CZ303403B6

CZ303403B6 - Použití acetyl-L-karnitinu k príprave léciva pro zvýšení exprese transfektovaných genu

Info

Publication number: CZ303403B6
Application number: CZ20022757A
Authority: CZ
Inventors: Pisano@Claudio
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S. P. A.
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2012-08-29
Also published as: PL204125B1; DK1257658T3; CY1106872T1; ITRM20000077A1; CA2400110A1; EP1257658A1; SK11872002A3; MXPA02007959A; US20050124570A1; ATE366320T1; WO2001061025A1; DE60129206D1; EP1257658B1; HUP0204460A2; SK287759B6; JP2003522544A; DE60129206T2; IT1316990B1; US7560439B2; US20030022859A1

Abstract

Použití acetyl-L-karnitinu (ALC) k príprave léciva urceného pro použití v kombinaci s genovou terapií. Soucasné podávání acetyl-L-karnitinu vede ke zvýšení exprese transfektovaných genu.

Description

Použití acetyl-L-karnitími k přípravě léčiva pro zvýšení exprese transfektovaných genů

Oblast techniky

Zde popisovaný vynález se týká použití C| - C₆ alkanoyl-L-kamitinů, zvláště acetyl-L-kamitinu k přípravě rekombinantních proteinů.

Dosavadní stav techniky

Výroba proteinů technologií genetického inženýrství, tj. využíváním buněčných klonů, ve kterých jsou vloženy geny transfekci, je známa. Jeden z problémů, se kterým je nutno počítat pri použití transfektovaných klonů tkví v tom, že po určité době se geny uměle do buněk vkládané za účelem tvorby požadovaného proteinu utlumí. Problém útlumu genů si uvědomujeme mnohem pronikavěji v genové terapii. V tomto případě geny, které byly pacientovi vloženy přestávají vytvářet terapeuticky nezbytný protein.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že Cj-Có alkanoyl-L-kamitiny a zvláště acetyl-L-kamitin nebo L-kamitin zvyšuje genovou expresi transfektovaných genů,

Kamitinenť' je pro účel tohoto vynálezu míněn Cj-C₆ alkanoyl-L-kamitin nebo L-kamitin.

V následujícím popisu, čistě jako příklad, se bude odkazovat na upřednostňované řešení s acetylL-kamitinem.

Působení acetyl-L-kamitínu v buněčných klonech transfektovaných známými technikami, např. liposomy, značně zvyšuje expresi proteinů, kódovaných transfektovanými geny.

Předmětem předloženého vynálezu je způsob zvýšení genové exprese transfektovaných genů spočívající v podávání acetyl-L-kamitinu,

Z hlediska průmyslové využitelnosti při použití acetyl-L-kamitinu odkazuje zde popisovaný vynález na zvýšení exprese rekombinantních proteinů současně se způsobem výroby těchto rekombinantních proteinů spočívající v použití acetyl-L-kamitinuje zvýšení exprese jmenovaných proteinů.

V terapeutické oblasti a v oblasti genetického inženýrství obecně, je předmětem zda popisovaného vynálezu použití acetyl-L-kamitinu k přípravě produktu vhodného ke genové terapii pro zlepšení exprese proteinů, rovněž tak jako jeho použití (acetyl-L-kamitinu) k přípravě produktu vhodného k udržení transfektovaných genů v klonech.

Zde popisovaný vynález je dále ilustrován dále uváděnou pokusnou částí.

Materiály a metody

Pokusy in vitro

Buněčné kultury.

Byly použity buněčné linie HeLa ATCC rakoviny děložního hrdla. Buňky byly kultivovány v mediu RPMI 1640 (eurobio) obsahujícím antibiotika a 10% fetální telecí sérum.

- 1 CZ 303403 B6

Pokusy s acetyl-L-kamitinem (ALC)

4.10⁶ a 5.10⁶ buněk kultivovaných v mediu obsahujícím ALC o výsledné koncentraci 5mM a lOmM bylo naočkováno po dvou 125ml lahví, přičemž 2.10⁶ buněk, na které se nepůsobilo ALC bylo naočkováno do 75ml lahve. Pokus byl opakován po 48 hodinách (shodující se s naočkováním buněk pro transfekci) a po 72 hodinách (na konci transfekce) a opakoval se také po 120 hodinách, a to pouze u vzorků transfektovaných na lysi ve 72 hodině.

Přechodná transfekce plasmidu pRL-CMV

Buňky pro transfekci byly naočkovány 24 hodin předem na 12 jamkové plotny (Corning) v počtu odpovídajícím 10⁵ buněk na jamku. Transfekce byla provedena trojnásobně pro každý vzorek s použitím liposomu DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a plasmidu pRL-CMV (Promega, č. kat. E2261). Stručně: na každý vzorek bylo použito 1,5 pg DNK na jednu jamku a 9,2 μΜ liposomu na jednu jamku stím, že konečný objem byl 1050 μΐ na jeden vzorek; transfekční směs (25 μΙ na vzorek) byla ponechána pri teplotě okolí po dobu 30 minut a potom přidán HBS2x (20mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) v množství 25 μΐ roztoku najeden vzorek a 50 μΐ takto získaného roztoku z jednoho vzorku bylo přidáno k buňkám na dobu 5 hodin. Po provedení tří promytí PBS (fosforečnanový ústojný roztok o pH 7,4) bez vápníku a hořčíku se ponechaly buňky kultivovat v růstovém mediu obsahujícím ALC v koncentracích vyznačených u pokusů až do doby kyze buněk na luciferázovou zkoušku. Jako kontrolní byla přidána čistá DNK v roztoku lx HBS.

Lucíferázová zkouška v transfektovaných vzorcích in vitro

Buňky byly promyty PBS (fosforečnanový ústojný roztok o pH 7,4) bez vápníku a hořčíku a podrobeny lyži přídavkem 200 μΙ lyzačního ústojného roztoku obsaženého v soupravě GeneLux L002-100 (Wallac) používané pro luciferázovou zkoušku. Po 20 minutách byly odebrány celkové proteiny a 10 μΐ z každého vzorku analyzováno na luciferázu postupem vedeným v soupravě; zkouška byla provedena na 96 jamkových plotnách za použití luminotnetru Victor² (Wallec). Získané hodnoty luminiscence vyjádřené v relativních světelných jednotkách (RLU) byly přepočteny na mg celkových proteinů s použitím výpočtu Bransfordovy metody.

Pokusy in vivo

Působení acetyl-L-kamitinem (ALC)

Použitými zvířaty pro pokusy in vivo byly myši Balb/c (Harlan), a to v každé skupině 5 zvířat. Skupiny byly rozděleny na kontrolní zvířata (3 skupiny) a na zvířata (6 skupin), která dostávala orálně ALC v dávce lOOmg.kg'¹, Pokus začal čtyři dny před transfekci při denním podávání a byl opakován každý den až do utracení.

Utracení zvířat

Zvířata byla utracena 24, 48 a 72 hodin po transfekci.

Z každého zvířete byly odebrány plíce, promyty fyziologickým roztokem, zváženy, zmraženy kapalným dusíkem a skladovány při -80 °C až do doby extrakce proteinu.

Transfekce plasmidu pRL-CMV

Zvířata tvořící kontrolní skupiny a tři skupiny zvířat zkoušených ALC obdržely intravenózní injekce 25 pg pRL-CMV plasmidu na jednu myš použitím liposomu o koncentraci 12 pm.pg'¹injikované DNK. Liposomy a DNK byly smíseny v roztoku PBS a uchovávány na ledu po dobu 1 hodiny před injikováním. Další tři skupiny zkoumaných zvířat obdržely injekce 25 pg pRL-CMV

-2CZ 303403 B6 plasmidu na jednu myš v roztoku samotného PBS. Výsledný objem injikovaného roztoku každému zvířeti byl 208 μΙ.

Extrakce proteinů z plic a luciferázová zkouška

Výsledky

Exprese luciferázy při transfekci in vitro io Lyzáty ve 24 hodině. Exprese luciferázy získaná ze vzorků zkoušených s ALC byla vyšší než u vzorků kontrolních buněk. Střední hodnota RLU na mg celkových proteinů počítaná na základě trojnásobně provedených vzorků vykazovala v porovnání s kontrolními vzorky přibližně 1,6 násobné zvýšení u vzorků na které se působilo 5mM ALC. Navíc bylo pozorováno, že ve vzorcích zkoušených s lOmM ALC nebylo žádné další zvýšení. Získané výsledky ukazují, že neexis15 tuje vztah dálkové závislostí mezi ALC a expresí luciferázy, a to alespoň u koncentrací použitých v našich pokusech, zatímco na expresi transfektované luciferázy kladný účinek vykazují. U vzorků transfektovaných samotnou DNK, která tvoří naši kontrolní skupinu, nebyla pozorována žádná aktivita luciferázy.

Lyzáty ve 48. hodině. Pozorovaný účinek na vzorcích vystavených lyži ve 24. hodině se neudržel 48 hodin po transfekci, kde se exprese luciferázy v absolutních hodnotách snižovala u všech transfektovaných vzorků. Získané hodnoty RLU na mg proteinu nevykazují žádné významné rozdíly mezi pokusnými a kontrolními vzorky.

Lyzáty ve 72. hodině. Vzorky nevykazovaly žádnou expresi luciferázy, takže hodnoty RLU.mg ¹nemohly být stanoveny.

Exprese luciferázy in vitro

Pokus 1. HeLa 100 000/12 jamkové plotny 1,5 pg na jamku

	RLU.mg střední hodnota a std. odch.
Dotap. + LUC	491,090
	142,451
Dotap + ETC	20,802
	2,283
5mM ALC + LUC	18,060
	3,241
5mM ALC + ETS	17,025
	3,481
5mM ALC + dotap + LUC Ί	779,340
	159,453
5mM ALC + dotap + ETS	22,411
	2,447
lOmM ALC + LUČ	20,481
	7,044
lOmM ALC + ETS	17,724
	1,020
1 OmM ALC + dotap + LUC	750,034
	94,431
lOmM ALC + dotap + ETS	20,520
	2,180

-3CZ 303403 B6

Usoudili jsme, že k ověření, zda kladný účinek ALC na aktivitu luciferázy má vztah k aktivaci transkripčního mechanismu nebo zvýšení propustnosti buněk, vyhodnotíme celkové množství transfektované nitrobuněčné plasmidové DNK analýzou slot blot.

Slot blot”

Buněčná kultura. Buněčné linie HeLa (ATCC) rakoviny děložního hrdla byla uchovávána v médiu RPMI (Europio) doplněného 10% fetálním telecím sérem, 1% P/S ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% CO₂.

Působení s ALC.

5.10⁶ buněk bylo naočkováno do 125ml lahve a uchováváno v RPMI doplněného jako v předchozím postupu a obsahujícího ALC ve dvou koncentracích (5mM a lOmM) 4 dny před transfekcí. Působení bylo opakováno na konci transfekce. Buňky, na které nebylo působeno ALC byly kultivovány za stejných podmínek a použity jako kontrolní.

Přechodná exprese pRL-CMV.

Na I2jamkové plotně (Corning) bylo l den před transfekcí naočkováno 10⁵ buněk na jamku. Pro transfekcí byt použit liposom DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a plasmid pRLCMV (Promega, č. kat. E2261) v 6 jamkách na vzorek. Stručně: 1,5 pg DNK a vodný roztok liposomu o koncentraci 9,2μΜ na jamku byly za laboratorní teploty smíseny (25 μΐ na vzorek) k vytvoření komplexu DNK-liposom. Po inkubaci po dobu 30 minut byl přidán stejný objem HBS 2x (20mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7,4) na jednu jamku a transfekční směs byla rozdělena (50 μΐ na jamku v doplněném mediu). Buňky byly s tímto komplexem inkubovány po dobu 5 hodin a potom komplex odstraněn promytím PBSD (fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok o pH 7,4, prostý Ca²⁺ a Mg²⁺). Buňky byly udržovány v doplněném médiu obsahujícím ALC po dobu 24 hodin a potom použity k analýze. Jako kontrolní byla transfektována čistá DNK v PHS Ix (pRL-CMV).

Extrakce DNK.

Celková buněčná DNK byla od transferovaných buněk extrahována alkalickou lyží metodou uváděnou maniatísem. Po promytí PBS byly buňky odebrány s PBS (1 molů na jamku) a centrifugovány při 15 000 g po dobu 10 minut za laboratorní teploty.

Podle postupu byla každá peleta umístěna na led lyžována za použití: 100 μΐ roztoku I (50mM glukóza, 25mM Tris-HCl (pH - 8), lOmM EDTA (pH = 8)), 200 μΐ roztoku II (0,2N NaOH, 1% SDS), 150 μΐ roztoku III (5M octan draselný, ledová kyselina octová). Po odstředění při 12 000 g po dobu 5 minut při 4 °C by! supematant oddělen a DNK vysrážena EtOH. Pelety byly resuspendovány vTe lx (50 μΐ navzorek).

Značení vzorků

Vzorek luciferázového genu byl získán štěpením pRL-CMV po dobu 2 hodin HindíII při 37 °C a potom za stejných podmínek BamHI. Po štěpení byla směs podrobena elektroforéze na 0,8 % agarózovém gelu v ústojném roztoku TAE lx (40 mM Tris-HCl (pH 7,8), l,lmM EDTA a 37mM octan sodný) a excizí izolován fragment odpovídající luciferázovému genu. Značení luciferázového genu bylo provedeno značkovacím systémem Rediprime II DNK (Amersham Pharmacia biotech, č. kat. RPN 1633) a stabilizovaný Ridivue [a-³²P]dCTP (Amersham Pharmacia biotech, č. kat. AA 0005) podle obdrženého návodu.

-4CZ 303403 B6

Slot blot

Vzorky DNK byly absorbovány na kladně nabitou nylonovou membránu (Boehringer, č. kat. 1209299) za použití přístroje Biorad Slot Blot. DNK byla navázána na filtr UV Stratalinkerem5 2400 (Stratagene). Po předběžné inkubaci na filtru s hybridizaěním roztokem QuikHyb (Stratagene, č. kat. 201220) po dobu 20 minut při 68 °C bylo po povaření s DNK lososího spermatu po dobu 2 minut přidáno 2,5.10⁶ cpm.ml značeného vzorku. Hybridizace byla prováděna při 68 °C po dobu l hodiny a potom byl filtr dvakrát promýván ústojným roztokem I (SSC 2x SDS 0,1 %) po dobu 15 minut za laboratorní teploty a potom ústojným roztokem II (SSC 0,lx, SDS, io 0,1% po dobu 30 minut při 60 °C. Filtr byl k zobrazení vystaven v luminiscenčním přístroji ('Phosphor Imager) záření a potom denzitometricky analyzován s použitím softwaru IPlab Gel.

Denzitometrie slot blot (viz tabulka) prozrazuje, že neexistuje žádný rozdíl mezi hodnotami získanými u transfektovaných buněk v přítomnosti a nepřítomnosti ALC. Malý pokles byl pozo15 rován u lOmM ALC. Tyto výsledky ukazují, že přítomnost ALC nemění buněčnou absorpci komplexu DNK-liposom buňkou, což ukazuje, že by ALC mohla ovlivňovat expresi luciferázy v oblasti transkripce.

Denzitometrické hodnoty (v relativních jednotkách)

	slot	objem	střední hodnota
čistá DNK	1	81620
	2	93505
	3	85305	72618.2
	4	64280
	5	56880
	6	54119

komplex Dotap/DNK	7	239399
	8	250530
	9	251720	252088,5
	10	258812
	11	258100
	12	253970

čistá DNK + 5mM ALC	13	59846
	14	58324
	15	61431	61441,5
	16	70373
	17	63045
	18	55630

komplex Dotap/DNK + 5mM ALC	19	222013
	20	255756
	21	253422	240634,5
	22	234654
	23	239053
	24	238909

čistá DNK + lOmM ALC	25	26326
	26	71831
	27	54172	52595,2
	28	70496
	29	48707
	30	44037

komplex Dotap / DNK + lOmM ALC	31	173870
	32	225644
	33	116848	165345
	34	114911
	35	157762
	36	203035

-5CZ 303403 B6

Tabulka: na obrázku jsou znázorněny jednotlivé hodnoty (v relativních jednotkách) navzokovaných filtrů získané denzitometrickou analýzou za použití softwaru IPlab Gel. Jak je výše uvedeno, pRL-CMV DNK byla transfektována Dotap (komplex Dotap/DNK) a transfekce byla provedena jak s buňkami, na které nebylo působeno (slot 7 až 12), tak s buňkami s 5mM (slot 19 až

24) a lOmM (slot 31 až 36) ALC, Jako kontrolní byla za stejných pokusných podmínek pouižita pRL-CMV bez liposomu (čistá DNK): buňky, na které nebylo působeno (slot 1 až 6), buňky s 5mM (slot 13 až 18) a 1 OmM (slot 25 až 30) ALC.

Shrnutí.

io

Porovnání mezí denzitometrickými hodnotami získanými transfekcí provedenou v přítomnosti nebo nepřítomnosti ALC ukazuje, že mezi permeabilitou buněk pro komplex DNK/Dotap a kladným účinkem ALC na aktivitu luciferázy není žádný vztah.

Claims

1. Použití acetyl-L-kamitinu k přípravě léčiva pro použití v kombinaci s genovou terapií ke zvýšení exprese proteinů kódovaných transferovanými geny.