PL207902B1 - Produkty farmaceutyczne zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15(IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów - Google Patents
Produkty farmaceutyczne zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15(IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworówInfo
- Publication number
- PL207902B1 PL207902B1 PL382945A PL38294507A PL207902B1 PL 207902 B1 PL207902 B1 PL 207902B1 PL 382945 A PL382945 A PL 382945A PL 38294507 A PL38294507 A PL 38294507A PL 207902 B1 PL207902 B1 PL 207902B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- cells
- interleukin
- products according
- cytokine
- Prior art date
Links
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 title claims description 30
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 title claims description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 13
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 5
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 title claims description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 26
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 15
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 13
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 11
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 11
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 9
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 3
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007761 synergistic anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są produkty farmaceutyczne, zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15 (IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów, zwłaszcza czerniaka.
Od wielu lat standardowym leczeniem nowotworów u człowieka było i jest leczenie operacyjne (chirurgiczne), chemioterapia oraz radioterapia. Od pewnego czasu do terapii nowotworów wprowadzona jest nowa kategoria leczenia - immunoterapia. W przeciwieństwie do standardowych form, gdzie najlepszy efekt terapeutyczny uzyskuje się po zastosowaniu najbardziej radykalnego leczenia (możliwie duży zakres interwencji chirurgicznej lub zastosowanie maksymalnych bezpiecznych dawek leku lub napromieniowania) w immunoterapii celem jest przede wszystkim nie bezpośredni wpływ na nowotwór lecz wzmocnienie działania mechanizmów immunologicznych odpowiedzi przeciwnowotworowej (J.A. Andreas i wsp., Critical Rev. Oncol/Hematol. (2000) 34:1-25, M. Jakóbisiak i W. Lasek, IMMUNOLOGIA, red. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Wyd. Naukowe PWN, str. 522-543, 2002). Stąd też zastosowanie preparatów immunologicznych działających różnokierunkowo może dać efekt przeciwnowotworowy synergistyczny.
Podawanie komórek nowotworowych w formie szczepionki jest odmianą immunoterapii czynnej, mającej na celu indukowanie swoistych reakcji przeciwnowotworowych, podczas gdy podawanie cytokin, w tym interleukiny IL-15, jest formą immunoterapii biernej - wzmagającej reakcje nieswoiste układu odpornościowego (M. Jakóbisiak i W. Lasek, IMMUNOLOGIA, red. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Wyd. Naukowe PWN, str. 522-543, 2002, S. Mocellin i wsp. (2004) Lancet Oncol. 5: 681-689).
W klinice, w leczeniu nowotworów czł owieka jest stosowana (w ograniczonym zakresie) immunoterapia czynna z użyciem szczepionki Melacine i OncoVax (S. Mocellin i wsp. (2004) Lancet Oncol. 5: 681-689), stosowane, odpowiednio, do leczenia czerniaka i raka jelita grubego. W immunoterapii biernej stosuje się z kolei takie cytokiny jak IL-2 i IFN alfa. Trwają cały czas poszukiwania nowych szczepionek, ponieważ efekty immunoterapii są niezadowalające (V.K. Sondak i wsp. (2007) Clin. Cancer Res. 12 (supl) 2337s-2341s).
W modelu zwierzęcym stosowane są różne formy immunoterapii czynnej, bazujące na komórkach nowotworowych (modyfikowanych genetycznie, ich lizatach lub ekstrahowanych antygenach) oraz pojedynczych czynników działających nieswoiście, w tym cytokin (M. Jakóbisiak i W. Lasek, IMMUNOLOGIA, red. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Wyd. Naukowe PWN, str. 522-543, 2002).
Znany jest z polskiego zgłoszenia wynalazku nr P-366240 sposób indukowania reakcji przeciwnowotworowej przeciwko przerzutom płucnym u pacjentów z czerniakiem. Wynalazek dotyczy sposobu wywoływania reakcji przeciwnowotworowej przeciwko czerniakowi przez podanie skutecznej ilości kompozycji, która obejmuje przynajmniej: (i) modyfikowaną haptenem syngeniczną komórkę czerniaka, zasadniczo nie będącą w fazie wzrostu, (ii) modyfikowane haptenem błony komórkowe czerniaka, (iii) peptyd izolowany z modyfikowanej haptenem komórki albo błon komórkowych czerniaka, (iv) limfocyt T zdolny do pośredniczenia w takiej reakcji przeciwnowotworowej jak np. regresja czerniaka. Czerniak leczony według wynalazku wywołuje przerzuty do płuc, węzłów chłonnych albo podskórne.
Znana jest z polskiego opisu patentowego nr 190445 genetyczna szczepionka przeciwrakowa przeznaczona jest do wzbudzenia własnych mechanizmów obronnych pacjenta do zwalczenia nowotworów, zwłaszcza czerniaka złośliwego. Istotą wynalazku jest genetyczna modyfikacja allogenicznych komórek nowotworowych poprzez wprowadzenie do nich dwóch genów: dla interleukiny 6 i dla jej rozpuszczalnego receptora, które następnie wstrzykiwane będą chorym.
Przedmiotem wynalazku są produkty farmaceutyczne, zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15 (IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów, zwłaszcza czerniaka.
Modyfikacja genetyczna komórek nowotworowych polega na wprowadzeniu do genomu komórek genów dla cytokin lub ich wariantów. Jako geny dla cytokin lub ich wariantów stosuje się korzystnie (a) gen dla cytokiny Interleukiny 12 (IL-12) lub (b) gen dla cytokiny określanej jako czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-alfa lub (c) gen dla czynnika stymulującego powstawanie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) lub (d) gen dla cytokiny interleukiny 6 połączonej z jej rozpuszczalnym receptorem (IL-6/slL-6R). Modyfikowane genetycznie komórki czerniaka będą poniżej definiowane, odpowiednio, jako (a) szczepionka B78/IL-12, (b) B78/TNF-alfa, (c) B78/GM-CSF, (d) gen dla cytokiny składającej się z interleukiny 6 połączonej z jej rozpuszczalnym receptorem (IL-6/slL-6R), nazywanej
PL 207 902 B1 zamiennie Hyper-IL-6. Interleukina 15 (IL-15) - drugi składnik kompozycji terapeutycznej to rekombinowana ludzka cytokina IL-15, korzystnie mająca specyficzną aktywność 4,96 x 105 U/mikrogram białka.
Produkty według wynalazku podaje się w następującej kolejności: najpierw modyfikowane genetycznie komórki nowotworowe wydzielające cytokiny lub ich warianty a następnie interleukinę 15.
Stwierdzono, że produkty według wynalazku podawane łącznie, ale w określonej, wskazanej kolejności wykazują znacznie silniejsze działanie niż każdy z nich podawany oddzielnie. Zjawisko synergizmu występującego w produkcie według wynalazku zostało udokumentowane w badaniach na modelu mysim, przedstawionych w poniższych przykładach.
P r z y k ł a d I
Szczepionkę B78/IL-12 przygotowano w następujący sposób. Gen dla mysiej IL-12 wyekstrahowano z plazmidu pEM12 za pomocą enzymów Xhol i Notl po czym wprowadzono go do wektora retrowirusowego Samenv. Komórki pakujące PA317 (kupione z ATCC, CRL 9078) zostały następnie poddane elektroporacji w celu wbudowania wytworzonego powyżej wektora Samenv-IL-12. W kolejnym etapie komórki pakujące rozhodowywano w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FCS i gentamycyny i dwa dni później poddane były selekcji na integrację genu w pożywce zawierającej genetycynę G418. Wyselekcjonowane klony komórek były sprawdzane pod kątem uwalniania wektora wirusowego. Supernatanty zawierające wektory wirusowe zawierające gen dla IL-12 były dodawane następnie do hodowli komórek czerniaka B78-H1 w obecności polibrenu (4 mikrogramy/ml), po czym procedura została powtórzona ponownie. Komórki czerniaka, w których doszło do integracji genu dla IL-12 były następnie selekcjonowane metodą ograniczonych rozcieńczeń. Spośród komórek czerniaka wydzielających IL-12 do badań wybrano klon wytwarzający maksymalne ilości IL-12, tj. 272 pg/1 x 106 komórek/ 24 godziny. Komórki tej szczepionki (B78/IL-12) charakteryzowały się ciągłym wzrostem w pożywce hodowlanej składającej się z medium Dulbecco's (high glucose), 10% surowicy płodowej cielęcej, L-glutaminy, 2-merkaptoetanolu oraz antybiotyków (wszystkie odczynniki kupione z firmy GIBCO Life Technologies) (W. Lasek i wsp., Cancer Immunol. Immunother. (2004) 53: 363-372.
Drugi składnik produktu - interleukina IL-15 - to rekombinowana ludzka cytokina IL-15 mająca specyficzną aktywność 4,96 x 105 U/mikrogram białka dostarczona z firmy lmmunex Corp. (aktualnie Amgen) z Seattle, WA, Stany Zjednoczone.
Wymieniona linia wyjściowa czerniaka mysiego B78-H1 oraz komórki szczepionkowe są zabankowane w Zakładzie Immunologii Centrum Biostruktury Akademii Medycznej w Warszawie
P r z y k ł a d II
Komórki szczepionki B78/H1 były przygotowane w sposób podobny do opisanego wyżej. Wektor wirusowy zawierający gen dla TNF-alfa (DCCMV-TNF) był dodawany do hodowli komórek pakujących PA317 poddawanych elektorporacji w celu integracji wektora z komórkowym DNA. Następnie komórki były selekcjonowane na obecność genu dla TNF-alfa w pożywce hodowlanej zawierającej genetycynę G418 (0,5 mg/ml) przez 3 tygodnie. Kolejnym etapem było generowanie komórek czerniaka B78-H1 wydzielających TNF-alfa. Dokonywano tego inkubując komórki czerniaka z supernatanem z hodowli komórek pakują cych PA317 w obecnoś ci plibrenu (8 mikrogramów/ml). Hodowle selekcjonowano w obecności G418. Komórki czerniaka, w których doszło do integracji genu dla TNF-alfa były następnie selekcjonowane metodą ograniczonych rozcieńczeń. Spośród komórek czerniaka wydzielających TNF-alfa do badań wybrano klon wytwarzający maksymalne ilości TNFIL-12, tj. 8,1 ng/ 1 X 106 komórek/ 24 godziny. Pełne dane dotyczące przygotowania szczepionki B78/TNF opisane są w pracy: W. Lasek i wsp., (2000) Cancer Gene Ther. 7: 1581-1590. Komórki tej szczepionki (B78/TNF) charakteryzowały się ciągłym wzrostem w pożywce hodowlanej składającej się z medium Dulbecco's (high glucose), 10% surowicy płodowej cielęcej, L-glutaminy, 2-merkaptoetanolu oraz antybiotyków (wszystkie odczynniki kupione z firmy GIBCO - Life Technologies).
Drugi składnik produktu - interleukina IL-15 - to rekombinowana ludzka cytokina IL-15 mająca specyficzną aktywność 4,96 x 105 U/mikrogram białka dostarczona z firmy lmmunex Corp. (aktualnie Amgen) z Seattle, WA, Stany Zjednoczone.
Wymieniona linia wyjściowa czerniaka mysiego B78-H1 oraz komórki szczepionkowe są zabankowane w Zakładzie Immunologii Centrum Biostruktury Akademii Medycznej w Warszawie.
P r z y k ł a d III
Komórki szczepionki B78/GM-CSF były przygotowywane jak opisano poniżej. Mysi gen dla GMCSF był wycinany z plazmidu pGEMTeasy mGM-CSF przy pomocy enzymu Notl i klonowany w wektorze retrowirusowym DCCMV IRES Neo. Kolejnym etapem było przygotowanie komórek pakujących (packaging cells) wytwarzających w dużej ilości wektor retrowirusowy zawierający gen dla GM-CSF.
PL 207 902 B1
W tym celu komórki PA317 (kupione z ATCC, kod CRL9078) były elektroporowane z wirusowym cDNA i hodowane w pożywce hodowlanej przez dwa dni. Po tym czasie komórki były selekcjonowane w poż ywce zawierającej genetycynę (G418, Life Technologies Inc., 1 mg/ml). Supernatant z hodowli wytwarzających wirusy z genem dla GM-CSF dodawano do hodowli komórek czerniak B78-H1, hodowanych w temp. 37°C, w warunkach pełnej wilgotności i 95% CO2, uzupełnionej polibrenem (4 mikrogramy/ml). Całość była inkubowana przez 24 godziny, a następnie komórki selekcjonowano w pożywce zawierającej genetycynę j.w. Komórki wydzielające GM-CSF były selekcjonowane metodą ograniczonych rozcieńczeń. Ostatecznie uzyskano komórki szczepionkowe wydzielające 551 pg GM-CSF/ 1x106 komórek/ 24 godziny.
Drugi składnik produktu - interleukina IL-15 - to rekombinowana ludzka cytokina IL-15 mająca specyficzną aktywność 4,96 x 105 U/mikrogram białka dostarczona z firmy lmmunex Corp. (aktualnie Amgen) z Seattle, WA, Stany Zjednoczone.
Wymieniona linia wyjściowa czerniaka mysiego B78-H1 oraz komórki szczepionkowe są zabankowane w Zakładzie Immunologii Centrum Biostruktury Akademii Medycznej w Warszawie.
P r z y k ł a d IV
Komórki szczepionki B78/IL-6/slL-6R były wytwarzane metodą opisaną w pracach: W. Iżycki i wsp., Współcz. Onkologia (2004) 8: 124-131 i A. Mackiewicz i wsp. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 762, 361-373. Komórki charakteryzowały się ciągłym wzrostem w pożywce hodowlanej i wydzielały 14,1 ng IL-6/SIL-6R/1 x 106 komórek/24 godziny.
Drugi składnik produktu - interleukina IL-15 - to rekombinowana ludzka cytokina IL-15 mająca specyficzną aktywność 4,96 x 105 U/mikrogram białka dostarczona z firmy lmmunex Corp. (aktualnie Amgen) z Seattle, WA, Stany Zjednoczone.
Wymieniona linia wyjściowa czerniaka mysiego B78-H1 oraz komórki szczepionkowe są zabankowane w Zakładzie Immunologii Centrum Biostruktury Akademii Medycznej w Warszawie.
P r z y k ł a d V
Produkty farmaceutyczne były badane na myszach w następującym modelu. Myszy krzyżówki (C57BL/6xDBA/2)F1 w wieku 8-12 tygodni nastrzykiwano w poduszeczkę prawej tylnej łapki w ilości 2 x 105 lub 3 x 105 komórek czerniaka B78-H1 w 20 mikrolitrach zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS, Biomem, Lublin). Przed nastrzyknięciem komórki czerniaka były hodowane w pełnej pożywce hodowlanej (j.w.) w temp. 37°C, w warunkach pełnej wilgotności i 95% CO2. Trzy dni później myszy były dzielone na 4 grupy i rozpoczynano leczenie polegające na sekwencyjnym podawaniu kompozycji terapeutycznej bądź w celach porównawczych pojedynczych składników do miejsca wcześniejszej inokulacji komórek nowotworowych. Tworzono następujące grupy doświadczalne myszy:
I. podawanie szczepionki + IL-15 II. podawanie samej szczepionki
III. podawanie samej IL-15
IV. podawanie płynu PBS (kontrola)
Komórki szczepionki podawane były w dniu podziału myszy na grupy w ilości 1 x 106 komórek szczepionki w 20 mikrolitrach PBS (grupa I i II). W celu uniknięcia mnożenia się komórek szczepionki komórki te przed podaniem myszom były napromieniowane w dawce 4500 R. Trzy dni później, czyli 6 dni po „zaraż eniu komórkami czerniaka B78-H1, rozpoczynano sekwencyjne podawanie drugiego składnika kompozycji, czyli IL-15. Składnik ten podawany był w ilości 2 mikrogramy w 20 mikrolitrach PBS z dodatkiem 0,1% bydlęcej albuminy (firmy Sigma - Aldrich) (dawka dzienna), przez kolejne 5 dni, czyli w dniach 6, 7, 8, 9 i 10 po inokulacji komórek czerniaka B76-H1 (grupa I i III). W kolejnych dniach myszy były obserwowane na obecność guza w łapce - mierzono suwmiarką średnicę łapki z nastrzyknię tymi komórkami czerniaka 2 razy w tygodniu.
Opisany wyżej schemat terapeutyczny stosowano w czterech wariantach doświadczalnych („1, „2, „3, „4), w których za każdym razem stosowano inny rodzaj szczepionki przeciwnowotworowej:
(„1) podawanie komórek szczepionki B78/IL-12 + IL-15 (wykres 1) („2) podawanie komórek szczepionki B78/TNF + IL-15 (wykres 2) („3) podawanie komórek szczepionki B78/GM-CSF + IL-15 (wykres 3) („4) podawanie komórek szczepionki B78/IL-6/slL-6R (wykres 4)
Na wykresach na osi X umieszczono ilość dni po inokulacji komórek guza, na osi Y na wykresach oznaczonych A średnicę guza (w milimetrach +/-SE) a na wykresach oznaczonych B liczba myszy wyleczonych w %.
PL 207 902 B1
W przypadku doś wiadczenia „1 uzyskano najlepszy efekt terapeutyczny (100% wyleczonych zwierząt) w grupie myszy leczonych kompozycją terapeutyczną (B78/IL12 + IL-15), w porównaniu do myszy leczonych pojedynczymi składnikami (wykres 1). Podobny efekt i 100% wyleczeń uzyskano w przypadku uż ycia kompozycji B78/TNF + IL-15 (schemat doświadczalny „2, wykres 2) i B78/GM-CSF + IL-15 (schemat doświadczalny „3, wykres 3). Analogiczny efekt - wyższość kompozycji nad pojedynczymi składnikami, objawiającą się najwolniejszym wzrostem guza uzyskano po zastosowaniu B78/IL-6/slL-6R (wariant terapeutyczny „4, wykres 4).
Claims (8)
1. Produkty farmaceutyczne, zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15 (IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów, zwłaszcza czerniaka.
2. Produkty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako gen dla cytokin lub ich wariantów stosuje się gen dla cytokiny Interleukiny 12 (IL-12).
3. Produkty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako gen dla cytokin lub ich wariantów stosuje się gen dla cytokiny określanej jako czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-alfa).
4. Produkty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako gen dla cytokin lub ich wariantów stosuje się gen dla czynnika stymulującego powstawanie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF).
5. Produkty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako gen dla cytokin lub ich wariantów stosuje się gen dla cytokiny składającej się z interleukiny 6 połączonej z jej rozpuszczalnym receptorem (IL-6/slL-6R), nazywanej zamiennie Hyper-IL-6.
6. Produkty według zastrz. 1, znamienne tym, że jako plazmidy niosące interleukinę 15 (IL-15), stosuje się rekombinowaną ludzką cytokinę IL-15.
7. Produkty według zastrz. 6, znamienne tym, że rekombinowana ludzka cytokina IL-15 ma specyficzną aktywność 4,96 x 105 U/mikrogram białka.
8. Produkty według zastrz. 1, znamienne tym, że najpierw podaje się modyfikowane genetycznie komórki nowotworowe wydzielające cytokiny lub ich warianty a następnie plazmidy niosące interleukinę 15 (IL-15).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL382945A PL207902B1 (pl) | 2007-07-18 | 2007-07-18 | Produkty farmaceutyczne zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15(IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL382945A PL207902B1 (pl) | 2007-07-18 | 2007-07-18 | Produkty farmaceutyczne zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15(IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL382945A1 PL382945A1 (pl) | 2009-01-19 |
| PL207902B1 true PL207902B1 (pl) | 2011-02-28 |
Family
ID=42985066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL382945A PL207902B1 (pl) | 2007-07-18 | 2007-07-18 | Produkty farmaceutyczne zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15(IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL207902B1 (pl) |
-
2007
- 2007-07-18 PL PL382945A patent/PL207902B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL382945A1 (pl) | 2009-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7998736B2 (en) | Adoptive immunotherapy with enhanced T lymphocyte survival | |
| ES2218994T3 (es) | Linea celular inmunomoduladora universal que expresa citocinas y composiciones relacionadas y procedimientos de fabricacion y uso. | |
| JP4094053B2 (ja) | 免疫または炎症応答の調節による抗がん遺伝子療法 | |
| JP3524918B2 (ja) | 癌のリンホカイン遺伝子療法 | |
| EP0915708A1 (en) | Cancer immunotherapy using autologous tumor cells combined with allogeneic cytokine-secreting cells | |
| C. Ochoa et al. | Interleukin-15 in gene therapy of cancer | |
| US9814682B2 (en) | Vaccination with immuno-isolated cells producing an immunomodulator | |
| JP2011036251A (ja) | ウイルスベクターおよびその遺伝子治療のための使用 | |
| Ohe et al. | Combination effect of vaccination with IL2 and IL4 cDNA transfected cells on the induction of a therapeutic immune response against Lewis lung carcinoma cells | |
| Nishimura et al. | Combination tumor‐immunotherapy with recombinant tumor necrosis factor and recombinant interleukin 2 in mice | |
| Hsieh et al. | Regression of established mouse leukemia by GM-CSF-transduced tumor vaccine: implications for cytotoxic T lymphocyte responses and tumor burdens | |
| Nanni et al. | The immune response elicited by mammary adenocarcinoma cells transduced with interferon-γ and cytosine deaminase genes cures lung metastases by parental cells | |
| Lasek et al. | Antitumor effects of the combination therapy with TNF-α gene–modified tumor cells and interleukin 12 in a melanoma model in mice | |
| Duda et al. | Recombinant BCG therapy suppresses melanoma tumor growth | |
| LEE et al. | Rapid recruitment of macrophages in interleukin‐12‐mediated tumour regression | |
| Lees et al. | The effect of T1 and T2 cytokines on the cytotoxic T cell response to mannan-MUC1 | |
| Cao et al. | Cytokine gene transfer in cancer therapy | |
| US20040009146A1 (en) | Anti-tumor vaccine and method | |
| PL207902B1 (pl) | Produkty farmaceutyczne zawierające szczepionki przeciwnowotworowe i plazmidy niosące interleukinę 15(IL-15), jako łączny preparat do zastosowania w immunoterapii nowotworów | |
| Iwanuma et al. | Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells by tumor cells transfected with the interleukin-2 gene | |
| Hwu | Current challenges in cancer gene therapy | |
| Santin et al. | Development and characterization of an IL-4-secreting human ovarian carcinoma cell line | |
| Cao et al. | Induction of antitumor immunity and treatment of preestablished tumor by interleukin-6-gene-transfected melanoma cells combined with low-dose interleukin-2 | |
| Margolin et al. | Cytokines in the treatment of cancer | |
| Viret et al. | Tumor immunotherapy by vaccination with cytokine gene transfected cells |