PL204125B1

PL204125B1 - Sposób zwiększania ekspresji genu, zastosowanie acetylo-L-karnityny do zwiększania ekspresji rekombinowanych białek i zastosowanie acetylo-L-karnityny do wytwarzania leku

Info

Publication number: PL204125B1
Application number: PL365011A
Authority: PL
Inventors: Claudio Pisano
Original assignee: Sigma Tau Ind Farmaceuti
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2009-12-31
Also published as: CZ20022757A3; US7560439B2; CY1106872T1; EP1257658A1; AU2001237712A1; ITRM20000077A1; JP2003522544A; SK287759B6; IT1316990B1; ES2288164T3; WO2001061025A1; ITRM20000077A0; DE60129206T2; HUP0204460A2; SK11872002A3; ATE366320T1; US20050124570A1; CZ303403B6; JP4726378B2; DE60129206D1

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób zwiększania ekspresji genu, zastosowanie acetylo-L-karnityny do zwiększania ekspresji rekombinowanych białek i zastosowanie acetylo-L-karnityny do wytwarzania leku.

Znane jest wytwarzanie białek za pomocą techniki inżynierii genetycznej, czyli przy użyciu klonów komórek, do których geny wprowadza się przez transfekcję. Jednym z problemów napotykanych przy stosowaniu transfekowanych klonów jest to, że po pewnym okresie czasu, geny sztucznie wprowadzone w celu wytwarzania żądanego białka, cichną. Problem wyciszania genów jest jeszcze wyraźniej widoczny w terapii genowej. W tym przypadku, gen, który został wprowadzony pacjentowi, zaprzestaje wytwarzania terapeutycznie koniecznego białka.

Obecnie stwierdzono, że C1-C6 alkanoilo-L-karnityny, a szczególnie acetylo-L-karnityna, zwiększa ekspresję transfekowanych genów.

Dla celów tego wynalazku „karnityna” oznacza C1-C6 alkanoilo-L-karnitynę lub L-karnitynę. W niniejszym opisie, przykładowo, jako zalecaną postać realizacji stosuje się acetylo-L-karnitynę.

Traktowanie klonów komórkowych acetylo-L-karnityną przy użyciu znanych technik, np. liposomów, istotnie zwiększa ekspresję białek kodowanych przez transfekowane geny.

Celem niniejszego wynalazku jest zatem opracowanie sposobu zwiększania ekspresji genowej genów transfekowanych.

W odniesieniu do moż liwoś ci zastosowania przemysł owego, niniejszy wynalazek odnosi się do stosowania acetylo-L-karnityny w celu zwiększania ekspresji rekombinowanych białek razem z metodą wytwarzania rekombinowanych białek, których ulepszanie polega na stosowaniu acetylo-L-karnityny w celu zwię kszenia ekspresji wymienionych biał ek.

W sektorze terapeutycznym i ogólnie dziedzinie inż ynierii genetycznej, celem wynalazku jest zastosowanie acetylo-L-karnityny do wytwarzania produktu użytecznego w terapii genowej do poprawiania ekspresji białek, jak również zastosowanie acetylo-L-karnityny do wytwarzania produktu użytecznego przy utrzymywaniu transfekowanych genów w klonach.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób zwiększania ekspresji genu w transfekowanych tymi genami komórkach, polegający na tym, że obejmuje podawanie acetylo-L-karnityny do pożywki dla komórek.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie acetylo-L-karnityny w pożywce hodowlanej komórek transfekowanych genem do zwiększania ekspresji rekombinowanych białek kodowanych przez ten gen.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie acetylo-L-karnityny do wytwarzania leku do podawania w połączeniu z terapią genową do poprawiania ekspresji białek kodowanych przez ten gen.

Niniejszy wynalazek został zilustrowany w części doświadczalnej przedstawionej poniżej.

Materiały i metody

Doświadczenia in vitro

Hodowle komórkowe. Wykorzystano linię komórkową raka szyjki macicy HeLa, ATCC. Komórki hodowano w pożywce RPMI 164 Medium (eurobio), zawierającej antybiotyki i 10% cielęcą surowicę płodową.

Traktowanie acetylo-L-karnityną (ALC). 4x10⁶ i 5x10⁶ komórek hodowanych w pożywce zawierające ALC o końcowym stężeniu wynoszącym odpowiednio 5 mM i 10 mM, posiano w dwóch kolbach o objętości 125 cm³, podczas gdy 2x10⁶ komórek nie traktowanych ALC, powleczono w kolbie o objętości 75 cm³. Traktowanie powtarzano po 48 godzinach (co pokrywało się z posiewaniem komórek do transfekcji) i po 72 godzinach (na końcu transfekcji) i powtarzano także po 120 godzinach, tylko w przypadku próbek transfekowanych do lizy po 72 godzinach.

Krótkotrwała transfekcja plazmidu pRL-CMV. Komórki posiewano do transfekcji, 24 godziny przedtem, w 24-studzienkowych płytkach (Corning), w ilościach odpowiadających 10⁵ komórek na studzienkę. Transfekcję przeprowadzano trzykrotnie dla każdej próbki, przy użyciu liposomu DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) i plazmidu pRL-MCV (Promega nr katalogowy E2261).

W skrócie, użyto 1,5 μg/studzienkę DNA i 9,2 μΜ/studzienkę liposomu na próbkę, biorąc końcową objętość wynoszącą 1050 μl/próbkę; mieszaninę transfekcyjną (25 μl/próbkę) pozostawiano w temperaturze otoczenia na 30 minut, a potem dodawano HBS 2x (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) w ilościach wynoszących 25 μl/próbkę, i 50 μl/próbkę tak otrzymanego roztworu dodano do komórek na 5 godzin. Po przeprowadzeniu trzech przemyć PBS (bufor fosforanowy pH 7,4) bez wapnia i magnezu,

PL 204 125 B1 komórki hodowano w pożywce wzrostowej, zawierającej ALC o stężeniu wskazanym w traktowaniu, do czasu lizy komórkowej, do testu lucyferazy. Jako kontrolę, dodawano sam DNA w roztworze 1xHBS.

Test lucyferazy na transfekowanych próbkach in vitro

Komórki przemyto PBS (bufor fosforanowy, pH 7,4) bez wapnia i magnezu i poddano lizie, dodając 200 μΐ buforu do lizy zawartego w zestawie GeneLux L002-100 (Wallac), stosowanego do testu lucyferazy. Po 20 minutach zebrano całkowite białko i 10 μl każdej próbki testowano z lucyferazą, postępując zgodnie z procedurą zaznaczoną w zestawie; test prowadzono w 96-studzienkowych płytkach przy użyciu luminometru Victor² (Wallac). Otrzymane odczyty luminescencji, wyrażone we względnych jednostkach świetlnych (RLU), znormalizowano w stosunku do mg całkowitego białka, obliczonego z użyciem metody Bradford.

Doświadczenia in vivo

Traktowanie acetylo-L-karnityną (ALC). Zwierzętami wykorzystanymi w doświadczeniach in vivo były myszy Balb/c (Harlan), 5 zwierząt na grupę. Grupy podzielono na zwierzęta nietraktowane (3 grupy) i zwierzęta traktowane (6 grup), traktowane doustnymi dawkami 100 mg/kg ALC). Traktowanie zapoczątkowano cztery dni przed transfekcją, dziennymi dawkami i powtarzano codziennie do czasu uśmiercenia.

Uśmiercanie zwierząt

Zwierzęta uśmiercano w 24, 48 i 72 godziny po transfekcji.

Płuca, pobrane od każdego zwierzęcia, przemyto w roztworze solanki, zważono, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji białka.

Transfekcja plazmidu pRL-CMV. Zwierzęta tworzące grupy nietraktowane i trzy grupy zwierząt traktowanych ALC, otrzymały dożylne wstrzyknięcia 25 μg/mysz plazmidu pRL-CMV, przy użyciu liposomu o stężeniu 12 μm/μg wstrzykiwanego DNA. Liposom i DNA mieszano w roztworze PBS i utrzymywano w lodzie przez 1 godzinę przed wstrzyknięciem. Drugie trzy grupy zwierząt traktowanych otrzymały wstrzyknięcia 25 μg/mysz plazmidu pRL-CMV w roztworze zawierającym sam PBS. Końcowa objętość wstrzykiwanego roztworu dla każdego zwierzęcia, wynosiła 208 pl.

Ekstrakcja białek z płuc i test lucyferazy

Wyniki

Ekspresja lucyferazy w transfekcji in vitro

Lizaty po 24 godzinach. Ekspresja lucyferazy otrzymana w próbkach traktowanych ALC była wyższa niż w próbkach komórek nietraktowanych. Średnia wartość RLU na mg całkowitego białka, obliczona na podstawie potrójnych próbek, wykazała około 1,6-krotne zwiększenie w próbkach traktowanych 5 mM ALC, w porównaniu z próbkami nietraktowanymi. Poza tym zaobserwowano, że w próbkach traktowanych 10 mM ALC nie było dodatkowego zwiększenia. Otrzymane wyniki pokazały brak związku zależności od dawki między ALC i ekspresją lucyferazy, co najmniej przy stężeniach stosowanych w doświadczeniu, podczas gdy wykazują wpływ pozytywny na ekspresję transfekowanej lucyferazy. W próbkach transfekowanych samym DNA, które stanowiły naszą grupę kontrolną, nie obserwowano aktywności lucyferazy.

Lizaty po 48 godzinach. Efekt obserwowany w próbkach poddanych lizie po 24 godzinach, nie był utrzymany 48 godzin po transfekcji, gdzie jednak ekspresja lucyferazy zanikła całkowicie we wszystkich transfekowanych próbkach. RLU otrzymane na mg białka wykazywały brak istotnych różnic między próbkami traktowanymi i nietraktowanymi.

Lizaty po 72 godzinach. Próbki nie wykazywały ekspresji lucyferazy, ponieważ nie można określić istotnych wartości RLU/mg.

Ekspresja lucyferazy in vivo.

Doświadczenie 2 HeLa 100 000/12-studzienkowe płytki 1,5 pg/studzienkę

	Średnie RLU/mg i s.d.
1	2
Dotap+LUC	491,090 142,451
Dotap+ETS	20,802 2,283
5 mM ALC+LUC	18,060 3,241

PL 204 125 B1 cd. tabeli

1	2
5 mM ALC+ETS	17,025 3,481
5 mM ALC+dota+LUC	779,340 159,453
5 mM ALC+dotap+ETS	22,411 2,447
10 mM ALC+LUC	20,481 7,044
10 mM ALC+ETS	17,724 1,020
10 mM ALC+dotap+LUC	750,034 94,431
10 mM ALC+dotap+ETS	20,520 2,180

Aby zweryfikować, czy dodatni wpływ ALC na aktywność lucyferazy był związany z aktywacją mechanizmów transkrypcyjnych, czy ze zwiększeniem przenikalności komórkowej, zdecydowano się na ocenę ilościową całkowitej ilości transfekowanego wewnątrzkomórkowego DNA plazmidowego, przez analizę Slot blot.

Slot blot

Hodowla komórkowa. Linię komórkową raka szyjki macicy HeLa (ATCC) utrzymywano w pożywce RPMI (Europio) uzupełnionej 10% surowicą płodu cielęcego, 1% P/S w wilgotnej atmosferze z 5% CO2.

Traktowanie ALC. 5x10⁶ komórek powleczono w kolbach o objętości 125 cm³ i utrzymywano w RPMI uzupełnionej jak opisano powyż ej, zawierającej ALC o dwóch stężeniach (5 mM i 10 mM) 4 dni przed transfekcją . Traktowanie powtórzono pod koniec transfekcji. Komórki nietraktowane hodowano w tych samych warunkach i wykorzystano jako kontrolę.

Krótkotrwała ekspresja pRL-CMV. 10⁵ komórek/studzienkę powleczono 1 dzień przed transfekcją, w 12-studzienkowej płytce (Corning). Do transfekcji wykorzystano liposom DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) i plazmid pRL-CMV (Promega nr katalogowy E2261), 6 studzienek/próbkę. W skrócie, 1,5 μg/studzienkę DNA i wodny roztwór liposomu w ilości 9,2 μΜ wymieszano w temperaturze pokojowej (25 μl/próbkę) tworząc kompleks DNA-liposom. Po inkubacji przez 30 minut, dodano taką samą objętość/studzienkę HBS 2x (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) i mieszaninę transfekcyjną podzielono na równe objętości 50 μl/studzienkę w uzupełnionej pożywce. Komórki inkubowano z kompleksem przez 5 godzin i kompleks usunięto przez przemycie PBS (roztwór soli buforowanej fosforanem, pH 7,4, pozbawiony Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺). Komórki utrzymywano w uzupełnionej pożywce, zawierającej ALC, przez 24 godziny, a następnie użyto do analizy. Sam DNA w HBS 1x (pRL-CMV transfekowano jako kontrolę).

Ekstrakcja DNA. Ekstrahowano całkowity komórkowy DNA przez lizę alkaliczną z transfekowanych komórek, zgodnie z metodą opisaną przez Maniatisa. Po przemyciu PBS, komórki zebrano z użyciem PBS (1 ml/studzienkę i wirowano przy 1500xg przez 10 minut w temperaturze pokojowej).

Zgodnie z protokołem, każdą grudkę, umieszczoną na lodzie, poddano lizie przy użyciu: 100 μl roztworu I [50 mM glukoza, 25 mM Tris-HCl (pH=8), 10 mM EDTA (pH=8)], 200 μl roztworu II [0,2 N NaOH, 1% SDS], 150 μl roztworu III (5 M octan potasu, lodowaty kwas octowy). Po wirowaniu przy 12000xg przez 5 minut w temperaturze 4°C, zebrano supernatant i DNA strącono za pomocą EtOH. Grudkę zawieszono ponownie w TE 1x (50 μl/próbkę).

Znakowanie sondy. Sondę, gen lucyferazy, otrzymano przez trawienie pRL-CMV Hindlll przez 2 godziny w temperaturze 37°C, a następnie BamHI w tych samych warunkach. Po trawieniu, mieszaninę poddano elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym w buforze TEA 1x (40 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1,1 mM EDTA i 37 mM octan sodu) i fragment odpowiadający genowi lucyferazy wyizolowano przez wycięcie. Znakowanie genu lucyferazy przeprowadzono z użyciem systemu do znakowania Rediprime

PL 204 125 B1

II DNA (Amersham Pharmacia biotech, nr katalogowy RPN 1633) i stabilizowanego Redivue [a^-32P] dCTP (Amersham Pharmacia biotech nr katalogowy AA 0005) zgodnie z nabytym protokołem.

Slot blot. Próbki DNA zaabsorbowano na dodatnio naładowanej błonie nylonowej (Boehringer, nr katalogowy 1209299) przy użyciu urządzenie Biorad Slot Blot. DNA połączono z filtrem przez U.V. Stratalinker-2400 (Stratagene). Po wstępnej inkubacji filtra z użyciem QuikHyb Hybridization Solution (Stratagene, nr katalogowy 201220) przez 20 minut w temperaturze 68°C, dodano 2,5x10⁶ cpm/ml znakowanej sondy, po gotowaniu z DNA spermy łososia, przez 2 minuty. Hybrydyzację przeprowadzono w temperaturze 68°C przez 1 godzinę, a następnie filtr przemyto dwukrotnie buforem I (SSC 0,2x, SDS 0,1%) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a potem buforem II (SSC 0,1x, SDS 0,1%) przez 30 minut w temperaturze 60°C. Filtr poddano ekspozycji wobec kasety „Phosphor Imager”, a następnie analizowano przez densytometrię przy użyciu programu komputerowego IPlab Gel.

Densytometria Slot blot (patrz tablica) ujawniła, że nie było różnic między wartościami otrzymanymi od komórek transfekowanych w obecności ALC lub przy braku. Niewielki spadek zaobserwowano przy 10 mM ALC. Wyniki te pokazały, że obecność ALC nie zmieniała wychwytu komórkowego kompleksu DNA/liposom sugerując, że ALC mogła wpływać na ekspresję lucyferazy na poziomie transkrypcyjnym.

Wartości densytometryczne (jednostki względne)

	Slot	Objętość	Średnia
Sam DNA	1	81620
	2	93505
	3	85305	7261,2
	4	64280
	5	56880
	6	54119

Kompleks Dotap/DNA	7	239399
	8	250530
	9	251720	252088,5
	10	258812
	11	258100
	12	253970

Sam DNA+ALC 5 mM	13	59846
	14	58324
	15	61431	61441,5
	16	70373
	17	63045
	18	55630

Kompleks Dotap/DNA+ALC 5 mM	19	222013
	20	255756
	21	253422	240634,5
	22	234654
	23	239053
	24	238909

PL 204 125 B1

Sam DNA+ALC 10 mM	25	26326
	26	71831
	27	54172	52595,2
	28	70498
	29	48707
	30	44037

Kompleks Dotap/DNA+ALC 10 mM	31	17 3 8 7 0
	32	225644
	33	116848	165345
	34	114911
	35	157762
	36	203035

Tablica: ukazano pojedyncze wartości (jednostki względne) otrzymane w analizie densytometrycznej, przy użyciu programu Iplab Gel, sondowanego filtru. Jak opisano powyżej, DNA pRL-CMV transfekowano przy użyciu Dotap (kompleks Dotap/DNA) i transfekcję przeprowadzono zarówno w komórkach nietraktowanych (slot 7-12) jak i komórkach traktowanych 5 mM (slot 19-24) i 10 mM (slot 31-36) ALC. Jako kontroli użyto pRL-CMV bez liposomu (sam DNA) w tych samych warunkach doświadczalnych: nietraktowane komórki (slot 1-6), traktowane komórki 5 mM (slot 13018) i 10 mM (slot 25-30) ALC.

Wniosek. Porównanie wartości densytometrycznych otrzymanych dla transfekcji przeprowadzonych w obecności ALC lub przy braku, ujawniają, że nie było związku między przepuszczalnością komórkową wobec kompleksu DNA/Dotap i dodatnim wpływem ALC na aktywność lucyferazy.

Claims

1. Sposób zwiększania ekspresji genu w transfekowanych tymi genami komórkach, znamienny tym, że obejmuje podawanie acetylo-L-karnityny do pożywki dla komórek.

2. Zastosowanie acetylo-L-karnityny w pożywce hodowlanej komórek transfekowanych genem do zwiększania ekspresji rekombinowanych białek kodowanych przez ten gen.

3. Zastosowanie acetylo-L-karnityny do wytwarzania leku do podawania w połączeniu z terapią genową do poprawiania ekspresji białek kodowanych przez ten gen.