PL209988B1 - Nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus paracasei - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus paracasei, o właściwościach probiotycznych.

Specyficzna i kontrolowana pozytywna regulacja składu mikroflory jelitowej może być osiągnięta na drodze probiozy czyli spożywania preparatów lub produktów żywnościowych zawierających żywe bakterie głównie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Dlatego też producenci żywności, a w szczególności żywności funkcjonalnej, oraz przemysł farmaceutyczny zainteresowani są pozyskiwaniem nowych szczepów tych bakterii o udokumentowanych właściwościach probiotycznych. Środowiskiem naturalnym bytowania bakterii z rodzaju Lactobacillus jest mleko, sery, mleczne napoje fermentowane, mięso a w szczególności wędliny fermentowane oraz kiszonki warzywne. Bakterie te zasiedlają również błony śluzowe przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt.

Dotychczas znane są szczepy bakterii Lactobacillus o właściwościach probiotycznych jak L. acidophilus NCFM, L. acidophilus DDS-1, L. acidophilus SBT-2062, L. acidophilus R0011, L. rhamnosus R0052, L. acidophilus LA-1, L. paracasei CRL-431, L. casei Shirota, L. casei DN-114001, L. fermentum RC-14, L rhamnosus GR-1, L. johnsonii La1, L. plantarum 299V, L. rhamnosus 271, L. reuteri SD2112, L rhamnosus GG, L. rhamnosus LB21, L. salivarius UCC118, L. acidophilus LB, L. paracasei F19.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919 o właściwościach probiotycznych, stanowiący homolog bakterii z gatunku Lactobacillus paracasei, o następującej sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNa, którego sekwencja określa przynależność gatunkową bakterii gtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacct 127 128 cgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataagg 187 188 ggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactag 24 7 248 agtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacc 307 308 caacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaag 367 368 gggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt 427 428 gcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtt 487 488 tcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcgg-actgaag 546 547 ggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatcta 606 607 atcctgttcgctacccatgctttcgagcctaa-cgtcagttacaaaccaaacaagccgcc 665 666 tt 667.

Nowy szczep wyizolowano z próbki kału dziecka. Nowy szczep wykazuje 99% homologię do bakterii z gatunku Lactobacillus paracasei. Bakterie mają kształt średniej długości gram-dodatnich pałeczek, prostych czasem lekko zakrzywionych.

Nowy szczep spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO.

Nowy szczep charakteryzuje się metabolizmem względnie heterofermentatywnym. Zdolny jest do fermentacji następujących sacharydów i ich pochodnych: glicerolu, L-arabinozy, rybozy, D-ksylozy, galaktozy, glukozy, fruktozy, mannozy, sorbozy, ramnozy, duocytolu, inozytolu, mannitolu, sorbitolu, α-metylo-D-glukozydu, N-acetyloglukozoaminy, amygdaliny, arbutyny, esculiny, salicyny, celobiozy, maltozy, laktozy, melibiozy, sacharozy, trehalozy, melecytozy, rafinozy, skrobi, gencjobiozy, D-turanozy, D-liksozy, D-tagatozy, glukonianu, co stwierdzono stosując test API 50 CHL. Laktozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 5,0 g/l, przy czym udział kwasu L(+) mlekowego wynosi 94,6%, kwasu octowego (2,32 g/l), aldehydu octowego (2,61 mg/l) i etanolu (2,83 mg/l), zaś glukozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 5,0 g/l, przy czym udział kwasu L(+) mlekowego wynosi 100%, kwasu octowego (0,2 g/l), aldehydu octowego (1,2 mg/l).

Nowy szczep otrzymuje się w wyniku hodowli na płynnym modyfikowanym podłożu według Rogosa o nazwie handlowej MRS, zawierającym jako źródło węgla 2% glukozy, w temperaturach

PL 209 988 B1

- 40°C, korzystnie 37°C, przy czym do wzrostu preferuje środowisko wzbogacone w CO2 dodawany w ilości korzystnie 5% v/v. Szczep rośnie w postaci małych, drobnych (średnica około 0,5 mm) lekko wypukłych kolonii, o kolorze jasnokremowym. Nie wytwarza katalazy. Brzeg i powierzchnia kolonii są gładkie. Nie wytwarza przetrwalników.

Nowy szczep wykazuje odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w zakresie pH od 2,5 do 3,5 oraz na sole żółci w stężeniach 2%, 4%, 6% w czasie do 48 godzin.

Nowy szczep wykazuje oporność w stosunku do następujących antybiotyków i chemioterapeutyków o działaniu przeciwbakteryjnym: wankomycyny, cefalotyny, ceftazydymu, aztreonamu, amikacyny, streptomycyny, klotrimazolu.

Nowy szczep charakteryzuje się dobrym przyleganiem do linii komórkowych Caco-2 oznaczonym jako (++), przy czym adherencję określano półilościowo przyjmując, iż (-) oznacza brak przylegania, (+) pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, (++) - pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, (+++) - liczne bakterie w poszczególnych polach widzenia.

Nowy szczep wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do bakterii patogennych przenoszonych drogą pokarmową; Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria innocua.

Nowy szczep posiada niewielką aktywność fekalną. Spośród trzech enzymów: β-glukozydazy, β-glukuronidazy i ureazy, aktywna jest tylko β-glukozydaza.

Poniższe przykłady ilustrują identyfikację genetyczną szczepu oraz jego cechy morfologiczne, biochemiczne i biotechnologiczne, z powołaniem się na rysunek, na którym fig. 1 przedstawia wykres przeżywalności mieszanek bakterii ŁOCK 0919 z glukonianem wapnia, mlekiem w proszku i preparatem fruktooligosacharydu o nazwie handlowej Raftilose®, przechowywanych w temperaturze chłodniczej, zaś fig. 2 przeżywalność tych mieszanek przechowywanych w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d I.

W celu określenia przynależności gatunkowej nowego szczepu ŁOCK 0919 sekwencję nukleotydową regionu DNA kodującego gen 16S rRNA tego szczepu porównano, za pomocą odpowiedniego programu komputerowego, z sekwencją takiego samego regionu DNA znanego szczepu Lactobacillus paracasei. Porównanie sekwencji nowego szczepu i znanego szczepu Lactobacillus paracasei:

Nowy; 68 Znany: 1326 Nowy: 128 Znany: 1266 Nowy: 188 Znany: 1206 Nowy: 248 Znany: 1146 Nowy: 308 Znany: 1086 Nowy: 368 Znany: 1026 Nowy; 428 Znany: 966 Nowy; 488 Znany: 906 Nowy: 547 Znany: 846 Nowy: 607 Znany: 786 Nowy: 666 Znany: 727 taggcgagttgcagcctacaytcccjaactgagaatggctttaagacjattagcttiiacct ?tagg<

i i TT

I Η I I II 11 I I I INI

UIIIHUH

Yctttaagagattagcttg,

IIHIiFlTlIIΙΪΙIIί grtaggcgągttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacct cgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataagg I I I IIIIIIIIIII11 11 I ί I I II I I I I I i I I I I I 11 I I I I I I I I IIIIIIIIIIIIIII cgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataagg gcagtcttactag

............................. I I III I I I I I I U ggćatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactag aqtqcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacc

............................... I 11 I I U 11 11 I IH I [ II 11 1111 111 agtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacc caacątctcacgacaccjacictgaccjacaaccatcjcaccacct^tcattttcfcccccciaai ΐϊϊϊϊΐΐϊ ΐϊϊϊΓΐΤΪΤΓΪΪΓϊϊϋι i i i i ii 111 Γίι 11 ίι 1111 rn ι?ι 1111111 gtcattttgcccccgaag Tl 11111II11IJ 111 I T

I I I I II I I I I I II I I I Tl Tl 11 I I Tl I I I I I I I Tl II I I III caacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaecacctgtcattttgcccccgaag qqqaaacctqatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt

II I H 111111111 1111111111111111111 ll 11 !l 111111II1111111111111 gggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt c tt cgaatt aaaccacatgct ccaccgct ti

127

1267

187

1207

247

1147

307

1087

367

1027

427

967

487

907

546

847

606

787

665

728 tgtgcgggcccccgtcaattcctttgag' lii IIIΙΪΙIIIIIII I I I II I I I I Tl T

I^CttCCJi gcttcgaattaaaććaćatgćtććaććgćttgtgcgggccćccgtcaattcctttgagtt tcaaccttącggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcgg-actgaag

11111 111 11 1111 11 1111 11 U i 1111111111 I! I 11111 111111 111 1111 Η I tcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaag aaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtateta

..... ........Tl I I l ITTI I ITT........ ......

II I I I I I I I I I I ITl I I I I I I I I I I

I I I I I I II I 11 II I I I I Tl 11 I I I i I

IIIIIII III I I I I I I ggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatcta atcctqttcqctacccatgctttcgagcctaa-cgtcagttacaaaccaaacaagccgcc |||||| | | | II | | I I I I I I I III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I atcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagaca-gccgcc tt 667 I I tt 726.

PL 209 988 B1

W wyniku porównania sekwencji nowego szczepu Ł OCK 0919 i szczepu znanego, dla nowego szczepu stwierdzono:

długość = 1522, podobieństwo = 596/602 (99%), niezidentyfikowane = 3/602 (0%), nić = Plus/Minus

Dla szczepu ŁOCK 0919 wyizolowano 16 białek wewnątrzkomórkowych o masach molekularnych: 69,36; 62,57; 54,10; 48,66; 45,84; 42,97; 40,92; 38,87; 32,43; 30,85; 29,60; 27,41; 24,17; 23,64; 19,95; 16,87 kDa oraz 14 białek zewnątrzkomórkowych o masach 174,59; 93,10; 78,05; 62,57; 56,25; 48,66; 47,69; 42,97; 40,92, 36,82; 34,49; 32,93; 32,43; 29,10 kDa.

P r z y k ł a d II.

Szczep ŁOCK 0919 hodowano na podłożu płynnym MRS o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy 4,0, ekstrakt mięsny - 8,0, pepton K -10,0, glukoza - 20,0, wodoro-cytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny 0,05, agar - 15,0, w temperaturze 37°C doprowadzając do środowiska hodowli CO2 w ilości 5% objętościowych w stosunku do objętości podłoża. Po 24 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 10⁹ komórek/ml.

P r z y k ł a d III.

Bakterie otrzymane jak w przykładzie II umieszczono w środowiskach o pH 2,5 i 3,5.

W środowisku o pH 2,5 po 180 minutach przeż y ł o 1,7 x 10⁶ jtk (jednostek tworzących kolonie)/ml przy wyjściowej ich ilości 6,5 x 10⁷ jtk/ml. W środowisku o pH 3,5 po 180 minutach przeżyło 2,8 x 10⁷ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 7,0 x 10⁷ jtk/ml.

P r z y k ł a d IV.

Bakterie otrzymane jak w przykładzie II poddano działaniu soli żółci o stężeniach 2%, 4% i 6% w czasie do 48 godzin. W wyniku działania soli ż ółci o stężeniu 2% po 48 godzinach przeż yło 5,6 x 10⁶ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 1,6 x 10⁸ jtk/ml. Pod wpływem działania soli żółci o stężeniu 4% po 48 godzinach przeży ł o 3,3 x 10⁶ jtk/ml przy wyjś ciowej ich iloś ci 6,4 x 10⁷ jtk/ml. Pod wpływem działania soli żółci o stężeniu 6% po 48 godzinach przeżyło 4,1 x 10⁵ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 1,2 x 10⁸ jtk/ml.

P r z y k ł a d V.

W celu określenia wła ściwoś ci biotechnologicznych nowego szczepu bakterii ŁOCK 0919, inokulum tego szczepu zaszczepiono mleko UHT o 2% zawartości tłuszczu. Szczep ŁOCK 0919 fazę stacjonarną osiągnął po 16 godzinach hodowli w mleku, zaś plon komórek wynosił 5,4 x 10⁸ jtk/ml. Czas trwania fazy adaptacyjnej bakterii wyniósł 2 godziny.

Maksymalna wartość właściwej szybkości wzrostu szczepu wynosiła 0,23h^-1, a produktywność hodowli była równa 0,33 x 10⁸. Szczep w początkowym etapie fazy stacjonarnej osiągnął kwasowość wynoszącą 30°SH, gwarantującą czysto kwaśny smak produktu. Specyficzna aktywność kwasząca bakterii wyrażona w °SH na jednostkę tworzącą kolonie w fazie stacjonarnej wzrostu szczepu wynosiła 5,2°SH/10⁸ jtk.

Po 24 godzinach inkubacji szczep wykorzystał laktozę mleka w 33,3%. Nadto stwierdzono, iż:

- szczep charakteryzuje się aktywnością β-galaktozydazy na poziomie 0,43 J, przy czym jednostka aktywności J definiowana jest jako ilość μmoli o-nitrofenylo-e-galaktopiranozy (ONP) uwolnionych w czasie 1 minuty przez 1 mg suchej masy bakterii,

- jest zdolny do jednoczesnego wykorzystania glukozy i galaktozy,

- nie syntetyzuje bakteriocyn i związków bakteriocynopodobnych.

- jest zdolny do syntezy biosurfaktantów tj. niewrażliwych na działanie enzymów proteolitycznych - pepsyny i trypsyny związków o aktywności antagonistycznej w stosunku do: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Enterobacter aerogenes.

P r z y k ł a d VI.

Określano trwałość przechowalniczą produktów i preparatów zawierających nowy szczep ŁOCK 0919.

W tym celu mleko UHT o 2% zawartości tłuszczu zaszczepiano inokulum bakterii ŁOCK 0919 dodanym w ilości 10%, inkubowano do momentu ukwaszenia mleka, po czym ukwaszone mleko przechowywano w temperaturze 4-5°C w ciągu 21 dni. W analogicznych warunkach przechowywano również mleko nieukwaszone zawierające inokulum tych bakterii. W trakcie przechowywania w mleku ukwaszonym i nieukwaszonym sprawdzano przeżywalność bakterii ŁOCK 0919 oraz kwasowość ogólną produktu.

Przeżywalność szczepu ŁOCK 0919 w nieukwaszonym mleku, przechowywanym przez 21 dni w temperaturze 4-5°C wynosiła 96%, a liczba komórek bakterii kształtowała się na poziomie 10⁸ jtk/ml.

PL 209 988 B1

W mleku ukwaszonym szczepem ŁOCK 0919 liczba ż ywych bakterii była wysoka i wynosiła 10⁹ jtk/ml i w trakcie 21 dni przechowywania nie uległa istotnej zmianie. Nadto stwierdzono, iż chłodnicze przechowywanie mleka ukwaszonego szczepem ŁOCK 0919 stabilizuje kwasowość całkowitą na poziomie 32,4°SH (granice kwasowości 30-46°SH), która gwarantuje czysto kwaśny smak produktu i zapewnia bardzo dobre cechy sensoryczne produktu.

Przygotowano mieszanki szczepu ŁOCK 0919 z 10% dodatkiem glukonianu wapnia, preparatu Raftilose® i mleka w proszku, po czym poddano je procesowi liofilizacji. Oceniano trwałość liofilizowanych preparatów przechowywanych w czasie 4 miesięcy w warunkach chłodniczych (4-5°C) oraz w temperaturze pokojowej (25°C). Wyniki oceny przeż ywalnoś ci bakterii ŁOCK 0919 w tych mieszankach w temperaturze chłodniczej i temperaturze pokojowej przedstawiono w postaci wykresów na fig. 1 i fig. 2 rysunku.

Okazało się, iż temperatura chłodnicza zapewnia większą stabilność i trwałość liofilizowanych preparatów niezależnie od czynnika ochronnego.

Przechowywanie preparatu bakterii suszonego sublimacyjnie z mlekiem jako medium ochronnym w czasie 4 miesięcy w temperaturze chłodniczej spowodowało obniżenie liczby żywych komórek o 13,2%, zaś w temperaturze pokojowej o 23,5%. W czasie 4 miesięcy przechowywania liofilizatu mieszaniny komórek bakterii z preparatem Raftilose® stopień redukcji liczby żywych komórek ŁOCK 0919 wzór o 27,6% w temperaturze chłodniczej i o 31,8% w temperaturze pokojowej. Zamieralność komórek bakterii ŁOCK 0919 liofilizowanych z glukonianem wapnia, przechowywanych w temperaturze chłodniczej wynosiła 16,5%, natomiast przechowywanych w temperaturze pokojowej - 19,4%.

W sekwencjach nukleotydowych: a - oznacza nukleotyd zawierają cy adeninę jako zasadę azotową , g - oznacza nukleotyd zawierają cy guaninę jako zasadę azotową , c - oznacza nukleotyd zawierający cytozynę jako zasadę azotową, t - oznacza nukleotyd zawierający tyminę jako zasadę azotową.

Claims (1)

1. Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus paracasei ŁOCK 0919 o właściwościach probiotycznych, stanowiący homolog bakterii z gatunku Lactobacillus paracasei, o następującej sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNa, którego sekwencja określa przynależność gatunkową bakterii

   68 gtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacct 127

   128 cgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataagg 187 188 ggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactag 247 248 agtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacc 307 308 caacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaag 367 368 gggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt 427 428 gcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtt 487 488 tcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcgg-actgaag 546 547 ggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatcta 606 607 atcctgttcgctacccatgctttcgagcctaa-cgtcagttacaaaccaaacaagccgcc 665