PL209782B1 - Sekwencje nukleotydowewektorów, fuzyjne białka zawierające domeny MutS i GFP, sposób ich otrzymywania oraz sposób ich zastosowania do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNA - Google Patents
Sekwencje nukleotydowewektorów, fuzyjne białka zawierające domeny MutS i GFP, sposób ich otrzymywania oraz sposób ich zastosowania do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNAInfo
- Publication number
- PL209782B1 PL209782B1 PL376945A PL37694505A PL209782B1 PL 209782 B1 PL209782 B1 PL 209782B1 PL 376945 A PL376945 A PL 376945A PL 37694505 A PL37694505 A PL 37694505A PL 209782 B1 PL209782 B1 PL 209782B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- muts
- gfp
- histag
- protein
- fusion protein
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 35
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 2
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 12
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 6
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 29
- 102000010645 MutS Proteins Human genes 0.000 description 28
- 108010038272 MutS Proteins Proteins 0.000 description 28
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 101150013854 mutS gene Proteins 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 101100185881 Clostridium tetani (strain Massachusetts / E88) mutS2 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 101150117187 glmS gene Proteins 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011246 intracellular protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku są sekwencje nukleotydowe wektorów kodujących fuzyjne białka histag-GFP-MutS, histag-MutS-GFP-histag, MutS(ProGly)5-GFP-histag, fuzyjne białka histag-GFP-MutS, histag-MutS-GFP-histag, histag-MutS(ProGly)5-GFP-histag, sposób ich otrzymywania oraz ich zastosowanie do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNA.
Znanych jest wiele molekularnych sposobów wykrywania mutacji i niekomplementarności w DNA, różnią cych się czułością i wiarygodnością oznaczenia. Mogą być one pomocne w diagnozie terapii i profilaktyce tysięcy chorób genetycznych oraz nowotworowych, które dotyczą 40% populacji ludzkiej. Liczba mutacji punktowych i polimorfizmów jednonukleotydowych (SNP) szacowana jest w genomie ludzkim na miliony.
Białko MutS jest naturalnym komórkowym strażnikiem wierności replikacji. Zadaniem tego białka jest rozpoznanie niekomplementarności w DNA, która powstaje, jeśli polimeraza wstawi błędnie zasadę. Białko MutS rozpoznaje wszystkie typy nie sparowanych i błędnie sparowanych zasad. Powstanie kompleksu MutS-DNA staje się sygnałem do uruchomienia procesu naprawy DNA, w którym uczestniczy kilkanaście innych białek. Homologi MutS występują we wszystkich komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. Powinowactwo MutS do niekomplementarności zależy od typu, organizmu z którego MutS, a nawet kontekstu sekwencji.
Białko MutS jest znanym narzędziem do wykrywania niekomplementarności w strukturze DNA, także in vitro. Opracowano kilka sposobów badania mutacji przy pomocy białka MutS. Sposoby te wykorzystują zdolność MutS do opóźniania migracji DNA w żelu poliakrylamidowyrn Skonstruowano rozmaite fuzyjne białka MutS, najczęściej z małą domeną oligohistydynową umożliwiającą oczyszczanie białka metodą chromatografii metalopowinowactwa, ponadto z domenami takimi jak MBP, tioredoksyna-streptawidyna, a także przeprowadzono ekspresję fuzji GFP z MutS E. Coli. Detekcja mutacji przy pomocy białka MutS wymaga amplifikacji badanego regionu DNA przy pomocy PCR i zmieszania z DNA odnoś nikowym. Nastę pnie po ogrzaniu i ozię bieniu powstają tzw. heterodupleksy jak przedstawiono na rysunku (Fig. 1), tj. cząsteczki DNA zawierające jedną nić z DNA odnośnikowego, drugą z DNA badanego. Jeś li w DNA badanym wystę puje mutacja, to w heterodupleksie powstaje niekomplementarność, którą może rozpoznać MutS.
Znane jest białko GFP (zielona proteina fluoryzująca) pochodzące z meduzy Aequorea victoria, żyjącej w Oceanie Spokojnym. Jest to obecnie jedna z najbardziej popularnych domen fuzyjnych umożliwiających lokalizację lub detekcję białka fuzyjnego dzięki silnej zielonej fluorescencji. Zaletą tej domeny jest niewielki rozmiar (238 reszt aminokwasowych), aktywność w postaci monomeru, fluorescencja nie wymagająca żadnych substratów i kofaktorów, oraz stabilność w różnych warunkach buforowych. Występująca w tej domenie grupa chromoforowa (parahydroksybenzylidenoimidazolidon) jest cyklicznym trimerem, uformowanym z reszt aminokwasowych 65-67: Ser-Tyr-Gly w wyniku autokatalitycznej cyklizacji i utlenieniu. GFP posiada dużą odporność na proteolizę i denaturację. Jej fluorescencja jest zachowana w obecności umiarkowanych czynników denaturujących, takich jak: 1% SDS, 8M mocznik oraz po immobilizacji za pomocą aldehydu glutarowego lub formaldehydu. Opublikowane zostały wyniki prac badawczych, w których w genie kodującym dziką formę GFP przeprowadzono szereg mutacji zmieniających właściwości kodowanych białek. Jednym z takich mutantów jest białko GFPuv (Crameri, A., et al., Nat. Biotechnol. 14, 315-9 1996), które zawiera 3 aminokwasowe substytucje (Ser zamiast Phe99, Thr w miejsce Met153 oraz Ala zamiast Val163) nie zmieniając sekwencji w chromoforze, ale zwiększając emisję światła 18 razy w stosunku do wtGFP w nadekspresyjnym szczepie E. Coli. Wykazano, że możliwe jest wykrycie pojedynczej cząsteczki GFP przy użyciu techniki mikroskopowej.
Wynalazkami są: sekwencje nukleotydowe wektorów plazmidowych zawierające DNA kodujące fuzyjne białko histag-GFP-MutS o wzorze 1 oraz sekwencje nukleotydowe wektorów plazmidowych zawierające DNA kodujące fuzyjne białko histag-MutS-GFP-histag o wzorze 2 oraz sekwencje nukleotydowe wektorów plazmidowych zawierające DNA kodujące fuzyjne histag-MutS(ProGly)5-GFP-histag o wzorze 3.
Wynalazki stanowią również: fuzyjne białko histag-GFP-MutS o wzorze 4 oraz fuzyjne białko histag-MutS-GFP-histag o wzorze 5 oraz fuzyjne białko histag-MutS(ProGly)5-GFP-histag o wzorze 6.
Wynalazkiem jest też sposób otrzymywania fuzyjnych białek złożonych z domen MutS i GFP o wzorach 1 lub 2 lub 3 polegający na tym, ż e fuzyjne białko produkowane jest w komórkach Escherichia Coli, charakteryzujący się tym, że komórki E. coli transformuje się plazmidem zawierającym sePL 209 782 B1 kwencję DNA kodującą fuzyjne białko odpowiednio o wzorze 4 lub 5 lub 6, po czym korzystnie oczyszcza się to białko z lizatu komórek przy użyciu metody chromatografii metalopowinowactwa.
Wynalazkiem jest również sposób wykrywania mutacji i niekomplementarności w DNA polegający na przyłączeniu fuzyjnego białka zawierającego domenę MutS, charakteryzujący się tym, że przyłącza się fuzyjne białko odpowiednio o wzorze 4 lub 5 lub 6, po czym wykrywa się znanymi metodami pomiaru fluorescencji położenie domeny GFP.
Wynalazek pozwala na stworzenie nowego narzędzia do wykrywania mutacji punktowych, o mo ż liwoś ciach przewyż szają cych dotą d opracowane metody, dzię ki pominię ciu etapu znakowania DNA, możliwości detekcji jednej cząsteczki DNA zawierającej mutację po przyłączeniu białka fuzyjnego złożonego z domen MutS i GFP oraz dzięki możliwości użycia wynalazku w systemach, które pozwalają na lokalizację pojedynczej cząsteczki GFP. W konsekwencji możliwe jest pominięcie etapu amplifikacji DNA przy pomocy PCR. Ponadto wynalazek znajduje zastosowanie do wewnątrzkomórkowej detekcji niekomplementarności w DNA.
Przedmiot wynalazku objaśniono bliżej w przykładach i na rysunku, na którym przedstawiono:
Fig. 1 Powstawanie heterodupleksów DNA
Fig. 2 Sekwencje nukleotydowe starterów do amplifikacji genu GFPuv w celu konstrukcji fuzji GFP z koń cem C biał ka MutS.
Fig. 3 Rekombinantowy plazmid pUET1-gfp-mutS.
Fig. 4 Sekwencje nukleotydowe starterów do amplifikacji genu GFPuv w celu konstrukcji fuzji GFP z końcem C białka MutS.
Fig. 5 Rekombinantowy plazmid pUET1-mutS-gfp.
Fig. 6 Kaseta zawierająca sekwencję kodującą złącze peptydowe (ProGly)5 oraz gen oporności na kanamycynę.
Fig. 7 Rekombinantowy plazmid pUET1-mutS-(progly)5-gfp.
Fig. 8 Fuzje MutS i GFP zaopatrzone w domeny oligohistydynowe histag. Wyniki ekspresji i oczyszczania białek nadprodukowanego w komórkach E. coli.
Fig. 9 Fluorescencja frakcji elucyjnej białka His-tag-GFP-MutS ze złoża His-trap w porównaniu z fluorescencją buforu elucyjnego.
Fig. 10 Wyniki retardacji fragmentu 262 pz przez fuzje MutS i GFP.
P r z y k ł a d 1
Sposób otrzymywania wektorów plazmidowych niosących geny kodujące fuzje białka MutS i GFP
Konstrukcja plazmidu pUET1-gfp-mutS kodującego białko histag-GFP-MutS
Gen kodujący fuzyjne białko histag-GFP-mutS skonstruowano przez klonowanie genu GFPuv w miejsca restrykcyjne Bg/II-KpnI plazmidu pUET1-Tth-mutS niosącego gen mutS Thermus Thermophilus. DNA kodujące gen GFPuv uzyskano przez amplifikację PCR na matrycy DNA plazmidu pGFPuv (Clontech) przy użyciu starterów zawierających miejsca restrykcyjne Bg/II i KpnI, jak przedstawiono na rysunku (Fig. 2). Sekwencje nukleotydowe rozpoznania dla restryktaz: Bg/II (agatct) i KpnI (ggtacc) umieszczono w ramkach. Sekwencje nukleotydowe komplementarne do genu GFPuv zapisano wielkimi literami. W ten sposób uzyskano plazmid pUET1-gfp-mutS, w którym geny GFP i mutS tworzą jedną ramkę odczytu pod kontrolą promotora T7, jak przedstawiono na rysunku (Fig. 3). Poprawność sekwencji nukleotydowej genu fuzyjnego potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencję nukleotydową plazmidu pUET1-mutS-gfp przedstawia wzór 1.
Konstrukcja plazmidu pUET1-mutS-gfp kodującego białko histag-MutS-GFP
Gen kodujący fuzyjne białko histag-MutS-GFF skonstruowano przez klonowanie genu GFPuv w miejsca restrykcyjne EcoRI-HindIII plazmidu pUET1-Tth-MutS-ns niosącego gen mutS Thermus thermophilus pozbawiony kodonu STOP. DNA kodujące gen GFPuv uzyskano przez amplifikację PCR na matrycy DNA plazmidu pGFPuv (Clontech) przy użyciu starterów zawierających miejsca restrykcyjne EcoRI i HindllI jak przedstawiono na rysunku (Fig. 4). Sekwencje nukleotydowe rozpoznania dla restryktaz: Kpnl (ggtacc) i Hindlll (aagctt) umieszczono w ramkach. Sekwencje nukleotydowe komplementarne do genu GFPuv zapisano wielkimi literami. W ten sposób uzyskano plazmid pUET1-mutS-gfp, w którym geny GFP i mutS tworzą jedną ramkę odczytu pod kontrolą promotora T7, jak przedstawiono na rysunku (Fig. 5). Poprawność sekwencji nukleotydowej genu fuzyjnego potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencję nukleotydową plazmidu pUET1-mutS-gfp przedstawia wzór 2.
PL 209 782 B1
Konstrukcja plazmidu pUET1-mutS-(progly)5-gfp kodującego białko histag-MutS-(ProGly)5-GFP-histag
Gen kodujący fuzyjne białko histag-MutS-(ProGly)-GFP-histag skonstruowano przez wprowadzenie fragmentu DNA kodującego sekwencję aminokwasową (ProGly)5 do plazmidu pUET1 mutS-gfp pomiędzy geny mutS. W celu ułatwienia klonowania tej sekwencji, została ona wprowadzona jako części kasety zawierającej gen oporności na kanamycynę (kan). Kaseta, została uzyskana przez amplifikację PCR na matrycy DNA plazmidu niosącego gen oporności na kanamycynę przy użyciu starterów zawierających sekwencję kodującą peptyd (ProGly)5 oraz miejsca rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych do klonowania i miejsca wiązania rybosomów rbs (jedno dla genu kan, drugie dla genu gfp). (Fig. 6A) przedstawia sekwencje nukleotydowe starterów użytych do konstrukcji kaset (starter „reverse przedstawiony jest jako sekwencja komplementarna). Sekwencje odpowiadające sekwencji genu oporności na kanamycynę są podkreślone. (Fig. 6B) przedstawia tricistronowy system uzyskany przez insercję kasety zawierającej gen kan w miejsce EcoRI między geny mutS i gfp. Po wycięciu genu kan. enzymem Sacll i autoligacji plazmidu, odtworzona została jedna ramka odczytu kodująca fuzję białka złożonego z domen MutS i GFP połączonych sekwencją złącza (ProGly)5, jak przedstawiono na rysunku (Fig. 7). Sekwencję kodującą peptyd (ProGly)5 zaznaczono czarną strzałką. Poprawność sekwencji nukleotydowej genu fuzyjnego potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Sekwencję nukleotydową plazmidu pUET1-mutS-gfp przedstawia wzór 3.
P r z y k ł a d 2
Sposób otrzymywania fuzji białek MutS i GFP
Nadekspresja i oczyszczanie białka histag-MutS-GFP-histag
Ekspresję białka histag-MutS-GFP-histag prowadzono w komórkach E. coli BL.21(DE3)pLysS transformowanych plazmidem pUET1-mutS-gfp w temp. 30°C. Ekspresję białka fuzyjnego potwierdzono przez analizę profili białkowych, w 10% żelu poliakrylamidowym barwionym Brilliant Blue w warunkach denaturujących. Białko histag-MutS-GFP, 124kDa nadprodukowane w temp. 30°C, oczyszczono z 800 ml hodowli E. coli przy zastosowaniu chromatografii metalopowinowactwa i zagęszczono przez ultrafiltrację. Uzyskano końcową wydajność 5,4 mg (6,8 mg/l hodowli). Surowy ekstrakt szczepu przedstawiono na rysunku (Fig. 8A), a białko histag-GFP-MutS przedstawiono na rysunku (Fig. 8D). Jako odnośnik przy badaniu ekspresji i oczyszczania białek zastosowano μg osocza krwi bydlęcej (Fig. 8G) oraz białkowy wzorzec masy cząsteczkowej 220, 170, 116, 76, 66, 53 kDA (Fig. 8H).
Nadekspresja i oczyszczanie białka histag-GFP-MutS
Ekspresję białka histag-GFP-MutS prowadzono w komórkach E. coli BL.21(DE3)pLysS transformowanych plazmidem pUET1-gfp-MutS w temp. 30°C. Ekspresję białka fuzyjnego potwierdzono przez analizę profili białkowych 10% żelu poliakrylamidowym barwionym Brilliant Blue w warunkach denaturujących. W przeciwieństwie do hodowli bakteryjnych zawierających natywne białko GFPuv, które silnie fluoryzują przy ekspozycji na UV, hodowle zawierające białko histag-GFP-MutS nie wykazywały typowej dla GFP fluorescencji przy ekspozycji na UV, jeśli hodowlę prowadzono w 37°C, natomiast silną fluorescencję typową dla GFP, wykazywały hodowle bakteryjne, jeśli ekspresję prowadzono w temp. 30°C. Białko histag-GFP-MutS, o wielkości 122,6 kDa oczyszczono z 800 ml hodowli E. coli przy zastosowaniu chromatografii metalopowinowactwa i zagęszczono przez ultrafiltrację. Uzyskano końcową wydajność 10,2 mg (12,8 mg/l hodowli). Surowy ekstrakt szczepu przedstawiono na rysunku (Fig. 8B), a białko histag-GFP-MutS przedstawiono na rysunku (Fig. 8E). Jako odnośnik przy badaniu ekspresji i oczyszczania białek zastosowano 2 μg osocza krwi bydlęcej (Fig. 8G) oraz białkowy wzorzec masy cząsteczkowej 220, 170, 116, 76, 66, 53 kDA (Fig. 8H).
Nadekspresja i oczyszczanie białka histag-MutS-(ProGly)5-GFP-histag
Ekspresję białka histag-MutS-(ProGly)5-GFP-histag prowadzono w komórkach E. coli BL.21 (DE3)pLysS transformowanych plazmidem pUET1-MutS-(ProGly)5-GFP-histag w temp. 30°C. Ekspresję białka fuzyjnego potwierdzono przez analizę profili białkowych w 10% żelu poliakrylamidowym barwionym Brilliant Blue w warunkach denaturujących. Białko histag-MutS-GFP, 125,8 kDa oczyszczono z 800 ml hodowli E. coli przy zastosowaniu chromatografii metalopowinowactwa i zagęszczono przez ultrafiltrację. Uzyskano końcową wydajność 8,8 mg (11,0 mg/l hodowli). Surowy ekstrakt szczepu przedstawiono na rysunku (Fig. 8C), a białko histag-GFP-MutS przedstawiono na rysunku (Fig. 8F). Jako odnośnik przy badaniu ekspresji i oczyszczania białek zastosowano 2 μg osocza krwi
PL 209 782 B1 bydlęcej (Fig. 8G) oraz białkowy wzorzec masy cząsteczkowej 220, 170, 116, 76, 66, 53 kDA (Fig. 8H).
P r z y k ł a d 3
Sposób wykrywania mutacji i niekomplementarności w DNA przy zastosowaniu białek fuzyjnych zawierających domenę MutS i GF
Zdolność wiązania niekomplementarności przez fuzje MutS z GFP potwierdzono przy użyciu retardacji DNA w 6% żelu poliakrylamidowym, barwionym SYBR-Gold, jak przedstawiono na rysunku (Fig. 10). Do analizy przygotowano przez zmieszanie heterodupleks DNA, zawierający dwa fragmenty (łącznie po 125 ng) identyczne za wyjątkiem jednej zasady na pozycji 143 (substytucja T-C) oraz homodupleks DNA (250 ng). Analizę prowadzono w obecności wzorca masowego DNA: (501, 489, 442, 331, 242 pz). Wszystkie spośród trzech fuzji wykazywały specyficzność rozpoznawania niekomplementarności. Całkowicie komplementarne DNA było wydajnie wiązane przez MutS przy znacznym nadmiarze białka. Kompleksy fuzji MutS i GFP z komplementarnym DNA są łatwe do odróżnienia od kompleksów z DNA zawierającym niekomplementarność dzięki różnicom w opóźnieniu migracji.
Spektrum fluorescencyjno emisyjne oczyszczonych fuzji białka MutS z GFP oraz odnośnika histag-GFP zmierzono przy pomocy spektrofluorymetru PerkinElmer LS5 na złożu His-trap. Nie zaobserwowano różnic w spektrum ekscytacji i emisji fluorescencji białek fuzyjnych względem danych literaturowych dla białka GFP (maksimum ekscytacji przy 395 nm., maksimum emisji przy 509 nm.). Intensywność fluorescencji białka histag-GFP-MutS była zbliżona do kontroli histag-GFP, natomiast intensywność fluorescencji białek histag-MutS-GFP-histag i histag-MutS-(ProGly)5-GFP-histag były około 4-5 razy niższe niż dla kontroli histag-GFP jak przedstawiono na rysunku (Fig. 9).
Claims (8)
1. Sekwencje nukleotydowe wektorów plazmidowych zawierające DNA kodujące fuzyjne białko histag-GFP-MutS o wzorze 1.
2. Sekwencje nukleotydowe wektorów plazmidowych zawierające DNA kodujące fuzyjne białko histag-MutS-GFP-histag o wzorze 2.
3. Sekwencje nukleotydowe wektorów plazmidowych zawierające DNA kodujące fuzyjne histag-MutS(ProGly)5-GFP-histag o wzorze 3.
4. Fuzyjne białko histag-GFP-MutS o wzorze 4.
5. Fuzyjne białko histag-MutS-GFP-histag o wzorze 5.
6. Fuzyjne białko histag-MutS(ProGly)5-GFP-histag o wzorze 6.
7. Sposób otrzymywania fuzyjnych białek złożonych z domen MutS i GFP o wzorach 1 lub 2 lub 3 polegający na tym, ż e fuzyjne białko produkowane jest w komórkach Escherichia Coli, znamienny tym, że komórki E. coli transformuje się plazmidem zawierającym sekwencję DNA kodują cą fuzyjne białko odpowiednio o wzorze 4 lub 5 lub 6, po czym korzystnie oczyszcza się to białko z lizatu komórek przy użyciu metody chromatografii metalopowinowactwa.
8. Sposób wykrywania mutacji i niekomplementarności w DNA polegający na przyłączeniu fuzyjnego białka zawierającego domenę MutS, znamienny tym, że stosuje się fuzyjne białko odpowiednio o wzorze 4 lub 5 lub 6, po czym wykrywa si ę znanymi metodami pomiaru fluorescencji położ enie domeny GFP.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL376945A PL209782B1 (pl) | 2005-09-07 | 2005-09-07 | Sekwencje nukleotydowewektorów, fuzyjne białka zawierające domeny MutS i GFP, sposób ich otrzymywania oraz sposób ich zastosowania do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL376945A PL209782B1 (pl) | 2005-09-07 | 2005-09-07 | Sekwencje nukleotydowewektorów, fuzyjne białka zawierające domeny MutS i GFP, sposób ich otrzymywania oraz sposób ich zastosowania do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL376945A1 PL376945A1 (pl) | 2007-03-19 |
| PL209782B1 true PL209782B1 (pl) | 2011-10-31 |
Family
ID=43014650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL376945A PL209782B1 (pl) | 2005-09-07 | 2005-09-07 | Sekwencje nukleotydowewektorów, fuzyjne białka zawierające domeny MutS i GFP, sposób ich otrzymywania oraz sposób ich zastosowania do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL209782B1 (pl) |
-
2005
- 2005-09-07 PL PL376945A patent/PL209782B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL376945A1 (pl) | 2007-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McCarty et al. | Regulatory Region C of theE. coliHeat Shock Transcription Factor, σ32, Constitutes a DnaK Binding Site and is Conserved Among Eubacteria | |
| KR20190091499A (ko) | 내열성의 역전사 효소 돌연변이체 | |
| JP2004507217A (ja) | リステリア菌ゲノム、ポリペプチドおよびその使用 | |
| Wallis et al. | In vivo and in vitro characterization of overproduced colicin E9 immunity protein | |
| EP3436602B1 (en) | Nanopore protein conjugates and uses thereof | |
| Karpel et al. | A basic isozyme of yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with nucleic acid helix-destabilizing activity | |
| JPWO2018004014A1 (ja) | トランスグルタミナーゼ活性を有する組換えタンパク質 | |
| CN120210151A (zh) | 一种突变的MuA转座酶及其应用 | |
| CN118185902B (zh) | 热稳定性增强的Bst DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用 | |
| PL209782B1 (pl) | Sekwencje nukleotydowewektorów, fuzyjne białka zawierające domeny MutS i GFP, sposób ich otrzymywania oraz sposób ich zastosowania do wykrywania niekomplementarności oraz mutacji w DNA | |
| KR102684067B1 (ko) | DNA 및 RNA 동시 검출을 위한 Cas 복합체 및 이의 용도 | |
| JP2008245604A (ja) | 高効率耐熱性ｄｎａリガーゼ | |
| WO2022210748A1 (ja) | 新規なガイドｒｎａとの複合体形成能を有するポリペプチド | |
| US20250051737A1 (en) | Dna polymerase mutant and use thereof | |
| US20100087005A1 (en) | Auxiliary reagent for gene transfer | |
| JP5324083B2 (ja) | 高反応性耐熱性ｄｎａリガーゼ | |
| CN118126984B (zh) | 一种修饰的Pae CasDinG解旋酶及其应用 | |
| WO2015115661A1 (ja) | アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法 | |
| CN119265164B (zh) | 一种Cas蛋白及其在检测中的应用 | |
| Mukherjee et al. | Alteration in template recognition by Escherichia coli RNA polymerase lacking the ω subunit: A mechanistic analysis through gel retardation and foot-printing studies | |
| MIKULiK et al. | Molecular and functional properties of protein SS1 from small ribosomal subunits of Streptomyces aureofaciens | |
| US9284590B2 (en) | Monodisperse random coil proteins and bioconjugates thereof | |
| US20190112583A1 (en) | Novel multiply backbone n-methyl transferases and uses thereof | |
| KR20250107841A (ko) | 신규 포어 단량체 및 포어 | |
| US20110053258A1 (en) | Novel promoter sequence and the application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080907 |