PL210394B1 - Sposób usuwania śluzów bakteryjnych - Google Patents

Abstract

Sposób usuwania śluzów bakteryjnych, szczególnie szczepów Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, charakteryzuje się tym, że obejmuje przemywanie bakterii roztworami buforowymi: glicyna - HCl lub glicyna - NaOH.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania śluzów bakteryjnych, szczególnie bakterii mukoidalnych takich jak Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spickermann et Kotthof) Davis et al. (Cms) - sprawca bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jednym z najważniejszych patogenów ziemniaka (Lee i in. 1997, OEPP/EPPO 2006). Synonimy nazwy patogena to: Corynebacterium michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Carlson et Vidaver, Corynebacterium michiganensis pv. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Dye et Kemp oraz Corynebacterium sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Skaptason et Burkholder (OEPP/EPPO, 2006).

Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus to gramdodatnie bakterie stanowiące formy pałeczkowate oraz kuliste (OEPP/EPPO, 2006), które wspólnie z rodzajem Rathayibacter tworzą grupę fitopatogenicznych corynebakterii o wspólnym pochodzeniu filogenetycznym (Lee i in. 1997). Kolonie większości szczepów hodowanych na pożywkach agarowych są mukoidalne, jakkolwiek zdarzają się również szczepy pośrednie i niemukoidalne (Bishop i in. 1988, Baer i Gudmestadt 1993).

Do poznanych dotychczas czynników wirulencji Cms należą:

a) Śluzy bakteryjne o kwaśnym charakterze i wielkości 1-10 MDa (Jahr i in. 1999) charakterystyczne są również dla innych podgatunków z gatunku C. michiganensis. Składają się one z kilku (I-III) komponentów cukrowych o podobnym składzie chemicznym, zróżnicowanych pod względem stopnia aglomeracji (Westra i Slack 1992). Występowanie IV komponentu składającego się głównie z mannozy jest charakterystyczne tylko dla bakterii Cms (Denny 1995). Śluzy bakteryjne z jednej strony zabezpieczają komórki bakteryjne przed utratą wilgoci, natomiast z drugiej poprzez fizyczną okluzję na ściankach wiązek przewodzących są przyczyną zahamowania transpiracji i więdnięcia roślin (Jahr i in. 1999).

Skład chemiczny śluzów bakteryjnych oraz ich obecność jest istotna w diagnostyce bakterii Cms opartej na testach serologicznych, w których składniki śluzu wykorzystuje się zazwyczaj jako antygeny. Prawidłowa ocena patogena na podstawie śluzów bakteryjnych jest zależna nie tylko od uwarunkowań genetycznych, lecz również od zmienności w chemicznym charakterze i ilości śluzów produkowanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms (Bishop i Slack 1987, Baer i Gudmestad 1993).

b) Celulaza wytwarzana przez większość przebadanych szczepów Cms (Baer i Gudmestad 1993) bierze udział w degradacji tkanek wiązki naczyniowej powodując rozwarstwianie się części zewnętrznej bulwy od rdzenia (Jahr i in. 1999, Nissinen i in. 2001). Laine i współpracownicy (2000) wykazali, że celulaza kodowana jest przez gen w natywnym plazmidzie pCS1 bakterii Cms (Laine i in. 2000).

c) Toksyczny glikoproteid wyizolowany przez Strobela (1970), poprzez wysokie powinowactwo w stosunku do fragmentów ś cian i membran komórek gospodarza, prawdopodobnie powoduje zaburzenia w przepuszczalności tych drugich (Romanenko i in. 1997).

Dotychczas nie zdołano opracować skutecznej metody bezpośredniego chemicznego lub biologicznego zwalczania patogena. Dezynfekcja powierzchni bulw nie spełnia swego zadania wskutek przebywania bakterii w wiązkach naczyniowych, do których nie mają dostępu środki dezynfekujące.

Jednym z najbardziej skutecznych sposobów ograniczenia, czy też eliminacji sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jego wczesne wykrycie. Detekcja potrzebna jest zarówno w procesie produkcji, obróbki, jak i dystrybucji materiału roślinnego. Stąd właściwe metody detekcji powinny być odpowiednio czułe i specyficzne, jak również proste, szybkie, wiarygodne i powtarzalne (Waleron i in. 2003).

Zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi, prawidłowa diagnostyka sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka wymaga stosowania przynajmniej dwóch testów laboratoryjnych opartych na różnych zasadach biologicznych łącznie z testem patogeniczności (OEPP/EPPO, 2006). W zależności od ekspresji objawów bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stosuje się odpowiednie schematy postępowania zawierające testy fizjologiczne, biochemiczne, serologiczne, molekularne i inne (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

Testy fizjologiczne i biochemiczne stosowane do rutynowej kontroli, pozwalają określić właściwości fenotypowe Cms. Zgodnie z najnowszą Dyrektywą Komisji WE, testy te muszą być przeprowadzane przy użyciu izolatów bakterii uzyskanych w procesie pasażowania na agarze odżywczym z glukozą. Natomiast porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach uzyskanych

PL 210 394 B1 po wzroście na agarze odżywczym z glukozą w obecności znanej kontroli Cms (Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

W przypadku roś lin wykazujących wyraź ne symptomy choroby stosuje się izolację bakterii na pożywkach półselektywnych NCP-88 (De la Cruz i in. 1992) oraz MTNA (Jansing i Rudolph 1998), natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii Cms wykorzystuje się ogólne podłoża wzrostowe, jak agar odżywczy (NA), agar odżywczy z glukozą (NDA), agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) oraz pożywkę mineralną z glukozą i wyciągiem drożdżowym (YGM) (De Boer i Copeman 1980, Dyrektywa Komisji WE 2006/56).

Jednym z głównych problemów związanych z detekcją i identyfikacją bakterii Cms jest wolne tempo wzrostu tego patogena. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę uniwersalną, obce bakterie saprofityczne, charakteryzujące się znacznie szybszym tempem wzrostu, porastają całą jej powierzchnię, często uniemożliwiając skuteczną izolację czystych szczepów Cms (OEPP/EPPO, 2006). Izolacja patogena na pożywkach półselektywnych zawierających w swym składzie antybiotyki takie jak: siarczan polimyksyny B, kwas nalidyksylowy i cykloheksymid (NCP-88) oraz trimetoprim, kwas nalidyksylowy i amfoterycynę B (MTNA), pozwala znacznie zmniejszyć ilość obcych bakterii. Najlepsze efekty izolacji na podłożu półselektywnym można uzyskać po uprzedniej inokulacji roślin oberżyny ekstraktem z komórkami patogena. Rośliny oberżyny są dobrym środowiskiem dla selektywnego namnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (OEPP/EPPO 2006).

Test patogeniczności na młodych siewkach oberżyny inokulowanej trzydniową kulturą testowanego izolatu, stosowany jest jako ostateczny test dla potwierdzenia infekcji latentnej oraz oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako Cms. Test ten cechuje stosunkowo niska czułość (10⁶ CFU/ml) oraz duża czasochłonność - około 40 dni. Dla skrócenia czasu testu biologicznego jako roślinę indykatorową stosuje się również tytoń. Wadą tego testu jest niestety mniejsza czułość (10⁸-10⁹ CFU/ml) (OEPP/EPPO 2006).

Jako jedną z metod identyfikacji bakterii Cms przez długi czas stosowano barwienie Gramma wymazów z wydzieliny wiązek naczyniowych z łodygi i bulwy (Glick i in. 1944, Slack 1987). Jednakże jednoznaczna diagnoza tą metodą jest trudna ze względu na możliwość występowania innych gramdodatnich bakterii, jak Clostridium ssp. Bacillus ssp., a także saprofitycznych bakterii z rodzaju Corynebacterium (Crowley i De Boer 1982).

W niektórych pracowniach stosowano również aglutynacyjny test lateksowy pozwalający wykryć 10⁷ komórek w 1 ml (Slack i in. 1979). Test odwróconej pasywnej hemoaglutynacji (RPH) z krwinkami owcy opłaszczonymi przeciwciałami anty-Cms z surowicy królika lub żółtka jaja kury, pozwala na wykrywanie w czasie ok. 90 minut obecności Cms w stężeniu 6x10⁶ komórek w 1 ml (Kohm i Eggers-Schumacher 1995).

Wykrywanie sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka metodami serologicznymi nadal stwarza znaczne trudności ze względu na zróżnicowanie morfologiczne form patogena (Mills i Russell 2003). Powszechnie stosowanymi metodami serologicznymi w detekcji Cms są test pośredniej immunofluorescencji - IF (Slack i in. 1979, De Boer i Copeman 1980) oraz test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Drennan i in. 1993, De Boer i in. 1994, 2005). Jakkolwiek test ELISA niedopuszczony przez EPPO jako test przesiewowy, cieszy się znacznie większym powodzeniem w krajach Ameryki Północnej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych MAb 9A1 w teście IF zapewnia wysoką specyficzność (De Boer i Wieczorek 1984) i wykrywalność bakterii Cms w granicach 10⁴ komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka (Baer i Gudmestad 1993). Często dla zwiększenia czułości metod serologicznych stosuje się również tańsze, ale mniej specyficzne przeciwciała poliklonalne. Niestety wadą takiego rozwiązania są występujące często fałszywie pozytywne wyniki wskutek reakcji krzyżowych z innymi bakteriami (Crowley i De Boer 1982) oraz niewykrywalnie niemukoidalnych szczepów bakterii Cms (Baer i Gudmestad 1993). Zasadniczym wykrywanym antygenem nie są komórki bakterii Cms, lecz rozpuszczalne egzopolisacharydy, których ilość w stosunku do liczby komórek moż e być zmienna (Lewosz 1997). Obie metody IF i ELISA pozwalają wykrywać bakterie Cms w bulwach i łodygach ziemniaka, przy czym metoda immunofluorescencyjna wykazuje większą czułość i specyficzność dla bulw, natomiast metoda ELISA pozwala z większą czułością wykrywać patogena w łodygach ziemniaka (De Boer i in. 1994).

We współczesnej diagnostyce wykorzystuje się tradycyjne, posiadające wiele zalet, dobrze sprawdzone metody detekcji mikroorganizmów. Zwykle są one czasochłonne i wymagają stosowania specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Wyklucza to przeprowadzenie testu w warunkach polowych, gdzie wymagany jest niemal natychmiastowy wynik pomiaru, a próbka powinna być zanalizo4

PL 210 394 B1 wana najlepiej w miejscu jej pobrania (Łoś i Węgrzyn, 2005). Ponieważ jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczającym rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych jest ich wczesne wykrycie, toteż warunki takie muszą być spełniane w coraz to większej liczbie procedur. Istnieje zatem rosnące zapotrzebowanie na szybkie, czułe i bezpośrednie metody detekcji, które będą jednocześnie specyficzne i niedrogie, a które umożliwią bieżącą kontrolę zarówno podczas wzrostu roślin, procesu produkcyjnego, przechowywania, jak i dystrybucji żywności (De Boer i Beumer 1999).

Tak więc problemem jest znalezienie usuwania śluzu bakterii, szczególnie mukoidalnych takich jak np. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms).

Nieoczekiwanie powyższy problem został rozwiązany poprzez zastosowanie sposobu według prezentowanego wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania śluzów bakteryjnych, zwłaszcza bakterii szczepów Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (w skrócie Cms), charakteryzujący się tym, że obejmuje przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stęże ń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje utratę żywotności komórek bakteryjnych. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - NaOH nie powoduje znacznej utraty żywotności bakterii Cms. W kolejnej korzystnej realizacji sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że roztwór glicyna - NaOH powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że uwolnienie bakterii Cms immunopułapkowanych następuje na podłożu, na którym zostały uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że przemywanie bakterii roztworami buforowymi glicyna - HCl lub glicyna - NaOH wzmacnia korelację ilości bakterii z uzyskanym sygnałem metodą ELISA. Bakterie Cms poddane działaniu roztworu o pH alkalicznym są zdolne tworzyć nowe kolonie po godzinnej inkubacji w tym roztworze. W sposobie według wynalazku uwolnienie bakterii Cms immunopułapkowanych następuje na podłożu, na którym zostały uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał.

Równie korzystnie sposób według wynalazku stanowi wstępny etap przygotowania bakterii Cms do wykrywania znanymi metodami immunologicznymi typu ELISA, IFAS.

Zastosowanie przeciwciał anty-Cms zdolnych do bezpośredniego oddziaływania z powierzchnią komórek bakterii Cms pozwala zapobiec utracie tych komórek z podłoża na którym zostały immunopułapkowane. Wymywanie immunopułakowanych bakterii Cms ma miejsce w przypadku stosowania przeciwciał anty-Cms skierowanych na komponenty śluzów bakteryjnych otaczających bakterie. Ze względu na rozpuszczalność tych komponentów, istnieje ryzyko utraty komórek bakteryjnych z powierzchni, na której zostały immunopułapkowane za pośrednictwem otaczających je komponentów śluzów bakteryjnych. Według wynalazku nowo wytworzone przeciwciała anty-Cms skierowane na bakterie pozbawione śluzu dają możliwość detekcji szczepów bakterii Cms o różnym stopniu mukoidalności. Sposób znamienny tym, iż bakterie przed analizą powinny być pozbawione komponentów śluzów przez przemycie buforem o odczynie kwaśnym lub alkalicznym. Baer i Gudmestad (1993) stosując sześć rodzajów przeciwciał anty-Cms nie byli w stanie wykryć niemukoidalnych szczepów bakterii Cms metodą ELISA. Autorzy nie zanotowali natomiast problemów z detekcją szczepów bakterii Cms wytwarzających średnie i duże ilości śluzów bakteryjnych (Baer i Gudmestad 1993).

Sposobem według wynalazku uzyskuje się bakterie Cms, których komórki pozbawione są śluzów bakteryjnych. Skuteczność usuwania śluzów bakteryjnych z powierzchni komórek bakteryjnych oceniano metodą antronową mierząc ilość pozostających śluzów w supernatancie po żwirowaniu bakterii oraz metodą DAS-ELISA przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych z firmy Loewe mierząc wykrywalność bakterii po usunięciu śluzów wskutek przemywania bakterii roztworami buforowymi o odczynie kwaś nym i/lub alkalicznym.

Sposób przemywania bakterii Cms według wynalazku, którego wynikiem są komórki bakteryjne pozbawione śluzów bakteryjnych, może posłużyć jako:

sposób przygotowania antygenu do wytwarzania przeciwciał skierowanych na same komórki bakteryjne, nie wykrywających jednocześnie komponentów śluzów bakteryjnych,

PL 210 394 B1 wstę pny etap przygotowania bakterii Cms do wykrywania metodami immunologicznymi typu ELISA, IFAS, itd., pozwalający na uniknięcie zafałszowań detekcji tej bakterii metodami immunologicznymi wynikających z różnej mukoidalności szczepów bakterii Cms, sposób oceny ilościowej bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) metodami immunologicznymi przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych anty-Cms, sposób uwalniania bakterii Cms immunopuł apkowanych na podł o ż u, na którym został y uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał, pozwalający na zachowanie żywotności tych komórek. Fakt ten ma niebagatelne znaczenie w przypadku testów diagnostycznych pozwalających przyżyciowo stwierdzić zjadliwość wyizolowanych komórek bakteryjnych.

Zaletą wynalazku jest możliwość odzyskiwania żywych komórek bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus pułapkowanych przy pomocy przeciwciał na podłożach immunosorpcyjnych i następnie wysianie tych komórek na pożywkę. Ma to istotne znaczenie dla pełnego przeprowadzenia analizy fitopatologicznej wyizolowanego z zainfekowanej tkanki roślinnej szczepu bakterii Cms w celu przeprowadzenia testu przyżyciowego na roś linie indykatorowej. Test taki jest konieczny dla stwierdzenia wirulentności wyizolowanego szczepu sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka.

P r z y k ł a d 1: Oznaczanie śluzów bakteryjnych metodą antronową; usuwanie śluzu bakteryjnego

Użyto trzy szczepy bakterii Cms: BPR 527, PD 221 oraz PD 406, różniących się ilością wytwarzanego śluzu. Na podstawie wyglądu kolonii bakteryjnych i ilości śluzu pozostającego w supernatancie oznaczanych metodą antronową, stwierdzono, że najbardziej mukoidalnym szczepem był szczep PD 406, średnio PD 221, natomiast najmniej śluzu wytwarzał szczep BPR 527 (Tabela 1).

T a b e l a 1. Ilość śluzów bakteryjnych w supernatantach oznaczana metodą antronową po żwirowaniu komórek bakterii Cms. Średnią i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla trzech powtórzeń

Bakterie Cms 5^106 CFU/ml	Ilość śluzu w supernatancie w przeliczeniu na glukozę
^g]	SD
Szczep BPR 527	16	± 1,6
Szczep PD 221	34	± 2,7
Szczep PD 406	44	± 2,3

Bakterie stopniowo odmywano ze śluzu bakteryjnego i testowano metodą DAS-ELISA stosując przeciwciała poliklonalne z firmy Loewe.

Śluz usuwano poprzez kilkukrotne, krótkotrwałe przemywanie komórek bakteryjnych w różnych mediach, tj.: w buforze glicyna - HCl o odczynie kwaśnym lub w buforze glicyna - NaOH o odczynie alkalicznym lub w wodzie podwójnie destylowanej, każdorazowo zatężając bakterie poprzez wirowanie. Znane jest użycie buforów kwaśnego i alkalicznego w chromatografii powinowactwa, gdzie powodują one dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało (Hermanson i in. 1992). Nowością według sposobu jest zastosowanie tych roztworów do efektywnego usuwania składników śluzów bakteryjnych z powierzchni komórek bakterii Cms.

Wyniki w tabeli 2 wskazują, że głównym antygenem, z którym reagują IgG anty-Cms są kompleksy śluzu bakteryjnego. Pomimo użycia jednakowych ilości komórek badanych szczepów Cms, najwyższe wartości testu ELISA otrzymano dla mukoidalnego szczepu PD 406 i odpowiednio niższe dla szczepów PD 221 i BPR 527 wytwarzających mniejsze ilości śluzu.

Po usunięciu śluzów wyniki testu ELISA znacznie lepiej korelowały z ilością komórek bakteryjnych w zawiesinie. Usunięcie śluzu według wynalazku buforem kwaśnym i/lub alkalicznym pozwoliło ujednolicić wyniki testu ELISA przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych. Wynika z tego, że czułość testu ELISA zależy przede wszystkim od ilości śluzów wytwarzanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms, a nie od rzeczywistej ilości komórek w zawiesinie.

W obecności śluzu stosowane przeciwciała poliklonalne wykrywały bakterie Cms z różną intensywnością. Natomiast po usunięciu śluzu według wynalazku, niezależnie od badanego szczepu, wynik testu ELISA znacznie lepiej korelował z ilością komórek bakteryjnych w zawiesinie.

Wprowadzenie dodatkowego etapu według wynalazku polegającego na usunięciu komponentów śluzów bakteryjnych pozwoliło w teście ELISA na uzyskanie odpowiedzi ilościowej przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych.

PL 210 394 B1

T a b e l a 2. Wynik testu DAS-ELISA z różnymi szczepami bakterii Cms pozbawianymi śluzu bakteryjnego względem przeciwciał z Loewe. Średnią i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla trzech powtórzeń

Zawiesina bakterii Cms (5000 CFU/ml)	Szczep BPR 527	Szczep PD 221	Szczep PD 406
A405	SD	A405	SD	A405	SD
Bakterie w zawiesinie wodnej	0,530	±0,025	0,950	±0,012	1,150	±0,031
Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną	0,372	±0,021	0,389	±0,041	0,428	±0,008
Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym	0,270	±0,005	0,277	±0,009	0,268	±0,006
Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym	0,285	±0,008	0,280	±0,003	0,289	±0,005

Według wynalazku sposób odmywania śluzu bakteryjnego z komórek bakterii Cms pozwala na zachowanie żywotności tych bakterii. Bakterie Cms poddane działaniu roztworu o pH alkalicznym są zdolne tworzyć nowe kolonie nawet po godzinnej inkubacji w tym roztworze (Tabela 3). Zaobserwowano jedynie nieznaczny spadek przeżywalności badanych szczepów wraz z upływem czasu inkubacji, przy czym większą odpornością charakteryzował się szczep wytwarzający najwięcej śluzu. Większość bakterii pozostała żywa jeszcze po 10 minutowym traktowaniu buforem o odczynie alkalicznym (Tabela 3). Oznacza to, że komórki bakteryjne, z których usunięto śluz w alkalicznym pH zachowują zdolność namnażania się (Tabela 4).

T a b e l a 3. Przeżywalność [%] bakterii Cms inkubowanych w buforze o odczynie alkalicznym w czasie 0 - 60 min po posiewie na podłożu YGM

Zawiesina Cms (szczep PD 406)	Czas inkubacji [min]
0	5	10	15	20	30	40	50	60
Przeżywalność [%]	100	98,6	74,2	52,1	40,3	27,7	21,1	20,6	18,6

T a b e l a 4. Określenie żywotności bakterii Cms przy stopniowym usuwaniu śluzu. Za wartość 100% przyjęto liczbę kolonii po inkubacji w podwójnie destylowanej, sterylnej wodzie. Wynik po 5 minutach inkubacji. Średnią i odchylenie standardowe (SD) obliczono dla trzech powtórzeń

Zawiesina bakterii Cms	Liczba kolonii na pożywce YGM po 5-cio minutowej inkubacji
BPR 527	PD 221	PD 406
[%]	SD	[%]	SD	[%]	SD
Bakterie w zawiesinie wodnej	100	±1,1	100	±2,6	100	±1,9
Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną	91,3	±2,6	69,9	±1,4	84,6	±3,8
Bakterie przemyte buforem o odczynie alkalicznym	51,5	±2,7	60,0	±4,0	98,2	±7,1

Proces usuwania śluzów bakteryjnych prowadzono z udziałem świeżo sporządzonych zawiesin szczepów bakterii Cms zróżnicowanych pod względem mukoidalności (zdolności wytwarzania śluzów). W celu zapewnienia odpowiednich warunków dla procesu usuwania śluzów bakteryjnych, proces przemywania komórek baterii Cms prowadzi się poprzez kilkukrotne przemywanie w roztworach buforowych o pH kwaśnym i/lub alkalicznym oraz w wodzie destylowanej.

Najkorzystniejsze rezultaty w wyniku realizacji sposobu według wynalazku osiąga się wówczas, gdy proces przemywania prowadzi się przy zastosowaniu roztworu glicyna - HCl o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i/lub roztworu glicyna - NaOH o stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11 oraz wody destylowanej, korzystnie dwukrotnie destylowanej. Sposobem według wynalazku uzyskuje się bakterie Cms, których komórki pozbawione są śluzów bakteryjnych. Skuteczność usuwania śluzów bakteryjnych z powierzchni komórek bakteryjnych oceniano metodą antronową mierząc ilość pozostających śluzów w supernatancie po żwirowaniu bakterii oraz metodą

PL 210 394 B1

DAS-ELISA przy wykorzystaniu przeciwciał poliklonalnych z firmy Loewe mierząc wykrywalność bakterii po usunięciu śluzów wskutek przemywania bakterii roztworami buforowymi o odczynie kwaśnym i/lub alkalicznym.

P r z y k ł a d 2: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wykorzystaniem buforu glicyna - HCl

Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD

221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna HCl (pH 2,0) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.

P r z y k ł a d 3: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wykorzystaniem buforu glicyna

- NaOH

Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna NaOH (pH 11) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.

P r z y k ł a d 4: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wielokrotnym wykorzystaniem buforu glicyna - NaOH

Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna HCl (pH 2,5), trzykrotnie 0,2 M buforem glicyna - NaOH (pH 10,5) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.

P r z y k ł a d 5: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wielokrotnym wykorzystaniem buforu glicyna - NaOH, glicyna - HCl oraz wody destylowanej

Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano czterokrotnie 0,1 M buforem glicyna - HCl (pH 3,0), czterokrotnie 0,1 M buforem glicyna - NaOH (pH 10) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie liofilizowano i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania.

P r z y k ł a d 6: Sporządzenie wodnych zawiesin bakteryjnych z wykorzystaniem buforu glicyna

- NaOH, glicyna - HCl oraz wody destylowanej

Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych różnych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H2O i wirowano 15 min. 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, natomiast zewnątrzkomórkowe polisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano 0,1 M buforem glicyna - HCl (pH 2,5), 0,1 M buforem glicyna - NaOH (pH 10,5) oraz trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą odwirowując bakterie za każdym razem jw. Tak przygotowane bakterie liofilizowano i przechowywano w 4°C do czasu wykorzystania. Ustalenie warunków odmywania śluzu z bakterii pozwoliło na wytworzenie przeciwciał poliklonalnych mty-Cms względem nowego rodzaju antygenu - komórek bakteryjnych bez śluzu. Znany jest sposób uzyskiwania przeciwciał poprzez immunizację królików (Ball i inni 1993). Znamiona nowości zawiera natomiast antygen - bakterie Cms pozbawione śluzu oraz wytworzone przy jego udziale przeciwciała poliklonalne anty-Cms. Nowe przeciwciała mają istotne znaczenie dla diagnostyki, ponieważ posiadają epitopy obecne na powierzchni komórek bakteryjnych pozbawionych zewnątrzkomórkowych komponentów śluzów bakteryjnych. Przeciwciała te nie reagują z komórkami Cms pokrytymi śluzem oraz reagują nieznacznie z komórkami częściowo pozbawionymi śluzu bakteryjnego.

Claims (7)

1. Sposób usuwania śluzów bakteryjnych, zwłaszcza bakterii szczepów Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (w skrócie Cms), znamienny tym, że obejmuje przemywanie bakterii roztworem buforowym glicyna - HCl w stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, oraz w pH 1,5 - 3,5, korzystnie w zakresie 2 - 3 i roztworem buforowym glicyna - NaOH w stężeniu 0,001 - 1 M, korzystnie w zakresie stężeń 0,05 - 0,5 M, o pH 9,5 - 12, korzystnie w zakresie 10 - 11.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje utratę żywotności komórek bakteryjnych.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - NaOH nie powoduje znacznej utraty żywotności bakterii Cms.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - HCl powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór glicyna - NaOH powoduje dysocjację kompleksu antygen - przeciwciało.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uwolnienie bakterii Cms immunopułapkowanych następuje na podłożu, na którym zostały uprzednio wyłapane za pomocą przeciwciał.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przemywanie bakterii roztworami buforowymi glicyna - HCl lub glicyna - NaOH wzmacnia korelację ilości bakterii z uzyskanym sygnałem metodą