PL205960B1 - Przeciwpotowa kosmetyczna kompozycja oraz nieterapeutyczny sposób zmniejszania lub eliminowania potu lub nieprzyjemnego zapachu ciała - Google Patents

Abstract

Przedstawiono przeciwpotowe kompozycje zawierające ściągającą sól glinu lub cyrkonu mogą dawać podrażnienia, gdy są stosowane zewnętrznie na skórze, które to podrażnienia można łagodzić lub ich unikać przez wprowadzanie do kompozycji receptora peroksyzomu aktywowanego proliferatorem (PPAR) aktywującego kwas tłuszczowy i/lub jego hydrolizujący prekursor taki jak trigliceryd lub ester PPAT, zwłaszcza w ilości dobranej w zakresie od 0,5 do 10% wagowych. Kompozycje korzystnie zawierają aktywowana sól glinową lub kompleks glinowo-cyrkonowy glicyny.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy przeciwpotowych kompozycji przeznaczonych do zewnętrznego stosowania na ludzką skórę. A w szczególności przeciwpotowych kompozycji zawierających środek zdolny do łagodzenia lub kontrolowania podrażniania skóry.

W wielu krajach cywilizacyjne zachowania kierują ludzi do podejmowania dział a ń dla zapobiegania, lub kontrolowania, przykrych zapachów ciała, albo widocznych wilgotnych plam wywołanych przez pocenie, w szczególności na obszarach pod pachami, albo na ubraniach w sąsiedztwie obszaru pod pachami. W pewnych krajach preferuje się kontrolowanie zarówno potu jak i zapachu, a w innych faworyzuje się kontrolowanie samego przykrego zapachu.

Obecnie rynek produktów przeciwpotowych jest zdominowany przez produkty stosowane zewnętrznie na skórę, produkty na bazie soli glinu lub cyrkonu, które mają zapobiegać, albo co najmniej kontrolować, umiejscowione pocenie na obszarze skóry, w szczególności pod pachami. Często takie kompozycje mogą jednocześnie zapewniać zauważalny stopień odwonienia.

Dezodoranty są kompozycjami przeznaczonymi albo do maskowania przykrego zapachu, albo do zapobiegania lub powstrzymywania jego powstawania. To ostatnie zazwyczaj obejmuje zmniejszanie i/albo kontrolowanie rozwoju populacji mikroorganizmów na danym obszarze, albo preferencyjne celowanie w takie bakterie jak podklasa Coryne, które przyczyniają się do wytwarzania przykrego zapachu pod pachami, albo przerywanie szlaków, na których tworzy się przykry zapach z wydzielin. Sole glinu lub cyrkonu zapewniają korzyści dezodoryzujące, nawet w ilości poniżej ich powszechnie akceptowanej zawartości dającej znaczący efekt przeciwpotowy.

Przeciwpotowe kompozycje wykorzystuje się w wielu postaciach, na przykład jako produkty na kulce, kremy lub miękkie ciała stałe, żele, sztywne sztyfty, aerozole i spraye rozpylane pompką. Jednak wszystkie mogą mieć kilka pospolicie występujących wad.

Główną wadą wielu przeciwpotowych produktów jest to że zawierają jeden, lub więcej, typowych składników uważanych za nieprzyjazne dla ludzkiej skóry na tych obszarach ciała na których kompozycje są normalnie stosowane. W szczególności takie składniki obejmują wyżej wymienione sole glinu i cyrkonu, a działanie tych soli może być zaostrzane poprzez inne składniki, zazwyczaj również stosowane ponieważ wykazują inne korzystne cechy, albo w inny sposób przyczyniają się do tego że kompozycja jest szczególnie skuteczna. Takie niezbędne, lub w inny sposób wysoce pożądane lub pożądane składniki w kompozycjach zawierających sole glinu lub cyrkonu obejmują ciekłe nośniki, jak lotne silikony i etanol, jak też wiele innych składników powszechnie stosowanych w takich kompozycjach, jak składniki zapachowe i emulgatory. Uważa się, że takie składniki po nałożeniu kompozycji zawierającej przeciwpotową sól wykazują szkodliwy efekt, w szczególności podrażnianie skóry użytkownika.

Niewłaściwe działanie na skórę może być tolerowane, co najmniej w pewnym zakresie, zmiennym od użytkownika do użytkownika, ale korzystne byłoby zidentyfikowanie środków zmniejszających, lub eliminujących takie działanie. Podrażnianie można łagodzić przez zmniejszenie ilości danego składnika aktywnego w kompozycji, ale poważną wadą takiego podejścia jest to, że wtedy skuteczność składnika jest gorsza.

Byłoby pożądane wytworzenie skutecznych przeciwpotowych kompozycji, które by nie podrażniały skóry, a w szczególności byłoby pożądane dostarczenie kompozycji zapewniających także dodatnie korzyści pielęgnacyjne skórze.

Byłoby pożądane dostarczenie przeciwpotowych kompozycji, które ciągle byłyby skuteczne pod względem głównego celu, tj. zawierałyby znane substancje przeciwpotowo aktywne wykazujące pewny lub podobny poziom aktywności, ale w których szkodliwe dla skóry efekty byłyby złagodzone, lub można by ich uniknąć, oraz poprawić stan skóry w określonym miejscu. Jednoczesne uzyskanie tych cech wymaga zidentyfikowania materiałów, nie tylko skutecznych ze względu na drugorzędny cel, ale takich które nie są nadmiernie antagonizujące w stosunku do składników wprowadzanych dla zapewnienia, lub dostarczenia, substancji przeciwpotowo aktywnej, a w szczególności by unikać, lub minimalizować, oddziaływania między tymi materiałami i tymi składnikami podczas transportu i przechowywania zawierających je kompozycji.

Różne opisy patentowe ujawniają wprowadzanie środków zmiękczających skórę do przeciwpotowych kompozycji.

Rozważano wiele różnych klas materiałów, w tym w publikacjach US-A5254332 albo WO 00/28956. Środki zmiękczające skórę zazwyczaj są uważane za składniki niepodrażniające, a co najPL 205 960 B1 mniej pewne z nich, mogą zmiękczać skórę. Jednak brak ujawnienia, że środki zmiękczające skórę, jako klasa materiałów, działa jako środki aktywujące receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów (peoxisome proliferator-activated receptor - PPAR), ani jakiegokolwiek ujawnienia co do tego jak zidentyfikować ograniczoną liczbę środków zmiękczających skórę, które byłyby nazwane i zdolne do takiego działania, spośród opisanej ogromnej ilości środków zmiękczających skórę, które są znane i nie są zdolne do takiego dzia ł ania.

Podobnie, kilka opisów patentowych, jak WO 98/58625 ujawnia kompozycje zżelowane za pomocą różnych środków żelujących, bez omawiania czy są czy nie są zdolne do działania jako środki aktywujące PPAR, albo wskazania jak zidentyfikować które, jeżeli jakikolwiek, ze środków żelujących może być zdolny do działania jako środek aktywujący PPAR w ilościach mniejszych niż wymagane do zżelowania kompozycji w których występuje, a które nie są do tego zdolne.

W publikacji US-4724129 ujawniono przeciwpotowe kompozycje zawierają ce ś cią gają c ą przeciwpotową sól glinu i/albo cyrkonu, ale nie rozważano wprowadzania nienasyconych kwasów tłuszczowych aktywujących PPAR w celu złagodzenia podrażniania.

W publikacji US-5976514 ujawniono przeciwpotowe kompozycje zawierające ś ciągają cą przeciwpotową sól glunu i/albo cyrkonu, oraz lotną węglowodorową ciecz w celu łagodzenia podrażniania skóry. Jednak w opisie nie rozważano wprowadzania nienasyconych kwasów tłuszczowych aktywujących PPAR.

W publikacji US6083493 ujawniono kompozycje przeciwpotowe zawierające ś ciągającą przeciwpotową sól i wybrany jako materiał nośnikowy eter izopropyloglicerolowy, który jest łagodniejszy niż wiele nośników zawierających poliole. Jednak w opisie nie rozważa się wprowadzania nienasyconego kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR.

Receptory aktywowane peroksyzomowym proliferatorem (skrótowo tutaj określane jako PPAR) są czynnikami transkrypcji, które kontrolują lipidowy metabolizm. Są trzy izotypy PPARa, PPARe/δ i PPARy, wszystkie zostały zlokalizowane w skórze zgodnie z ujawnieniem z publikacji Riviers i in., w J. Invest. Dermatol. 111, 1116-1121 (1998). Zakres specyficznych kwasów tłuszczowych aktywujących te czynniki, co skutkuje przeciwzapalnym działaniem, dla zmniejszenia odpowiedzi w postaci podrażnienia naskórka i odpowiedzi pro-różnicowania/anty-proliferacji dla znormalizowania metabolizmu skóry i zapewnienia dodatkowych korzyści pielęgnacyjnych skórze. W US-A-5981586, na rzecz Pershadsingh, ujawniono że ligandy PPAR mogą zmniejszać proliferację i zapalenie na skórze. W międzynarodowym zgłoszeniu PCT opublikowanym jako WO-A-98/32444, na rzecz Elias i in., ujawniono że ligandy PPAR mogą przywracać/zapobiegać dysfunkcjom skórnej bariery. W EP-A-888773, Malnoe i in., opisano stosowanie lipidu kwasu petroselinowego aktywującego PPAR w leczeniu i zapobieganiu zapaleniu w powierzchniowych tkankach. Ponadto zgłoszenie PCT opublikowane jako WO-A-99/47110, Alaluf i in., ujawnia stosowanie kwasu petroselinowego, albo jego glicerydów, dla zmniejszenia podrażniania skóry w traktowaniu skóry przeznaczonym do jednoczesnego zwalczania procesu starzenia i tworzenia zmarszczek, który także ma właściwości rozjaśniania skóry. W EP-A-709084, Laugier i in., opisano stosowanie oleju kolendrowego, bogatego w kwas petroselinowy, w kosmetycznej kompozycji do skóry przeznaczonej do nawilżania suchej skóry. W US-A-5260053, Chappell i in., opisano kompozycje dezodorantów zawierające, między innymi, olej kolendrowy, dla zapewnienia zmniejszenia przykrego zapachu, przez zmniejszenie populacji zarówno mikrokoków jak i dyfteroidów, oraz dla maskowania pozostających androsteronowych związków. W DE-A-19883808114, Grillo Werke i in, opisano dezodorant do stosowania w gospodarstwie domowym, w celach higienicznych i w przemyśle, który zawiera sól cynku kwasu rycynolowego, i/albo sole innych (nie)nasyconych OH kwasów tłuszczowych o co najmniej 17 atomach węgla. Podobne dezodoryzujące kompozycje zawierające rycynoleinian cynku są opisane w FR-A-2311529, Dart Industries Inc. Żaden z tych opisów nie przedstawia specyficznego ujawnienia w odniesieniu do kompozycji przeciwpotowych.

W zgłoszeniu PCT opublikowanym jako WO-A-99/26597 (Parrott) ujawniono że olej z ogórecznika można wprowadzać do przeciwpotowych kompozycji dla zmniejszenia podrażniania skóry, bez zmniejszania przeciwpotowej aktywności, ale Parrot nie ujawnia jak zlokalizować alternatywne lub ulepszone rozwiązania problemu, ani jak polepszyć ogólny stan skóry.

Chociaż w stanie techniki ujawniono użycie kilku wymienionych z nazwy środków zmiękczających skórę w pewnych produktach przeznaczonych do pielęgnacji skóry, to kontynuuje się badania nad znalezieniem alternatywnych, albo ulepszonych układów. Wpływ każdego składnika kompozycji powinien być rozważany pojedynczo. Także jego oddziaływanie z innymi składnikami powinno być

PL 205 960 B1 rozważane dla otrzymania pełnego obrazu. Na przykład, neutralizacja kwasów substancji przeciwpotowo aktywnych może skutkować deaktywacją substancji przeciwpotowo aktywnej poprzez kompleksowanie. Ponadto, takie kompleksowanie skutkuje też usunięciem funkcjonalności kwasu. Nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że kwasy tłuszczowe zdolne do aktywowania PPAR-ów można wprowadzać do przeciwpotowej kosmetycznej kompozycji i zachowują one swoją funkcjonalność, dając kompozycję o zmniejszonej mocy podraż niania, i moż na takż e dostarczać dodatkowych korzyś ci skórze na obszarze pod pachami.

Publikacja WO 01/45663, L'Oreal, opublikowana w czerwcu 2001, tj. po dacie pierwszeństwa niniejszego zgłoszenia, opisuje stosowanie aromatycznych policyklicznych związków jako aktywatorów receptorów typu PPAR w kosmetycznych lub farmaceutycznych kompozycjach, ale także tutaj brak ujawnienia przeciwpotowych kompozycji.

Zgodnie z tym, celem wynalazku jest dostarczenie przeciwpotowych kompozycji, które łagodzą, lub dzięki którym unika się jednej, lub więcej, niekorzystnej cechy opisanej powyżej, a w szczególności podrażniania skóry.

Bardziej dokładnie, celem pewnych wykonań wynalazku jest dostarczenie przeciwpotowych kompozycji, w których niekorzystne dla skóry cechy mogą być złagodzone lub wyeliminowane, ale umożliwia się wprowadzanie składników aktywnych.

Celem pewnych wykonań wynalazku jest to że zewnętrznie stosowane przeciwpotowe kompozycje nie powodują podrażniania.

Celem innych wykonań wynalazku jest dostarczenie stosowanych zewnętrznie na skórę przeciwpotowych kompozycji zapewniających skórze korzyści pielęgnacyjne, obok łagodzenia lub unikania podrażniania skóry.

Przedmiotem wynalazku jest przeciwpotowa kosmetyczna kompozycja odpowiednia do zewnętrznego stosowania na ludzką skórę zawierająca:

i. przeciwpotowo aktywną substancję zawierającą ściągającą sól glinu lub cyrkonu; ii. nośnik dla substancji przeciwpotowo aktywnej;

która zawiera olefinowo nienasycony kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów inny niż co najmniej 1% wagowy kwasu rycynolowego albo linolowego.

Korzystnie kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów jest wybrany spośród kwasu petroselinowego, skoniugowanego kwasu linolowego cis-9-trans-11, skoniugowanego kwasu linolowego trans-10-cis-12, kwasu 7-trans oktadekanowego, kwasu cis-parynarowego, kwasu dokozaheksenowego, kwasu cis-4,7,10,13,16,19 dekozaheksenowego, kwasu rycynolaidowego, kwasu stearydonowego, kwasu kolumbinowego, kwasu linolenelaidowego, kwasu wakcenowego, kwasu eikozapentanowego i kwasu pinolenowego.

Korzystnie kompozycja dodatkowo zawiera olej zawierający triglicerydy wybrany spośród oleju z nasion kolendry, oleju z nasion niecierpka balsaminy, parynarowego laurynarowego tłuszczu z nasion owoców drzewa palmowego, lub oleju z nasion barwinka brazylijskiego, odwodnionego oleju rycynowego i oleju z orlika pospolitego.

Korzystnie kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów zawiera 16 lub 18 atomów węgla, a zwłaszcza zawiera kwas petroselinowy.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera olej z nasion kolendry.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera od 0,1 do 20% wagowych, a korzystnie od 0,5 do 10% wagowych kwasu tłuszczowego aktywującego receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów.

Korzystnie kompozycja zawiera kombinacje kwasów tłuszczowych aktywujących receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów lub ich prekursorów w stosunku wagowym od 5:1 do 1:5.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera od 10 do 30% wagowych substancji przeciwpotowo aktywnej.

A korzystnie substancja przeciwpotowo aktywna zawiera chlorohydrat glinu i/lub glinowo/cyrkonowy kompleks glicyny.

Także korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera lotny silikonowy nośnik, korzystnie w ilości od 10 do 70% wagowych.

Korzystnie kompozycja zawiera środek strukturujący, lub zagęszczający, w stężeniu wystarczającym do wytworzenia sztywnego sztyftu, albo miękkiego ciała stałego.

PL 205 960 B1

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera bazową kompozycję która tworzy aerozolową kompozycję razem z propelentem, a stosunek wagowy propelenta do bazowej kompozycji jest wybrany w zakresie od 40:60 do 99:1.

Przedmiotem wynalazku jest także nieterapeutyczny sposób zmniejszania lub eliminowania potu lub nieprzyjemnego zapachu ciała przez zewnętrzne stosowanie na skórę przeciwpotowej kompozycji przeciwpotowo aktywnej substancji obejmującej ściągającą sól glinu lub cyrkonu i nośnik, jak wyżej określona, ze zmniejszaniem lub eliminowaniem podrażnienia skóry powodowanego przez stosowanie kompozycji na skórę, przy czym stosuje się kompozycję, do której wprowadzono olefinowo nienasycony kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów w iloś ci wystarczają cej do zmniejszenia podraż niania skóry, z wyłączeniem co najmniej 1% wagowego kwasu rycynolowego lub kwasu linolowego.

Stosowane określenie „kwas tłuszczowy aktywujący PPAR” obejmuje kwasy tłuszczowe aktywujące PPARa, PPARe/δ i PPARy. Rozpoznano, że wiele kwasów tłuszczowych aktywujących PPA-Ra zazwyczaj także jest kwasami tłuszczowymi aktywującymi PPARe/δ i/albo PPARy.

Określenie „skuteczna ilość kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR lub jego prekursora” oznacza ilość, która zmniejsza podrażnienie skóry wywołane przez jeden lub więcej, składnik w bazowej przeciwpotowej kompozycji.

Dodatkowych korzyści skórze można dostarczać także przez stosowanie środka aktywującego PPAR, lub jego prekursora, w co najmniej pewnych wykonaniach wynalazku.

Określenie „przeciwpotowa kompozycja” oznacza kompozycję zawierającą sól glinu, lub cyrkonu, zdolną do działania jako środek ściągający, jeżeli nie podano inaczej.

Wynalazek obejmuje stosowanie w przeciwpotowych kompozycjach, w których substancja przeciwpotowo aktywna jest rozproszona w nośniku, skutecznego stężenia kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR lub jego ulegającego hydrolizie prekursora.

Wygodnym testem reporterowym dla określenia czy dany kwas tłuszczowy jest materiałem aktywującym PPARa opiera się na genie lucyferazy świetlika. W teście, uważa się że związek jest kwasem tłuszczowym aktywującym PPARa jeżeli daje co najmniej 1,5 razy większą aktywację w porównaniu z aktywacją dla kontrolnego nośnika, gdy jest podany w ilości 100 μM. Bardziej korzystnie, ligand aktywujący PPARa daje co najmniej 1,5 krotne wzbudzenie przy 50 μM; bardziej korzystnie jeszcze co najmniej 1,5 krotne wzbudzenie przy 25 μM; a nawet jeszcze bardziej korzystnie co najmniej 1,5 krotne wzbudzenie przy 10 μM. Naturalnie ligandy utrzymują indukowanie aktywacji gdy są stosowane w większych ilościach.

Stwierdziliśmy, że nie jest istotne, aby dostarczać kwas tłuszczowy w wolnej postaci. Dodatkowo, albo alternatywnie, kwas tłuszczowy aktywujący PPAR może być wprowadzany do kompozycji jako ulegający hydrolizie prekursor kwasu, jak w szczególności trigliceryd, albo ester. Jest to szczególnie wygodne dla kompozycji przeznaczonych do stosowania w obszarze pod pachami, ze względu na obecność współ istniejących na skórze bakterii szczególnie w dużej ilości na obszarze pod pachami w porównaniu z całym obszarem skóry. Takie bakterie mogą skutecznie hydrolizować triglicerydy i estry na skórze, a przez to uwalniać kwasy tłuszczowe; (Marples, R. Cur. Med. Res. Opin. 7, suppl. 2, strony 67 - 70 (1982)).

Szczególnie pożądane jest, aby wybrać takie kwasy tłuszczowe PPAR lub ich prekursory, które są nienasycone, a zwłaszcza zawierające hydroksylowy i/lub metylowy łańcuch boczny. Wiele takich kwasów zawiera od 14 do 30 atomów węgla.

Przykładami kwasów tłuszczowych PPAR które wykazały aktywność aktywowania PPAR są:

i)	kwas cis-parynarowy
ii)	skoniugowany kwas linolowy cis-9-trans-11
iii)	kwas kolumbinowy
iv)	kwas dokozaheksaenowy
V)	kwas eikozapentanowy
vi)	kwas heksadekatrienowy
vii)	kwas linolenelaidowy (izomer kwasu linolenowego)

PL 205 960 B1 cd. przykładów

viii)	kwas petroselinowy
ix)	kwas pinolenowy
X)	kwas punicynowy
xi)	kwas rycynolowy
xii)	kwas rycynolaidowy (izomer kwasu rycynolowego)
xiii)	kwas stearydonowy
xiv)	skoniugowany kwas linolowy trans-10-cis-12
xv)	kwas 7-trans oktadekanowy
xvi)	kwas wakcenowy

Potencjalne źródło ulegających hydrolizie prekursorów PPAR zawiera triglicerydy, jak olej z nasion kolendry siewnej dla kwasu petroselinowego, olej z nasion niecierpka balsamina (impatiens balsimina), parynarowy laurynarowy tłuszcz z nasion owoców drzewa palmowego (parinarium laurinarium kernel fat), albo olej z nasion barwinka brazylijskiego (sabastiana brasilienensis) dla kwasu cisparynarowego, odwodniony olej rycynowy dla skoniugowanego kwasu linolowego, i olej z orlika pospolitego (aquilegia vulgaris) dla kwasu kolumbinowego.

Jeżeli stosuje się pojedynczy, ulegający hydrolizie prekursor kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR to w szczególności jest to olej z ogórecznika (borage oil), olej rycynowy (castor oil) lub olej słonecznikowy. Pożądane są kwasy aktywujące PPAR zawierające 16 lub 18 atomów węgla.

Najbardziej korzystne kwasy aktywujące PPAR są olefinowo nienasycone, a szczególnie korzystne są zawierające mono-, di- lub tri-nienasycenie. Wiele najbardziej pożądanych kwasów aktywujących PPAR jest nie tylko nienasyconych, ale także ma 16 lub 18 atomów węgla. Alternatywnie, kwas aktywujący PPAR (xvii) zawiera kwas 12-hydroksystearynowy, czasami określany skrótowo jako 12-HSA, który jest skuteczny w przedstawionym rozwiązaniu w stężeniu mniejszym niż jest wymagane do utworzenia zżelowanej formulacji.

Ilość ligandów kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR w wynalazku stanowi co najmniej minimalną ilość wykazującą zmniejszanie podrażnienia i/albo poprawę stanu skóry, w porównaniu z taką samą kompozycją nie zawierającą liganda PPAR. Można by oczekiwać, że minimalna ilość będzie nie tylko zmieniała się od związku do związku, ale także będzie zależała od tego czy kwas stosuje się w wolnej postaci, czy przez jego prekursor. Minimalną ilość można określić metodą testu płatkowego opisanego poniżej. W wielu kompozycjach, kwas tłuszczowy aktywujący PPAR, lub jego prekursor, jest dobrany w zakresie od co najmniej 0,025%, a korzystnie od 0,05% wagowych, i na ogół nie stanowi więcej niż 20% wagowych. W wielu korzystnych kompozycjach stosuje się stężenia kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR, lub jego prekursora, wynoszące co najmniej 0,1% aż do 5%, jak od 0,2 do 1% wagowego.

Jeżeli jest to pożądane, kwas aktywujący PPAR lub jego prekursor, może zawierać dowolną kombinację dwóch lub więcej kwasów aktywujących PPAR, lub ich prekursorów, pod warunkiem, że co najmniej jeden z nich spełnia warunek że jest albo (a) kwasem tłuszczowym aktywującym PPAR innym niż co najmniej 1% wagowych kwasu rycynylowego lub linolowego, albo (b) ulegającym hydrolizie prekursorem kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR innym niż olej z ogórecznika, olej rycynowy lub olej słonecznikowy. Drugi kwas aktywujący PPAR, lub jego prekursor, może być wybrany ze wszystkich kwasów aktywujących PPAR i ich prekursorów, w tym może być kwasem rycynolowym, kwasem linolowym, olejem rycynowym, olejem słonecznikowym i olejem z ogórecznika. Stosunek wagowy składników w kombinacji kwasów aktywujących PPAR, lub ich prekursorów, może być w zakresie 5:1 do 1:5, jak 3:1 do 1:3, a w szczególności wynosi około 2:1, około 3:2, około 1:1, około 2:3 lub około 1:2. Pożądane jest aby kombinacja zawierała co najmniej dwa kwasy aktywujące PPAR wybrane z podanych powyżej przykładów i) do xvii), albo ich triglicerydowych prekursorów, w wyżej podanych stosunkach wagowych, albo w zakresach 5:1 do 1:5, a korzystnie 1:1.

Pewne korzystne kombinacje obejmują: kwas petroselinowy i 12-HSA kwas petroselinowy i

PL 205 960 B1 kwas petroselinowy i prekursor kwasu linolowego (olej słonecznikowy i/lub olej z ogórecznika) kwas petroselinowy i kwas pinolenowy kwas petroselinowy i prekursor kwasu pinolowego (olej z szyszek sosnowych) kwas petroselinowy i kwas cis parynarowy kwas pinolenowy i 12-HSA kwas pinolenowy i kwas linolowy kwas pinolenowy i kwas linolenowy 12-HSA i kwas linolowy 12-HSA i kwas linolenowy kwas cis-parynarowy i 12-HSA kwas cis-parynarowy i kwas linolowy kwas cis-parynarowy i kwas linolenowy kwas cis-parynarowy i kwas pinolenowy

Przeciwpotowe kompozycje według wynalazku zawierają substancję przeciwpotowo aktywną, którą jest ściągająca sól glinu lub cyrkonu. Ilość substancji przeciwpotowo aktywnej w kompozycji według wynalazku może wynosić od 1 do 35% wagowych kompozycji, korzystnie co najmniej 5% wagowych, a bardziej korzystnie 15% do 30% wagowych bazowej kompozycji. Bazowa kompozycja obejmuje propelent który może być zastosowany.

Przykłady odpowiednich substancji aktywnych obejmują sole glinu, sole cyrkonu, kompleksy glinu i/lub cyrkonu, na przykład halogenki glinu, hydroksyhalogenki glinu, oksyhalogenki cyrkonylu, hydroksyhalogenki cyrkonylu i ich mieszaniny. Specyficzne przykłady obejmują aktywowany chlorohydrat glinu, chlorohydrat glinu, pentachlorohydrat glinu i chlorohydrat glinowocyrkonowy. Użyteczne sole cyrkonowe obejmują hydroksychlorek cyrkonu i oksychlorek cyrkonu. Inne ogólnie używane substancje aktywne są znane specjalistom. Korzystne substancje aktywne obejmują ZAG (glicyna cyrkonowoglinowa), AAZG (aktywowana glicyna glinowocyrkonowa) i AACH (aktywowany chlorohydrat glinu). Substancja przeciwpotowo aktywna może występować w postaci rozdrobnionej i wtedy jest normalnie zawieszona w odpowiednim nośnikowym płynie, który zazwyczaj nie miesza się z wodą, i który może być ustrukturowany lub zagęszczony. Alternatywnie, substancja aktywna może być rozpuszczona w polarnym roztworze, jak na przykład wodnym roztworze, albo w polarnym alkoholu wielowodorotlenowym o małym ciężarze cząsteczkowym, jak glikol propylenowy, korzystnie w postaci od 30% do 60% wagowych roztworu.

Kompozycje według wynalazku mogą także zawierać od 0,01% do 90% substancji dezodoryzująco aktywnej. Substancją dezodoryzująco aktywną stosowaną w kosmetykach według wynalazku może być dowolna substancja dezodoryzująco aktywna znana w tej dziedzinie, jak alkohole, w szczególności monowodorotlenowe alifatyczne alkohole, jak etanol lub propanol, substancje przeciwmikrobowe, jak poliheksametylenobiguanidy, na przykład dostępne jako Cosmocil™, albo chlorowcowane związki aromatyczne, na przykład triklosan, dostępny jako Irgasan™, niemikrobiocydowe substancje dezodoryzująco aktywne, jak trietylocytrynian, bakteriocydy i bakteriostatyki. Jeszcze inne substancji dezodoryzująco aktywne mogą obejmować sole cynku, jak rycynoleinian cynku.

W pewnych wykonaniach substancja dezodoryzująco aktywna obejmuje sól, lub kompleks, glinu i/lub cyrkonu, jak wyżej opisane w odniesieniu do substancji przeciwpotowo aktywnych, ale w stężeniach takich jak od 0,1% do 6% wagowych, które zapewniają właściwości dezodoryzujące, nie zawsze spełniając narodowe minimalne standardy dla zachowania właściwości przeciwpotowych.

Materiał nośnikowy dla kompozycji według wynalazku może obejmować jeden, lub więcej, lotny nośnikowy płyn, jeden lub więcej, nielotny środek zmiękczający skórę, i może być ustrukturowany lub zagęszczony jednym, lub więcej, materiałem zagęszczającym i/lub strukturującym, jeśli jest wymagany. Nośnikowy materiał, w tym gdy jest to wymagane, nośnikowe materiały zapewniające dodatkowe właściwości, jak zmiękczanie skóry, mogą często stanowić aż do około 99% wagowych, a w wielu przypadkach od 5% do 90% wagowych, a w szczególności od 10% do 70% wagowych kompozycji, albo bazowej kompozycji, jeśli miesza się ją następnie z propelentem. Gdy kompozycja zawiera obie hydrofilową i hydrofobową fazę, to stosunek wagowy tych dwóch faz często wynosi od 10:1 do 1:10. Aerozolowe kompozycje według wynalazku można korzystnie wytworzyć przez wprowadzenie do odpowiedniego aerozolowego dozownika bazowej kompozycji jak tutaj opisana, czyli wolnej od propelenta, i co najmniej 0,7 krotności, a często 1,5 krotności jej wagi, propelenta.

Przeciwpotowa kompozycja może zawierać mieszaninę rozdrobnionego ciała stałego, lub zawiesinę ciała stałego w ciekłym środowisku, która może być zagęszczona dla zmniejszenia szybkości

PL 205 960 B1 rozdzielania, albo ustrukturowana dla wytworzenia kremu (miękkiego ciała stałego) lub ciała stałego. Alternatywnie, kompozycja może zawierać mieszaninę ciekłych składników, w tym roztwór substancji aktywnej w nośniku, taka kompozycja często ma postać emulsji olej-w-wodzie albo woda-w-oleju, która może być zagęszczana lub żelowana.

Nośnikowy materiał, który może być płynem lub mieszaniną płynów, często jest dobrany zgodnie z fizyczną postacią kosmetycznej kompozycji, na przykład lotne silikony o małej lepkości, węglowodory o małym ciężarze cząsteczkowym, alkohole i woda, i może być dobrany przez specjalistów dla zapewnienia odpowiednich fizycznych i sensorycznych właściwości produktu. Należy rozumieć, że pewne płynne alkohole, jak w szczególności etanol, mogą jednocześnie stanowić oba składniki nośnik i substancję dezodoryzująco aktywną, chociaż korzystne kompozycje zawierające takie materiały również zawierają dodatkowo substancję dezodoryzująco i/lub przeciwpotowo aktywną.

Lotne silikony są zazwyczaj wybrane spośród cyklicznych polisiloksanów mających 3 do 8 grup dialkilosilikonowych, zwłaszcza dimetylosilikonowych, a w szczególności 4 lub 5 grup dimetylosilikonowych. Inne użyteczne lotne silikony mogą obejmować liniowe polisiloksany, korzystnie mające 4 lub 5 grup alkilosiloksanowych, w tym grupy terminalne. Ciek łe węglowodory o małym ciężarze cząsteczkowym mogą stanowić oleje parafinowe. Odpowiednie alkohole mogą obejmować monowodorotlenowe alkohole, jak alifatyczne alkohole C3 do C10, dwuwodorotlenowe alkohole, jak glikol lub glikol propylenowy, albo wielowodorotlenowe alkohole, jak glicerol lub sorbitol. Nośnikowe materiały mogą zapewniać dodatkowe pożądane właściwości, tak jak wielowodorotlenowe alkohole, na przykład glicerol mogą działać jako środek nawilżający, a lotne cyklometikony mogą działać jako środki zmiękczające skórę.

Nielotne środki zmiękczające skórę, jeżeli są stosowane w kompozycji, to mogą stanowić pojedynczy zmiękczający skórę związek, albo mieszaninę związków zmiękczających skórę. Takie środki zmiękczające skórę często mają parametr rozpuszczalności poniżej 10, a wiele z nich od 5,5 do 9. Zazwyczaj obejmują one estry nasyconych kwasów tłuszczowych i alkoholi tłuszczowych, etery zawierające alifatyczne i polialkilenowe grupy, węglowodory, rozpuszczalne w wodzie etery, oleje mineralne i poliorganosiloksany, oraz ich mieszaniny.

Nielotne silikony to często polialkilosiloksany, polialkiloarylosiloksany lub polieterosiloksany o lepkości powyżej 10 mPa · s, jak aż do około 5 x 10⁶ mPa · s w temp. 25°C, w tym polimetylofenylosiloksany lub kopolimery dimetylopolioksyalkilenoeterów.

Zmiękczające skórę alifatyczne estry często mają około 12 do 25 atomów węgla, i korzystnie jeden podstawnik o łańcuchu co najmniej 12 atomów węgla. Przykłady obejmują palmitynian cetylu, mirystynian butylu, stearynian glicerylu i monolaurynian propylenoglikolu. Kompozycja może zawierać ciekły alifatyczny eter, który może zapewniać zmiękczanie skóry, jak etery pochodzące z glikoli polialkilenowych i alkoholi o małym ciężarze cząsteczkowym (na przykład do C6), jak eter polipropylenoglikolo(10-15)-butylowy.

Całkowita ilość materiałów zmiękczających skórę w kompozycji, z wyłączeniem kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR i jego prekursora, często wynosi od 1% do 70% wagowych.

Środek zagęszczający, lub strukturujący, jeżeli jest wymagany, dobiera się pod względem postaci produktu kosmetycznej kompozycji. Środkiem zagęszczającym, lub strukturującym, może być związek organiczny (monomeryczny lub polimeryczny), albo nieorganiczny, i zazwyczaj jest on wybrany w zależności od fizycznej natury ciekłej fazy, która ma być zagęszczana, lub strukturowana, jak na przykład w zależności od tego czy jest hydrofobowa czy hydrofilowa. Normalnie jego ilość jest dobrana dla uzyskania żądanej lepkości cieczy lub kremu, albo żądanej odporności na penetrację ciała stałego zawierającego kwas tłuszczowy aktywujący PPAR lub jego prekursor, zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Środek zagęszczający, lub strukturujący, może być dowolnym z dużej liczby materiałów, w tym, na przykład woskowych strukturantów dla kompozycji zawierających fazę niemieszającą się z wodą, w tym uwodorniony olej roś linny, uwodorniony olej rycynowy, kwasy tłuszczowe, jak kwas 12-hydroksystearowy (12-HSA) lub estrowe albo amidowe pochodne takich kwasów, wosk pszczeli, wosk parafinowy, woski mikrokrystaliczne, wosk silikonowy i tłuszczowe alkohole, jak alkohol stearylowy. Strukturant może także być środkiem żelującym (żelantem) tworzącym włókna, takim przykładem jest 12-HSA. Inne przykłady obejmują amidy lub estry N-acylowych aminokwasów, w tym w szczególności

GP-1 (di-n-butyloamid kwasu N-lauroilo-L-glutaminowego), lanosterol, kombinacje sterolu i estru sterolu, jak w szczególności β-sitosterol i γ-oryzanol, poliestryfikowana celobioza, zwłaszcza z kwasem

PL 205 960 B1 alifatycznym C8 do C10, estry treitolu lub wybrane drugorzędowe amidy di- lub trizasadowych kwasów karboksylowych (na przykład 2-dodecylo-N,N'-dibutylobursztynamid) stosowane same lub w kombinacji.

Polimeryczne materiały stosowane do zagęszczania obejmują polimery, jak poliamidy, hydroksypropylocelulozę i naturalne lub syntetyczne gumy, jak poliglicerydy w tym agar, agaroza, pektyna lub guary, albo ich mieszaniny lub kombinacje. Wartą uwagi klasą materiałów do zagęszczania niemieszającej się z wodą fazy są pochodne hydrolizowanej skrobi lub innych polisacharydów, w szczególności zestryfikowane dekstryny, jak palmitynian dekstryny. Dalsza klasa polimerów szczególnie przeznaczonych do strukturowania fazy olejowej zawierającej olej silikonowy, obejmuje polisiloksanowe elastomery. Środki zawieszające, jak krzemionki lub glinki, jak bentonit, montmorylonit lub hektoryt, w tym dostępne jako Bentone™ także mogą być stosowane dla zagęszczania ciekłych kompozycji według wynalazku. Kompozycja może być zagęszczana niepolimerycznymi organicznymi środkami żelującymi, w tym wybranymi dibenzylidenoalditolami (na przykład dibenzylidenosorbitol).

Ilość strukturanta, lub środka zagęszczającego, jaką można włączyć w kompozycje według wynalazku będzie zależała od lepkości płynnej kompozycji, albo zakresu twardości stałych kompozycji, jakie mają być uzyskane. Stosowana ilość będzie w praktyce także zmieniać się w zależności od chemicznej natury strukturanta, lub środka zagęszczającego. W wielu przypadkach ilość strukturanta, lub środka zagęszczającego, będzie w zakresie 0,1 do 25% wagowych, a w szczególności 1 do 15% wagowych.

Kompozycja według wynalazku może ewentualnie zawierać inne składniki, obok już wymienionych, w zależności od natury i postaci końcowego produktu.

Inne składniki rozważane do stosowania w dezodorantach, lub środkach przeciwpotowych do ciała, także można wprowadzać do kompozycji według wynalazku. Obejmują one, na przykład środki powierzchniowo czynne/ułatwiające spłukiwanie, wypełniacze, środki zapachowe, konserwujące i barwiące. Takie składniki i ich stosowane ilości są zazwyczaj dobierane zgodnie z fizyczną i chemiczną postacią kosmetycznej kompozycji.

Środki powierzchniowo czynne mogą stanowić ewentualnie aż do 15%, częściej aż do 5% wagowych całego produktu, i są szczególnie użyteczne w formułowaniu emulsyjnych kompozycji przeciwpotowych, na przykład przeznaczonych do stosowania jako kompozycje sprayu dozowanego pompką, lub kompozycje na kulce (roll-on). Jednak dla innych typów produktów, korzystne jest aby kompozycja zawierała mniej niż około 8% wagowych środka powierzchniowo czynnego. Szczególnie korzystne są niejonowe środki powierzchniowo czynne. Często dogodnie dobiera się mieszaninę środków powierzchniowo czynnych, jak mieszanka o względnie wysokim HLB, na przykład 8 do 18, i mieszanka o względnie małym HLB, na przykład 2 do 8, które moż na wprowadzać w odpowiednich względnych proporcjach dla uzyskania średniego HLB około 6 do 12.

Wiele odpowiednich niejonowych środków powierzchniowo czynnych jest wybranych z niejonowych estrów, eterów lub tlenków amin mających odpowiednie HLB. Wiele korzystnych jonowych środków powierzchniowo czynnych zawiera ugrupowanie polioksyalkilenowe, zwłaszcza ugrupowanie polioksyetylenowe, na przykład 2 do 80, a zwłaszcza 5 do 60 jednostek oksyetylenowych, albo ewentualnie z zawartością ugrupowań polioksypropylenowych, dla zapewnienia hydrofilowości. Inne ugrupowania dostarczające hydrofilowości obejmują wielowodorotlenowe alkohole, jak sorbitol lub glicerol. Ugrupowanie hydrofobowe zazwyczaj pochodzi z alifatycznych alkoholi lub kwasów, albo amin zawierających około 8 do 50 atomów węgla, a w szczególności 10 do 30 atomów węgla. Przykłady odpowiednich niejonowych środków powierzchniowo czynnych obejmują ceteareth-10 do -25, ceteth-10-25, steareth-10-25 i stearynian PEG-15-25 lub distearynian PEG-8. Inne odpowiednie przykłady obejmują mono-, di- lub triglicerydy kwasów tłuszczowych C10-C20. Dalsze przykłady obejmują etery alkoholi tłuszczowych C18-C22 z tlenkami polietylenu (8 do 12 EO).

Przykłady środków powierzchniowo czynnych, które zazwyczaj mają małe HLB, często od 2 często zawierają mono- lub di- estry kwasów tłuszczowych i wielowodorotlenowych alkoholi, jak glicerol, sorbitol, erytrytol lub trimetylolopropan, w tym pochodne cetylowe, stearylowe, arachidylowe i behenylowe.

Wypełniacze mogą stanowić aż do około 20%, częściej aż do 10% bazowej kompozycji, i mogą działać jako nośniki dla ciekłych składników. Odpowiednie wypełniacze obejmują stearynian glinu, tristearynian glinu, stearynian wapnia, talk lub drobno zmielony polietylen, przykładem jest ACUMIST B18. Ten ostatni może także zwiększać wrażenia odbierane przez skórę.

Środki zapachowe, jeżeli występują, to zazwyczaj stanowią aż do 4% całego produktu, a często od 0,1 do 1,5%.

PL 205 960 B1

Środki barwiące i konserwujące mogą być dodawane gdy jest to pożądane.

Inne ewentualne składniki są często kosmetycznymi środkami pomocniczymi, konwencjonalnie wprowadzanymi, lub rozważanymi, jako odpowiednie do stosowania w przeciwpotowych produktach.

Składniki, które mogą ewentualnie występować w nośniku kompozycji mogą korzystnie stanowić uzupełnienie składu kompozycji.

Propelenty powszechnie stosowane w aerozolowych kompozycjach zazwyczaj obejmują węglowodory, lub chlorowcowane węglowodory, jak fluorowęglowodory, o temperaturze wrzenia poniżej 10°C, a zwłaszcza o temperaturze wrzenia poniżej 0°C. Szczególnie korzystnie wprowadza się gazowe węglowodory w postaci skroplonej, a zwłaszcza węglowodory C3 do C6, w tym propan, izopropan, butan, izobutan, pentan i izopentan oraz mieszaniny dwóch, lub więcej, z nich. Korzystne propelenty to izobutan, izobutan/izopentan, izobutan/propan i mieszaniny izopropanu, izobutanu i butanu. Inne lub dodatkowe propelenty obejmują fluorowane węglowodory o małym ciężarze cząsteczkowym. Jeszcze inne propelenty mogą obejmować lotne etery lub dwutlenek węgla.

Względne stosunki wagowe propelenta i bazowej kompozycji są często dobrane w zakresie co najmniej 40:60 a zwłaszcza co najmniej 60:40. Proporcje w wielu wykonaniach wynoszą aż do 99:1 szczególnie do 95:1. Zazwyczaj proporcje dobiera się w zakresie co najmniej 70:30; i w tej samej lub w innych postaciach proporcje wynosz ą aż do 90:10.

Kompozycje według wynalazku mogą być dostarczane w dowolnej postaci produktu odpowiedniej, lub dostosowanej, do zewnętrznego stosowania na ludzką skórę, i są zazwyczaj zawarte w odpowiednim pojemniku, lub dozowniku, dla ułatwienia nakładania na wybrany obszar skóry, zwłaszcza pod pachami, gdzie pożądane jest kontrolowanie pocenia i/lub nieprzyjemnych zapachów.

Po ogólnym opisaniu wynalazku, specyficzne wykonania zostały poniżej przedstawione bardziej szczegółowo, ale jedynie przykładowo.

P r z y k ł a d 1: Test genowy reportera PPARa

Przesiewowo badano kwasy tłuszczowe dla zidentyfikowania kwasów tłuszczowych aktywujących PPAR w teście reporterowym.

Test polega na wiązaniu ligandów do i na aktywowaniu białek PPARa, które następnie aktywują geny pod kontrolą elementów odpowiedzi PPAR (PPRE). W tym teście gen lucyferazy świetlika klonowano za promotorem zawierającym 3 kopie kwasu tłuszczowego wiążącego białko PPRE. Poziom obserwowanej aktywności lucyferazy był bezpośrednio zależny, czyli pokazywał poziom aktywacji PPAR.

Test prowadzono przez przejściową transfekcję komórek Cos-7 z mieszaniną czterech plazmidów DNA. Były to:

1) konstrukt reporterowego genu PPAR (zmodyfikowany wektor reporterowy pNF-KB-luc (wektor reporterowy lucyferazy świetlika handlowo dostępny z firmy Clontech (element odpowiedzi NF-kB, promotor minimalnego TK, luc*, pochodzenie f1, pochodzenie pUC, amp^r)). Powtarzano kolejno dla 3 elementów odpowiedzi PPAR (PPRE-sów) odpowiadających PPRE znalezionym w kwasie tłuszczowym, promotor wiążący białko wprowadzano powyżej promotora minimalnej TK dla zastąpienia elementu odpowiedzi NF-kB);

2) wektor konstruktu nadekspresji PPARa (zmodyfikowany pcDNA3.1(-) (ssaczy wektor ekspresji handlowo dostępny z firmy Invitrogen (promotor CMV, f1 pochodzenie, SV40 pochodzenie, ColE1 pochodzenie, neo^r, amp^r)). Region kodujący ludzkiego PPARa cDNA wprowadzano poniżej promotora CMV pcDNA3.1(-).

3) konstrukt nadekspresji konstruktu RXRa (modyfikowany pRSV-cat (PSV LTR, pMB1 pochodzenie, amp^r) wektora (Proc, Natl, Acad. Sci., USA 79, 6777-6781). Region kodujący ludzkiego RXRa cDNA był wprowadzany poniżej promotora RSV. (Dar V.K.K. Chatterjee, Addenbrooke Hospital, Cambridge)).

4) kontrolny konstrukt lucyferazy (wektor reporterowy lucyferazy Renilla pRL-TK handlowo dostępny z firmy Promega (promotor HSV-TK, promotor T7, Rluc⁺, ori, amp^r)). Dla transfekcji DNA przygotowywano jako mieszaninę gen reporterowy : PPARa : RXRa : kontrolny w stosunku 40 : 4 : 3 : 3.

Komórki Cos-7 wzrastały w modyfikowanym środowisku Eagle' Medium z firmy Dulbecco, określanym tutaj skrótowo jako DMEM z 10% płodowego serum bydlęcego, także określanego tutaj jako FCS, w temperaturze 37°C, 5% CO2 do 80% zlania komórek. Potem komórki umieszczano w 24-studzienkowej płycie w stężeniu 50000 komórek na studzienkę i inkubowano przez noc w DMEM z 10% FCS w temperaturze 37°C, 5% CO2. Komórki potem transfekowano stosując reagent LipofectAMINE (GibcoBRL). W każdej studzience inkubowano 0,4 μg mieszanki DNA (w 25 μl DMEM) z 1 μl LipofectAMINE (w 25 μl DMEM) przez 45 minut. Potem mieszaninę uzupełniano do 250 μl na studzienkę i dodawano do komórek, które wcześniej przemywano 1 ml DMEM. Potem komórki inkuPL 205 960 B1 bowano przez 5 godzin w temperaturze 37°C, 5% CO₂ i 250 μl DMEM z dodanymi 10% SBCS (oczyszczana na węglu surowica cielęca). Komórki inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C, 5% CO2 przed ich traktowaniem odpowiednim związkiem/ekstraktem. Testowane związki podawano jako 1000x część roztworu podstawowego (w DMSO lub w etanolu, który był odpowiedni) i rozcieńczano w DMEM z 10% SBCS (500 μl na studzienkę) bezpośrednio przed dodawaniem do komórek. Każde traktowanie prowadzono trzykrotnie. Transfekcyjną mieszaninę usuwano z komórek i zastępowano badaną mieszanką, i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2. Komórki przemywano 1 ml PBS (bez wapnia lub magnezu) a potem prowadzono lizę z 100 μl na studzienkę 1 x Passive Lysis Buffer (jak dostarczany przez firmę Promega jako zestaw testowy Dual Luciferase). Lizę kontynuowano przez 15 minut a potem lizat testowano na aktywność lucyferazy świetlika i Renilla stosując zestaw testowy Promega Dual Luciferase. Dla tego testu pobierano 20 μl lizatu i badano zgodnie z instrukcją dostarczaną z zestawem stosując, płytę luminometryczną MLX microtiter™ (Dynex).

Aktywność lucyferazy świetlika (wywodzącej się z PPAR) normalizowano wobec wartości lucyferazy Renilla dla tej studzienki i obliczano wartość średnią dla każdych trzech studzienek traktowanych tym samym czynnikiem. Potem aktywność wyrażano jako krotność aktywacji wobec kontrolnej wartości dla nośnika (DMSO lub etanol) dla danej płyty. Jako pozytywną próbkę kontrolną wprowadzano farmaceutyczny ligand PPARa WY14.643.

Zgodnie z wyżej opisanym testem reporterowym, kwas tłuszczowy w tym Przykładzie spełnia test, tj. jest kwasem tłuszczowym aktywującym PPARa gdyż daje aktywację większą niż dla kwasu oleinowego, przy podawaniu w dawce 100 μM, co zazwyczaj daje więcej niż 1,57 razy wartość aktywacji w porównaniu z kontrolnym nośnikiem, podawanym w stężeniu 100 μM.

Wykazano najmniejszy testowany poziom podawania przy jakim testowany materiał spełnia test, a także najmniejszy poziom podawania przy którym uzyskano najlepszą aktywność [super] (50% więcej - co najmniej 2,25 razy aktywacja PPARa) lub jeszcze lepszą aktywność [MS] (100% więcej - co najmniej 3 razy aktywacja PPARa). Wyniki testu skriningowego przedstawiono w Tabeli 1:

T a b e l a 1

Materiał	spełnia przy	wynik przy
1	2	3
WY 14,643 (dodatnia kontrola)	10 pM	super	100 pM
kwas 12-hydroksystearynowy	10 pM	MS	25 pM
kwas arachidonowy	25 pM
kwas cis 13,16-dokozadienowy	10 pM
kwas cis parynarowy	10 pM	super	25 pM
kwas cis 11 eikozenowy	100 pM
kwas cis-11,14,17 eikozatrienowy	100 pM	MS	100 pM
kwas cis-11,14-eikozadienowy	10 pM	MS	100 pM
kwas cis-13,16,19 dokozatrienowy	100 pM
kwas cis-13 oktadecenowy	50 pM
kwas cis-15 oktadekanowy	100 pM
kwas cis-4,7,10,13,16,19 dokozaheksenowy	10 pM
kwas cis-5 eikozenowy	10 pM	MS	100 pM
kwas cis-7,10,13,16 dokozatetraenowy	100 pM	super	100 pM
kwas cis-8,11,14 eikozatrienowy	100 pM	super	100 pM

PL 205 960 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
CLA (50:50 mod2:mix2)	50 μίνΐ	MS	100 μM
CLA (c9, t11)	10 μίνΐ	super	25 μM
CLA (t10, c12)	50 μίνΐ	super	100 μM
CLA (t9,t11)	50 μίνΐ	MS	100 μM
kwas kolumbinowy	10 μίνΐ	super	25 μM
kwas elaidowy	100 μίνΐ
kwas heksadekatrienowy	10 μίνΐ	super	10 μM
kwas linolowy	10 μίνΐ	super	100 μM
kwas linolelaidynowy	25 μίνΐ
kwas linolenelaidowy	25 μίνΐ	super	25 μM
kwas palmitolejowy	50 μίνΐ
kwas petroselaidowy	50 μίνΐ	super	100 μM
kwas petroselinowy	10 μίνΐ	MS	100 μM
kwas pinolenowy	10 μίνΐ
kwas punikowy	25 μίνΐ
kwas rycynolaidowy	10 μίνΐ	MS	25 μM
kwas rycynolowy	10 μίνΐ
kwas stearydonowy/oktadekatetraenowy	25 μίνΐ	super	25 μM
kwas stearolowy	10 μίνΐ
kwasy tłuszczowe oleju słonecznikowego	25 μίνΐ	super	50 μM
kwas trans wakcenowy	10 μίνΐ
kwas trans-12 oktadecenowy	100 μίνΐ
kwas trans-13 oktadecenowy	10 μίνΐ
kwas trans-7 oktadecenowy	10 μίνΐ	MS	10 μM
linia bazowa kwas oleinowy (1,57 przy 100 μίνΐ)	baza

P r z y k ł a d 2

W tym przykładzie prowadzono badanie skórnej organotypowej hodowli dla kwasu petroselinowego (skrótowo PSA) dla wykazania przeciw-zapalnego działania przeciw podrażnieniom wywoływanym przez kompozycje przeciwpotowe.

Metoda: W tym przykładzie skórne organotypowe hodowle (Epiderm™, MatTek, USA) traktowano zewnętrznie kosmetycznym lotionem zawierającym kompozycję przeciwpotową (AP) której skład przedstawiono w Tabeli 2, i kwas petroselinowy wprowadzano do środowiska. Hodowle inkubowano w 37°C, 5% CO2 i 95% względnej wilgotności (standardowe warunki hodowli komórkowej) przez 24 godziny. Hodowlane medium oceniano pod względem zawartości pro-zapalnej cytokiny interleukiny-6 (IL-6) a potem przemywano dla usunięcia formulacji AP, żywotność hodowli określano stosując test Thiazoyl blue (MTT) (Mosmann, T. J. Immunol. Methods 65, strona 55 (1983). Poziom IL-6 określano stosując Immunoassey (Quantikine, systemy R&D).

PL 205 960 B1

Wyniki testu IL-6: Wyniki przedstawiono w Tabeli 2.

Stwierdzono, że kwas petroselinowy (500 μM) znacząco obniżył uwalnianie IL-6 wywoływane przez AP w hodowlach, w teście Dunnet'a z wartością poziomu istotności p<0,05. Zmniejszenie ilości prozapalnej cytokiny IL-6 wskazuje, że PSA hamuje podrażnienia wywoływane przez AP. Żywotność hodowli traktowanej samą kompozycją AP nie była znacząco różna od wartości dla hodowli traktowanej kompozycją AP i kwasem petroselinowym.

T a b e l a 2

Znak towarowy	Nazwa INCI	Dostawca	% wag/wag
Rezal 67	pentachlorohydrat Al-Zr (40%)	Reheis	50,00
destylowana woda	woda	NWW	35,95
DC245	cyklometikon	Dow Corning	4,00
Emulgade SE	stearynian glicerylu, ceteareth-20, ceteareth-12, alkohol cetearylowy, palmitynian cetylowy	Cognis	2,00
Strukturant Solanance	amfoteryczna skrobia ziemniaczana	National Starch	1,00
	środek zapachowy		1,00
Polawax GP200	alkohol cetearylowy, stearynian PEG 20	Croda	0,65
Cutina MD	stearynian glicerylu	Cognis	1,00
Eumulgin B2	ceteareth-20	Cognis	0,40
Eutanol G	oktylododekanol	Cognis	0,50
Glycerol	gliceryna	Unichema	4,00

P r z y k ł a d 3

W tym przykładzie prowadzono badania za pomocą płatkowego testu podrażniania na ludziach dla wykazania działania zapobiegającego podrażnianiu kwasu petroselinowego in vivo.

Metoda: Test płatkowy prowadzono na mieszanym zespole 50 ochotników w wieku między 18 a 55 lat, stosując podwójnie ślepy protokół na statystycznie wybranych płatkach. Próbki (20 mg) nakładano na papier filtracyjny, który umieszczano w komorze Finn™ (0,8 cm wewnętrznej średnicy). Potem komory mocowano do dłoniowej części przedramienia taśmą Scanpore™ (Norgesplater, Nor.) i pozostawiano na 47 godzin. Na koniec okresu 47 godzin, płatki usuwano i miejsca pozostawiano odsłonięte przez 5 godzin. Eksperci oceniali wizualnie suchość i zaczerwienienie wywołane przez płatek, i określali liczbowo, zgodnie z kryteriami oceny podanymi w Tabeli 3.

Wyniki: Wyniki przedstawiono w Tabeli 3

T a b e l a 3

T est płatkowy	wartość średnia podrażnienia
natrysk prototypową pompką	0,62
natrysk prototypową pompką + 0,25% kwasu petroselinowego	0,49
bez traktowania	0,46

Natrysk kompozycji przeciwpotowej prototypową pompką dawał znaczne zwiększenie podrażnienia. Było to znacznie łagodzone przez wprowadzenie 0,25% kwasu petroselinowego do kompozycji. Prowadzono statystyczną analizę testem Wilcoxon'a z poziomem istotności 5%. Wniosek z tego doświadczenia jest taki, że podrażnienie wywołane przez płatkowe testowanie kompozycji sprayu prototypową pompką zostało znacznie zmniejszone przez dodanie kwasu petroselinowego.

PL 205 960 B1

Skala stopniowania oceny miejsca po płatkach:

Stopień	Opis
0,0	brak widocznego skórnego zaangażowania
0,5	zanikające, ledwie zauważalne zaczerwienie lub nieznaczna suchość
1,0	zanikające ale wyraźne zaczerwienienie, brak wysypki lub popękanej skóry, albo brak zaczerwienienia ale wyraźna suchość; może być popękanie naskórka
1,5	wyraźnie widoczne zaczerwienienie, albo zanikające grudki o wyraźnym zaczerwienieniu, może być popękanie naskórka
2,0	średnie zaczerwienienie, może być bardzo mało grudek, albo głębokie popękanie, średnie do silnego zaczerwienienie w pęknięciach
2,5	średnie zaczerwienienie z ledwie widocznym obrzękiem lub silne zaczerwienie nie obejmujące znacznej części płatka (efekt aureoli wokół krawędzi), może być kilka grudek lub średnie do silnego zaczerwienienie
3,0	silne zaczerwienienie (czerwień buraczkowa), mogą być rozpowszechnione grudki lub łagodne do silnego zaczerwienienia z lekkim obrzękiem (krawędzie dobrze widoczne przez wyniesienie)
3,5	średnie do silnego zaczerwienienia ze średnim obrzękiem (ograniczony do obszaru płatka), albo średnie do silnego zaczerwienienie z wyizolowanym tworzeniem strupów lub pęcherzy
4,0	rozpowszechnione tworzenie pęcherzy lub strupów, albo średnie do silnego zaczerwienienie i/lub obrzęk rozciągający się poza obszar płatka

P r z y k ł a d 4

W tym przykładzie prowadzono badanie skórnych organotypowych hodowli z użyciem skoniugowanego kwasu linolowego trans-10-cis-12.

Metody: skórne organotypowe hodowle (Epiderm™, MatTek, USA) traktowano zewnętrznie na skórę wyżej określoną kompozycją (AP) i skoniugowany kwas linolowy trans-10-cis-12 (TC-CLA) wprowadzano do środowiska. Hodowle inkubowano w 37°C, 5% CO2 i 95% względnej wilgotności (standardowe warunki hodowli komórkowej) przez 24 godziny. Hodowlane środowisko oceniano na zawartość pro-zapalnej cytokiny interleukiny-6 (IL-6) a po przemywaniu dla usunięcia kompozycji AP, określano żywotność hodowli metodą opisaną w Przykładzie 2. Wyniki przedstawiono w Tabeli 5.

Wyniki testu IL-6: Stwierdzono, że TC-CLA (5 i 500 μM) znacznie obniża uwalnianie IL-6 wywoływane przez AP z hodowli, co określano w teście Dunnet'a z wartością istotności p<0,01. Zmniejszenie ilości pro-zapalnej cytokiny IL-6 wskazuje, że TC-CLA jest zdolny do hamowania podrażnienia wywołanego przez AP. Żywotność hodowli traktowanej tylko AP nie była znacząco różna od wartości dla hodowli traktowanej AP i kwasem petroselinowym.

T a b e l a 5

Traktowanie		IL-6 pg/ml		sd	n
Brak		51,7		6,3	4
AP		118,8		35,3	4
5 pM TC-CLA + AP		59,6		12,3	4
500 pM TC-CLA + AP		57,1		16	4

P r z y k ł a d 5

W tym przykładzie wykazano hydrolizę kwasu tłuszczowego aktywującego PPAR zawierającego triglicerydy dla typowych bakterii występujące na skórze u ludzi pod pachami.

Określano zdolność reprezentatywnych lipolitycznych skórnych bakterii (Tabela B) do hydrolizowania postaci triglicerydowych kwasu petroselinowego i skoniugowanego kwasu linolowego (tri-CLA), z uwalnianiem odpowiednich wolnych kwasów tłuszczowych (FFA-ów).

PL 205 960 B1

T a b e l a B: reprezentatywne lipazo-aktywne bakterie skórne

Rodzaj/grupa	Gatunek	kod 994
Corynebacterium	Nieokreślony	G42
Staphylococcus	S. epidermidis	DH1
Propionibacterium	P. acnes	G63

Metoda: Wytwarzano mikrobiologiczną masę przez hodowanie każdej hodowli w 2X 500 ml środowiska LIPMED™ (20 g/l Tryptone™ brzeczka sojowa; 10 g/l ekstrakt drożdżowy; 2,5 g/l Tween 80™), początkowo przez 48 godzin. Wtedy dodawano wysoko oleinowy olej słonecznikowy (HOSF) dla stymulowania aktywności lipazy i hodowle inkubowano przez dalsze 48 godzin, przed zbieraniem i przemywaniem w buforze KPi (pH 8,0). Komórki ponownie zawieszano do postaci pasty i ustalano pH na 8,0 przed określaniem suchej wagi i lipolitycznej aktywności.

Dla określenia lipolitycznej aktywności past komórek w tym teście, dodawano triglicerydy (tripetroselinina i tri-CLA), jak też surową trioleinę (HOSF) które włączano jako dodatnią kontrolną próbkę, i określano ilość uwolnionego wolnego kwasu tłuszczowego (FFA) za pomocą gazowej chromatografii.

Każdy test składał się z 3 ml komórkowej pasty, do której dodawano 2 ml mieszaniny zawierającej 5% (obj./obj.) triglicerydu i 16,67% (obj./obj.) emulgującego reagenta (17,9 g/l NaCl; 0,41 g/l KH2PO4, 540 ml/l glicerolu; 6,0 g/l gumy arabskiej, dostosowany do wartości pH 8,0). Wszystkie testy prowadzono w duplikatach, razem z próbkami kontrolnymi bez komórek, i inkubowano w 30°C z mieszaniem (100 obrotów na minutę), przez 4 godziny. Na koniec testowe próbki przechowywano w 4°C przez 72 godziny przed prowadzeniem analizy.

Uwalnianie FFA z testowanych triglicerydów określano ilościowo za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej (GC). Do każdej testowanej próbki dodawano standard wewnętrzny (1,0 mg/ml kwasu laurynowego) i środowisko zakwaszano (pH ok. 2) przez dodawanie HCl. Prowadzono ekstrakcję ciecz-ciecz stosując 2 objętości (10 ml) octanu etylu; fazy organiczną i nieorganiczną zbierano przez wirowanie (2000 obrotów na minutę, przez 3 minuty). Następnie 2,0 ml każdej fazy organicznej (górna warstwa) przenoszono do rurki próbnika przed analizą na aparacie Perkin Elmer 8000™ (seria 2) połączonym z GC z 15 m x 0,32 mmm (wewnętrzna średnica) FFAP (kopolimer kwas nitrotereftalowy zmodyfikowany PEG/siloksan) wypełnioną krzemionką kapilarną kolumną (grubość filmu 0,25 μm) (Quadrex). Kolumnę przyłączono do rozszczepiającej - nierozszczepiającej (split-splitless) strzykawki i detektora jonizacji płomieniowej (FID) z GC, wykrywanie prowadzono w 300°C. Gazem nośnikowym na kolumnie był hel (41,37 kPa (6,0 psi)) podczas gdy wodór (117,21 kPa (17 psi)) i powietrze (158,58 kPa (23 psi)) były nośnikami FID. Program temperaturowy dla analizy FFA był następujący 80°C (2 minuty); 80-250°C (20°C/minutę); 250°C (8 minut). Wymiar wstrzykiwanej próbki wynosił 0,5-1,0 μί. Poziomy FFA w zlewkach były określane ilościowo przez porównanie obszarów pików dla znanych ilości zarówno standardu wewnętrznego (kwas laurynowy) jak i zewnętrznego (kwas oleinowy, kwas petroselinowy i skoniugowane kwasy linolowe).

Wyniki: Wyniki wyrażano jako ilość mg FFA uwalnianego na gram komórek suchej wagi biomasy (mg FFA/g CD wt) w ciągu 4 godzin doświadczalnego inkubowania. W każdym przypadku, określano ilościowo tylko przeważający zhydrolizowany FFA (tj. kwas oleinowy z HOSF; kwas petroselinowy z tripetroselininy; CLA z tri-CLA); w konsekwencji możliwe jest, że całkowita ilość FFA jest większa dla, co najmniej części, tych wyników, czyli prawdziwy zakres aktywności lipazy jest niedoszacowany (na przykład w HOSF występują znaczne ilości innych kwasów tłuszczowych). Wyniki przedstawiono w Tabeli 6.

T a b e l a 6

Bakteria	Podłoże	średnia aktywność lipazy (mg FFA/g CDwt)
1	2	3
Coryn ebacterium (A) sp G42	HOSF (trioleina)	1,52
tripetroselenina	6,26
tri-CLA	2,23

PL 205 960 B1 cd. tabeli 6

1	2	3
S. spidermidis DH1	HOSF (trioleina)	36,0
tripetroselenina	114,4
	tri-CLA	59,9
P. acnes G63	HOSF (trioleina)	296,6
tripetroselenina	184,6
	tri-CLA	190,7

Powyższe dane wyraźnie pokazują, że tripetroselinina i tri-CLA są hydrolizowane przez lipolityczne bakterie skórne co najmniej tak łatwo jak trioleina, a jeszcze łatwiej w przypadku S. epidermidis. Pokazuje to, że populacja bakterii pospolicie występujących na skórze w obszarze pod pachami, byłaby zdolna do hydrolizowania triglicerydów z miejscowym uwalnianiem na skórze wolnych kwasów tłuszczowych aktywnych wobec PPARa, a przez to do kontrolowania lub wyeliminowania podrażniania.

P r z y k ł a d 6 i 7: Identyfikowanie środka korzystnego dla skóry w teście różnicowania keratynocytów

Podstawy: dobry stan skóry wynika z tworzenia nieuszkodzonej bariery chroniącej leżące pod nią tkanki i zapobiegającej utracie wody. Warstwa rogowa naskórka pełniąca te funkcje barierowe jest końcowym produktem normalnego różnicowania keratynocytów. Ważnym komponentem różnicowania keratynocytów, a zatem i warunkiem dobrego stanu skóry, jest tworzenie zrogowaciałej otoczki przez enzymy transglutaminazy. Zrogowaciałe otoczki są silnie usieciowaną klatką pokrytą przyłączonymi przez wiązania kowalentne lipidami, są one uważane za istotne dla wytrzymałości warstwy rogowej naskórka i zapewnienia nieprzenikalności dla wody. Cząsteczki zdolne do wpływania na dojrzewanie keratynocytów, wzmacniają aktywność transglutaminazy i tworzenie zrogowaciałych otoczek, zatem są potencjalnie ważnymi składnikami aktywnymi do wprowadzania do kompozycji przeznaczonych do poprawiania stanu skóry. Testy dla określenia keratynocytowej transglutaminazy i zrogowaciałych otoczek stosowano dla zidentyfikowania środków korzystnych dla skóry.

Metoda: ludzkie naskórkowe keratynocyty (pasaż 3) zaszczepiano w ilości 400 komórek/studzienka w 96-studzienkowej płycie w środowisku do wzrostu keratynocytów (KGM) zawierającym 0,03 mM wapnia i hodowano przez 3 dni w 37°C. Potem komórki traktowano ligandami PPAR w KGM zawierającym 0,03 mM wapnia i hodowano przez 4 dni, przed zbieraniem. Roztwory podstawowe ligandów PPAR rozpuszczano w dimetylosulfotlenku (DMSO) i rozcieńczano w KGM przed dodawaniem do komórek. Stężenie DMSO zazwyczaj wynosiło 0,01%, dodawano ekwiwalentną ilość DMSO do kontrolnych komórek. Zebrane komórki przemywano 3x buforowaną fosforanem solanką (PBS) i ekstraktowano w 1% Triton X100, 50 mM (tris[hydroksymetylo]aminoetan) (Tris) pH 8,0 plus inhibitory proteazy pepstatyna i leupeptyna (100 pl/studzienka). Ekstrakty badano na zawartość DNA stosując test DNA Pico Green (Molecular Probes, Inc.)

Test transglutaminazy (TGazy): Pozostałe komórki przyłączone do 96-studzienkowej płyty inkubowano z 70 pl/studzienka testowego buforu TGazy (50 mM Tris™ pH 8,0, 5 mM DTT, 50 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 15 pM odczynnika Texas Red Cadaverine) i inkubowano przez 16 godzin w 37°C. Potem płyty przemywano destylowaną wodą (x2) i określano fluorescencję związaną z sieciowaniem kadaweryny Texas Red, wzbudzenie przy 590 nm i emisja przy 645 nm.

P r z y k ł a d y 8 i 9: Test zrogowaciałej otoczki

Komórki hodowano w 96-studzienkowej płycie, jak opisano powyżej dla testów TGazy i określano zrogowaciałe otoczki stosując metodę różnicowania Hough-Monroe & Milstone (Anal. Biochem. 199, str. 25 (1991)). Po ekstrakcji Tris-tryton dla testu TGazy, komórki ekstrahowano 100 pl/studzienka 2% SDS, 20 mM DTT przez 16 godzin w 60°C. Po ekstrahowaniu zawiesinę SDS z każdej studzienki pojedynczo filtrowano przez membranę poliwinylidenofluorkową (PVDF) (Immobilon-P™ Transfer Membrane, Millipore), wstępnie blokowaną buforowaną Tris solanką (TBS) zawierającą 0,5% (obj./obj.) Tween 20, 0,5% w urządzeniu Dot Blot™ (Bio-Rad). Każdą próbkę przemywano kilkakrotnie buforem TBS/Tween przed usuwaniem membrany z urządzenia, spłukiwano destylowaną wodą i barPL 205 960 B1 wiono srebrem za pomocą zestawu do barwienia (Bio-Rad). Zabarwione membrany dot-blot skanowano i analizowano oprogramowaniem komputerowym Phoretix ArraY™.

P r z y k ł a d 6

Ten przykład przedstawia test transglutaminazy keratynocytowej z użyciem cis-9-trans-11 skoniugowanego kwasu linolowego (CT-CLA).

Metody: hodowane keratynocyty traktowano cis-9-trans-11 skoniugowanym kwasem linolowym (CT-CLA) przez 4 dni. Komórki ekstrahowano za pomocą Tris-1% Triton X100™ i określano aktywność nie-ekstrahowalnej Tgazy związaną z komórkami za pomocą Texas Red Cadaverine (zgodnie z wyżej opisaną metodą). Wyniki otrzymane w teście TGazy przedstawiono w Tabeli 7.

T a b e l a 7

		30 pM Ca2+ Tgaza/ng DNA
pM CT-CLA	średnia	sdev	n
0		16,82	2,55	6
0,1		18,30	2,52	6
1		18,46	2,89	6
10		28,07	5,60	6

Stwierdzono, że CT-CLA (10 μM) znacznie zwiększa aktywność keratynocytowej Tgazy w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że CT-CLA może zwiększać keratynocytowe różnicowanie.

P r z y k ł a d 7 badanie transglutaminazy keratynocytowej z użyciem kwasu petroselinowego

Metoda: powtórzono metodę z Przykładu 6, ale używano kwasu petroselinowego zamiast CT-CLA. Wyniki przedstawiono w Tabeli 8.

T a b e l a 8

		Aktywność TGazy (jednostki arb.)
pM kwasu petroselinowego	Średnia	sdev	n
0		285	136	6
0,01		366	54	6
0,05		563	107	6
0,1		471	172	6
1		752	77	6
5		743	98	6
10		741	158	6
15		729	208	6
25		907	263	6

Stwierdzono, że kwas petroselinowy (1-25 μM) znacznie zwiększa aktywność keratynocytowej TGazy w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że kwas petroselinowy może zwiększać keratynocytowe różnicowanie.

P r z y k ł a d 8: badanie zrogowaciałej otoczki keratynocytu z użyciem kwasu pinolenowego.

Metoda: hodowane keratynocyty traktowano kwasem pinolenowym przez 4 dni. Komórki ekstrahowano 2% SDS, 20 mM DTT i określano ilościowo zrogowaciałe otoczki, po filtrowaniu z użyciem membrany PDVF, przez barwienie srebrem, jak opisano powyżej. Wyniki przedstawiono w Tabeli 9.

PL 205 960 B1

T a b e l a 9

		Test zrogowaciałej otoczki (jednostki arb.)
pM kwasu pinolenowego	średnia	sdev	n
0		22831	6694	6
0,1		18828	1786	6
1		24860	4979	6
10		36579	9286	6

Stwierdzono, że kwas pinolenowy (10 μM) znacznie zwiększa aktywność keratynocytowej TGazy w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że kwas pinolenowy może zwiększać keratynocytowe różnicowanie.

P r z y k ł a d 9: badanie zrogowaciałej otoczki keratynocytu z użyciem kwasu heksadekatrienowego.

Metoda: powtórzono metodę z Przykładu 8 stosując kwas heksadekatrienowy zamiast kwasu pinolenowego. Wyniki przedstawiono w Tabeli 10.

T a b e l a 10

		Test zrogowaciałej otoczki (jednostki arb.)
pM kwasu heksadekatrienowego	średnia	sdev	n
0		17996	8860	6
0,1		17617	3664	6
1		36017	15579	6
10		40997	8617	6

Stwierdzono, że kwas heksadekatrienowy (1-10 μM) znacznie zwiększa aktywność keratynocytowego TGazy w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że kwas heksadekatrienowy może zwiększać keratynocytowe różnicowanie.

P r z y k ł a d 10: badanie keratynocytowej proliferacji z użyciem skoniugowanego kwasu linolowego cis-9-trans-11 (CT-CLA).

Metoda: hodowlane keratynocyty traktowano cis-9-trans-11 skoniugowanym kwasem linolowym (CT-CLA) przez 4 dni. Komórki ekstrahowano Tris-1% Triton X100 i zawartość DNA na studzienkę określano za pomocą testu Pico Green zgodnie z wyżej opisaną procedurą. Wyniki przedstawiono w Tabeli 11.

T a b e l a 11

		DNA (ng/studzienka)
pM CT-CLA	średnia	sdev	n
0		92,17	11,69	6
0,1		81,83	6,08	6
1		81,33	9,18	6
10		59,50	5,13	6

PL 205 960 B1

Stwierdzono, że CT-CLA (10 μM) znacznie zmniejsza aktywność syntezy keratynocytowego DNA w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że CT-CLA może działać jako środek antyproliferatywny dla keratynocytów.

P r z y k ł a d 11: badanie keratynocytowej proliferacji z użyciem kwasu pinolenowego.

Metoda: powtórzono metodę z Przykładu 10, ale stosowano kwas pinolenowy zamiast CT-CLA. Wyniki przedstawiono w Tabeli 12.

T a b e l a 12

		DNA (ng/studzienka)
pM kwasu pinolenowego	średnia	sdev	n
0		14,46	0,58	6
0,1		13,41	0,35	6
1		12,95	0,63	6
10		12,63	0,33	6

Stwierdzono, że kwas pinolenowy (10 μM) znacznie zmniejsza aktywność syntezy keratynocytowego DNA w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że kwas pinolenowy może działać jako środek antyproliferatywny dla keratynocytów.

P r z y k ł a d 12: analiza keratynocytowej proliferacji dla kwasu cis-parynarowego.

Metoda: powtórzono metodę z Przykładu 10, z kwasem cis-parynarowym zamiast CT-CLA. Wyniki przedstawiono w Tabeli 13.

T a b e l a 13

		DNA (ng/studzienka)
pM kwasu cis-parynarowego	średnia	sdev	n
0		3,5	0,4	6
1		3,3	0,9	6
5		4,1	0,8	6
10		2,6	0,4	6
20		1,5	0,4	6

Stwierdzono, że kwas cis-parynarowy (10 i 2 0 μM) znacznie zmniejsza aktywność syntezy keratynocytowego DNA w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że kwas cis-parynarowy może działać jako środek antyproliferatywny dla keratynocytów.

P r z y k ł a d 13: badanie skórnej organotypowej hodowli dla kwasu cis-parynarowego, dla wykazania działania przeciwzapalnego przy podrażnieniach wywołanych przez kompozycję przeciwpotową.

Metoda: skórne organotypowe hodowle (Epiderm™, MatTek, USA) traktowano zewnętrznie kompozycją AP z Przykładu 2 i do środowiska wprowadzano kwas petroselinowy. Potem hodowle inkubowano w 37°C, 5% CO2 i 95% względnej wilgotności (standardowe warunki hodowli komórkowej) przez 24 godziny. Środowisko hodowlane analizowano na zawartość pro-zapalnej cytokiny interleukiny-6 (IL-6) i po przemywaniu dla usunięcia kompozycji AP, określano żywotność hodowli w teście MTT. Poziom cytokiny IL-6 określano testem ELISA (układy R&D). Wyniki przedstawiono w Tabeli 14.

PL 205 960 B1

T a b e l a 14

Dawka	uwalnianie IL-6 (średnio +/- SD)	sd	wartość % formulacji AP	n
Zero	21,5	4,0	278,4	4
AP	57,1	24,7	100	4
1,0 ąM kwas cis-parynarowy (+AP)	26,8	9,4	105,6	4
10,0 ąM kwas cis-parynarowy (+AP)	23,3	5,3	81,5	4
100,0 ąM kwas cis-parynarowy (+AP)	25,7	15,1	53,8	4

Stwierdzono, że kwas cis-parynarowy (1-100 ąM) znacznie zmniejsza uwalnianie IL-6 wywoływane przez AP z hodowli, w teście Dunnet przy wartości znaczącej p<0,05. Redukcja prozapalnej cytokiny IL-6 wskazuje, że kwas cis-parynarowy będzie hamował podrażnienia wywoływane przez AP. Żywotność hodowli traktowanej tylko AP nie była znacząco różna od wartości dla hodowli traktowanej AP i kwasem cis-parynarowym.

P r z y k ł a d 14: badanie keratynocytowej proliferacji z użyciem kwasu heksadekatrienowego.

Metoda: powtórzono metodę z Przykładu 10, ale stosowano kwas heksadekatrienowy zamiast cis-9-trans-11 skoniugowanego kwasu linolowego. Wyniki przedstawiono w Tabeli 15.

T a b e l a 15

		DNA (ng/studzienka)
ąM kwasu heksadekatrienowego	średnia	sdev	n
0		1,66	0,19	6
0,1		0,98	0,23	6
1		1,27	0,19	6
10		1,13	0,26	6

Stwierdzono, że kwas heksadekatrienowy (0,1-10 ąM) znacznie redukuje aktywność syntezy keratynocytowego DNA w 1-stronnym teście ANOVA Student-Neumann-Kuels z wielokrotnym porównaniem (p<0,05). Wyniki wskazują, że kwas heksadekatrienowy może działać jako keratynocytowy środek antyproliferatywny.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przeciwpotowa kosmetyczna kompozycja odpowiednia do zewnętrznego stosowania na ludzką skórę zawierająca:

   1. przeciwpotowo aktywną substancję zawierającą ściągającą sól glinu lub cyrkonu; ii. nośnik dla substancji przeciwpotowo aktywnej;

   znamienna tym, że zawiera olefinowo nienasycony kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów inny niż co najmniej 1% wagowy kwasu rycynolowego albo kwasu linolowego.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów jest wybrany spośród kwasu petroselinowego, skoniugowanego kwasu linolowego cis-9-trans-11, skoniugowanego kwasu linolowego trans-10-cis-12, kwasu 7-trans oktadekanowego, kwasu cis-parynarowego, kwasu dokozaheksenowego, kwasu cis-4,7,10,13,16,19 dekozaheksenowego, kwasu rycynolaidowego, kwasu stearydonowego, kwasu kolumbinowego, kwasu linolenelaidowego, kwasu wakcenowego, kwasu eikozapentanowego i kwasu pinolenowego.

   PL 205 960 B1
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że dodatkowo zawiera zawierający triglicerydy olej wybrany spośród oleju z nasion kolendry, oleju z nasion niecierpka, parynarowego laurynarowego tłuszczu z nasion owoców drzewa palmowego, lub oleju z nasion barwinka brazylijskiego, odwodnionego oleju rycynowego i oleju z orlika pospolitego.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1-3, znamienna tym, że kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów zawiera 16 lub 18 atomów węgla.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów zawiera kwas petroselinowy.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera olej z nasion kolendry.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera od 0,1 do 20% wagowych, a korzystnie od 0,5 do 10% wagowych kwasu tłuszczowego aktywującego receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów.
8. 8. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-7, znamienna tym, że obejmuje kombinacje kwasów tłuszczowych aktywujących receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów lub ich prekursorów w stosunku wagowym od 5:1 do 1:5.
9. 9. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-8, znamienna tym, że zawiera od 10 do 30% wagowych substancji przeciwpotowo aktywnej.
10. 10. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-9, znamienna tym, że substancja przeciwpotowo aktywna zawiera chlorohydrat glinu i/lub glinowo/cyrkonowy kompleks glicyny.
11. 11. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-10, znamienna tym, że zawiera lotny silikonowy nośnik, korzystnie w ilości od 10 do 70% wagowych.
12. 12. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-11, znamienna tym, że zawiera środek strukturujący, lub zagęszczający, w stężeniu wystarczającym do wytworzenia sztywnego sztyftu, albo miękkiego ciała stałego.
13. 13. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-11, znamienna tym, że zawiera bazową kompozycję która tworzy aerozolową kompozycję razem z propelentem, a stosunek wagowy propelenta do bazowej kompozycji jest wybrany w zakresie od 40:60 do 99:1.
14. 14. Nieterapeutyczny sposób zmniejszania lub eliminowania potu lub nieprzyjemnego zapachu ciała przez zewnętrzne stosowanie na skórę przeciwpotowej kompozycji przeciwpotowo aktywnej substancji obejmującej ściągającą sól glinu lub cyrkonu i nośnik, jak określona w zastrz. 1 do 13, ze zmniejszaniem lub eliminowaniem podrażnienia skóry powodowanego przez stosowanie kompozycji na skórę, znamienny tym, że stosuje się kompozycję, do której wprowadzono olefinowo nienasycony kwas tłuszczowy aktywujący receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów w ilości wystarczającej do zmniejszenia podrażniania skóry, z wyłączeniem co najmniej 1% wagowego kwasu rycynolowego lub kwasu linolowego.