PL204359B1

PL204359B1 - Cykliczne peptydy, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowania

Info

Publication number: PL204359B1
Application number: PL346346A
Authority: PL
Inventors: David E. Wright; John S. O'brien
Original assignee: Myelos Corp
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2010-01-29
Also published as: CN1324367A; IL141586A0; HUP0103265A2; PL346346A1; CA2341810A1; HUP0103265A3; JP2010150272A; JP2002523518A; EP1105420A1; BR9913490A; JP4528443B2; AU751034B2; CZ2001655A3; ZA200102489B; AU5690599A; WO2000012553A1; KR20010079695A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są cykliczne peptydy, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowania.

Obecny wynalazek dotyczy peptydów neurotropowych i analgetycznych. Dokładniej, wynalazek dotyczy cyklicznych peptydów pochodzących z aktywnego regionu sapozyny C, które mają działanie neurotropowe i analgetyczne.

Czynniki neurotropowe są białkami lub peptydami zdolnymi do wpływania na przeżycie, docelowe unerwienia i/lub funkcję populacji komórki nerwowej (Barde, Neuron 2:1525-1534, 1989). Skuteczność czynników neurotropowych została dobrze udokumentowana zarówno in vitro jak i in vivo. Przykładowo, czynnik wzrostowy komórki nerwowej (NFG) działa jako czynnik tropowy dla cholinergicznej części przodomózgowia, obwodowych i czuciowych neuronów (Hefti i wsp., Neurobiol. Aging 10:515-533, 1989) i może odwrócić występujące naturalnie jak również spowodowane fizycznymi urazami uszkodzenia nerwów obwodowych (Rich i wsp., J. Neurocytol. 16:261-268, 1987). Pochodzący z mózgu czynnik neurotropowy (BDNF) jest czynnikiem tropowym dla obwodowych neuronów czuciowych, neuronów dopaminergicznych i zwoju siatkówkowego (Henderson i wsp., Restor. Neurol. Neurosci. 5:15-28, 1993). Pokazano, że BDNF zapobiega występującej naturalnie śmierci komórki, zarówno in vitro jak i in vivo (Hofer i wsp., Nature 331:262-262, 1988). Czynnik neurotropowy z ciała rzęskowego (CNTF) sprzyja przeżyciu in vitro pochodzącego od zarodka kurzego zwoju rzęskowego i podtrzymuje przeż ycie hodowanych czuciowych współ czulnych i grzbietowych neuronów ruchowych (Ip i wsp., J. Physiol. Paris 85:122-130, 1991). Demielinizacja jest pospolitą wadą występującą w szeregu chorób ośrodkowego układu nerwowego (CNS), z których najbardziej rozpowszechnioną jest stwardnienie rozsiane (MS). MS jest chorobą przewlekłą, która może prowadzić do całkowitej niesprawności i charakteryzuje się zniszczeniem osłonki mielinowej, przy równoczesnym zachowaniu aksonów w postaci zasadniczo nieuszkodzonej. Obecnie nie ma skutecznego leczenia MS. Inne choroby ośrodkowego układu nerwowego, w których występuje demielinizacja obejmują ostre rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia, stwardnienie zanikowe boczne, ostrą krwotoczną leukodystrofię, postępujące wieloogniskowe zapalenie mózgu, leukodystrofię metachromatyczną i leukodystrofię nadnerczową. Obwodowy układ nerwowy (PNS) również może być dotknięty demielinizacją, tak jak to występuje w zespole Guillain-Barre (Pathologic Basis of Disease, Robbins i wsp., wyd., W. B. Saunders, Filadelfia, 1979 str., 1578-1582).

Uszkodzenia i neuropatie obwodowego układu nerwowego, takie jak te, które są wynikiem cukrzycy lub chemioterapii, obejmują najczęściej występujące zaburzenia obwodowego układu nerwowego. Obecne sposoby leczenia obwodowego układu nerwowego leczą jedynie objawy, a nie przyczynę choroby.

Ból neuropatyczny wynikający z uszkodzenia nerwu, taki jak uciśnięcie lub zgniecenie i pourazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego jest zazwyczaj długotrwały lub chroniczny. Najbardziej urazowe uszkodzenia nerwu również powodują tworzenie się nerwiaków, w których ból występuje jako skutek zaburzonej regeneracji nerwu. Ponadto związany z nowotworem ból neuropatyczny powstaje, gdy wzrost guza uciska sąsiadujące nerwy, mózg lub rdzeń przedłużony. Ból neuropatyczny jest również związany z chorobami, w tym cukrzycą i alkoholizmem. W większości przypadków ból neuropatyczny jest oporny na współczesne leki. Leki te mają również poważne skutki uboczne. Zgłoszenie Patentowe U.S. nr 08/611,307 dostarcza sposobu łagodzenia lub zapobiegania bólom neuropatycznym przez podanie osobnikowi skutecznej ilości aktywnego fragmentu prosapozyny.

Prosapozyna jest prekursorem grupy czterech małych odpornych na temperaturę glikoprotein, które są wymagane do hydrolizy glikosfingolipidów przez lizosomalną hydrolazę (Kishimoto i wsp., J. Lipid Res., 33:1255-1267, 1992). Prosapozyna jest proteolitycznie obrabiana w lizosomach, w wyniku czego powstają sapozyny A, B, C i D (O'Brien i wsp., FASEB J. 5:301-308, 1991). O'Brien i wsp., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9593-9596, 1994), patent U.S. n. 5,571,787 i opublikowany jako zgłoszenie PCT nr WO95/03821 ujawniający, że prosapozyna, sapozyna C pobudza wzrost neurytów i sprzyja zwiększonej mielinacji. Ponadto, w patentach U.S. nr 5,571,787, 5,696,080, 5,714,459 i opublikowanym zgłoszeniu PCT nr WO95/03821 ujawniono, że 22-merowy peptyd (CE FLVKEVTKLIDNNKTEKEIL; Sekw. Id. Nr:1) składający się z aminokwasów 8-29 z pobudzającej wzrost neurytów ludzkiej sapozyny C. Odnośniki te ujawniają również, że 18-merowy peptyd (YKEVTKLIDNNKTEKEIL; Sekw. Id. Nr:2) zawarty w aktywnej 22 merowej sapozynie C (z V zastąpioną przez Y) również sprzyja wzrostowi neurytu i jest zdolny do przekraczania bariery krew-mózg. O'Brien i wsp., (FAPL 204 359 B1

SEB J. 9:681-685, 1995) wykazali, że 22-merowy peptyd pobudza aktywność acetylotransferazy cholinowej i zapobiega śmierci neuronu. Aktywny neurytogenny fragment został zlokalizowany na liniowej 12-merowej sekwencji znajdującej się na aminokońcowej części sapozyny C (LIDNNKTEKEIL; Sekw. Id. Nr:3) (O'Brien i wsp., FASEB J. 681-685, 1994). Liepinish i wsp., (Nature Struct. Biol. 4:793-795) wskazali, że konformacja pętli neurotroficznie aktywnego peptydu, segmentu NK-lizyny (reszty 17-30) może być naśladowana przez kolisty peptyd.

Największą przeszkodą w terapeutycznym zastosowaniu peptydów in vivo jest ich wrażliwość na degradację proteolityczną .

Wynalazek dotyczy cyklicznego peptydu o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6.

W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja farmaceutyczna zawierająca peptyd według wynalazku.

Korzystnie kompozycja jest w fiolce z septum.

Korzystnie peptyd według wynalazku jest sformułowany z materiałem warunkującym kontrolowane uwalnianie.

Korzystnie kompozycja jest w postaci zliofilizowanej.

Korzystnie również kompozycja jest w postaci liposomalnej.

Korzystnie również kompozycja jest w postaci przydatnej do podania miejscowego.

Korzystnie kompozycja jest w postaci jednostkowych dawek.

Obecny wynalazek dostarcza cyklicznych peptydomimetyków prosapozyny, o dobrej oporności na proteolityczną degradację i zdolności do przekraczania bariery krew-mózg.

Korzystnie cykliczny peptyd według wynalazku jest podawany dożylnie, domięśniowo, śródskórnie, podskórnie, śródczaszkowo, do płynu rdzeniowo-mózgowego lub miejscowo. Korzystnie peptyd jest podany w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku. W innym aspekcie tego korzystnego wykonania, peptyd jest zawarty w strukturze lamelarnej.

Wynalazek dotyczy też cyklicznego peptydu o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do zastosowania w leczeniu bólu związanego z neuropatią.

Obecny wynalazek dotyczy cyklicznego peptydu o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do zastosowania w indukcji mielinizacji lub w hamowaniu demielinizacji u ssaka.

Ponadto w zakres wynalazku wchodzi cykliczny peptyd o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do zastosowania w hamowaniu degeneracji neuronalnej lub w promowaniu wzrostu neurytu.

Obecny wynalazek dotyczy też zastosowania cyklicznego peptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia stwardnienia rozsianego, ostrego rozsianego zapalenia mózgu i rdzenia, postępującego wieloogniskowego zapalenia mózgu i rdzenia, dystrofii metachromatycznej lub dystrofii nadnerczowej.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania cyklicznego peptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia choroby Parkinsona.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie cyklicznego peptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia neuropatii siatkówkowej.

Obecny wynalazek dotyczy też zastosowania cyklicznego peptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia neuropatii ruchowej, neuropatii czuciowej, neuropatii obwodowej, neuropatii indukowanej taksolem, neuropatii cukrzycowej.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania cyklicznego peptydu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia bólu neuropatycznego u ssaków po urazie.

Cykliczne peptydy według wynalazku zawierają 11 aminokwasów i są zmodyfikowaną na C-końcu sapozyną. Peptyd według wynalazku ma sekwencję cyklo-[LLDNNKTEKLY] (Sekw. Id. Nr:5) lub cyklo-[LIDNNATEEIL] (Sekw. Id. Nr:6). Z powodu ich ograniczonych struktur te naśladujące prosapozynę cykliczne peptydy są znacząco bardziej oporne na degradację enzymatyczną i są zdolne do przekraczania bariery krew-mózg, lepiej niż odpowiadające im peptydy liniowe. Cykliczne peptydy według wynalazku są równie skuteczne lub bardziej skuteczne w pobudzaniu wzrostu neurytu, niż znany wysoce aktywny liniowy peptydomimetyk prosapozyny („prosaptyd”) o sekwencji TXLIDNNATEEILY, gdzie X oznacza D-alaninę (Sekw. Id. Nr:7) (Przykład 1). Ponadto cykliczne peptydy według wynalazku są bardziej skuteczne niż prosaptyd w zapobieganiu śmierci komórki nerwowej in vitro (Przykład 2). Te cykliczne peptydy utraciły wolne końce aminowe i karboksylowe. Zatem są bardziej oporne in vivo na degradację przez aminopeptydazy i karboksypeptydazy, które degradują peptydy od końca aminowego i karboksylowego. Peptydy będące cyklicznymi pochodnymi sapozyny C zawierające aktywny 11-merowy region i ich neurotropowe analogi mają zastosowanie w pobudzaniu funkcjo4

PL 204 359 B1 nalnego powrotu do normalnego stanu po urazach toksycznych, niedotlenieniu, uszkodzeniach degeneratywnych i wrodzonych obwodowego i ośrodowego układu nerwowego. Dodatkowo, peptydy te pobudzają mielinizację i przeciwdziałają skutkom chorób demielinizacyjnych. Peptydy te stymulują wzrost neuronów, pobudzają mielinizację, pobudzają ochronę neuronów i zapobiegają programowanej śmierci komórki w tkance nerwowej ssaków, korzystnie ludzi. Peptydy według wynalazku mogą również być użyte do leczenia różnych neuropatii, obejmujących, ale nie wyłącznie neuropatię motoryczną, czuciową, obwodową, indukowaną taksolem i wywołaną cukrzycą. W znaczeniu tu stosowanym, neuropatia jest zaburzeniem funkcjonalnym lub zmianą patologiczną w obwodowym układzie nerwowym i klinicznie jest charakteryzowana przez odchylenia od normy neuronów czuciowych i ruchowych. Peptydy są również użyteczne jako środki przeciwbólowe, szczególnie do leczenia bólu neuropatycznego u ssaka, szczególnie u człowieka, który może się rozwinąć po upływie dni lub miesięcy po urazie i zazwyczaj jest długotrwały lub przewlekły.

Zdolność cyklicznego peptydu do pobudzania wzrostu neurytu, zapobiegania śmierci neuronu, pobudzania mielinizacji, hamowania demielinizacji, łagodzenia bólu związanego z neuropatia i leczenia neuropatii receptora może być łatwo określona przez osobę o przeciętnych umiejętnościach z dziedziny, z zastosowaniem procedury opisanej w Przykładach 1-9. Sposoby oznaczenia zdolnoś ci tych peptydów do pobudzania mielinizacji i hamowania demielinizacji są zestawione w podanych poniżej Przykładach 3 i 4.

Typowo, minimalna ilość peptydów według wynalazku wykazująca neurotroficzną aktywność w komórkowej pożywce hodowlanej wynosi zazwyczaj co najmniej 5 ng/ml. Rozważane jest uż ycie in vitro takiej lub większej ilości cyklicznych, syntetycznych peptydów według wynalazku. Typowo, peptydy te będą stosowane w stężeniach w zakresie 0,1 μg/ml do 10 μg/ml. Skuteczna ilość dla każdej konkretnej tkanki może być określona zgodnie z Przykładem 1.

Komórki nerwowe mogą być traktowane in vitro lub ex vivo przez bezpośrednie podanie peptydów według wynalazku do komórek. Można to osiągnąć przykładowo, przez hodowanie komórek w pożywce hodowlanej odpowiedniej dla konkretnego rodzaju komórki a następnie dodanie peptydu do pożywki. Gdy traktowane komórki znajdują się in vivo, typowo u kręgowców, korzystnie u ssaka, kompozycja może być podana jedną z kilku technik. Najkorzystniej kompozycję wstrzykuje się bezpośrednio do krwi lub tkanki, w wystarczającej ilości aby uzyskać pożądane miejscowe stężenie peptydu. W peptydach pozbawionych lizyny i argininy degradacja proteolityczna jest zmniejszona. Mniejsze peptydy (tj. dwudziestomery lub mniejsze) będą najprawdopodobniej przekraczały barierę krew-mózg i wnikały do ośrodkowego układu nerwowego w celu leczenia chorób OUN (patrz Banks i wsp., Peptides 13:1289-1294, 1992).

Do leczenia chorób układu nerwowego można stosować również bezpośrednie wstrzyknięcie doczaszkowe lub wstrzyknięcie do płynu mózgowo-rdzeniowego dostatecznych ilości dających żądane miejscowe stężenie neurotropiny. W obu przypadkach stosowany jest farmaceutycznie dopuszczalny możliwy do wstrzyknięcia nośnik. Takie nośniki obejmują, na przykład, buforowany fosforanem roztwór soli i roztwór Ringera. Alternatywnie kompozycja może być podana do obwodowej tkanki nerwowej przez bezpośrednie miejscowe wstrzyknięcie lub podanie układowe. Rozważane są różne konwencjonalne drogi podawania, w tym dożylne, do płynu mózgowo-rdzeniowego, domięśniowe, śródskórne, podskórne, doczaszkowe, donosowe, nadtwardówkowe, miejscowe i doustne. W przypadku gdy lek jest podawany jako przeciwbólowy korzystne jest podanie przez wstrzyknięcie domięśniowe lub dożylne.

Kompozycje peptydowe według wynalazku mogą być zapakowane i podawane w postaci jednostkowych dawek, takich jak możliwa do wstrzykiwania kompozycja lub preparat miejscowy o wielkości dawek odpowiadających podawanej pacjentowi dawce dziennej lub jako kompozycja o kontrolowanym uwalnianiu. Przykładową dawką jednostkową jest dzienna dawka aktywnego składnika w PBS lub w postaci zliofilizowanej zawarta w fiolce z septum. Odpowiednie dzienne ogólnoukładowe dawkowanie peptydów według wynalazku jest określone na podstawie wagi ciała kręgowca, w przypadku leczenia chorób neuronalnych, demielinacji lub ogólnie jako lek przeciwbólowy lub do leczenia bólu neuropatycznego jest w zakresie od około 0,01 do około 10 000 μg/kg. Korzystniej, dzienne ogólnoukładowe dawki wynoszą między około 0,1 i 1,000 μg/kg. Korzystniej, dzienne ogólnoukładowe dawki wynoszą między około 10 i 100 μg/kg. Tak więc dla typowego 70 kg człowieka dawki mogą wynosić między około 0,7 i 700, 000 μg dziennie; korzystniej pomiędzy około 7 i 70, 000 μg dziennie, a najkorzystniej między około 700 i 7,000 μg/kg. Dzienna dawka materiału podawanego miejscowo będzie o około rząd wielkości mniejsza. Rozważane jest również podawanie doustne.

PL 204 359 B1

W pewnym, korzystnym wykonaniu wynalazku peptydy neurotropowe są podane miejscowo. Mogą one być podawane do komórek nerwowych in vivo, przez ich wszczepienie. Możliwe jest stosowanie kwasu polimlekowego, kwasu poligalaktozowego, regenerowanego kolagenu wielowarstwowych liposomów i wielu innych, konwencjonalnie stosowanych formulacji depot. Możliwe jest też stosowanie pompy infuzyjnej, systemów wychwytujących macierzy w połączeniu z transdermalnymi systemami terapeutycznymi. Peptydy mogą również być przed wszczepieniem enkapsułkowane w glikolu polietylenowym, jak to opisano w patencie U.S. Nr. 5,529,914.

Neurotropowe peptydy według wynalazku mogą również być zamknięte w micellach lub liposomach. Technologia enkapsułkowania w liposomach jest dobrze znana. Liposomy mogą być kierowane do specyficznej tkanki, takiej jak tkanka nerwowa, przez zastosowanie receptorów, ligandów lub przeciwciał zdolnych do wiązania docelowej tkanki. Przygotowanie takich formulacji jest dobrze znane w dziedzinie (Radin i wsp., Meth. Enzymol., 98:613-618, 1983).

Obecnie nie ma komercyjnie dostępnych farmaceutyków zdolnych do podtrzymania pełnej funkcjonalnej regeneracji i odtworzenia integralności strukturalnej układów nerwowych. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku OUN. Regeneracja nerwów obwodowych przy użyciu czynników neurotropowych jest również możliwe. Ponadto, czynniki neurotropowe mogą być przydatne terapeutycznie w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych związanych z degeneracją populacji neuronów specyficznych obszarów mózgu. Główną przyczyną choroby Parkinsona jest degeneracja neuronów dopaminergicznych substancji czarnej. Ponieważ przeciwciała przeciw prosapozynie barwią immunohistochemicznie neurony dopaminergiczne w substancji czarnej, na przekrojach mózgu człowieka, neurotropowe peptydy według wynalazku mogą być terapeutycznie przydatne w leczeniu choroby Parkinsona. Neuropatia siatkówkowa, neurodegeneracyjna choroba oka prowadząca do utraty wzroku w młodości są również możliwe do leczenia z zastosowaniem peptydów według wynalazku.

Od dawna wierzono, że celem dostania się do populacji komórek nerwowych w mózgu, czynniki neurotropowe powinny być podane domózgowo, ponieważ białka te nie przechodzą przez barierę krew-mózg. W patencie U.S. nr 5,571,787 ujawniono, że jodowany neurotropowy 18-merowy fragment pochodzący z sapozyny C przenika przez barierę krew-mózg. Peptydy według wynalazku powinny również przenikać przez tę barierę i dlatego mogą być podawane dożylnie. Inne populacje neuronalne, takie jak neurony motoryczne, mogą być również traktowane przez iniekcję dożylną, chociaż jako droga alternatywna rozważana jest również bezpośrednia iniekcja do płynu mózgowo-rdzeniowego.

Komórki mogą być traktowane w celu ułatwienia tworzenia się mieliny lub zapobiegania demielinizacji w sposób wyżej opisany in vivo, ex vivo lub in vitro. Choroby przebiegające z demielinizacją włókien nerwowych obejmują MS, leukoencefalopatię, postępującą leukoencefalopatię, leukodystrofię metachromatyczną i nadnerczową mogą być spowolnione lub zatrzymane przez podanie peptydów neurotropowych według wynalazku do komórek dotkniętych chorobą. Rozważane jest również odwrócenie chorób z demielinizacją lub innych zniszczeń komórki nerwowej.

Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być stosowane in vitro jako narzędzia badawcze do badania wpływów czynników neurotropowych i preparatów powodujących wytwarzanie mieliny. Jednakże, bardziej praktycznie mają one doraźne zastosowanie jako odczynniki laboratoryjne i składniki podłoży hodowlanych dla komórek, które ułatwiają wzrost i utrzymywanie komórek nerwowych in vitro.

Peptydy według wynalazku są syntetyzowane na złożu stałym przy użyciu ustalonych sposobów i Fmoc z zastosowaniem dobrze znanego w dziedzinie protokołu automatycznej syntezy na fazie stałej (Traeciak i wsp., Tetrahedron Lett. 33: 4557-4561, 1992) na syntetyzerze peptydów Protein Technologies Symphony. Cyklizowane peptydy są odcinane od złoża stałego przy pomocy TFA/woda/triozopropylosilan (95:2,5:2,5). Peptydy oczyszczono stosując HPLC w odwróconej fazie na kolumnie C-18 eluując 0,3% kwasem trichlorooctowym (TFA) w acetonitrylu. Spektralną analizę masową polipeptydów przedstawiono na Sekw. Id. Nr: 5 (peptyd A) i 6 (peptyd B) potwierdzając, że zsyntetyzowano cykliczne peptydy [Sekw. Id. Nr: 5: MH⁺ 1333 (oczekiwana), 1333 (obserwowana); Sekw. Id. Nr:6 MH^- 1127 (oczekiwana), 1127 (obserwowana)].

Poniższe przykłady są ilustracjami i nie są przeznaczone aby ograniczały zakres obecnego wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Pobudzanie in vitro wzrostu neurytu.

Komórki nerwiaka niedojrzałego NS20Y hodowano w DMEM zawierającej 10% cielęcą surowicę płodową (FCS). Komórki usuwano trypsyną i umieszczano na szklanych szkiełkach przykrywkowych w 30 mm płytkach Petriego. Po 20-24 godzinach pożywkę zastępowano 2 ml DMEM zawierają6

PL 204 359 B1 cej 0,5% FCS plus różne stężenia peptydu A, peptydu B lub TX14(A). Komórki hodowano przez dodatkowe 24 godziny, płukano PBS i utrwalano roztworem Bouin'a (nasycony wodą kwas pikrynowy/formalina/kwas octowy 15:5:1) przez 30 minut. Utrwalacz usunięto PBS, a wzrost neuronów oceniono pod mikroskopem kontrastowo-fazowym. Komórki wykazujące jeden lub więcej wyraźnie określonych neurytów równych lub dłuższych niż średnica komórki liczono jako dodatnie. Co najmniej 200 komórek oceniono w różnych częściach każdej szalki w celu określenia procentu komórek posiadających neuryty, a oznaczenia wykonano w dwóch powtórzeniach.

Wszystkie trzy peptydy indukowały wzrost neurytów w komórkach NS20Y. T1/2 (ED50), które jest stężeniem peptydu dającym 50% przyrost wzrostu neurytów wyniósł 1,0 ng/ml dla TX14(A) i dla peptydu B. T1/2 wynosił dla peptydu A 0,6 ng/ml. Tak więc peptyd B był tak samo skuteczny jak TX14(A) podczas gdy peptyd A był bardziej skuteczny niż TX14(A). To wykazuje, że cykliczne peptydy z obecnego wynalazku mają doskonałą aktywność w porównaniu z ustalonym standardem „prosaptydu”.

P r z y k ł a d 2

Zapobieganie śmierci komórki in vitro

Komórki NS20Y umieszczono jak to opisano w Przykładzie 1 i hodowano na szklanych szkiełkach przykrywkowych w 0,5% płodowej surowicy bydlęcej, przez dwa dni w obecności lub przy braku TX14(A), peptydu A lub peptydu B. Pożywkę usunięto i do każdej studzienki dodano 0,2% błękit trypanu w PBS. Wybarwione na niebiesko martwe komórki liczono jako procent wszystkich komórek przy pomocy mikroskopu odwróconego, licząc 400 komórek na 4 obszarach każdej studzienki. Średni błąd powtórzeń wynosił 5%. TX14(A), peptyd A i peptyd B zmniejszały liczbę komórek, które barwiły się na niebiesko błękitem trypanu (martwe. T1/2 (ED50) dla ochrony komórki nerwowej przed śmiercią wynosił dla TX14(A) 1,0 ng/ml. Peptydy A i B silniej działały przy wartościach T1/2 odpowiednio 0,6 ng/ml i 0,8 ng/ml. To wskazuje, że cykliczne peptydy posiadają niezwykłą aktywność chronienia komórek nerwowych przed programowaną śmiercią komórki w porównaniu ze standardowymi, liniowymi „prosaptydami”.

P r z y k ł a d 3

Oznaczenie mielinizacji ex vivo

Móżdżkowe eksplantaty noworodków myszy przygotowano zgodnie z Satomi (Zool. Sci., 9: 127137, 1992). Wzrost neurytów i mielinizację obserwowano przez 22 dni w hodowli, podczas tego okresu gdy u noworodka myszy móżdżek normalnie ulega różnicowaniu neuronalnemu i rozpoczyna się mielinizacja. Peptydy będące cyklicznymi pochodnymi sapozyny C mające 11 aminokwasów o sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr:5 lub 6 (10 μg/ml) dodano drugiego dnia po przygotowaniu eksplantatów (trzy eksplantaty kontrolne i trzy traktowane), i przyrost neurytów i mielinizację oceniano przez obserwację mikroskopową w jasnym polu z kamerą video. Ósmego dnia hodowle zawierające peptydy są cieńsze i bardziej rozprzestrzenione niż hodowle kontrolne. Dnia 15 hodowle poddane działaniu peptydu zawierały liczne komórki z długimi wypustkami na obrzeżach które były mniej wystające w nietraktowanych hodowlach kontrolnych. Hodowle poddane działaniu peptydu po 22 dniach zawierają znacząco więcej mielinowych aksonów w podkorowej substancji białej w porównaniu do eksplantantów kontrolnych. Tak więc peptydy według wynalazku ex vivo indukują zwiększoną mielinizację w różnicującym się móżdżku.

P r z y k ł a d 4

Zapobieganie demielinizacji

Zapobieganie śmierci komórek Schwanna jest skorelowane z zapobieganiem demielinizacji komórek Schwanna zawierających rozległą otoczkę mielinową. Dodanie cyklicznego peptydu będącego pochodną sapozyny C o 11 aminokwasach i sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do komórek Schwanna w hodowli zmniejsza obumieranie komórek Schwana w sposób zależny od dawki i pobudza włączanie sulfatydów, lipidów specyficznych dla mieliny, do komórki Schwana. To wskazuje, że cykliczne peptydy według wynalazku mogą zapobiegać demielinizacji z powodu śmierci komórki Schwana.

P r z y k ł a d 5

Zastosowanie peptydów w leczeniu urazowych uszkodzeń OUN spowodowanych niedokrwieniem

Ludzie ze zmianami urazowymi rdzenia kręgowego otrzymali domózgowordzeniową lub bezpośrednią iniekcję z około 100 μg/ml cyklicznego peptydu będącego pochodną sapozyny C mającą 11 aminokwasów o sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr:5 lub 6 w jałowym roztworze solanki lub w postaci depot dla umożliwienia wolnego, ciągłego uwalniania peptydu w miejscu zmiany. Poprawę ocenia się przez nabywanie funkcji nerwu motorycznego (to jest zwiększonej ruchliwości kończyny). Leczenia kontynuowano do wystąpienia dalszej poprawy.

PL 204 359 B1

P r z y k ł a d 6.

Zastosowanie peptydów w leczeniu zaburzeń z demielinizacją

Pacjentom, u których rozpoznano wczesne stadium MS podano cykliczny peptyd będący pochodną sapozyny C mającą 11 aminokwasów o sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr:5 lub 6, przez bezpośrednią dożylną iniekcję do płynu mózgowo-rdzeniowego stosując ten sam zakres dawki jak w Przykładzie 3. Dawki są powtarzane codziennie co 2-5 dni lub co tydzień i obserwuje się poprawę siły mięśni, koordynacji mięśni szkieletowych i mielinizacji (jak określono przez MRI).

P r z y k ł a d 7

Zmniejszanie bólu neuropatycznego w szczurzym modelu Chung

W przykładzie tym opisano działania dużych dawek szybko działającej, dooponowej iniekcji cyklicznego peptydu będącego pochodną sapozyny C o 11 aminokwasach i sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr:5 lub 6 w doświadczalnym modelu Chung obwodowego bólu neuropatycznego. Każdy peptyd jest zsyntetyzowany chemicznie, oczyszczony, rozpuszczony w sterylnym PBS i zbuforowany do obojętnego pH. Wcześniej opisaną przez Kim i wsp., (Pain, 50:355, 1992) procedurę chirurgiczną przeprowadza się na samcach szczurów dla wywołania stanu allodynicznego. W dwa tygodnie po zabiegu chirurgicznym wprowadzony jest cewnik dokręgowy. Pięć dni później, podaje się peptydy w ilości 0,007, 0,07 i 0,7 μg/szczura. Następnie określa się przy pomocy skalibrowanych włosów von Frey'a wartości graniczne ciśnienia. Im dłuższy jest czas wycofywania przez zwierzę łapy, w odpowiedzi na wywierany nacisk, tym słabszy jest ból neuropatyczny. Peptydy znacząco zwiększają wartości graniczne ciśnienia wskazując na znaczące złagodzenie neuropatycznego bólu.

P r z y k ł a d 8

Leczenie neuropatii czuciowej

Myszom podaje się taksol dla zaindukowania neuropatii czuciowej. Poddanym działaniu taksolu myszom podaje się 50 μg/kg, 100 μg/kg lub 250 μg/kg cyklicznego peptydu będącego pochodną sapozyny C o 11 aminokwasach i sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr: 5 lub 6. Utratę odczuwania ciepła mierzy się stosując aparat Hargreaves'a do badania wrażliwości jako wskaźnika neuropatii czuciowej. Każda z trzech dawek peptydu jest skuteczna w zapobieganiu lub zahamowaniu odczucia ciepła u myszy traktowanych taksolem. A zatem cykliczne peptydy będące pochodną sapozyny C według wynalazku, skutecznie hamują neuropatię czuciową.

P r z y k ł a d 9

Łagodzenie bólu neuropatycznego u szczurów z cukrzycą

W przykładzie tym opisano działania kg cyklicznego peptydu będącego pochodną spozyny C mającego 11 aminokwasów o sekwencji pokazanej na Sekw. Id. Nr: 5 lub 6 po podaniu dootrzewnowym w szczurzym modelu neuropatii cukrzycowej.

Szczury obarczono cukrzycą przez pojedynczą, dootrzewnową iniekcję streptozotocyny (50 mg/kg wagi ciała, świeżo rozpuszczonej w 0,9% jałowej solance) w celu usunięcia komórek-β trzustki i indukcję niedoboru insuliny jak opisano przez Calcutt i wsp., (Pain, 68: 293-299, 1996). Dwa dni później przez pomiar poziomu glukozy we krwi potwierdzono cukrzycę u szczurów, którym wstrzyknięto streptozotocynę. Zwierzęta, którym wstrzyknięto streptozotocynę ze stężeniem glukozy we krwi poniżej 15 mmol/l wyłączano z dalszych badań, zgodnie z powszechnie akceptowaną definicją hiperglikemii w badaniach na obarczonych cukrzycą szczurach.

Zarówno szczury obarczone cukrzycą jak i szczury kontrolne badano przez 8 tygodni przez analizowanie odpowiedzi behawioralnej na szkodliwą chemicznie formalinę jako wskaźnik allodyni (Calcutt i wsp., powyżej, 1996). Pokrótce, szczury otrzymały śródskórnie iniekcję ze świeżo przygotowanej formaliny (50 μl 0,5% roztworu w jałowej solance) w grzbietową powierzchnię prawej tylnej łapy. Takie stężenie formaliny wywołuje submaksymalne odpowiedzi behawioralne u szczurów kontrolnych i pozwala wykryć nadwrażliwość u szczurów z cukrzycą podczas faz Q i 2 (Calcutt i wsp., Eur. J. Pharmacol., 285:189-197, 1995). Zwierzęta przeniesiono do klatki obserwacyjnej skonstruowanej tak, aby umożliwiała ciągłą obserwację kończyn. Liczba wzdrygnięć w ciągu minuty z pięciominutowymi przerwami przez następne 60 minut jest liczona przez obserwatora nieświadomego o statusie każdej z grup zwierząt. Faza 1 jest określona jako początkowy pomiar wzdrygnięć (1-2 i 5-6 minut po iniekcji); faza Q (wyciszenia) jako pomiary wykonane w 10-11, 15-16 i 20-21 minutach; i Faza 2 jako wszystkie następne pomiary po iniekcji, jak to wcześniej określono dla badań na szczurach z cukrzycą (patrz przykładowo, Malmberg i wsp., Neurosci. Lett., 161:45-48, 1993). Porównanie aktywności podczas każdej z tych faz dokonano przez zsumowanie wzdrygnięć w punktach pomiarowych w ciągu fazy.

PL 204 359 B1

Szczury z cukrzycą podzielono na dwie grupy po 4 zwierzęta w każdej, zwierzętom podano solankę i cykliczny peptyd będący pochodną sapozyny C mający 11 aminokwasów i o odpowiedniej sekwencji przedstawionej na Sekw. Id. Nr: 5 lub 6. Dwie godziny przed podaniem 0,5% formaliny szczury z cukrzycą potraktowano solanką lub 200 μg/kg peptydu, stosując podanie dootrzewnowe.

Podanie peptydu całkowicie zapobiegło nienormalnej odpowiedzi wzdrygnięciem się w Fazie 1 i poprawiło odpowiedź o 70% w Fazie 2. Co za tym idzie dootrzewnowe podanie peptydu zmniejszało ból wynikający ze wstrzyknięcia formaliny i poprawiało funkcje neuronu motorycznego w szczurzym modelu bólowej neuropatii cukrzycowej.

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(1) ZGŁASZAJĄCY: MYELOS CORPORATION (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: CYKLICZNE PEPTYDY ANELGEZOWE I NEUROTROPOWE .

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 6 (iv) ADRES DLA KORESPONDENCJI (A) ADRESAT: Knobe, Martens, Olson & Bear (B) ULICA: 620 Newport Center Drive, 16^Λ Floor (C) MIASTO: Newport Beach (D) STAN:CA (E) PAŃSTWO: U.S.A.

(F) KOD: 92660 (v) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA (A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Zgodny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: Windows (D) PROGRAM: FastSEQ dla Windows wersja 2,Ob (vi) DATA OBECNEGO ZGŁOSZENIA (A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA WNIESIENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DATA WCZEŚNIEJSZEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 60/098,359 (B) DATA WNIESIENIA: 28 sierpień 1998 (viii) INFORMACJE O RZECZNIKU/AGENCIE (A) NAZWISKO: Bartfeld, Neil S (B) NUMER REJESTRACYJNY: 39,901 (C) REFERENCJE/NUMER ZAKOTWICZENIA: MYELOS.014PR (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE (A) TELEFON: 619-235-8550 (B) TELEFAX: 619-235-0176 (C) TELEX:

(2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1 cys Glu Phe Leu Val Lys Glu val Thr Lys Leu ile Asp Asn Asn Lys 1 5 10 15

Thr Glu Lys Glu Lys 20 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 204 359 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa

RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2

Lys Glu val Thr Lys Leu ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu 5 10 15

Leu (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3

Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Glu ile Leu ⁵ 10 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: cykliczna (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (ix) WŁAŚCIWOŚCI (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) LOKALIZACJA: 1...2 (C) INNE INFORMACJE: A, L, I, V, Y, W, F, LUB M (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) LOKALIZACJA: 3...3 (C) INNE INFORMACJE: D, E, K LUB R (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) LOKALIZACJA: 6...6 (C) INNE INFORMACJE: JAKIKOLWIEK AMINOKWAS (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) LOKALIZACJA: 8...8 (C) INNE INFORMACJE: D LUB E (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) LOKALIZACJA: 9...9 (C) INNE INFORMACJE: JAKIKOLWIEK AMINOKWAS (A) NAZWA/KLUCZ: inna (B) LOKALIZACJA: 10...11

PL 204 359 B1 (C) INNE INFORMACJE: A, L, I, V, Y, W, F, LUB M (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4

Xaa xaa Xaa Asn Asn xaa Thr xaa xaa xaa xaa ^{1 5} 10 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI SEQ ID NO:5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: cykliczna (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5

Leu Leu Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys Leu Tyr ⁵ 10 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: cykliczna (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6

Leu Ile Asp Asn Asn Ala Thr Glu Glu ile Leu 1 5 io

Claims

1. Cykliczny peptyd o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6.

2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ż e zawiera peptyd okreś lony w zastrz. 1.

3. Kompozycja farmaceutyczna wedł ug zastrz. 2, znamienna tym, ż e jest w fiolce z septum.

4. Kompozycja farmaceutyczna wed ług zastrz. 2, znamienna tym, że peptyd określony w zastrz. 1 jest sformułowany z materiałem warunkującym kontrolowane uwalnianie.

5. Kompozycja farmaceutyczna wedł ug zastrz. 2, znamienna tym, ż e jest w postaci zliofilizowanej.

6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, ż e jest w postaci liposomalnej.

7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, jest w postaci przydatnej do podania miejscowego.

8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że jest w postaci jednostkowych dawek.

9. Cykliczny peptyd o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do zastosowania w indukcji mielinizacji lub w hamowaniu demielinizacji u ssaka.

10. Cykliczny peptyd o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do zastosowania w hamowaniu degeneracji neuronalnej lub w promowaniu wzrostu neurytu.

PL 204 359 B1

11. Cykliczny peptyd o sekwencji przedstawionej w Sekw. Id. Nr 5 lub 6 do zastosowania w leczeniu bólu związanego z neuropatią.

12. Zastosowanie cyklicznego peptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia stwardnienia rozsianego, ostrego rozsianego zapalenia mózgu i rdzenia, postępującego wieloogniskowego zapalenia mózgu i rdzenia, dystrofii metachromatycznej lub dystrofii nadnerczowej.

13. Zastosowanie cyklicznego peptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia choroby Parkinsona.

14. Zastosowanie cyklicznego peptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia neuropatii siatkówkowej.

15. Zastosowanie cyklicznego peptydu określonego w zastrz.

nia neuropatii ruchowej, neuropatii czuciowej, neuropatii obwodowej, lem, neuropatii cukrzycowej.

16. Zastosowanie cyklicznego peptydu określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia bólu neuropatycznego u ssaków po urazie.

1 do wytwarzania leku do leczeneuropatii indukowanej takso-