PL209986B1 - Nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus casei - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus casei, o właściwościach probiotycznych.

Specyficzna i kontrolowana pozytywna regulacja składu mikroflory jelitowej może być osiągnięta na drodze probiozy czyli spożywania preparatów lub produktów żywnościowych zawierających żywe bakterie głównie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Dlatego też producenci żywności, a w szczególności żywności funkcjonalnej oraz przemysł farmaceutyczny zainteresowani są pozyskiwaniem nowych szczepów tych bakterii o udokumentowanych właściwościach probiotycznych. Środowiskiem naturalnym bytowania bakterii z rodzaju Lactobacillus jest mleko, sery, mleczne napoje fermentowane, mięso a w szczególności wę dliny fermentowane oraz kiszonki warzywne. Bakterie te zasiedlają również bł ony śluzowe przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt.

Dotychczas znane są szczepy bakterii Lactobacillus o właściwościach probiotycznych jak L. acidophilus NCFM, L. acidophilus DDS-1, L. acidophilus SBT-2062, L. acidophilus R0011, L rhamnosus R0052, L. acidophilus LA-1, L. paracasei CRL-431, L. casei Shirota, L. casei DN-114001, L. femientum RC-14, L. rhamnosus GR-1, L. Johnsona La1, L. plantarum 299V, L. rhamnosus 271, L. reuteri SD2112, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LB21, L. salivarius UCC118, L. acidophilus LB, L. paracasei F19.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus casei ŁOCK 0908 o wł a ś ciwoś ciach probiotycznych, stanowi ący homolog bakterii z gatunku Lactobacillus casei, o następującej sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNa, którego sekwencja określa przynależność gatunkową bakterii cgtattaaccgcggcgtgttgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgag 80 ttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctc 140

141 gcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatg 200

201 atttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaa 260

261 ctaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctc 320

321 acgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacct 380

381 gatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaat 440

441 taaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttg 500

501 cggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaac 560

561 cctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttc 620

621 gctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactg 680

681 gtgttcttccatatatctacgcattt-accgctacacatggagttccactgtcctcttct 739

740 gcactcaagtttcc-agtttccgatgcactttctcggttaagccgagggcttttacatta 798

799 gacttaaaaaaaccgctgcgctcgctttacccccaataaatccggataacgcttggcccc 858

859 cttcgtattacc 870,

Nowy szczep wyizolowano z próbki kału dziecka. Nowy szczep wykazuje 98% homologię do bakterii z gatunku Lactobacillus casei. Bakterie mają kształt pałeczek gram-dodatnich o różnej długości, prostych, niekiedy zakrzywionych.

Nowy szczep spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO.

Nowy szczep charakteryzuje się metabolizmem względnie heterofermentatywnym. Zdolny jest do fermentacji następujących sacharydów i ich pochodnych, glicerolu, rybozy, galaktozy, glukozy, fruktozy, mannozy, sorbozy, ramnozy, duocytolu, inozytolu, mannitolu, sorbitolu, α-metylo-D-glukozydu, N-acetyloglukozoaminy, amygdaliny, arbutyny, esculiny, salicyny, celobiozy, mahozy, laktozy, melibiozy, sacharozy, trehalozy, melecytozy, rafinozy, skrobi, gencjobiozy, D-turanozy, D-tagatozy, glukonianu, co stwierdzono stosując test API 50 CHL. Laktozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 6,4 g/l, przy czym udział kwasu L(+) mlekowego wynosi 96,4%, kwasu octowego (2,26 g/l), aldehydu octowego (1,87 mg/l) i etanolu (1,14mg/l).

Nowy szczep otrzymuje się w wyniku hodowli na płynnym modyfikowanym podłożu według Rogosa o nazwie handlowej MRS, zawierającym, jako źródło węgla 2% glukozy, w temperaturach 3537°C, korzystnie 37°C. Szczep rośnie w postaci dużych (średnica około 2 mm), lekko wypukłych kolonii, o kolorze jasnokremowym. Brzeg i powierzchnia kolonii są gładkie. Nie wytwarza przetrwalników.

Nowy szczep wykazuje odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w zakresie pH od 2,5 do 3,5 oraz na sole żółci w stężeniach 2%, 4%, 6% w czasie do 48 godzin.

PL 209 986 B1

Nowy szczep wykazuje oporność w stosunku do następujących antybiotyków i chemioterapeutyków o działaniu przeciwbakteryjnym: wankomycyny, cefalotyny, ceftazydymu, aztreonamu, amikacyny, streptomycyny, klotrimazolu.

Nowy szczep charakteryzuje się dobrym przyleganiem do linii komórkowych Caco-2 oznaczonym, jako (++), przy czym adherencję określano półilościowo przyjmując, iż (-) oznacza brak przylegania, (+) - pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, (++) - pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, (+++) - liczne bakterie w poszczególnych polach widzenia.

Nowy szczep wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do bakterii patogennych przenoszonych drogą pokarmową: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomoms aeruginosa, Enterococcus faecalis. Salmonella enteritidis. Salmonella Typhimurium, Lisłeria monocytogenes, histeria innocua.

Nowy szczep posiada niewielką aktywność fekalną. Spośród trzech enzymów β-glukozydazy, β-glukuronidazy i ureazy, aktywna jest tylko β-glukozydaza.

Poniższe przykłady ilustrują identyfikację genetyczną szczepu oraz jego cechy morfologiczne, biochemiczne i biotechnologiczne, z powołaniem się na rysunek, na którym fig. 1 przedstawia wykres przeżywalności mieszanek bakterii ŁOCK 0908 z glukonianem wapnia, mlekiem w proszku i preparatem fruktooligosacharydu o nazwie handlowej Raftilose®, przechowywanych w temperaturze chłodniczej, zaś fig. 2 - przeżywalność tych mieszanek przechowywanych w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d I.

W celu określenia przynależności gatunkowej nowego szczepu ŁOCK 0908 sekwencję nukleotydową regionu DNA kodującego gen 16S rRNA tego szczepu porównano, za pomocą odpowiedniego programu komputerowego, z sekwencją takiego samego regionu DNA znanego szczepu Lactobacillus casei. Porównanie sekwencji nukleotydowych nowego szczepu i znanego szczepu Lactobacillus casei:

Nowy: 21 Znany: 1376 Nowy: 81 Znany: 1316 Nowy: 141 Znany: 1256 Nowy: 201 Znany: 1196 Nowy: 261 Znany: 1136 Nowy: 321 Znany: 1076 Nowy: 381 Znany: 1016 Nowy: 441 Znany: 956 Nowy: 501 Znany: 896 Nowy: 561 Znany: 836 Nowy: 621 Znany: 776

acgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacct I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I acgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacct gatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaat I I I I I I I I II I I I 1 I I I I I I I I II I I I I I i ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I gatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaat taaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttg I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I taaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttg cggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaac

I I I I I I IIIIIIIIII II III I III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I IIII TT ITII I I I cggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaac cctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttc I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I cctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttc gctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactg

Tl IIIIIIIIIIIIIII I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I I I I I I I I I gctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactg

1317

140

1257

200

1197

260

1137

320

1077

380

1017

440

957

500

897

560

837

620

777

680

717

PL 209 986 B1

Nowy: 681 Znany: 716 Nowy: 740 Znany: 656 Nowy: 799 Znany: 596 Nowy: 859 Znany: 537 gtgttcttccatatatctacgcattt-accgctacacatggagttccactgtcctcttct 739 I III I I I I IIII I I I I IIII I I I I II I I I I I III I I I I IIII I I I I III I I I I I III I I gtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttct 657 gcactcaagtttcc-agtttccgatgcactttctcggttaagccgagggcttttacatta 798 T llllllllllll III IIIIIIIIIIIII I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I llll I gnactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatca 597 gacttaaaaaaaccgctgcgctcgctttacccccaataaatccggataacgcttggcccc 858 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I gacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttg-ccac 538 cttcgtattacc 870 II I I I I I I I I I ctacgtattacc 526.

W wyniku porównania sekwencji nowego szczepu Ł OCK 0908 i szczepu znanego, dla nowego szczepu stwierdzono:

długość = 1521, podobieństwo = 837/852 (98%), niezidentyfikowane = 3/852 (0%), nić = Plus/Minus.

Dla szczepu ŁOCK 0908 wyizolowano 16 białek wewnątrzkomórkowych o masach molekularnych 69,36; 62,57; 54,10; 48,66; 45,84; 42,97; 40,92; 38,87; 32,43; 30,85; 29,60; 27,41; 24,17; 23,64; 19,95; 16,87 kDa oraz 14 białek zewnątrzkomórkowych o masach 174,59; 93,10; 78,05; 62,57; 56,25; 48,66; 47,69; 42,97; 40,92; 36,82; 34,49; 32,93; 32,43; 29,10 kDa.

P r z y k ł a d II.

Szczep ŁOCK 0908 hodowano na podłożu płynnym MRS o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy 4,0, ekstrakt mięsny - 8,0, pepton K - 10,0, glukoza - 20,0, wodoro-cytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7- wodny - 0,20, siarczan magnezu 4 - wodny 0,05, agar - 15,0, w temperaturze 37°C. Po 24 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 3,0 x 10⁹ komórek/ml.

P r z y k ł a d III.

Bakterie otrzymane jak w przykładzie II umieszczono w środowiskach o pH 2,5 13,5.

W środowisku o pH 2,5 po 180 minutach przeżyło 1,7 x 10⁶ jtk (jednostek tworzących kolonie)/ml przy wyjściowej ich ilości 6,5 x 10⁷ jtk/ml. W środowisku o pH 3,5 po 180 minutach przeżyło 2,8 x 10⁷ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 7,0 x 10⁷ jtk/ml.

P r z y k ł a d IV.

Bakterie otrzymane jak w przykładzie II poddano działaniu soli żółci o stężeniach 2%, 4% i 6% w czasie do 48 godzin. W wyniku działania soli żó łci o stężeniu 2% po 48 godzinach przeżyło 5,6 x 10⁶ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 1,6 x 10⁸ jtk/ml. Pod wpływem działania soli żółci o stężeniu 4% po 48 godzinach przeżyło 3,3 x 10⁶ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 1,34 x 10⁸ jtk/ml. Pod wpływem działania soli żółci o stężeniu 6% po 48 godzinach przeżyło 4,1 x 10⁵ jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 1,2 x 10⁸ jtk/ml.

P r z y k ł a d V.

W celu okreś lenia wł a ś ciwoś ci biotechnologicznych nowego szczepu bakterii Ł OCK 0908, inokulum tego szczepu zaszczepiono mleko UHT o 2% zawartości tłuszczu. Szczep ŁOCK 0908 fazę stacjonarną osiągnął po 20 godzinach hodowli w mleku, zaś plon komórek wynosił 6,9 x 10⁸ jtk/ml. Czas trwania fazy adaptacyjnej bakterii wyniósł 0,5 godziny.

Maksymalna wartość właściwej szybkości wzrostu szczepu wynosiła 0,23 h^-1, a produktywność hodowli był a równa 0,64 x 10⁸.

Szczep w początkowym etapie fazy stacjonarnej osiągnął kwasowość wynoszącą 42°SH, gwarantującą czysto kwaśny smak produktu. Specyficzna aktywność kwasząca bakterii wyrażona w °SH na jednostkę tworzącą kolonie w fazie stacjonarnej wzrostu szczepu wynosiła 5,8°SH/10⁸ jtk.

Po 24 godzinach inkubacji szczep wykorzystał laktozę mleka w 32,0%. Nadto stwierdzono, iż:

- szczep charakteryzuje się aktywnością β-galaktozydazy na poziomie 0,42 J, przy czym jednostka aktywności J definiowana jest jako ilość μmoli o-nitrofenylo-e-galaktopiranozy (ONP) uwolnionych w czasie 1 minuty przez 1 mg suchej masy bakterii,

- jest zdolny do jednoczesnego wykorzystania glukozy i galaktozy,

- nie syntetyzuje bakteriocyn i związków bakteriocynopodobnych,

- nie syntetyzuje również biosurfaktantów.

P r z y k ł a d VI.

Określano trwałość przechowalniczą produktów i preparatów zawierających nowy szczep ŁOCK 0908.

PL 209 986 B1

W tym celu mleko UHT o 2% zawartoś ci tłuszczu zaszczepiano inokulum bakterii Ł OCK 0908 dodanym w ilości 10%, inkubowano do momentu ukwaszenia mleka, po czym ukwaszone mleko przechowywano w temperaturze 4-5°C w ciągu 21 dni. W analogicznych warunkach przechowywano również mleko nieukwaszone zawierające inokulum tych bakterii.

W trakcie przechowywania w mleku ukwaszonym i nieukwaszonym sprawdzano przeżywalność bakterii ŁOCK 0908 oraz kwasowość ogólną produktu. Przeżywalność szczepu ŁOCK 0908 w nieukwaszonym mleku, przechowywanym przez 21 dni w temperaturze 4-5°C wynosiła 94%, a liczba komórek bakterii kształtowała się na poziomie 10⁸ jtk/ml.

W mleku ukwaszonym szczepem ŁOCK 0908 liczba żywych bakterii była wysoka i wynosiła 10⁹ jtk/ml i w trakcie 21 dni przechowywania nie uległa istotnej zmianie. Nadto stwierdzono, iż chłodnicze przechowywanie mleka ukwaszonego szczepem ŁOCK 0908 stabilizuje kwasowość całkowitą na poziomie 41,6°SH (granice kwasowości 30-46°SH), która gwarantuje czysto kwaśny smak produktu i zapewnia bardzo dobre cechy sensoryczne produktu.

Przygotowano mieszanki szczepu ŁOCK 0908 zawierające 10% dodatek glukonianu wapnia, preparatu Raftilose® i mleka w proszku, po czym poddano je procesowi liofilizacji.

Oceniano trwałość liofilizowanych preparatów przechowywanych w czasie 4 miesięcy w warunkach chłodniczych (4-5°C) oraz w temperaturze pokojowej (25°C). Wyniki oceny przeżywalności bakterii ŁOCK 0908 w tych mieszankach w temperaturze chłodniczej i temperaturze pokojowej przedstawiono w postaci wykresów na fig. 1 i fig. 2 rysunku.

Okazało się, iż temperatura chłodnicza zapewnia większą stabilność i trwałość liofilizowanych preparatów niezależnie od czynnika ochronnego. Przechowywanie preparatu bakterii suszonego sublimacyjnie z mlekiem jako medium ochronnym w czasie 4 miesięcy w temperaturze chłodniczej spowodowało obniżenie liczby żywych komórek o 10,3%, zaś w temperaturze pokojowej o 26,2%. W czasie 4 miesięcy przechowywania liofilizatu mieszaniny komórek bakterii z preparatem Raftilose® stopień redukcji liczby żywych komórek ŁOCK 0908 wzrósł o 29,0% w temperaturze chłodniczej i o 38,9% w temperaturze pokojowej. Zamieralność komórek bakterii ŁOCK 0908 liofilizowanych z glukonianem wapnia, przechowywanych w temperaturze chłodniczej wynosiła 27,2%, natomiast przechowywanych w temperaturze pokojowej - 32,9%. W sekwencjach nukleotydowych:

a - oznacza nukleotyd zawierający adeninę , jako zasadę azotową g - oznacza nukleotyd zawierają cy guaninę jako zasadę azotową , c - oznacza nukleotyd zawierający cytozynę jako zasadę azotową, t - oznacza nukleotyd zawierający tyminę jako zasadę azotową.

Claims (1)

1. Nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus casei LOCK 0908 o właściwościach probiotycznych, stanowiący homolog bakterii z gatunku Lactobacillus casei, o następującej sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNa, którego sekwencja określa przynależność gatunkową bakterii

   21 cgtattaaccgcggcgtgttgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgag 80

   81 ttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctc 140

   141 gcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatg 200

   201 atttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaa 260

   261 ctaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctc 320

   321 acgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacct 380

   381 gatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaat 440

   441 taaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttg 500

   501 cggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaac 560

   561 cctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttc 620

   621 gctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactg 680

   681 gtgttcttccatatatctacgcattt-accgctacacatggagttccactgtcctcttct 739

   740 gcactcaagtttcc-agtttccgatgcactttctcggttaagccgagggcttttacatta 798

   799 gacttaaaaaaaccgctgcgctcgctttacccccaataaatccggataacgcttggcccc 858

   859 cttcgtattacc 870.