CN117737088A

CN117737088A - 牛结节性皮肤病病毒环状rna和疫苗的制备及其应用

Info

Publication number: CN117737088A
Application number: CN202311630394.4A
Authority: CN
Inventors: 仲从浩; 殷波; 翟伟锋; 刘纯西; 左炽健; 张震; 聂文豪
Original assignee: Shanghai Shenruilian Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shanghai Shenruilian Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-11-30
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本发明公开牛结节性皮肤病病毒环状RNA和疫苗的制备及其应用，所述环状RNA编码表达牛结节性皮肤病病毒优化的LSDV122蛋白、优化的LSDV141蛋白、优化的LSDV117蛋白、优化的LSDV060蛋白。本发明优选的环状RNA分子提高目标蛋白在牛细胞中表达量，用环状RNA分子制备的疫苗成功激发牛体内产生高水平抗体并激活高水平细胞免疫反应，为制备预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的RNA疫苗提供基础。

Description

牛结节性皮肤病病毒环状RNA和疫苗的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种牛结节性皮肤病病毒环状RNA和疫苗的制备及其应用，具体涉及一种编码牛结节性皮肤病病毒优化的LSDV122、优化的LSDV141、优化的LSDV117和优化的LSDV060的环状RNA分子组合的制备及应用；包含编码牛结节性皮肤病病毒优化的LSDV122、优化的LSDV141、优化的LSDV117、优化的LSDV060的环状RNA、线性RNA、重组质粒、重组大肠杆菌工程菌，以及环状RNA的制备方法及应用。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease，LSD)是一种由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus，LSDV)引起的高度传染性疫病。1929年LSD首次发现于非洲的赞比亚，我国首次确诊的LSD病例发生在2019年8月新疆，之后在多个省份报道发病。LSD典型特征是在皮肤上形成结节，导致牛皮受损，造成产奶量下降、流产、不育等，少数发病牛最终因严重感染死亡，还因牛的流动和贸易限制造成间接损失，对养牛业产生重大经济影响。该病被世界动物卫生组织列为必须报告的牛疫病之一，我国农业农村部将其列为二类动物疫病。

LSDV属于痘病毒科，与山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)均为山羊痘病毒属。LSDV大小约为290nm×270nm，LSDV感染细胞时主要以细胞外包膜病毒(Extracellular Enveloped Virus，EEV)和细胞内成熟病毒(Intracellular Mature Virus，IMV)形式，但主要以稳定性更好的IMV形式存在于细胞内，直至细胞裂解后感染另一个宿主。LSDV基因组较大有约151kb，编码156个开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)，编码的蛋白质涉及DNA复制、转录、mRNA合成、核苷酸代谢、结构形成和稳定、毒力等多个生物功能。

根据国家动物疫病免疫技术指南，目前我国推荐接种5倍剂量的山羊痘活疫苗来预防牛结节性皮肤病。但弱毒活疫苗具有致病的风险，近年来已发现牛结节病毒活疫苗株和野毒株发生重组的报道(doi：10.1371/journal.pone.0207480)。接种灭活疫苗安全，但灭活疫苗在制造过程中有病毒扩散的风险，因此制造成本、质量控制和生产工艺要求均较高。因此需要开发更安全、高效同时成本可控的新型牛结节性皮肤病病毒疫苗。

RNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的RNA直接导入机体，使其在体内直接翻译，完成目标蛋白的表达，从而引起机体特异的免疫反应，已在人重大呼吸道传染病的预防方面发挥重要作用。目前在临床或临床前应用的RNA主要为线性RNA，与线性RNA相比，环状RNA分子往往具有较长的半衰期，具有更好的稳定性，在蛋白表达、临床治疗中具有重要的应用前景。

针对LSDV的RNA疫苗等新型疫苗的研究较为困难：病毒结构复杂，基因组较大编码至少156个ORF，且具有多层囊膜结构，各囊膜上分别具有多个不同蛋白，难以选择合适的疫苗靶点。M.NAVEED(doi：10.26355/eurrev_202307_33000)和Sehrish Kakakhel(doi：10.3390/bioengineering10040430)等分别使用通过生物信息学方法预测的LSDV的毒性T细胞表位、辅助T细胞表位和B细胞表位设计了相应的RNA分子并进行了分子制备，但并均未能评价免疫效果。LSDV、GTPV和SPPV基因高度同源，Min Zheng等尝试构建了针对GTPV的DNA分子组合(doi:10.1016/j.virol.2009.05.031)，编码A27(对应LSDV117)、L1(对应LSDV060)、A33(对应LSDV122)、B5(对应LSDV141)蛋白组合，该分子组合在小鼠体内免疫效果和攻毒保护效果均优于山羊痘活疫苗，提示可能是LSDV疫苗研究有效靶点。但直接使用该组野生型蛋白存在问题：(1)A27、L1、A33、B5蛋白均为膜蛋白或者膜相关蛋白，表达有难度，如A33蛋白在体外表达时以包涵体存在，导致抗原的免疫原性低(doi:10.3390/v8060159)。(2)Min Zheng等构建DNA疫苗编码野生型A27、L1、A33、B5蛋白组合在小鼠体内效果好，但在羊体内攻毒保护效果差。该分子组合在羊体内的产生的抗体滴度、细胞免疫应答均较低，低于山羊痘活疫苗，可能是在羊体内效果不好的重要原因。因此设计牛结节性皮肤病病毒RNA疫苗需首先解决的问题包括：设计牛结节性皮肤病病毒RNA分子在牛体细胞中可高效率表达目标蛋白；疫苗在本动物牛体内能诱导高水平体液免疫应答和细胞免疫应答。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种牛结节性皮肤病病毒环状RNA和疫苗的制备及其应用。解决了用野生型蛋白和公开方法设计环状RNA分子目标蛋白表达量低，对应疫苗产生病毒抗体水平低、细胞免疫应答弱的问题，为制备预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的RNA疫苗提供基础。所述环状RNA编码表达牛结节性皮肤病病毒优化的LSDV122蛋白、优化的LSDV141蛋白、优化的LSDV117蛋白、优化的LSDV060蛋白。本发明优选的环状RNA分子提高目标蛋白在牛细胞中表达量，用环状RNA分子制备的疫苗成功激发牛体内产生高水平抗体并激活高水平细胞免疫反应，为制备预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的RNA疫苗提供基础

本发明提供的技术方案如下：

<环状RNA>

所述环状RNA包含以下环状RNA分子中的至少一种：编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白的环状RNA分子；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.3所示的序列，或与SEQ ID NO.3所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV122蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.5所示的序列，或与SEQ ID NO.5所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV141蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.7所示的序列，或与SEQ ID NO.7所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV117蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID NO.9所示的序列，或与SEQ ID NO.9所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV060蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的序列，或与SEQ ID NO.11所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV122蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的序列，或与SEQ ID NO.13所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV141蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的序列，或与SEQ ID NO.15所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV117蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的序列，或与SEQ ID NO.17所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV060蛋白活性的序列。

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.4所示的序列，或与SEQ ID NO.4所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV122蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.6所示的序列，或与SEQ ID NO.6所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV141蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.8所示的序列，或与SEQ ID NO.8所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV117蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.10所示的序列，或与SEQ ID NO.10所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV060蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.12所示的序列，或与SEQ ID NO.12所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV122蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.14所示的序列，或与SEQ ID NO.14所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV141蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.16所示的序列，或与SEQ ID NO.16所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV117蛋白活性的多肽的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.18所示的序列，或与SEQ ID NO.18所示的序列具有至少90％的序列同一性，且编码具有或部分具有LSDV060蛋白活性的多肽的序列。

所述环状RNA包含如下(a)～(d)中任一项所示排列次序的编码元件和调控元件：

(a)第一外显子、第二外显子、5’间隔区、翻译起始元件、编码元件和3’间隔区；

(b)第一外显子、第二外显子、翻译起始元件和编码元件；

(c)翻译起始元件和编码元件；

(d)翻译起始元件、编码元件和插入元件。

所述翻译起始元件包含如下所示的一种或两种以上的具有翻译起始活性的序列：IRES序列、5’UTR序列、Kozak序列、包含m⁶A修饰的序列、核糖体18S rRNA的互补序列；所述插入元件包含如下所示的一种或两种以上的序列：非翻译区序列、polyN序列、适配体序列、核糖体开关序列、结合转录调控因子的序列；其中，所述polyN序列，其中N选自A、T、G、C中的至少一种。

在一些实施方案中，本发明所述的环状RNA通过传统PIE系统制备得到，在此条件下，所述环状RNA包含如下(a)或(b)所示排列次序的元件：

(b)第一外显子、第二外显子、翻译起始元件和编码元件。

对于其中的第一外显子、第二外显子、5’间隔区、3’间隔区，可参考专利申请CN202011408937.4、CN202210200112.6和CN202210200186.X，上述专利的全部内容通过引用并入本申请中。

在另一些实施方案中，本发明所述的环状RNA通过clean PIE系统制备得到，在此条件下，所述环状RNA包含如下(c)或(d)所示排列次序的元件：

(c)翻译起始元件和编码元件；

(d)翻译起始元件、编码元件和插入元件。

在一些优选的实施方案中，本发明所述的环状RNA通过clean PIE系统制备得到，所述环状RNA包含上述(d)所示排列次序的元件。制备环状RNA的clean PIE系统可以参照专利CN202210200112.6、CN202210200186.X中所示出的内容，上述专利的全部内容通过引用并入本申请。

在一些实施方案中，本发明所述的翻译起始元件可以是能够起始环状RNA中编码元件翻译的任意类型的元件。

在一些优选的实施方案中，本发明所述的翻译起始元件包含IRES序列。示例性的，所述IRES序列包括但不限于来源于Echovirus、Human poliovirus、Human Enterovirus、Coxsackievirus、Human rhinovirus、Canine picornavirus、Turdivirus 3、Hepatovirus、Passerivirus、Picornaviridae、Tremovirus A、Feline kobuvirus、Murine kobuvirus、Kobuvirus sewage Kathmandu、Ferret kobuvirus、Marmot kobuvirus、Humanparechovirus、Chicken picornavirus、Falcon picornavirus、Feline picornavirus、French Guiana picornavirus等等的IRES序列。

在一些实施方案中，本发明所述的插入元件可以用于调控重组核酸分子的转录，用于调控环状RNA的翻译，实现环状RNA在不同组织之间的特异性表达，或者用于纯化环状RNA等等。

在一些具体的实施方式中，本发明所述的插入元件包含如下所示的一种或两种以上的序列：非翻译区序列、polyN序列、适配体序列、核糖体开关序列、结合转录调控因子的序列；其中，所述polyN序列，其中N选自A、T、G、C中的至少一种。

在一些实施方案中，所述环状RNA包括如下环状RNA分子组合中的任意一组：

组合一：包括如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的环状RNA分子；

组合二：包括如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的环状RNA分子；

组合三：包括如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的环状RNA分子。

所述如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.12所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.14所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.16所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.18所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I。

<牛结节性皮肤病病毒疫苗>

本发明还进一步提供一种包括如上所述的环状RNA的牛结节性皮肤病病毒疫苗。

所述牛结节性皮肤病病毒疫苗包括如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的RNA分子；如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的RNA分子；包括如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ IDNO.36所示的核苷酸序列的RNA分子、如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的RNA分子中的至少一种。

所述如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.12所示的编码元件，如SEQID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.14所示的编码元件，如SEQID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.16所示的编码元件，如SEQID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQ ID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.18所示的编码元件，如SEQID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ ID NO.21所示的内含子片段I。

<牛结节性皮肤病病毒疫苗的制备方法>

所述牛结节性皮肤病病毒疫苗的制备方法包括如下步骤：

S1、将编码牛结节性皮肤病病毒蛋白基因的编码元件和调控元件合成并克隆到质粒载体，得到含有编码牛结节性皮肤病病毒蛋白基因的编码元件和调控元件的重组载体；

S2、将所述步骤S1得到的含有编码牛结节性皮肤病病毒蛋白基因的编码元件和调控元件的重组载体转化或转导宿主，得到含有所述重组载体的重组子；

S3、培养所述步骤S2得到的重组子，制备含有编码牛结节性皮肤病病毒蛋白基因的编码元件和调控元件的质粒；

S4、用所述步骤S3得到的含有编码牛结节性皮肤病病毒蛋白基因的编码元件和调控元件的质粒，制备得到编码牛结节性皮肤病病毒蛋白的环状RNA；

S5、用所述步骤S4得到的编码牛结节性皮肤病病毒蛋白的环状RNA加入脂质纳米颗粒和冷冻保护剂，得到所述牛结节性皮肤病病毒疫苗。

作为本发明的一个实施方案，本发明的调控元件包含内含子片段I和II、翻译起始元件截断片段I和I、插入元件。

<线状RNA>

本发明还提供一组线状RNA，所述线状RNA发生自剪切反应后环化形成如上所述的环状RNA。

在一些实施方案中，本发明所述的线状RNA来源于传统PIE系统，在此条件下，所述线状RNA包含如下(e)或(f)所示排列次序的元件：

(e)5’同源臂、3’内含子片段II、第二外显子、5’间隔区、翻译起始元件、编码元件、3’间隔区、第一外显子、5’内含子片段I和3’同源臂；

(f)5’同源臂、3’内含子片段II、第二外显子、翻译起始元件、编码元件、第一外显子、5’内含子片段I和3’同源臂。

具有上述结构的线状RNA分子能够利用I类内含子的核酶活性，在体外发生自剪切环化反应，得到环状RNA。具体的，在GTP的引发下，5’内含子与第一外显子的连接处发生断裂；第一外显子的核酶裂口进一步攻击3’内含子与第二外显子的连接处，使该处发生断裂，3’内含子解离，第一外显子和第二外显子连接得到环状RNA。

在另一些实施方案中，本发明所述的线状RNA来源于clean PIE系统，在此条件下，所述线状RNA包含如下(g)、(h)或(i)所示排列次序的元件：

(g)内含子片段II，翻译起始元件截断片段II，编码元件，翻译起始元件截断片段I，内含子片段I；

(h)内含子片段II，翻译起始元件截断片段II，编码元件，插入元件，翻译起始元件截断片段I，内含子片段I；

(i)内含子片段II，翻译起始元件截断片段II，编码元件，终止密码子，polyAC，翻译起始元件截断片段I，内含子片段I。

当具有上述结构的线状RNA分子在制备环状RNA时，核酶识别翻译起始元件截断片段I(IRES片段I)与内含子片段I连接位置首先产生断裂，释放内含子片段I；然后核酶识别翻译起始元件截断片段II(IRES片段II)与内含子片段II连接位置产生断裂，释放内含子片段II。翻译起始元件截断片段I的3’末端与翻译起始元件截断片段II的5’末端连接成环状分子。

在一些优选的实施方案中，本发明所述的线状RNA来源于clean PIE系统，所述线状RNA包含上述(i)所示排列次序的元件。

在一些具体的实施方案中，本发明所述翻译起始元件截断片段II包含如SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.2任一项所示的序列。

在一些具体的实施方案中，本发明所述翻译起始元件截断片段I包含如SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.20任一项所示所示的序列。翻译起始元件截断片段I的核苷酸序列与翻译起始元件截断片段II的核苷酸序列连接可以得到完整的翻译起始元件序列。

在一些优选的实施方案中，本发明所述翻译起始元件截断片段II为SEQ ID NO.24所示的序列；本发明所述翻译起始元件截断片段I为SEQ ID NO.25所示的序列。

在一些具体的实施方案中，本发明所述终止密码子如(TAA)x(TAG)y(TGA)z所示，其中x+y+z≥1，x,y,z分别独立地为大于等于0的整数，优选序列为TGA。

在一些具体的实施方案中，本发明所述polyAC为如SEQ ID NO.19所示序列。

<重组核酸分子>

本发明提供了一种重组核酸分子，所述重组核酸分子转录后形成上述线状RNA。

在一些实施方案中，本发明所述的重组核酸分子除了包含上述线状RNA中所包含的元件外，在重组核酸分子中还可以包含调控序列。示例性的，调控序列为T7启动子。

<重组大肠杆菌工程菌>

本发明提供了一种重组大肠杆菌工程菌，所述工程菌为上述重组核酸分子转化E.coli而得。

<核酸脂质纳米颗粒组合物>

本发明提供了一种核酸脂质纳米颗粒组合物，所述核酸脂质纳米颗粒组合物包含脂质纳米颗粒以及上述环状RNA。

通过将上述环状RNA包载进入脂质纳米颗粒，可以提高机体对环状RNA的摄取效率，同时提高了环状RNA的储存稳定性，为开发应用牛结节性皮肤病病毒疫苗提供帮助。

<医药用途>

本发明提供的上述环状RNA、牛结节性皮肤病病毒疫苗、牛结节性皮肤病病毒疫苗制备方法所制得的疫苗、线状RNA、重组核酸分子和/或核酸脂质纳米颗粒组合物可以用于预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒。

本发明提供的上述环状RNA、牛结节性皮肤病病毒疫苗、牛结节性皮肤病病毒疫苗制备方法所制得得疫苗、线状RNA、重组核酸分子、重组大肠杆菌工程菌、和/或核酸脂质纳米颗粒组合物在制备用于预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的药物中的用途。

本发明提供了一种预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的方法，其包括向受试者施用有效量的上述环状RNA、线状RNA、牛结节性皮肤病病毒疫苗、牛结节性皮肤病病毒疫苗制备方法所制得的疫苗、重组核酸分子和/或核酸脂质纳米颗粒组合物；优选地，通过注射的方式进行施用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供优选的RNA分子组合(编号STV-LSDV122、STV-LSDV141、STV-LSDV117、STV-LSDV060)，分别包含优化的编码元件和优化的翻译起始元件，编码元件分别编码牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白、LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白、LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白、LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白，在蛋白表达效率和免疫活性方面更优，为研制牛结节性皮肤病病毒的RNA疫苗提供基础。

2)优选的RNA分子提高在牛肾细胞MBDK中蛋白表达量，明显高于用公开方法针对野生型蛋白设计的环状RNA分子(见图3)。

3)用优选RNA分子组合制备的RNA疫苗(编号LNP-M4)提高在牛体内的抗体滴度、抗原特异的T细胞免疫应答反应，显著优于市售山羊痘活疫苗(见图5～图7)。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为用于生成牛结节性皮肤病病毒各环状RNA的前体序列示意图和环状RNA序列。

图2为实施例2中各RNA分子毛细管凝胶(CGE)电泳图。

图3为实施例3中优化前后的RNA分子在牛肾细胞中表达及western blot验证。

图4为实施例4中各组疫苗在小鼠体内诱导的IgG抗体滴度。

图5为实施例5中各组疫苗在牛体内诱导的IgG抗体滴度。

图6为实施例5中免疫后各抗原刺激PBMC细胞增殖。

图7为实施例5中各组免疫牛3天和7天血液IFN-γ水平。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。

在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

在本发明中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在本发明中，术语“约”可以表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。

在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

在本发明中，术语“环状RNA”是指呈封闭环形的RNA分子。在本发明中，所使用的环状RNA具有蛋白翻译活性，又可称为“环状RNA”。

在本发明中，术语“线状RNA”是指能够环化形成环状RNA的RNA前体，其一般由线状的DNA分子转录形成，又可称为“线状RNA”。

在本发明中，术语“线性RNA”是指包括5’帽子结构(5’)，3’多聚腺苷尾巴(PolyAtail)，5’非翻译序列(5’untranslational region，5’UTR)，3’非翻译序列(3’untranslational region，3’UTR)以及开放阅读框(Open reading frame，ORF)等结构的具有翻译功能的RNA，又可称为“线性RNA”。

在本发明中，术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。在本发明中，重组核酸分子包含编码目标多肽的编码元件，和连接于所述编码元件上游的翻译起始元件。

在本发明中，术语“翻译起始元件”是指能够招募核糖体，起始RNA分子的翻译过程的任意的序列。示例性的，翻译起始元件包括IRES序列、m6A修饰序列，或滚环翻译的起始序列等等。

在本发明中，术语“IRES”(Internal ribosome entry site，IRES)又称内部核糖体进入位点，“内部核糖体进入位点”(IRES)属于翻译控制序列，通常位于所关注基因的5’端，并使得以帽非依赖性方式翻译RNA。经转录的IRES可直接结合核糖体亚单位，以使得RNA起始密码子在核糖体中适当地取向以进行翻译。IRES序列通常位于RNA的5’UTR中(起始密码子的正上游)。IRES在功能上取代对各种与真核生物翻译机制相互作用的蛋白因子的需求。

在本发明中，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

在本发明中，术语“野生型”与“天然存在”为同义词，是指在自然界中可以找到的并且没有被人为修改过的对象。

在本发明中，术语“变体”、“突变体”可互换使用，是指相对于“野生型”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸。其中，取代是指用不同的核苷酸/氨基酸置换占用一个位置的核苷酸/氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸/氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸/氨基酸之后添加核苷酸/氨基酸。

在本发明中，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

在本发明中，术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。

在本发明中，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明中所述的RNA分子，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。

在本发明中，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触本发明中所述的RNA分子，从而与不接触时相比降低罹患疾病的概率和/或减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

实施例1牛结节性皮肤病病毒基因设计与合成

针对牛结节性皮肤病病毒主要抗原蛋白LSDV122、LSDV141、LSDV117、LSDV060的野生型蛋白和优化蛋白，分别设计环状RNA的载体DNA，各DNA载体沿5’向3’的方向包含如下元件：内含子片段II、翻译起始元件截断片段II、蛋白质编码元件、插入元件、翻译起始元件截断片段I、内含子片段I，具体见表1。

表1各载体DNA设计

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其中，内含子片段II、翻译起始元件截断片段II(编号CKV-II)、插入元件(polyAC)、翻译起始元件截断片段I(编号CKV-I)、内含子片段I为参考专利CN 114574483 A设计，其中翻译起始元件CKV为rine kobuvirus IRES序列第80位G突变为T、第81位A突变为C、第82位G突变为T得到突变序列。翻译起始元件截断片段II(编号SVDV2-II或STV-II)、翻译起始元件截断片段I(编号SVDV2-I或STV-I)为本研究通过设计筛选获得，在相应细胞中可大幅提高环状RNA分子在牛细胞中的表达效率，具体地信息如下：

内含子片段II的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

翻译起始元件截断片段II(编号CKV-II)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

蛋白质编码元件中包含终止密码子(如(TAA)x(TAG)y(TGA)z所示，其中x+y+z≥1，x,y,z分别独立地为大于等于0的整数，优选终止密码子为TGA；

牛结节性皮肤病病毒野生型LSDV122蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.3，核苷酸序列SEQ ID NO.4)、野生型LSDV141蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.5，核苷酸序列SEQ ID NO.6)、野生型LSDV117蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.7，核苷酸序列SEQ ID NO.8)、野生型LSDV060蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.9，核苷酸序列SEQ ID NO.10)；

牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白，为野生型LSDV122蛋白包含突变P85Y和D98E，并对核苷酸序列进行优化(氨基酸序列SEQ ID NO.11，核苷酸序列SEQ ID NO.12)；

LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白，为野生型LSDV141蛋白去除N端17个氨基酸及去除C端11个氨基酸，并对核苷酸序列进行优化(氨基酸序列SEQ ID NO.13，核苷酸序列SEQ ID NO.14)；

LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白，为野生型LSDV117蛋白N端增加信号肽MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWAAA及包含突变Y33S，并对核苷酸序列进行优化(氨基酸序列SEQ IDNO.15，核苷酸序列SEQ ID NO.16)；

LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白，为野生型LSDV060蛋白去除C端37个氨基酸，并对核苷酸序列进行优化(氨基酸序列SEQ ID NO.17，核苷酸序列SEQ ID NO.18)。

优化的蛋白序列和核苷酸序列为本研究筛选获得，可提高蛋白稳定性和分泌表达效率；

插入元件(polyAC)的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

翻译起始元件截断片段I(CKV-I)的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

内含子片段I的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

翻译起始元件截断片段II(编号SVDV2-II)的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

翻译起始元件截断片段I(编号SVDV2-I)的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

翻译起始元件截断片段II(编号STV-II)的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

翻译起始元件截断片段I(编号STV-I)的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

上述基因片段委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并克隆至pUC57载体，经基因测序验证正确。由载体DNA转录获得线性RNA，由线性RNA按如下机制形成环状RNA：核酶识别翻译起始元件截断片段I(IRES片段I)与内含子片段I连接位置首先产生断裂，释放内含子片段I；然后核酶识别翻译起始元件截断片段II(IRES片段II)与内含子片段II连接位置产生断裂，释放内含子片段II。翻译起始元件截断片段I的3’末端与翻译起始元件截断片段II的5’末端连接成环状分子(图1)。

实施例2环状RNA的制备

将实施例1获得的DNA载体制备成环状RNA。

(a)菌种制备：将表1对应的DNA载体分别转化DH5α感受态细胞，涂布于含有抗生素100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有抗生素100μg/ml氨苄青霉素的3ml LB液体培养基，37℃培养，从中取1ml菌液加入终浓度为8％的甘油，-80℃冷冻保存，经基因测序验证正确，分别得到工程菌，编号分别为b-CKV-LSDV122-wt、b-SVDV2-LSDV122、b-STV-LSDV122、b-CKV-LSDV141-wt、b-SVDV2-LSDV141、b-STV-LSDV141、b-CKV-LSDV117-wt、b-SVDV2-LSDV117、b-STV-LSDV117、b-CKV-LSDV060-wt、b-SVDV2-LSDV060、b-STV-LSDV060，作为后续试验的种子。

(b)质粒抽提：将外部构建的穿刺菌进行37℃/220rpm活化3～4h；取活化菌液扩大培养，培养条件：37℃/220rpm震荡过夜培养；通过商用试剂盒进行质粒抽提(天根无内毒素质粒大提试剂盒)。

(c)质粒酶切与纯化：通过限制性核酸内切酶BsaI(近岸蛋白)/BsaI(Takara)进行质粒酶切，酶切体系如下：10×缓冲液(buffer)：100μl，质粒：5mg，BsaI：150μl(5000U)，水补足至1000μl，37℃过夜酶切。酶切后使用商用DNA回收试剂盒(TIANGEN)将酶切产物进行柱纯化，获得线性化质粒。

(d)体外转录：配置转录体系如下表2所示：

表2

试剂	体积
		10×反应缓冲液(Reaction Buffer)	2ml
ATP(100mM)	2ml
		CTP(100mM)	2ml
UTP(100mM)	2ml
		GTP(100mM)	2ml
线性化质粒(1.5mg/ml)	600μl
		T7 RNA聚合酶(RNA Polymerase)(25U/μl)	2ml
RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)(10U/μl)	2ml
		无核酸酶水(Nuclease free water)	总计20ml

反应条件：在37℃/220rpm恒温震荡反应2～4h，后转录体系中加入2ml脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)，在37℃/220rpm恒温震荡反应15min。

(e)转录产物RNA沉淀：将上述a)所得的转录产物中加入LiCl溶液(终浓度2.5M)，置于-20℃过夜沉淀；将过夜处理溶液进行离心，获得RNA沉淀，室温干燥后通过无酶水重悬沉淀，获得线状RNA水溶液。

(f)RNA环化与浓缩：环化体系与条件如下表3所示

表3

将上述溶液充分混合均匀，于55℃加热15min。将环化RNA产物进行超滤管离心浓缩，弃去滤液；并将超滤后的液体转移至新的离心管中。

(g)环状RNA HPLC纯化：取环状RNA在150mM磷酸盐缓冲液流动相中通过色谱柱SEC-1000(SEPAX)进行分离，并收集主峰成分。

(h)纯化后环状RNA超滤浓缩：将环状RNA进行超滤管离心浓缩，弃去滤液；添加无酶水至超滤管中，重复清洗环状RNA两遍；将超滤后的液体转移至新的离心管中。

(i)成功制备了各环状RNA分子(见表4)，按如下项目进行RNA检验：

1)鉴定：各RNA进行基因测序合格，序列与目标序列一致。

2)浓度分析：通过紫外分光光度计测定RNA的浓度，结果如表4。

3)完整性分析：通过毛细管凝胶电泳(CGE)测定RNA完整性/纯度，均不低于80％，结果如表4和图2所示。

表4

RNA分子编号	核苷酸序列	完整性/纯度/％	浓度/mg/ml
				CKV-LSDV122-wt	SEQ ID NO.26	91	2.4
CKV-LSDV141-wt	SEQ ID NO.27	90	2.0
				CKV-LSDV117-wt	SEQ ID NO.28	89	2.1
CKV-LSDV060-wt	SEQ ID NO.29	91	2.3
				SVDV2-LSDV122	SEQ ID NO.30	92	2.3
SVDV2-LSDV141	SEQ ID NO.31	90	2.5
				SVDV2-LSDV117	SEQ ID NO.32	87	2.4
SVDV2-LSDV060	SEQ ID NO.33	92	2.0
				STV-LSDV122	SEQ ID NO.34	91	2.3
STV-LSDV141	SEQ ID NO.35	91	2.2
				STV-LSDV117	SEQ ID NO.36	90	2.1
STV-LSDV060	SEQ ID NO.37	89	2.6

实施例3瞬式转染表达验证

(1)方法

使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)将各RNA分子转染至牛肾细胞MDBK中，转染方法参考Lipofectamine 2000试剂盒说明书。48小时后，STV-LSDV122、STV-LSDV141、STV-LSDV060组细胞用裂解液(10mM Tris-Cl,pH 7.4,1mM MgCl2,0.5％ NP40,20μg/ml DNase I)裂解并经10％SDS-PAGE凝胶电泳，STV-LSDV117组细胞取细胞培养上清10％SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白分别转化到硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)上，通过westernblot检测定量目标蛋白和内参蛋白GAPDH：目标蛋白用兔抗病毒阳性血清(1比500稀释)孵育，内参蛋白用兔抗牛GAPDH抗体(1比500稀释，sigma公司)孵育。结合的抗体用碱性磷酸酶标记的小鼠抗兔IgG(1比500稀释，sigma公司)检测，最终通过NBT/BCIP底物(Promega公司)显色。兔抗病毒阳性血清为用牛结节性皮肤病灭活疫苗免疫新西兰兔获得，经牛结节皮肤病抗体检测试剂盒(深圳芬德)检测，抗体效价不低于1比5000。

(2)结果

Western blot结果见图3。针对野生型蛋白设计的RNA分子(CKV-LSDV122-wt、CKV-LSDV141-wt、CKV-LSDV117-wt、CKV-LSDV060-wt)在牛肾细胞MDBK中表达较弱。而对翻译起始元件、蛋白质氨基酸序列和核苷酸序列优化后的RNA分子(STV-LSDV122、STV-LSDV141、STV-LSDV117、STV-LSDV060)在牛肾细胞MDBK中表达量均明显大幅度提高。

因此对LSDV122蛋白，以DNA载体(编号p-STV-LSDV122)、大肠杆菌菌种(编号b-STV-LSDV122)、环状RNA分子(编号STV-LSDV122)为优选；

因此对LSDV141蛋白，以DNA载体(编号p-STV-LSDV141)、大肠杆菌菌种(编号b-STV-LSDV141)、环状RNA分子(编号STV-LSDV141)为优选；

因此对LSDV117蛋白，以DNA载体(编号p-STV-LSDV117)、大肠杆菌菌种(编号b-STV-LSDV117)、环状RNA分子(编号STV-LSDV117)为优选；

因此对LSDV060蛋白，以DNA载体(编号p-STV-LSDV060)、大肠杆菌菌种(编号b-STV-LSDV060)、环状RNA分子(编号STV-LSDV060)为优选

实施例4 LNP-RNA疫苗制备

(1)方法

a)将实施例3获得的各环状RNA分子或者RNA分子组合分别用商品化LNP制备成LNP包裹的RNA，为进一步动物试验提供准备。LNP-RNA制备主要参考文献doi：10.1016/j.cell.2022.03.044进行，其中商品化LNP(GenVoy-ILM，Precision NanoSystems公司)与环状RNA按试剂说明书进行混合，最后将缓冲体系置换成10mM Tris-HCL(pH7.4，含8％蔗糖)，过滤除菌并定量后得到LNP-RNA。用Quant-iT^TMRiboGreen^TMRNA Assay Kit(Invitrogen^TMR11490)测定RNA含量和包封率。在Zeta电位-激光粒度仪Malvern ZetasizerNano-ZEN 3600(Malvern)上采用动态光散射法测量LNP颗粒的粒径、PDI、表面电位。

(2)结果

最终获得4组试验疫苗，分别为LNP包裹的STV-LSDV122(编号LNP/122)、LNP包裹的STV-LSDV141(编号LNP/141)、LNP包裹的STV-LSDV117(编号LNP/117)、LNP包裹的STV-LSDV060(编号LNP/060)、LNP包裹的STV-LSDV122+STV-LSDV141+STV-LSDV117+STV-LSDV060四RNA组合物(编号LNP/M4)。LNP包载RNA的各项指标检验合格：粒径低于120nm，PDI小于0.3，包封率大于90％；表面电位呈电负性。

表18 LNP-RNA样品表征

编号	粒径(nm)	PDI	表面电位(mV)	包封率(％)	RNA含量(mg/ml)
						LNP/122	102	0.11	-7.2	93	1.1
LNP/141	110	0.12	-7.1	92	1.2
						LNP/117	109	0.14	-6.5	92	1.1
LNP/060	105	0.13	-7.1	93	1.2
						LNP/M4	106	0.13	-6.8	92	1.2

实施例5小鼠免疫及抗体检测

(1)实验方法

6～8周龄雌性BABL/c小鼠随机分为11组，每组4只，将实施例4制备的LNP包裹的环状RNA疫苗，进行小鼠肌肉免疫，接种剂量分别为2μg/只和10μg/只，总体积为50μl/只，同时以接种LNP的小鼠为阴性对照，分别在0周和3周进行免疫，第二次免疫后第21天采集血液分离血清，采用间接ELISA方法测试各组针对病毒的抗体滴度。其中主要步骤包括，牛结节性皮肤病灭活疫苗的灭活病毒用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释至1μg/ml，取200μl加入到96孔板酶标板(Costar公司)4℃包被过夜；用5％ BSA-PBS于37℃封闭2小时；2倍比梯度稀释的待测血清加入96孔板中，37℃反应1小时；加入HRP标记的兔抗小鼠IgG(Sigma公司)37℃反应1小时，之后加入底物(0.01％过氧化氢)显色，测定OD492nm值。抗体滴度终点为大于临界值的最高血清稀释倍数，其中临界值为阴性对照组OD492nm均值加3倍标准偏差。

(4)结果

结果见图4。针对LSD主要抗原设计的RNA分子均能激发小鼠产生针对灭活病毒的抗体，其中以LNP/060组明显优于其他各组，但单个分子产生的抗体滴度均较低。而将四RNA分子组分混合(LNP/M4组)则明显提高抗体滴度，表明四组分对抗体的产生具有明显的协同增效作用。

实施例6动物免疫和效果评估

(1)方法

6～9月龄牛(牛结节性皮肤病病毒抗原和抗体阴性)20头，平均分为4组，每组5只，进行颈侧部肌肉免疫接种：

组1：接种实施例4制备的LNP/M4，免疫剂量150μg/头。

组2：接种实施例4制备的LNP/M4，免疫剂量100μg/头。

组3：市售山羊痘活疫苗(含山羊痘病毒弱毒株(CVCC AV41)，每头份病毒含量不低于10^3.5TCID₅₀)，根据国家动物疫病免疫技术指南，免疫剂量为说明书剂量的5倍，即2.5ml/头。

组4：接种无菌PBS，免疫剂量1ml/头。

1)抗体分析：一次注射免疫后第21天采集血液分离血清，采用间接ELISA方法测试各组针对病毒的抗体滴度，具体操作方法同实施例4，其中用HRP标记的小鼠抗牛IgG(Sigma公司)。

2)T淋巴细胞增殖分析：一次注射免疫后第14天采集血液置于5mM EDTA中并迅速用Lymphoprep淋巴细胞分离液(TBD公司，天津)分离PBMC细胞，用含15％FBS的RPMI培养基(sigma公司)重悬。在96孔组织培养板接种细胞(2×10⁶个细胞/ml，100μl)，分别用10μg牛结节性皮肤病灭活疫苗对应灭活病毒或Con A抗原(阳性对照)或LSD122多肽池或LSD141多肽池或LSDV117多肽池或LSDV060多肽池刺激，阴性对照组未用抗原刺激，抗原蛋白多肽池由11个氨基酸交叠组成15个mers，多肽纯度85％以上，由申联生物合成和提供。37℃孵育培养72小时，加入50μl MTT反应3小时，加入100μl DMSO，测试OD570nm值。与对照组比，计算试验组相对增殖的细胞百分比。

3)血液IFN-γ含量测定：在一次免疫后0天、3天、7天，分别采集血清，通过牛IFN-γ-ELISA kit(invitrogen公司)测定IFN-γ含量，具体操作参考试剂盒说明书。与第0天比，计算第3天和第7天各组IFN-γ相对含量变化。

(2)试验结果

抗体检测结果见图5，T淋巴细胞增殖检测结果见图6，血液IFN-γ含量检测结果见图7。LNP/M4组成功诱导牛产生病毒特异抗体，且免疫后淋巴细胞增殖明显以及IFN-γ含量升高明显表明LNP/M4组成功激活T细胞免疫反应。其中LNP/M4-150μg组的病毒特异的抗体滴度、免疫第3天IFN-γ水平均显著高于市售山羊痘活疫苗，此外虽然病毒特异的淋巴细胞增殖水平与市售疫苗相近，但抗原特异的淋巴细胞增殖水平显著高于市售疫苗，表明LNP/M4-150μg组能激发更高的体液免疫反应和细胞免疫反应。本研究优化设计的RNA分子组合为研制高效预防牛结节性皮肤病病毒感染的环状RNA疫苗提供基础。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA包含以下环状RNA分子中的至少一种：编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白的环状RNA分子、编码表达牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白的环状RNA分子；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV122蛋白优化获得的LSDV122-1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.11所示的序列，或与SEQ ID NO.11所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV122蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV141蛋白优化获得的LSDV141-1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.13所示的序列，或与SEQ ID NO.13所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV141蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV117蛋白优化获得的LSDV117-1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.15所示的序列，或与SEQ ID NO.15所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV117蛋白活性的序列；

所述牛结节性皮肤病病毒LSDV060蛋白优化获得的LSDV060-1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.17所示的序列，或与SEQ ID NO.17所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有LSDV060蛋白活性的序列。

2.根据权利要求1所述的环状RNA，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的环状RNA，其特征在于，所述环状RNA包含如下(a)～(d)中任一项所示排列次序的元件：

(b)第一外显子、第二外显子、翻译起始元件和编码元件；

(c)翻译起始元件和编码元件；

(d)翻译起始元件、编码元件和插入元件；

4.根据权利要求1所述的环状RNA，其特征在于：所述环状RNA包括如下环状RNA分子组合中的任意一组：

组合一：包括如SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQID NO.29所示的核苷酸序列的环状RNA分子；

组合二：包括如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQID NO.33所示的核苷酸序列的环状RNA分子；

组合三：包括如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的环状RNA分子、如SEQID NO.37所示的核苷酸序列的环状RNA分子。

5.根据权利要求4所述的环状RNA，其特征在于：

所述如SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.12所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ IDNO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.14所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ IDNO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.16所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ IDNO.21所示的内含子片段I；

所述如SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的环状RNA分子，由包含如下所示排列次序的编码元件和调控元件的载体DNA转录环化形成：如SEQ ID NO.1所示的内含子片段II，如SEQID NO.24所示的翻译起始元件截断片段II，如SEQ ID NO.18所示的编码元件，终止密码子，如SEQ ID NO.19所示的polyAC，如SEQ ID NO.25所示的翻译起始元件截断片段I，如SEQ IDNO.21所示的内含子片段I。

6.一种包含如权利要求1-5中任一项所述的环状RNA的牛结节性皮肤病病毒疫苗。

7.一种根据权利要求6所述牛结节性皮肤病病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8.一种线状RNA，其特征在于，所述线状RNA发生自剪切反应后环化形成如权利要求1-5中任一项所述的环状RNA。

9.一种重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子转录后形成如权利要求8所示的线状RNA。

10.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为如权利要求9所述的重组核酸分子转化E.coli而得。

11.一种如权利要求1-5中任一项所述的环状RNA；或如权利要求6所述的牛结节性皮肤病病毒疫苗；或如权利要求7所述的牛结节性皮肤病病毒疫苗的制备方法；或如权利要求8所述的线状RNA；或如权利要求9所述的重组核酸分子；或如权利要求10所述的重组大肠杆菌工程菌在制备用于预防和/或治疗牛结节性皮肤病病毒的药物中的用途。