PL210395B1 - Test immunologiczny na obecność bakterii - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH do uzyskiwania przeciwciał do testów immunologicznych do wykrywania komórek bakterii.

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii do uzyskiwania przeciwciał do wytwarzania testu immunologicznego do wykrywania komórek bakterii, zwłaszcza Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spickermann et Kotthoff) Davis et al.

(Cms) - sprawca bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jednym z najważniejszych patogenów ziemniaka (Lee i in. 1997, OEPP/EPPO 2006). Synonimy nazwy patogena to: Corynebacterium michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Carlson et Vidaver, Corynebacterium michiganensis pv. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Dye et Kemp oraz Corynebacterium sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Skaptason et Burkholder (OEPP/EPPO, 2006).

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus to gramdodatnie bakterie stanowiące formy pałeczkowate oraz kuliste (OEPP/EPPO, 2006), które wspólnie z rodzajem Rathayibacter tworzą grupę fitopatogenicznych corynebakterii o wspólnym pochodzeniu filogenetycznym (Lee i in. 1997). Kolonie większości szczepów hodowanych na pożywkach agarowych są mukoidalne, jakkolwiek zdarzają się również szczepy pośrednie i niemukolidalne (Bishop i in. 1988, Baer i Gudmestadt 1993).

Do poznanych dotychczas czynników wirulencji Cms należą:

a) Śluzy bakteryjne o kwaśnym charakterze i wielkości 1-10 MDa (Jahr i in. 1999) charakterystyczne są również dla innych podgatunków z gatunku C. michiganensis. Składają się one z kilku (I-III) komponentów cukrowych o podobnym składzie chemicznym, zróżnicowanych pod względem stopnia aglomeracji (Westra i Slack 1992). Występowanie IV komponentu składającego się głównie z mannozy jest charakterystyczne tylko dla bakterii Cms (Denny 1995). Śluzy bakteryjne z jednej strony zabezpieczają komórki bakteryjne przed utratą wilgoci, natomiast z drugiej poprzez fizyczną okluzję na ściankach wiązek przewodzących są przyczyną zahamowania transpiracji i więdnięcia roślin (Jahr i in. 1999).

Skład chemiczny śluzów bakteryjnych oraz ich obecność jest istotna w diagnostyce bakterii Cms opartej na testach serologicznych, w których składniki śluzu wykorzystuje się zazwyczaj jako antygeny. Prawidłowa ocena patogena na podstawie śluzów bakteryjnych jest zależna nie tylko od uwarunkowań genetycznych, lecz również od zmienności w chemicznym charakterze i ilości śluzów produkowanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms (Bishop i Slack 1987, Baer i Gudmestadt 1993).

b) Celulaza wytwarzana przez większość przebadanych szczepów Cms (Baer i Gudmestadt 1993) bierze udział w degradacji tkanek wiązki naczyniowej powodując rozwarstwianie się części zewnętrznej bulwy od rdzenia (Jahr i in. 1999, Nissinen i in. 2001). Laine i współpracownicy (2000) wykazali, że celulaza kodowana jest przez gen w natywnym plazmidzie pCSl bakterii Cms (Laine i in. 2000).

c) Toksyczny glikoproteid wyizolowany przez Strobela (1970), poprzez wysokie powinowactwo w stosunku do fragmentów ścian i membran komórek gospodarza, prawdopodobnie powoduje zaburzenia w przepuszczalności tych drugich (Romanenko i in. 1997).

Dotychczas nie zdołano opracować skutecznej metody bezpośredniego chemicznego lub biologicznego zwalczania patogena. Dezynfekcja powierzchni bulw nie spełnia swego zadania wskutek przebywania bakterii w wiązkach naczyniowych, do których nie mają dostępu środki dezynfekujące.

Jednym z najbardziej skutecznych sposobów ograniczenia, czy też eliminacji sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jego wczesne wykrycie. Detekcja potrzebna jest zarówno w procesie produkcji, obróbki, jak i dystrybucji materiału roślinnego. Stąd właściwe metody detekcji powinny być odpowiednio czułe i specyficzne, jak również proste, szybkie, wiarygodne i powtarzalne (Waleron i in. 2003).

Zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi, prawidłowa diagnostyka sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka wymaga stosowania przynajmniej dwóch testów laboratoryjnych opartych na różnych zasadach biologicznych łącznie z testem patogeniczności (OEPP/EPPO, 2006). W zależności od ekspresji objawów bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stosuje się odpowiednie schematy postępowania zawierające testy fizjologiczne, biochemiczne, serologiczne, molekularne i inne (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

Testy fizjologiczne i biochemiczne stosowane do rutynowej kontroli, pozwalają określić właściwości fenotypowe Cms. Zgodnie z najnowszą Dyrektywą Komisji WE, testy te muszą być przeprowadzane przy użyciu izolatów bakterii uzyskanych w procesie pasażowania na agarze odżywczym

PL 210 395 B1 z glukozą. Natomiast porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach uzyskanych po wzroście na agarze odżywczym z glukozą w obecności znanej kontroli Cms (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

W przypadku roś lin wykazujących wyraź ne symptomy choroby stosuje się izolację bakterii na pożywkach półselektywnych NCP-88 (De la Cruz i in. 1992) oraz MTNA (Jansing i Rudolph 1998), natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii Cms wykorzystuje się ogólne podłoża wzrostowe, jak agar odżywczy (NA), agar odżywczy z glukozą (NDA), agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) oraz pożywkę mineralną z glukozą i wyciągiem drożdżowym (YGM) (De Boer i Copeman 1980, Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

Jednym z głównych problemów związanych z detekcją i identyfikacją bakterii Cms jest wolne tempo wzrostu tego patogena. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę uniwersalną, obce bakterie saprofityczne, charakteryzujące się znacznie szybszym tempem wzrostu, porastają całą jej powierzchnię, często uniemożliwiając skuteczną izolację czystych szczepów Cms (OEPP/EPPO, 2006). Izolacja patogena na pożywkach półselektywnych zawierających w swym składzie antybiotyki takie jak: siarczan polimyksyny B, kwas nalidyksylowy i cykloheksymid (NCP-88) oraz trimetoprim. kwas nalidyksylowy i amfoterycynę B (MTNA), pozwala znacznie zmniejszyć ilość obcych bakterii. Najlepsze efekty izolacji na podłożu półselektywnym można uzyskać po uprzedniej inokulacji roślin oberżyny ekstraktem z komórkami patogena. Rośliny oberżyny są dobrym środowiskiem dla selektywnego namnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (OEPP/EPPO 2006).

Test patogeniczności na młodych siewkach oberżyny inokulowanej trzydniową kulturą testowanego izolatu, stosowany jest jako ostateczny test dla potwierdzenia infekcji latentnej oraz oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako Cms. Test ten cechuje stosunkowo niska czułość (10⁶ CFU/ml) oraz duża czasochłonność - ok. 40 dni. Dla skrócenia czasu testu biologicznego jako roślinę indykatorową stosuje się również tytoń. Wadą tego testu jest niestety mniejsza czułość (10⁸-10⁹ CFU/ml) (OEPP/EPPO 2006).

Jako jedną z metod identyfikacji bakterii Cms przez długi czas stosowano barwienie Gramma wymazów z wydzieliny wiązek naczyniowych z łodygi i bulwy (Glick i in. 1944, Slack 1987). Jednakże jednoznaczna diagnoza tą metodą jest trudna ze względu na możliwość występowania innych gramdodatnich bakterii, jak Clostridium ssp., Bacillus ssp., a także saprofitycznych bakterii z rodzaju Corynebacterium (Crowley i De Boer 1982).

W niektórych pracowniach stosowano również aglutynacyjny test lateksowy pozwalający wykryć 10⁷ komórek w 1 ml (Slack i in. 1979). Test odwróconej pasywnej hemoaglutynacji (RPH) z krwinkami owcy opłaszczonymi przeciwciałami anty-Cms z surowicy królika lub żółtka jaja kury. pozwala na wykrywanie w czasie ok. 90 minut obecności Cms w stężeniu 6x10⁶ komórek w 1 ml (Kohm i Eggers-Schumacher 1995).

Wykrywanie sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka metodami serologicznymi nadal stwarza znaczne trudności ze względu na zróżnicowanie morfologiczne form patogena (Mills i Russell 2003). Powszechnie stosowanymi metodami serologicznymi w detekcji Cms są test pośredniej immunofluorescencji - IF (Slack i in. 1979, De Boer i Copeman 1980) oraz test immunoenzymatyczny - ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Drennan i in. 1993, De Boer i in. 1994, 2005). Jakkolwiek test ELISA niedopuszczony przez EPPO jako test przesiewowy, cieszy się znacznie większym powodzeniem w krajach Ameryki Północnej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych MAb 9A1 w teście IF zapewnia wysoką specyficzność (De Boer i Wieczorek 1984) i wykrywalność bakterii Cms w granicach 10⁴ komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka (Baer i Gudmestad 1993). Często dla zwiększenia czułości metod serologicznych stosuje się również tańsze, ale mniej specyficzne przeciwciała poliklonalne. Niestety wadą takiego rozwiązania są występujące często fałszywie pozytywne wyniki wskutek reakcji krzyżowych z innymi bakteriami (Crowley i De Boer 1982) oraz niewykrywanie niemukoidalnych szczepów bakterii Cms (Baer i Gudmestad 1993). Zasadniczym wykrywanym antygenem nie są komórki bakterii Cms, lecz rozpuszczalne egzopolisacharydy, których ilość w stosunku do liczby komórek może być zmienna (Lewosz 1997). Obie metody IF i ELISA pozwalają wykrywać bakterie Cms w bulwach i łodygach ziemniaka, przy czym metoda immunofluorescencyjna wykazuje większą czułość i specyficzność dla bulw, natomiast metoda ELISA pozwala z większą czułością wykrywać patogena w łodygach ziemniaka (De Boer i in. 1994).

We współczesnej diagnostyce wykorzystuje się tradycyjne, posiadające wiele zalet, dobrze sprawdzone metody detekcji mikroorganizmów. Zwykle są one czasochłonne i wymagają stosowania specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Wyklucza to przeprowadzenie testu w warunkach polowych,

PL 210 395 B1 gdzie wymagany jest niemal natychmiastowy wynik pomiaru, a próbka powinna być zanalizowana najlepiej w miejscu jej pobrania (Łoś i Węgrzyn, 2005). Ponieważ jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczającym rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych jest ich wczesne wykrycie, toteż warunki takie muszą być spełniane w coraz to większej liczbie procedur. Istnieje zatem rosnące zapotrzebowanie na szybkie, czułe i bezpośrednie metody detekcji, które będą jednocześnie specyficzne i niedrogie, a które umożliwią bieżącą kontrolę zarówno podczas wzrostu roś lin, procesu produkcyjnego, przechowywania, jak i dystrybucji żywności (De Boer i Beumer 1999).

Tak więc problemem jest znalezienie sposobu oceny ilościowej bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) metodami immunologicznymi przy wykorzystaniu ciał poliklonalnych anty-Cms.

Nieoczekiwanie powyższy problem został rozwiązany poprzez zastosowanie sposobu według prezentowanego wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 -11 do uzyskiwania przeciwciał do testów immunologicznych do wykrywania komórek bakterii. Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że antygen pochodzi z bakterii szczepu Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się szczepy o różnym stopniu mukoidalności. Równie korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciało jest znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie lub koloiloidalnie lub enzymatycznie. Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że przeciwciało koniugowane jest ze złotem koloidalnym.

W związku z powyższym, przedmiotem wynalazku jest także test immunologiczny typu ELISA, IFAS lub inny powszechnie znany charakteryzujący się tym, że antygen pochodzący z komórek bakterii, korzystnie bakterii mukoidalnych takie jak Cms, otrzymano według obejmującego etap przemywania bakterii roztworami buforowymi: glicyna - HCl lub roztwór glicyna - NaOH w celu otrzymania antygenu do otrzymywania przeciwciał.

Równie korzystnie przeciwciało użyte w teście immunologicznym jest znakowane radioaktywnie lub koloidalnie.

W kolejnej realizacji wynalazku przeciwciało pokrywane jest złotem koloidalnym.

P r z y k ł a d 1

Wykorzystanie komórek Cms pozbawionych śluzu do wytwarzania przeciwciał do testów immunologicznych

Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych posiadanych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15-25 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, a egzopolisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano 1 - 6 razy 0,001 - 1M buforem glicyna - HCl (pH 1,5 - 3,5), 1 - 6 razy 0,001 - 1M buforem glicyna - NaOH (pH 9,5 - 12), trzykrotnie sterylną H2O odwirowując bakterie za każdym razem jw. Bakterie liofilizowano i następnie sporządzono mieszaninę trzech liofilizatów w stosunku wagowym 1:1:1. Do immunizacji podskórnej królika stosowano 1% wodną zawiesinę liofilizatu z dodatkiem adiuwanta Gerbu 100 (1:1, v/v). Zawiesinę podawano sześciokrotnie w dwutygodniowych odstępach w 1 ml porcjach. Skrwawianie królika i izolację przeciwciał wykonywano wg Ball i inni (1993). Krew pobierano z żyły brzeżnej ucha królika bezpośrednio do probówek wirówkowych. Po zebraniu pozostawiano do skrzepnięcia 30 minut w temperaturze 37°C, a następnie przez noc w 4°C. Skrzep delikatnie oddzielano od ścianek i wirowano 15 minut 1000 x g w temp. 4°C w wirówce Beckman J-21. Surowicę zlewano delikatnie znad osadu, dodawano NaN3 do stężenia 0,02%, dziesięciokrotnie rozcieńczano 2 x dest. H2O i dodawano równoważną objętość nasyconego siarczanu amonu, delikatnie mieszano i pozostawiano na 60 min w temperaturze pokojowej w celu wytrącenia osadu. Mieszaninę zwirowywano 5 min 8000 x g na wirówce Sorvall RC-5B, usuwano supernatant, a osad rozpuszczano w buforze 0,5 x PBS pH 7,4 w objętości dwukrotnie większej niż początkowa objętość surowicy i dializowano przez noc wobec trzech zmian tego samego buforu z 0,02% NaN3. Dializowany roztwór nakładano na kolumnę wypełnioną DEAE - celulozą zrównoważoną buforem 0,5 x PBS z 0,02% NaN3, którym następnie przemywano złoże uzyskując elucję przeciwciał. Zbierano 3 ml frakcje, dla których stosunek absorbancji A₂₈₀/A₂₅₀ = 2,5 + 2,7. Frakcje łąPL 210 395 B1 czono i filtrowano następnie przez filtr antybakteryjny 0,2 μm i przechowywano w 4°C. Roztwory przeciwciał doprowadzano ww. buforem do stężenia 2 mg/ml, przyjmując, że absorbancja IgG w stężeniu 1 mg/ml przy λ = 280 nm wynosi 1,4. Przeciwciała reagują z komórkami Cms pokrytymi śluzem oraz reagują nieznacznie z komórkami częściowo pozbawionymi śluzu bakteryjnego (tabela 1).

T a b e l a 1

Porównanie miana przeciwciał anty-Cms względem średnio mukoidalnego szczepu bakterii Cms - PD 221 10⁴ CFU/ml oceniane testem IF

IgG	Zawiesina bakterii Cms	Miano	Ślepa bez IgG)
1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	-
IgG skierowane na omponenty śluzu bakteryjnego	Bakterie w zawiesinie wodnej	+	+	+/-	-/+	-/+	-/+	-
Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną	+	+	+/-	-/+	-	-	-
Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym	+	+/-	-	-	-	-	-
Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym	+	+/-	+	-	-	-	-
IgG skierowane na komórki bakteryjne bez śluzu	Bakterie w zawiesinie wodnej	-	-	-	-	-	-	-
Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną	+	-	-	-	-	-	-
Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym	+/-	-/+	-	-	-	-	-
Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym	+	+	-/+	-	-	-	-

Legenda: + - silna fluorescencja, +/- - średnia fluorescencja, -/+ - słaba fluorescencja, - brak fluorescencji

P r z y k ł a d 2

Sposób znakowania przeciwciał poliklonalnych skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp sepedonicus

W celu uzyskania fragmentów przeciwciał, przeprowadzano redukcję wiązań dwusiarczkowych S-S całych cząsteczek IgG inkubując je w roztworze EDTA - DTT w warunkach beztlenowych. Sporządzono sześć roztworów o różnych stężeniach przeciwciał w zakresie od 20 do 500 μg/ml w 0,2 ml końcowej objętości świeżo sporządzanego roztworu EDTA - DTT. Roztwory w 1,5 ml probówkach Eppendorf umieszczano i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej pod próżnią 0,1 MPa. Po rozszczelnieniu układu, roztwory z uzyskanymi fragmentami IgG natychmiast łączono ze standardowym roztworem złota koloidalnego OD 4,0 sporządzając mieszaniny w proporcji 1:1 (v/v). Roztwory inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej łagodnie mieszając, po czym pobierano po 50 μl każdego z roztworów i mieszano z 50 μl 2 N NaCl. Po ustaleniu optymalnych proporcji, złoto koloidalne mieszano z odpowiednią ilością zredukowanych przeciwciał i inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej łagodnie mieszając. Dla uniknięcia niespecyficznej sorpcji, pozostałą powierzchnię złota koloidalnego blokowano 1-20% roztworem BSA, natomiast nadmiar niezwiązanych fragmentów przeciwciał usuwano z roztworu koniugatu poprzez trzykrotne płukanie roztworem TBS - BSA i zatężanie na wirówce Eppendorf 5415C (0,5-2 godzin przy 1000-4000 x g). Osad uzyskany przy ostatnim wirowaniu, doprowadzano buforem TBS - BSA do gęstości optycznej OD535 nm = 0,1-4,0 i przechowywano w 4°C (roztwór IgG-Au1).

P r z y k ł a d 3

Sposób znakowania przeciwciał poliklonalnych skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp przypadkowy z całymi cząsteczkami IgG

Sporządzano roztwory przeciwciał o stężeniu 0,01-1 mg/ml, które dializowano przez noc w 4°C wobec trzech zmian 10 mM buforu boranowego pH 9,2 i doprowadzano do stężenia 0,1 mg/ml przyjmując, że A280 nm takich roztworów odpowiada wartości 0,140. Natomiast standardowy roztwór złota koloidalnego doprowadzano 10 mM buforem boranowym do pH 9,0. Wstępne miareczkowanie przeprowadzono sporządzając roztwory IgG o stężeniach od 5 do 50 Lil/ml, które łączono z dwukrotną

PL 210 395 B1 objętością standardowego roztworu złota koloidalnego OD 4,0, mieszano i inkubowano 10 minut w temp. pokojowej. Następnie pobierano po 50 μΐ każdego z roztworów i mieszano z 50 μΐ 2 N NaCl. Po ustaleniu optymalnych proporcji, złoto koloidalne mieszano z odpowiednią ilością zredukowanych przeciwciał i inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej łagodnie mieszając. Dalej postępowano podobnie jak w punkcie 1. Osad uzyskany przy ostatnim wirowaniu, doprowadzano buforem TBS - BSA do gęstości optycznej OD 535 nm = 0,1-4,0 i przechowywano w 4°C (roztwór IgG-Au2).

P r z y k ł a d 4

Opłaszczanie złota koloidalnego koniugatem IgG - alkaliczna fosfataza (AP)

Roztwór koniugatu IgG anty-Cms - AP dializowano przez noc w 4°C wobec trzech zmian 2 mM buforu boranowego pH 6,0-11,0 i doprowadzano do stężenia 0,1-1,0 mg/ml. Natomiast standardowy roztwór złota koloidalnego doprowadzano 2 mM buforem boranowym do pH 6,0-11,0. Sporządzono serię mieszanin złota koloidalnego z koniugatem IgG - AP w stężeniach 5-50 μg/ml, inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej, a następnie pobierano po 50 μl każdego z roztworów i mieszano z 50 μl 2 N NaCl. Po dobraniu odpowiedniego stężenia koniugatu, postępowano podobnie jak w punkcie 2, z tą różnicą, że stosowano bufor TBS - BSA z dodatkiem 0,01 - 100 mM MgC12 jako stabilizatora aktywności alkalicznej fosfatazy i przeciwciał. Uzyskany koniugat IgG-AP - złoto koloidalne doprowadzano buforem TBS - BSA z MgC12 do gęstości optycznej OD 524 nm = 0,1 - 4,0 i przechowywano w 4°C.

Claims (6)

1. Zastosowanie powierzchniowego antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11 do uzyskiwania przeciwciał do testów immunologicznych do wykrywania komórek bakterii.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen pochodzi z bakterii szczepu Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że stosuje się szczepy o różnym stopniu mukoidalności.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało jest znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie lub koloidalnie lub enzymatycznie.

5. Zastosowanie według zastrz.

6, znamienne tym, że przeciwciało koniugowane jest ze złotem koloidalnym.