctgtttt	gtacgttggt	ggtggaagct	tgaactcgag	tgaagaactg	gggagatttg	780
tcgagcttac	tgggatcccc	gttgcgagta	ctttgatggg	gcttggctct	tatccttgta	840
acgatgagtt	gtccctgcag	atgcttggca	tgcacgggac	tgtgtatgct	aactacgctg	900
tggagcatag	tgatttgttg	ctggcgtttg	gtgttaggtt	tgatgaccgt	gtcacgggaa	960
agctcgaggc	tttcgctagc	agggctaaaa	ttgtgcacat	agacattgat	tctgctgaga	1020
ttgggaagaa	taagacacct	cacgtgtctg	tgtgtggtga	tgtaaagctg	gctttgcaag	1080
ggatgaacaa	ggttcttgag	aaccgggcgg	aggagctcaa	gcttgatttc	ggtgtttgga	1140
ggagtgagtt	gagcgagcag	aaacagaagt	tccctttgag	cttcaaaacg	tttggagaag	1200
ccattcctcc	gcagtacgcg	attcagatcc	tcgacgagct	aaccgaaggg	aaggcaatta	1260
tcagtactgg	tgttggacag	catcagatgt	gggcggcgca	gttttacaag	tacaggaagc	1320
cgagacagtg	gctgtcgtca	tcaggcctcn	gagctatggg	ttttggactt	cctgctgcga	1380
ttggagcgtc	tgtggcgaac	cctgatgcga	ttgttgtgga	tattgacggt	gatggaagct	1440
tcataatgaa	cgttcaagag	ctggccacaa	tccgtgtaga	gaatcttcct	gtgaagatac	1500
tcttgttaaa	caaccagcat	cttgggatgg	tcatgcaatg	ggaagatcgg	ttctacaaag	1560
ctaacagagc	tcacacttat	ctcggggacc	cggcaaggga	gaacgagatc	ttccctaaca	1620
tgctgcagtt	tgcaggagct	tgcgggattc	cagctgcgag	agtgacgaag	aaagaagaac	1680
tccgagaagc	tattcagaca	atgctggata	caccaggacc	atacctgttg	gatgtgatat	1740
gtccgcacca	agaacatgtg	ttaccgatga	tcccaagtgg	tggcactttc	aaagatgtaa	1800
taacagaagg	ggatggtcgc	actaagtact	gagagatgaa	gctggtgatc	gatcatatgg	1860
taaaagactt	agtttcagtt	tccagtttct	tttgtgtggt	aatttgggtt	tgtcagttgt	1920

PL 210 988 B1 tgtactactt ttggttgttc ccagacgtac tcgctgttgt tgttttgttt cctttttctt 1980 ttatatataa 1990

<210>	5
<211>	2025
<212>	DNA
<213>	Brassica napus

<220> <221> <222> <223 >	modyfikowana	zasada
(31) . a, c,	(31) g, t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(709)	..(709)
<223>	a, c,	g. t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(979)	..(979)
<223>	a, c,	g, t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(990)	. . (1273	)
<223>	a, c,	g, t,	nieznana	lub	inna

<400> 5

ttctccttaa	ccccacagaa	accctcctcc	ngtctccacc	gtccactcgc	catctccgcc	60
gttctcaact	cacccgtcaa	tgtcgcacct	gaaaaaaccg	acaagatcaa	gactttcatc	120
tcccgctacg	ctcccgacga	gccccgcaag	ggtgctgata	tcctcgtgga	agccctcgag	180
cgtcaaggcg	tcgaaaccgt	cttcgcttat	cccggaggtg	cctccatgga	gatccaccaa	240
gccttgactc	gctcctccac	catccgtaac	gtcctccccc	gtcacgaaca	aggaggagtc	300
ttcgccgccg	agggttacgc	tcgttcctcc	ggcaaaccgg	gaatctgcat	agccacttcg	360
ggtcccggag	ctaccaacct	cgtcagcggg	ttagccgacg	cgatgcttga	cagtgttcct	420
ctcgtcgcca	tcacaggaca	ggtccctcgc	cggatgatcg	gtactgacgc	gttccaagag	480
acgccaatcg	ttgaggtaac	gaggtctatt	acgaaacata	actatctggt	gatggatgtt	540
gatgacatac	ctaggatcgt	tcaagaagca	ttctttctag	ctacttccgg	tagacccgga	600
ccggttttgg	ttgatgttcc	taaggatatt	cagcagcagc	ttgcgattcc	taactgggat	660
caacctatgc	gcttgcctgg	ctacatgtct	aggctgcctc	agccaccgna	agtttctcag	720
ttaggccaga	tcgttaggtt	gatctcggag	tctaagaggc	ctgttttgta	cgttggtggt	780
ggaagcttga	actcgagtga	agaactgggg	agatttgtcg	agcttactgg	gatccctgtt	840
gcgagtacgt	tgatggggct	tggctcttat	ccttgtaacg	atgagttgtc	cctgcagatg	900

PL 210 988 B1

cttggcatgc	acgggactgt	gtatgctaac	tacgctgtgg	agcatagtga	tttgttgctg	960
gcgtttggtg	ttaggtttna	tgaccgtgtn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	1020
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	10 8 0
nnnnnnrmnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	1140
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	1200
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	1260
nnnnnnnnnn	nnnagctaac	ccaagggaag	gcaattatca	gtactggtgt	tggacagcat	1320
cagatgtggg	cggcgcagtt	ttacaagtac	aggaagccga	ggcagtggct	gtcgtcctca	1380
ggactcggag	ctatgggttt	cggacttcct	gctgcgattg	gagcgtctgt	ggcgaaccct	1440
gatgcgattg	ttgtggacat	tgacggtgat	ggaagcttca	taatgaacgt	tcaagagctg	1500
gccacaatcc	gtgtagagaa	tcttcctgtg	aagatactct	tgttaaacaa	ccagcatctt	1560
gggatggtca	tgcaatggga	agatcggttc	tacaaagcta	acagagctca	cacttatctc	1620
ggggacccgg	caagggagaa	cgagatcttc	cctaacatgc	tgcagtttgc	aggagcttgc	1680
gggattccag	ctgcgagagt	gacgaagaaa	gaagaactcc	gagaagctat	tcagacaatg	1740
ctggatacac	ctggaccgta	cctgttggat	gtcatctgtc	cgcaccaaga	acatgtgtta	1800
ccgatgatcc	caagtggtgg	cactttcaaa	gatgtaataa	ccgaagggga	tggtcgcact	1860
aagtactgag	agatgaagct	ggtgatccat	catatggtaa	aagacttagt	ttcagttttc	1920
agtttctttt	gtgtggtaat	ttgggtttgt	cagttgttgt	actgcttttg	gtttgttccc	1980
agacttactc	gctgttgttg	ttttgtttcc	tttttctttt	atata		2025

<210>	6
•<211>	2160
<212>	DNA
<213>	Brassica napus
<400>	6

tcattcatca	tctctctctc	atttctctct	ctctctcatc	taaccatggc	ggcggcaaca	60
tcgtcttctc	cgatctcctt	aaccgctaaa	ccttcttcca	aatcccctct	acccatttcc	120
agattetccc	ttcccttctc	cttaacccca	cagaaaccct	cctcccgtct	ccaccgtcca	180
ctcgccatct	ccgccgttct	caactcaccc	gtcaatgtcg	cacctgaaaa	aaccgacaag	240
atcaagactt	tcatctcccg	ctacgctccc	gacgagcccc	gcaagggtgc	tgatatcctc	300
gtggaagccc	tcgagcgtca	aggcgtcgaa	accgtcttcg	cttatcccgg	aggtgcctcc	360
atggagatcc	accaagcctt	gactcgctcc	tccaccatcc	gtaacgtcct	cccccgtcac	420
gaacaaggag	gagtcttcgc	cgccgagggt	tacgctcgtt	cctccggcaa	accgggaatc	480

PL 210 988 B1

tgcatagcca	cttcgggtcc	cggagctacc	aacctcgtca	gcgggttagc	cgacgcgatg	540
cttgacagtg	ttcctctcgt	cgccatcaca	ggacaggtcc	ctcgccggat	gatcggtact	600
gacgcgttcc	aagagacgcc	aatcgttgag	gtaacgaggt	ctattacgaa	acataactat	660
ctggtgatgg	atgttgatga	catacctagg	atcgttcaag	aagcattctt	tctagctact	720
tccggtagac	ccggaccggt	tttggttgat	gttcctaagg	atattcagca	gcagcttgcg	780
attcctaact	gggatcaacc	tatgcgcttg	cctggctaca	tgtctaggct	gcctcagcca	840
ccggaagttt	ctcagttagg	ccagatcgtt	aggttgatct	cggagtctaa	gaggcctgtt	900
ttgtacgttg	gtggtggaag	cttgaactcg	agtgaagaac	tggggagatt	tgtcgagctt	960
actgggatcc	ctgttgcgag	tacgttgatg	gggcttggct	cttatccttg	taacgatgag	1020
ttgtccctgc	agatgcttgg	catgcacggg	actgtgtatg	ctaactacgc	tgtggagcat	1080
agtgatttgt	tgctggcgtt	tggtgttagg	tttgatgacc	gtgtcacggg	aaagctcgag	1140
gcgtttgcga	gcagggctaa	gattgtgcac	atagacattg	attctgctga	gattgggaag	1200
aataagacac	ctcacgtgtc	tgtgtgtggt	gatgtaaagc	tggctttgca	agggatgaac	1260
aaggttcttg	agaaccgggc	ggaggagctc	aagcttgatt	tcggtgtttg	gaggagtgag	1320
ttgagcgagc	agaaacagaa	gttcccgttg	agcttcaaaa	cgtttggaga	agccattcct	1380
ccgcagtacg	cgattcaggt	cctagacgag	ctaacccaag	ggaaggcaat	tatcagtact	1440
ggtgttggac	agcatcagat	gtgggcggcg	cagttttaca	agtacaggaa	gccgaggcag	1500
tggctgtcgt	cctcaggact	cggagctatg	ggtttcggac	ttcctgctgc	gattggagcg	1560
tctgtggcga	accctgatgc	gattgttgtg	gacattgacg	gtgatggaag	cttcataatg	1620
aacgttcaag	agctggccac	aatccgtgta	gagaatcttc	ctgtgaagat	actcttgtta	1680
aacaaccagc	atcttgggat	ggtcatgcaa	ttggaagatc	ggttctacaa	agctaacaga	1740
gctcacactt	atctcgggga	cccggcaagg	gagaacgaga	tcttccctaa	catgctgcag	1800
tttgcaggag	cttgcgggat	tccagctgcg	agagtgacga	agaaagaaga	actccgagaa	1860
gctattcaga	caatgctgga	tacacctgga	ccgtacctgt	tggatgtcat	ctgtccgcac	1920
caagaacatg	tgttaccgat	gatcccaagt	ggtggcactt	tcaaagatgt	aataaccgaa	1980
ggggatggtc	gcactaagta	ctgagagatg	aagctggtga	tccatcatat	ggtaaaagac	2040
ttagtttcag	ttttcagttt	cttttgtgtg	gtaatttggg	tttgtcagtt	gttgtactgc	2100
ttttggtttg	ttcccagact	tactcgctgt	tgttgttttg	tttccttttt	cttttatata	2160

<210> 7 <211> 1994 <212> DNA

PL 210 988 B1

<213>	Brassica napus
<220>
<221>	modyfikowana zasada
<222>	(9) . . (9}
<223>	a, c, g, t, nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana zasada
<222>	(23)..(23)
<223>	a, c, g, t, nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana zasada
< 2 2 2 >	(95)..(95)
<223>	a, c, g, t, nieznana	lub	inna
<220>
<221:=	modyfikowana zasada
<222>	(678)..(678)
<223>	a, c, g, t, nieznana	lub	inna

400> 7

gtctccacng	tccactcgcc	atntccgccg	ttctcaactc	acccgtcaat	gtcgcacctg	60
aaaaaaccga	caagatcaag	actttcatct	cccgntacgc	tcccgacgag	ccccgcaagg	120
gtgctgatat	cctcgtggaa	gccctcgagc	gtcaaggcgt	cgaaaccgtc	ttcgcttatc	180
ccggaggtgc	ctccatggag	atccaccaag	ccttgactcg	ctcctccacc	atccgtaacg	240
tcctcccccg	tcacgaacaa	ggaggagtct	tcgccgccga	gggttacgct	cgttcctccg	300
gcaaaccggg	aatctgcata	gccacttcgg	gtcccggagc	taccaacctc	gtcagcgggt	360
tagccgacgc	gatgcttgac	agtgttcctc	tcgtcgccat	cacaggacag	gtccctcgcc	420
ggatgatcgg	tactgacgcg	ttccaagaga	cgccaatcgt	tgaggtaacg	aggtctatta	480
cgaaacataa	ctatctggtg	atggatgttg	atgacatacc	taggatcgtt	caagaagcat	540
tctttctagc	tacttccggt	agacccggac	cggttttggt	tgatgttcct	aaggatattc	600
agcagcagct	tgcgattcct	aactgggatc	aacctatgcg	cttgcctggc	tacatgtcta	660
ggctgcctca	gccaccgnaa	gtttctcagt	taggccagat	cgttaggttg	atctcggagt	720
ctaagaggcc	tgttttgtac	gttggtggtg	gaagcttgaa	ctcgagtgaa	gaactgggga	780
gatttgtcga	gcttactggg	atccctgttg	cgagtacgtt	gatggggctt	ggctcttatc	840
cttgtaacga	tgagttgtcc	ctgcagatgc	ttggcatgca	cgggactgtg	tatgctaact	900
acgctgtgga	gcatagtgat	ttgttgctgg	cgtttggtgt	taggtttgat	gaccgtgtca	960
cgggaaagct	cgaggcgttt	gcgagcaggg	ctaagattgt	gcacatagac	attgattctg	1020
ctgagattgg	gaagaataag	acacctcacg	tgtctgtgtg	tggtgatgta	aagctggctt	1080
tgcaagggat	gaacaaggtC	cttgagaacc	gggcggagga	gctcaagctt	gatttcggtg	1140

PL 210 988 B1

tttggaggag	tgagttgagc	gagcagaaac	agaagttccc	gttgagcttc	aaaacgtttg	1200
gagaagccat	tcctccgcag	tacgcgattc	aggtcctaga	cgagctaacc	caagggaagg	1260
caattatcag	tactggtgtt	ggacagcatc	agatgtgggc	ggcgcagttt	tacaagtaca	1320
ggaagccgag	gcagtggctg	tcgtcctcag	gactcggagc	tatgggtttc	ggacttcctg	1380
ctgcgattgg	agcgtctgtg	gcgaaccctg	atgcgattgt	tgtggacatt	gacggtgatg	1440
gaagcttcat	aatgaacgtt	caagagctgg	ccacaatccg	tgtagagaat	cttcctgtga	1500
agatactctt	gttaaacaac	cagcatcttg	ggatggtcat	gcaattggaa	gatcggttct	1560
acaaagctaa	cagagctcac	acttatctcg	gggacccggc	aagggagaac	gagatcttcc	1620
ctaacatgct	gcagtttgca	ggagcttgcg	ggattccagc	tgcgagagtg	acgaagaaag	1680
aagaactccg	agaagctatt	cagacaatgc	tggatacacc	tggaccgtac	ctgttggatg	1740
tcatctgtcc	gcaccaagaa	catgtgttac	cgatgatccc	aagtggtggc	actttcaaag	1800
atgtaataac	cgaaggggat	ggtcgcacta	agtactgaga	gatgaagctg	gtgatccatc	1860
atatggtaaa	agacttagtt	tcagttttca	gtttcttttg	tgtggtaatt	tgggtttgtc	1920
agttgttgta	ctgcttttgg	tttgttccca	gacttactcg	ctgttgttgt	tttgtttcct	1980
ttttctttta	tata					1994

<210> 8 <211> 1950 <212> DNA <213> Brassica napus <220>

<221> <222> <223>	modyfikowana (51)..(51) a, c , g, t,	zasada nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(634)..(634)
< 2 2 3 >	a, c, g, t,	nieznana	lub	inna
<220>
<221>	modyfikowana	zasada
<222>	(996)..(996)
<223>	a, c, g, t,	nieznana	lub	inna

<400> 8

gtcaatgtcg	cacctgaaaa	aaccgacaag	atcaagactt	tcatctcccg	ntacgctccc	60
gacgagcccc	gcaagggtgc	tgatatcctc	gtggaagccc	tcgagcgtca	aggcgtcgaa	120
accgtcttcg	cttatcccgg	aggtgcttcc	atggagatcc	accaagcctt	gactcgctcc	180
tccaccatcc	gtaacgtcct	cccccgtcac	gaacaaggag	gagtcttcgc	cgccgagggt	240

PL 210 988 B1

tacgctcgtt	cctccggcaa	accgggaatc	tgcatagcca	cttcgggtcc	cggagctacc	300
aacctcgtca	gcgggttagc	cgacgcgatg	cttgacagtg	ttcctctcgt	cgccatcaca	360
ggacaggtcc	ctcgccggat	gatcggtact	gacgcgttcc	aagagacgcc	aatcgttgag	420
gtaacgaggt	ctattacgaa	acataactat	ctggtgatgg	atgttgatga	catacctagg	480
atcgttcaag	aagctttctt	tctagctact	tccggtagac	ccggaccggt	tttggttgat	540
gttcctaagg	atattcagca	gcagcttgcg	attcctaact	gggatcaacc	tatgcgcttg	600
cctggctaca	tgtctaggct	gcctcagcca	ccgnaagttt	ctcagttagg	tcagatcgtt	6S0
aggttgatct	cggagtctaa	gaggcctgtt	ttgtacgttg	gtggtggaag	cttgaactcg	720
agtgaagaac	tggggagatt	tgtcgagctt	actgggatcc	ctgttgcgag	tacgttgatg	780
gggcttggct	cttatccttg	taacgatgac	ttgtccctgc	agatgcttgg	catgcacggg	840
actgtgtatg	ctaactacgc	tgtggagcat	agtgatttgt	tgctggcgtt	tggtgttagg	900
tttgatgacc	gtgtcacggg	aaagctcgag	gcgtttgcga	gcagggctaa	gattgtgcac	960
atagacattg	attctgctga	gattgggaag	aataanacac	ctcacgtgtc	tgtgtgtggt	1020
gatgtaaagc	tggctttgca	agggatgaac	aaggttcttg	agaaccgggc	ggaggagctc	1080
aagcttgatt	tcggtgtttg	gaggagtgag	ttgagcgagc	agaaacagaa	gttcccgttg	1140
agcttcaaaa	cgtttggaga	agccattcct	ccgcagtacg	cgattcaggt	cctagacgag	1200
ctaacccaag	ggaaggcaat	tatcagtact	ggtgttggac	agcatcagat	gtgggcggcg	1260
cagttttaca	agtacaggaa	gccgaggcag	tggctgtcgt	cctcaggact	cggagctatg	1320
ggtttcggac	ttcctgctgc	gattggagcg	tctgtggcga	accctgatgc	gattgttgtg	1380
gacattgacg	gtgatggaag	cttcataatg	aacgttcaag	agctggccac	aatccgtgta	1440
gagaatcttc	ctgtgaagat	actcttgtta	aacaaccagc	atcttgggat	ggtcatgcaa	1500
tgggaagatc	ggttctacaa	agctaacaga	gctcacactt	atctcgggga	cccggcaagg	1560
gagaacgaga	tcttccctaa	catgctgcag	tttgcaggag	cttgcgggat	tccagctgcg	1620
agagtgacga	agaaagaaga	actccgagaa	gctattcaga	caatgctgga	tacacctgga	1680
ccgtacctgt	tggatgtcat	ctgtccgcac	caagaacatg	tgttaccgat	gatcccaagt	1740
ggtggcactt	tcaaagatgt	aataaccgaa	ggggatggtc	gcactaagta	ctgagagatg	1800
aagctggtga	tcgatcatat	ggtaaaagac	ttagtttcag	ttttcagttt	cttttgtgtg	1860
gtaatttggg	tttgtcagtt	gttgtactgc	ttttggtttg	ttcccagatt	tactcgctgt	1920
tgttgttttg	tttccttttt	cttttatata				1950

<210> 9

PL 210 988 B1

<211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220;· <223> opis sztucznej sekwencji:	syntetyczny	starter
<400> 9 cacaagtctc gtgttataaa ac			22
<210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> opis sztucznej sekwencji:	syntetyczny	starter
<400> 10 cattgagtgc caaacatatg aa			22
<210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> opis sztucznej sekwencji:	syntetyczny	starter
<400> 11 catacctgtt ggatgtgata t			21
<210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> opis sztucznej sekwencji:	syntetyczny	starter
<400> 12 aaacaacaac agcgagtacg t			21
<210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja
<220> <223> opis sztucznej sekwencji:	syntetyczny	starter

<400> 13 cacaagcctc gtgttataaa aa 22 <210> 14 <211> 23

PL 210 988 B1 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny starter <400> 14 cattgagtgc caaacattat gta <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny starter <400> 15 actcggagct atgggtttc <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny starter <400> 16 atccaacagg tacggtcca <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: syntetyczny starter <400> 17 tgggatggtc atgcaatg

<210>	18
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	opis sztucznej sekwencji: syntetyczny starter
<400>	18
cttgggatgg tcatgcaatt	20
<210>	19
<211>	2378

PL 210 988 B1 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 19

agattcgttt	ctattcatcc	ataattaata	aaaaaaaaag	accaaacaaa	caaaaatcat	SO
attccaaggg	tattttcgta	aacaaacaaa	accctcacaa	gtctcgtttt	ataaaacgat	120
tcacgttcac	aaactcattc	atcatctctc	tctcctctaa	ccatggcggc	ggcaacatcg	180
tcttctccga	tctccttaac	cgctaaacct	tcttccaaat	cccctctacc	catttccaga	240
ttctcccttc	ccttctcctt	aaccccacag	aaagactcct	cccgtctcca	ccgtcctctc	300
gccatctccg	ccgttctcaa	ctcacccgtc	aatgtcgcac	ctccttcccc	tgaaaaaacc	360
gacaagaaca	agactttcgt	ctcccgctac	gctcccgacg	agccccgcaa	gggtgctgat	420
atcctcgtcg	aagccctcga	gcgtcaaggc	gtcgaaaccg	tctttgctta	tcccggaggt	480
gcttccatgg	agatccacca	agccttgact	cgctcctcca	ccatccgtaa	cgtccttccc	540
cgtcacgaac	aaggaggagt	cttcgccgcc	gagggttacg	ctcgttcctc	cggcaaaccg	600
ggaatctgca	tagccacttc	gggtcccgga	gctaccaacc	tcgtcagcgg	gttagcagac	660
gcgatgcttg	acagtgttcc	tcttgtcgcc	attacaggac	aggtccctcg	ccggatgatc	720
ggtactgacg	ccttccaaga	gacaccaatc	gttgaggtaa	cgaggtctat	tacgaaacat	780
aactatttgg	tgatggatgt	tgatgacata	cctaggatcg	ttcaagaagc	tttctttcta	840
gctacttccg	gtagacccgg	accggttttg	gttgatgttc	ctaaggatat	tcagcagcag	900
cttgcgattc	ctaactggga	tcaacctatg	cgcttacctg	gctacatgtc	taggttgcct	960
cagcctccgg	aagtttctca	gttaggtcag	atcgttaggt	tgatctcgga	gtctaagagg	1020
cctgttttgt	acgttggtgg	tggaagcttg	aactcgagtg	aagaactggg	gagatttgtc	1080
gagcttactg	ggatccccgt	tgcgagtact	ttgatggggc	ttggctctta	tccttgtaac	1140
gatgagttgt	ccctgcagat	gcttggcatg	cacgggactg	tgtatgctaa	ctacgctgtg	1200
gagcatagtg	atttgttgct	ggcgtttggt	gttaggtttg	atgaccgtgt	cacgggaaag	1260
ctcgaggctt	tcgctagcag	ggctaaaatt	gtgcacatag	acattgattc	tgctgagatt	1320
gggaagaata	agacacctca	cgtgtctgtg	tgtggtgatg	taaagctggc	tttgcaaggg	1380
atgaacaagg	ttcttgagaa	ccgggcggag	gagctcaagc	ttgatttcgg	tgtttggagg	1440
agtgagttga	gcgagcagaa	acagaagttc	cctttgagct	tcaaaacgtt	tggagaagcc	1500
attcctccgc	agtacgcgat	tcagatcctc	gacgagctaa	ccgaagggaa	ggcaattatc	1560
agtactggtg	ttggacagca	tcagatgtgg	gcggcgcagt	tttacaagta	caggaagccg	1620
agacagtggc	tgtcgtcatc	aggcctcgga	gctatgggtt	ttggacttcc	tgctgcgatt	1680
ggagcgtctg	tggcgaaccc	tgatgcgatt	gttgtggata	ttgacggtga	tggaagcttc	1740

PL 210 988 B1

ataatgaacg ttcaagagct	ggccacaatc	cgtgtagaga	atcttcctgt	gaagatactc	1800
ttgttaaaca accagcatct	tgggatggtc	atgcaatggg	aagatcggtt	ctacaaagct	1860
aacagagctc acacttatct	cggggacccg	gcaagggaga	acgagatctt	ccctaacatg	1920
ctgcagtttg caggagcttg	cgggattcca	gctgcgagag	tgacgaagaa	agaagaactc	1980
cgagaagcta ttcagacaat	gctggataca	ccaggaccat	acctgttgga	tgtgatatgt	2040
ccgcaccaag aacatgtgtt	accgatgatc	ccaagtggtg	gcactttcaa	agatgtaata	2100
acagaagggg atggtcgcac	taagtactga	gagatgaagc	tggtgatcga	tcatatggta	2160
aaagacttag tttcagtttc	cagtttcttt	tgtgtggtaa	tttgggtttg	tcagttgttg	2220
tactactttt ggttgttccc	agacgtactc	gctgttgttg	ttttgtttcc	tttttctttt	2280
atatataaat aaactgcttg	ggtttttttt	catatgtttg	ggactcaatg	caaggaatgc	2340
tactagactg cgattatcta	ctaatcttgc	taggaaat			2378
<210> 20 <211> 2359 <212> DNA <213> Brassica napus
<400> 20 aaagaaaaga ccaaacaaac	aaaaatcata	ttccaagggt	attttcgtaa	acaaacaaaa	60
ccctcacaag cctcgtttta	taaaaacgat	tcacgttcac	aaactcattc	atcatctctc	120
tctcatttct ctctctctct	catctaacca	tggcggcggc	aacatcgtct	tctccgatct	180
ccttaaccgc taaaccttct	tccaaatccc	ctctacccat	ttccagattc	tcccttccct	240
tctccttaac cccacagaaa	ccctcctccc	gtctccaccg	tccactcgcc	atctccgccg	300
ttctcaactc acccgtcaat	gtcgcacctg	aaaaaaccga	caagatcaag	actttcatct	360
cccgctacgc tcccgacgag	ccccgcaagg	gtgctgatat	cctcgtggaa	gccctcgagc	420
gtcaaggcgt cgaaaccgtc	ttcgcttatc	ccggaggtgc	ctccatggag	atccaccaag	480
ccttgactcg ctcctccacc	atccgtaacg	tcctcccccg	tcacgaacaa	ggaggagtct	540
tcgccgccga gggttacgct	cgttcctccg	gcaaaccggg	aatctgcata	gccacttcgg	600
gtcccggagc taccaacctc	gtcagcgggt	tagccgacgc	gatgcttgac	agtgttcctc	660
tcgtcgccat cacaggacag	gtccctcgcc	ggatgatcgg	tactgacgcg	ttccaagaga	720
cgccaatcgt tgaggtaacg	aggtctatta	cgaaacataa	ctatctggtg	atggatgttg	780
atgacatacc taggatcgtt	caagaagcat	tctttctagc	tacttccggt	agacccggac	840
cggttttggt tgatgttcct	aaggatattc	agcagcagct	tgcgattcct	aactgggatc	900
aacctatgcg cttgcctggc	tacatgtcta	ggctgcctca	gccaccggaa	gtttctcagt	960

PL 210 988 B1

taggccagat	cgttaggttg	atctcggagt	ctaagaggcc	tgttttgtac	gttggtggtg	1020
gaagcttgaa	ctcgagtgaa	gaactgggga	gatttgtcga	gcttactggg	atccctgttg	1080
cgagtacgtt	gatggggctt	ggctcttatc	cttgtaacga	tgagttgtcc	ctgcagatgc	1140
ttggcatgca	cgggactgtg	tatgctaact	acgctgtgga	gcatagtgat	ttgttgctgg	1200
cgtttggtgt	taggtttgat	gaccgtgtca	cgggaaagct	cgaggcgttt	gcgagcaggg	1260
ctaagattgt	gcacatagac	attgattctg	ctgagattgg	gaagaataag	acacctcacg	132 0
tgtctgtgtg	tggtgatgta	aagctggctt	tgcaagggat	gaacaaggtt	cttgagaacc	1380
gggcggagga	gctcaagctt	gatttcggtg	tttggaggag	tgagttgagc	gagcagaaac	1440
agaagttccc	gttgagcttc	aaaacgtttg	gagaagccat	tcctccgcag	tacgcgattc	T500
aggtcctaga	cgagctaacc	caagggaagg	caattatcag	tactggtgtt	ggacagcatc	1560
agatgtgggc	ggcgcagttt	tacaagtaca	ggaagccgag	gcagtggctg	tcgtcctcag	1620
gactcggag.	t atgggtttc	ggacttcctg	ctgcgattgg	agcgtctgtg	gcgaaccctg	168 0
atgcgattgi	tgt.ggaca.tt	gacggtgatg	gaagcttcat	aatgaacgtt	caagagctyg	174 0
ccacaatccg	tgtagaga.u t.	ctt.cct.gtga	agatactct.t	gttaaacaac	cągęatcttg	1 8 0 0
ggatggtcat	gcaatgggaa	gatcggttct	ac-aaagct az.	cagagctcac	acttatctcg	1360
gggacccggc	aagggagaac	gagatcttcc	ctaacatgct	gcagtttgca	ggagcttgcg	1920
ggattccagc	tgcgagagtg	acgaagaaag	aagaactccg	agaagctatt	cagacaatgc	1980
tggatacscc	tggsccgtac	ct gt.Lggatg	teat.ct.gtcc	gcaccaagaa	cat.gtgttac	2 04 0
cgatgatccc	aagtggtggc	actttcaaag	atgtaataac	cgaaggggat	ggtcgcacta	2100
agtact.gaga	gatgaagctg	gtgatccatc	atatggtaaa	agacttagtt	tcagttttca	2160
gtttcttttg	tgtggtaatt	tgggtttgtc	agttgttgta	ctgcttttgg	tttgttccca	2220
gacttactcg	ctgttgttgt	tttgtttcct	ttttctttta	tatataaata	aactgcttgg	2280
gtttttttac	ataatgtttg	ggactcaatg	caaggaaatg	ctactagact	gcgattatct	2340
actaatcttg	caaggaaat					2359

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Sposób oznaczania u roślin Brassica tolerancji na herbicyd imidazolinonowy uwarunkowanej przez mutację PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego w genie AHAS1 z B. napus, znamienny tym, że obejmuje:

a) izolowanie z rośliny genomowego DNA;

PL 210 988 B1

f) wykrywanie obecności lub braku miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, na podstawie ruchliwości w substracie wspomnianych konformerów jednoniciowego polinukleotydu otrzymanego w etapie e).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że lewy starter AHAS1 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 9.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prawy starter AHAS1 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 10.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że lewy starter PM1 w etapie d) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 11.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prawy starter PM1 w etapie d) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 12.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap c) obejmuje wbudowanie znacznika do namnożonej części genu AHAS1.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że znacznik jest wybrany z grupy obejmującej znacznik radioaktywny, znacznik fluorescencyjny, znacznik luminescencyjny i znacznik paramagnetyczny.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substrat jest wybrany z grupy obejmującej poliakrylamid, liniowy poliakrylamid, poli(N,N-dimetyloakrylamid), celulozę hydroksylakilową, glikol polietylenowy, F127, agarozę, celulozę dietyloaminoetylową, sefarozę, POP4 i POP6.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sposób wykrywania jest wybrany z grupy obejmującej elektroforezę i chromatografię.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap wykrywania w roślinie obecności lub braku miejsca mutacji PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji polinukleotydowej AHAS3 typu dzikiego, warunkującego odporność na imidazolinon.

11. Sposób oznaczania u rośliny Brassica tolerancji na herbicyd imidazolinonowy uwarunkowanej przez mutację PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji polinukleotydowej AHAS3 typu dzikiego w genie AHAS3 z B. napus, znamienny tym, że obejmuje:

a) izolowanie z rośliny genomowego DNA;

PL 210 988 B1

h) usunięcie starterów AHAS1 z produktu etapu g);

j) denaturowanie produktu piątego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i do przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe; i

k) wykrywanie obecności lub braku miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego, na podstawie ruchliwości w substracie wspomnianego jednoniciowego konformera polinukleotydów.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że lewy starter AHAS3 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 13.

13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że prawy starter AHAS3 ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 14.

14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że lewy starter PM2 w etapach d) do e) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 15.

15. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że prawy starter PM2 w etapach d) do e) ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 16.

16. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że dziki allel miejsca mutacji PM2, którą jest substytucja nukleotydowa „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej typu dzikiego, ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 17.

17. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że starter wybiórczy dla mutacji PM2, którą jest substytucja nukleotydowa „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej typu dzikiego, ma sekwencję podaną na SEQ ID NO: 18.

18. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że etapy c) i d) obejmują wbudowanie znacznika do namnożonej części genu AHAS3.

19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że znacznik jest wybrany z grupy obejmującej znacznik radioaktywny, znacznik fluorescencyjny, znacznik luminescencyjny i znacznik paramagnetyczny.

20. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że etap analizowania wykorzystuje technikę wybraną z grupy obejmującej elektroforezę i chromatografię.

21. Sposób hodowania roślin z rodzaju Brassica z wykorzystaniem znacznika, w którym stosuje się jako znacznik mutację PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego w genie AHAS1 z B. napus; znamienny tym, że obejmuje:

a) izolowanie genomowego DNA z rośliny Brassica;

e) denaturowanie produktu drugiego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i do przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe;

g) selekcjonowanie jako rośliny rodzicielskiej dla dalszej hodowli, rośliny, w której zostało wykryte w etapie (f) występowanie miejsca mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego.

PL 210 988 B1

22. Sposób hodowania roślin z gatunków z rodzaju Brassica z wykorzystaniem znacznika, stosując jako znacznik mutację PM2, którą jest nukleotydowa substytucja „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego sekwencji polinukleotydowej w genie AHAS3 z B. napus; znamienny tym, że obejmuje:

a) izolowanie z rośliny genomowego DNA;

g) selekcjonowanie wspomnianej rośliny rodzicielskiej dla dalszej hodowli, jeśli występuje mutacja PM2, którą jest substytucja nukleotydowa „G” w „T” w pozycji 1712 sekwencji nukleotydowej AHAS3 typu dzikiego; oraz następnie stosowanie mutacji PM1, którą jest nukleotydowa substytucja „G” do „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego w genie B. napus AHAS1 jako znacznika, obejmujący następujące etapy:

k) denaturowanie produktu drugiego etapu amplifikacji do wytworzenia jednoniciowych polinukleotydów i do przyjęcia korzystnych konformacji przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe;

m) selekcjonowanie jako rośliny rodzicielskiej dla dalszej hodowli, rośliny, w której zostało wykryte w etapie (f) występowanie miejsce mutacji PM1, którą stanowi nukleotydowa substytucja „G” do „A” w pozycji 1874 sekwencji polinukleotydowej AHAS1 typu dzikiego.