PL201867B1

PL201867B1 - Mutant proteazy UBP1 i jego sekwencja kodująca, ich zastosowania oraz produkty i sposoby służące do ich otrzymywania

Info

Publication number: PL201867B1
Application number: PL359813A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Płucienniczak; Anna Wójtowicz; Diana Mikiewicz-Syguła; Grażyna Płucienniczak
Original assignee: Inst Biotechnologii I Antybiot; Instytut Biotechnologii I Antybiotykow
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2003-05-02
Publication date: 2009-05-29
Also published as: EP1623027A1; WO2004097011A1; US8956848B2; US20060177845A1; PL359813A1

Abstract

1. Mutant proteazy UBP1, znamienny tym, ze posiada sekwencj e aminokwasow a zawieraj ac a przynajmniej jedn a z nast epuj acych modyfikacji: - zamiana proliny znajduj acej si e w pozycji 415 sekwencji UBP1 na leucyn e, - zamiana fenyloalaniny znajduj acej si e w pozycji 739 sekwencji UBP1 na leucyn e, - zamiana glutaminy znajduj acej si e w pozycji 754 sekwencji UBP1 na leucyn e, - przy laczenie wi azaniem peptydowym polipeptydu ubikwityny do aminokwasu znajduj acego si e na N-ko ncu, - delecja co najmniej cz esci aminokwasów znajduj acych si e w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1. 4. Sekwencja nukleotydowa koduj aca mutanta proteazy UBP1, znamienna tym, ze zawiera przynajmniej jedn a z nast epuj acych mutacji: - zamiana kodonu proliny znajduj acego si e w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny, - zamiana kodonu fenyloalaniny znajduj acego si e w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny, - zamiana kodonu glutaminy znajduj acego si e w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny, - przy laczenie sekwencji koduj acej ubikwityn e, korzystnie w regionie rozpoczynaj acym ramk e odczytu, - delecja co najmniej cz esci kodonów spo sród pocz atkowych 54 kodonów sekwencji koduj acej UBP1. 9. Zastosowanie mutanta proteazy UBP1 do otrzymywania aktywno sci enzymu odcinaj acego ubikwityn e, przy czym stosowany mutant posiada sekwencj e aminokwasow a zawieraj aca przynajmniej jedn a z nast epuj acych modyfikacji: - zamiana proliny znajduj acej si e w pozycji 415 sekwencji UBP1 na leucyn e, - zamiana fenyloalaniny znajduj acej si e w pozycji 739 sekwencji UBP1 na leucyn e, - zamiana glutaminy znajduj acej si e w pozycji 754 sekwencji UBP1 na leucyn e, - przy laczenie wi azaniem peptydowym polipeptydu ubikwityny do aminokwasu znajduj acego si e na N-ko ncu, - delecja co najmniej cz esci aminokwasów znajduj acych si e w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy mutanta proteazy UBP1 i jego sekwencji kodującej, ich zastosowania oraz produktów i sposobów służących do ich otrzymywania. Prezentowany wynalazek znajduje zastosowanie w produkcji białek rekombinowanych, zwłaszcza na skalę przemysłową.

Ubikwityna jest białkiem powszechnie występującym u organizmów eukariotycznych. Wykazano (R. Baker, Current Opinion in Biotechnology 1996,7:541-546), że jest wygodnym nośnikiem białek heterologicznych otrzymywanych na drodze ekspresji w Escherichia coli. Ubikwityna jest zbudowana z 76 reszt aminokwasowych o łącznej masie 8,8 kDa. Biał ko to jest elementem uniwersalnego systemu modyfikowania białek. Zjawisko ubikwitynacji towarzyszy wszystkim nieomal procesom metabolicznym, od podziałów i różnicowania się komórki aż po jej śmierć. Ubikwityna zaangażowana jest w regulację ekspresji genów, reperację DNA, wpływa na aktywność chromatyny. A także bierze udział w transformacji nowotworowej. Odgrywa podstawową rolę w proteolizie białek regulacyjnych o krótkim czasie półtrwania, a także białek o dłuższym czasie półtrwania, które jednak z różnych przyczyn muszą być z komórki usunięte. Ubikwitynacja białek nie zachodzi u bakterii. Dowiedziono, iż białka połączone z ubikwityną podlegają wyższej ekspresji w E. coli, a także są silniej stabilizowane. Badania struktury krystalicznej ubikwityny prowadzone z zastosowaniem magnetycznego rezonansu jądrowego dowiodły, że zarówno w roztworze wodnym jak i stanie stałym stanowi ona zwartą, globularną cząsteczkę (S. Vijay-Kumar, C. Bugg, W. Cook, J. Mol. Biol. 1987,194:531-544). Hydrofobowy rdzeń ubikwityny składa się z pięciu równolegle ułożonych odcinków łańcucha polipeptydowego, powiązanych między sobą regularnie rozłożonymi wiązaniami wodorowymi co tworzy tzw. harmonijkę β. Brzegi jej powierzchni spina odcinek łańcucha zwinięty w 3,5 skrętu helisy α. Taka budowa nadaje cząsteczce ubikwityny niezwykłą odporność na wysoką temperaturę, duży zakres pH i zmiany polarności środowiska (Harding M M, Williams D H, Woolfson D N Biochemistry 1991, 30:3120-3128).

Proteaza UBP1 jest enzymem wyizolowanym z drożdży odcinającym ubikwitynę od białka umieszczonego na jej C-końcu. Enzym został opisany w 1991 roku (J. Tobias, A. Varshavsky, J. Biol. Chem. 1991,266; 12021-12028) i jest przedmiotem zgłoszenia patentowego WO91/17245 (patent europejski EP 531 404). Zbadano jej aktywność i określono warunki hodowli w bakteriach E. coli. Zgodnie z treścią opisu, jest to proteaza cysteinowa, która łączy się z ubikwityną wiązaniem estrowym. Długość łańcucha aminokwasowego UBP1 wynosi 809. Aktywność enzymu polega na zdolności odcinania peptydu ubikwityny znajdującego się na C-końcu trawionego polipeptydu, niezależnie od obecności kolejnych aminokwasów na N-końcu ubikwityny.

Zgłoszenie WO93/09235 opisuje inne białka drożdżowe należące do tej samej rodziny proteaz, mianowicie UBP2 i UBP3. Białka te wykazują podobną aktywność (patrz także US5494818, US5212058, US5683904).

Nie opisano dotychczas żadnych ulepszonych mutantów UBP1.

Znane są układy ekspresyjne, w których uzyskuje się białka fuzyjne składające się z ubikwityny lub jej pochodnej i polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie stosując enzym odcinający ubikwitynę (np. UBP1) odzyskuje się białko będące przedmiotem zainteresowania (patrz przykładowo: US5132213, US6018102). Taka metoda posiada wiele zalet obejmujących m.in. poprawę jakości i wydajności otrzymywanego białka, oraz uproszczenie metody oczyszczania, co ma istotne znaczenie w przemysłowej produkcji białek rekombinowanych (patrz przykładowo: WO03/010204). Stosując enzym odcinający ubikwitynę i odpowiednio zaprojektowane białka fuzyjne można również uzyskiwać modyfikowane na N-końcu polipeptydy (przykładowo: US5847097).

Stosowanie enzymu odcinającego ubikwitynę w procesach technologicznych wymaga jednak dysponowania względnie dużą ilością takiego białka. Znane metody nie pozwalają na uzyskanie wydajnej ekspresji tego enzymu i znacznie ograniczają możliwość jego stosowania, zwłaszcza w procesach przemysłowych.

Celem wynalazku jest dostarczenie wydajnego sposobu otrzymywania białka odcinającego ubikwitynę i środków służących do jego realizacji. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie środków pozwalających na łatwiejsze otrzymywanie białka o aktywności UBP1.

W związku z tym, celem wynalazku jest także dostarczenie sekwencji nukleotydowej umożliwiającej wydajną ekspresję enzymu o aktywności UBP1. Zatem, celem wynalazku jest również dostarczenie nowego, ulepszonego polipeptydu dającego białko o aktywności UBP1.

Nieoczekiwanie określone powyżej cele udało się osiągnąć dzięki niniejszemu wynalazkowi.

PL 201 867 B1

Przedmiotem wynalazku jest mutant proteazy UBP1, który posiada sekwencję aminokwasową zawierającą przynajmniej jedną z następujących modyfikacji:

- zamiana proliny znajdującej się w pozycji 415 sekwencji UBP1 na leucynę,

- zamiana fenyloalaniny znajdują cej się w pozycji 739 sekwencji UBP1 na leucynę ,

- zamiana glutaminy znajdującej się w pozycji 754 sekwencji UBP1 na leucynę,

- przyłączenie wiązaniem peptydowym polipeptydu ubikwityny do aminokwasu znajdującego się na N-końcu,

- delecja co najmniej części aminokwasów znajdują cych się w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1.

Korzystnie delecja obejmuje wszystkie aminokwasy znajdujące się w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1. Zgodnie ze szczególnie korzystną realizacją wynalazku mutant proteazy według wynalazku posiada jedną z sekwencji aminokwasowych mutantów przedstawionych na figurach 6, 8-10.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta proteazy UBP1, charakteryzująca się tym, że zawiera przynajmniej jedną z następujących mutacji:

- zamiana kodonu proliny znajdują cego się w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu fenyloalaniny znajdują cego się w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu glutaminy znajdującego się w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- przyłączenie sekwencji kodującej ubikwitynę , korzystnie w regionie rozpoczynającym ramkę odczytu,

- delecja co najmniej części kodonów spośród początkowych 54 kodonów sekwencji kodującej UBP1. Korzystnie delecja obejmuje początkowe 132 nukleotydy.

Korzystnie, sekwencja nukleotydowa według wynalazku zawiera ponadto zmiany kodonów uwzględniające preferencje przewidywanego układu ekspresyjnego. W szczególnie korzystnej realizacji przewidywanym gospodarzem ekspresyjnym jest E. coli, a zmiany kodonów obejmują zastąpienie co najmniej jednego spośród kodonów argininowych w pozycjach 96, 476, 482, 487, 702, 705, 710, 796, 801 sekwencji aminokwasowej UBP1 kodonem CGT lub CGC.

W jednej z korzystnych realizacji sekwencja nukleotydowa wedł ug wynalazku posiada jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 1, 5, 8-10.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutanta proteazy UBP1 do otrzymywania aktywności enzymu odcinającego ubikwitynę, przy czym stosowany mutant posiada cechy zdefiniowane powyżej. Korzystnie otrzymany enzym odcinający ubikwitynę stosuje się do otrzymywania białka będącego przedmiotem zainteresowania z białka hybrydowego składającego się z ubikwityny i białka będącego przedmiotem zainteresowania. Natomiast białkiem będącym przedmiotem zainteresowania jest białko lecznicze, korzystnie interleukina, interferon, hormon wzrostu, insulina albo erytropoetyna. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji nukleotydowej kodującej mutanta proteazy UBP1 do otrzymywania enzymu odcinającego ubikwitynę, przy czym stosowana jest sekwencja według wynalazku zdefiniowana powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą mutanta proteazy UBP1 według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Korzystnie sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta protezy UBP1 jest zawarta w plazmidzie pT7-7ArgStop.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą mutanta proteazy UBP1 według wynalazku zdefiniowaną po wyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania białka odcinającego ubikwitynę, charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą mutanta proteazy UBP1, a następnie izoluje się pożądany enzym lub zawierającą go frakcję, przy czym sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta proteazy UBP1 jest sekwencją według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Nieoczekiwanie okazało się, że zaproponowane w wynalazku nowe mutanty UBP1, zachowują podstawową aktywność enzymu odcinającego ubikwitynę i są łatwiejsze w otrzymywaniu. Zaprezentowane środki i sposoby umożliwiają łatwą i wydajną ekspresję enzymu o aktywności UBP1, przykładowo w dobrze poznanym układzie opartym o komórki E. coli. Dzięki temu, mutanty według wynalazku

PL 201 867 B1 nadają się do przemysłowego wykorzystania, przykładowo w procesach syntezy białek rekombinowanych obejmujących ekspresję białek fuzyjnych zawierających ubikwitynę.

Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku, w opisie umieszczono następujące figury:

Figura 1 przedstawia sekwencję kodującą białko hybrydowe ubikwityna::UBP1 (małymi literami opisana jest sekwencja ubikwityny, natomiast dużymi - sekwencja UBP1, tłustym drukiem zaznaczono sekwencję dla enzymu Sacll, kodon stopu oraz miejsce położenia primerów: UBP1MG i UBP1MD);

Figura 2 przedstawia mapę wektora ekspresyjnego pT7-7ArgStop, przy czym: Amp - gen oporności na ampicylinę, ArgU - gen kodujący tRNA komplementarny do kodonu AGA, Stop Transkrypcji sekwencja nukleotydowa warunkująca stop transkrypcji pochodząca z genu φ 10 faga T7;

Figura 3 przedstawia wykres prawdopodobieństwa wystąpienia domeny transmembranowej w UBP1 uzyskany za pomocą programu TMHMM Prediction of transmembrane helices in proteins (CBS; Denmark) - stwierdzono obecność domeny transmembranowej o długości 51 aminokwasów.

Figura 4 przedstawia obraz mikroskopowy komórek E. coli BLD21 zawierających plazmid pT77ArgStopUBI+UBP1 barwionych metodą Gramma.

Figura 5 - sekwencja kodująca białko hybrydowe UBI::UBP1 ΔC z usuniętą domeną transmembranową (małymi literami oznaczona została sekwencja kodująca UBI, dużymi literami - sekwencja kodująca proteazę UBP1 AC)

Figura 6 - sekwencja aminokwasowa proteazy UBP1 oraz proponowane zmiany. Tłustym drukiem zaznaczono sekwencję usuniętego fragmentu transmembranowego. Podkreśloną kursywą zaznaczono obszar centrum aktywnego, natomiast wytłuszczone i podkreślone zostały aminokwasy, które zostały zamienione na leucynę a następnie nazwane przez nas mutacjami: A, B i C.

Figura 7 obraz mikroskopowy przedstawiający preparat przyżyciowy hodowli bakteryjnej E. coli BLD21 z plazmidem pT7-7ArgStopUBI+UBP1 AC ze zmienionymi kodonami argininowymi.

Figura 8 Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa UBI+UBP1 ABC - mutacje polegające na zamianie: proliny na leucynę (pozycja 415), fenyloalaniny na leucynę (pozycja 739) oraz glutaminy na leucynę (pozycja 754), reszty aminokwasowe zaznaczono tłustym, podkreślonym drukiem.

Figura 9 Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa UBI+UBP1BC - mutacje polegające na zamianie fenyloalaniny na leucynę (pozycja 739) oraz glutaminy na leucynę (pozycja 754) reszty aminokwasowe zaznaczono tłustym, podkreślonym drukiem.

Figura 10 Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa UBI+UBP1C - mutacja polegająca na zamianie glutaminy na leucynę w pozycji 754, resztę aminokwasową zaznaczono tłustym, podkreślonym drukiem.

Figura 11 - badanie aktywności uzyskanych mutantów, produkty trawień - rozdział elektroforetyczny na żelu paa z SDS-em. Kolejne kolumny od lewej: kolumna nr 1 - wzorzec wielkości mas (wielkości od góry 97, 66, 45, 30, 20.1, 14.4 [kDa]), 2,3 - trawienie UBI::INF proteazą UBP1 AC w czasie 2h w 37°C, 4 - UBI::INF nie trawiony, 5, 6 - UBI::INF trawiony proteazą UBP1 AC przez 1 h w 37°C.

Poniższe przykłady służą jedynie zaprezentowaniu wybranych realizacji niniejszego wynalazku i nie powinny być uznane za ograniczenie jego zakresu.

P r z y k ł a d 1. Mutanty białka UBP1

Przykładowe mutanty UBP1 zawierające mutacje punktowe obejmują:

I UBP1ABC z mutacją A, B, C w pozycji 415, 739 i 754 - zamiana odpowiednio proliny, fenyloalaniny oraz glutaminy na leucynę.

II UBP1BC z mutacją w pozycji 739 i 754 - zamiana odpowiednio fenyloalaniny i glutaminy na leucynę.

III UBP1C z mutacją w pozycji 754 - zamiana glutaminy na leucynę.

Z wykorzystaniem tych mutantów zaprojektowano białka hybrydowe zawierające dodatkowo na N-końcu sekwencję aminokwasową ubikwityny (białka: UBI+UBP1ABC, UBI+UBP1BC oraz UBI+UBP1C).

Kolejna grupa mutantów została otrzymana poprzez usunięcie z opisanych powyżej białek sekwencji transmembranowej UBP1 lub części tej sekwencji (przykładowe białka:

UBP1AC, UBI+UBP1AC oraz ich mutanty zawierające co najmniej jedną z mutacji A, B lub C).

Wszystkie mutacje są umieszczone poza obszarem centrum aktywnego złożonego z reszt cysternowych (100-117 aa) i histydynowych (681-725 aa), zaznaczonego podkreśloną kursywą na figurze 6 prezentującym sekwencję aminokwasową UBP1 ze wskazaniem miejsc modyfikowanych.

Wyżej wymienione warianty proteazy zostały użyte jako enzym odcinający ubikwitynę od białka umieszcznego na jej C-końcu w naszym przypadku był to hybryd UBI::Interferon α.

PL 201 867 B1

P r z y k ł a d 2. Konstrukcja plazmidu z genem proteazy UBP1 i jej mutantami.

Gen protezy UBP1 o długości 2430 par zasad został otrzymany przy użyciu metody PCR. Matrycą był genomowy DNA Saccharomyces cerevisiae szczepu W303 (ade2-1, leu2-3, 112, trpl-1, his3-11, ura3-1, mit+, rho+). Do powielenia zaprojektowano primery:

UBP1P

SacII

5' AGACTCCGCGGTGGTGATTTGTTTATTGAAAGCAAGATA UBP1K

BamHl

5' GGGGATCCTTAGTTTACATCTTTACCAGAAATA

Oligonukleotydy zawierały miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych: Sacll oraz BamHl. Powielony fragment DNA zligowano z wektorem pBluescript SK(-), który był przecięty tymi samymi enzymami. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki kompetentne E. coli NM522. Plazmidowe DNA izolowano metodą alkaliczną. Następnie ze zrekombinowanych plazmidów wycięto gen UBP1 o długości 2430 par zasad enzymami restrykcyjnymi: Sacll i BamHl. Tak przygotowany fragment DNA ligowano z wektorem ekspresyjnym pT7-7ArgStopUBI, który powstał przez wligowanie sekwencji genu ubikwityny o długości 240 par zasad do plazmidu pT7-7ArgStop (figura 2) w miejsca restrykcyjne Ndel i EcoRI. Plazmid pT7-7ArgStop powstał w pracowni prof.dr hab. Andrzeja Płucienniczaka w oparciu o plazmid pT7-7 (S. Tabor, C. Richardson, Proc. Nat. Acad. Sci. 1985,262:1074-1078).

Wektor pT7-7ArgStopUBI trawiono enzymami Sacll i BamHl, następnie ligowano go z przygotowanym fragmentem DNA kodującym UBP1. Mieszaniną ligacyjną transformowano komórki kompetentne E. coli DH5a. Wyizolowano DNA oraz określono sekwencję, która prezentowana jest na figurze 1.

Gen proteazy włączono do wektora ekspresyjnego pT7-7ArgStopUBI. Otrzymane plazmidy z genem hybrydowym UBI::UBP1 wykorzystano do transformacji bakterii E. coli BLD21. Białko UBP1 było syntetyzowane (wytwarzane) podczas hodowli tych bakterii. Hodowla prowadzona była w 25°C w podłożu LB z dodatkiem 50 mg/ml ampicyliny. Hodowla do OD600=1 trwała około 30 godzin. Wykonano preparat barwiony metodą Gramma. Okazało się, że bakterie E. coli są kilkadziesiąt razy dłuższe niż zazwyczaj (figura 4).

Sekwencję aminokwasową UBP1 badano za pomocą programu TMHMM, który określa prawdopodobieństwo wystąpienia domeny transmembranowej (figura 3). Wykryta domena mogłaby opóźniać wzrost i podział komórek bakteryjnych. To mogło być także przyczyną tak długiego czasu wzrostu do OD600=1.

W celu jej usunięcia do genu UBP1 wprowadzono modyfikację przy użyciu metody PCR.

Modyfikacja polegała na włączeniu do sekwencji kodującej UBP1 dodatkowego miejsca restrykcyjnego Sacll.

W tym celu zaprojektowano primery, które zastosowano do mutagenezy punktowej QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit firmy Stratagene:

UBP1MG

Sacll

5' GGCATAGTAGTATTTTTTTACCGCGGTGGTGACCATCTAAACTACATTGT

UBP1MD

Sacll

5' ACAATGTAGTTTAGATGGTCACCACCGCGGTAAAAAAATACTACTATGCC

Za pomocą primerów: UBP1MG i UBP1MD (zaznaczono tłustym drukiem miejsca ich położenia na figurze 1) do wnętrza sekwencji kodującej UBP1 wprowadzono sekwencję dla enzymu restrykcyjnego Sacll (podkreślona). Dzięki temu po trawieniu plazmidu pT7-7ArgStopUBI+UBP1 enzymem Sacll usunięto fragment o długości 169 par zasad. W ten sposób powstał plazmid nazwany przez nas pT77ArgStopUBI+UBP1 AC. Zawiera on sekwencję kodującą przedstawioną na figurze 5. W analogiczny sposób otrzymano plazmidy kodujące inne mutanty hybrydowe według wynalazku zawierające sekwencję UBI.

P r z y k ł a d 3. Ekspresja genu proteazy UBP1AC oraz oczyszczanie enzymu.

Bakterie E. coli BLD21 transformowano plazmidem zawierającym gen proteazy UBP1 lub jednego z jej mutantów. W trakcie eksperymentów hodowlanych stwierdzono, że usunięcie domeny transmembranowej znacznie ułatwiło hodowlę bakteryjną i skróciło czas hodowli z 30 do ok. 12 go6

PL 201 867 B1 dzin. Obserwowano również powrót do naturalnego kształtu komórek bakteryjnych w przypadku komórek produkujących mutanta według wynalazku (figura 7). Bakterie E. coli BLD21 zawierające odpowiedni plazmid hodowano na pożywce LB zawierającej ampicylinę (50 mg/ml) w 25°C przez ok. 12 godz. do OD600=1, następnie indukowano przez dodanie IPTG (izopropylotiogalaktozyd). Po 2,5 godzinach bakterie zwirowywano. Osad komórek zawieszano w buforze do lizy i inkubowano 30 min w 20°C. Dodawano Tritonu X-100 do stężenia 1%. Preparat sonifikowano i zwirowywano. Supernatant nanoszono na kolumnę SP (mocny kationit Sepharose FF) a następnie hydrofobową kolumnę Phenylo Sepharose FF. Aktywność proteazy oznaczano przez trawienie UBI::Interferon α frakcją oczyszczonego enzymu. Wyniki przedstawiono na figurze 11.

Dodatkowo zmodyfikowano gen proteazy UBP1 przez zamianę części kodonów argininowych niekorzystnych dla bakterii E. coli (AGA lub AGG) na kodony, które występują u E. coli (CGT lub CGC). W końcowej wersji zostały zastąpione kodony kodujące argininę w pozycjach: 96; 476; 482; 487; 702; 705; 710; 796; 801, zaznaczone tłustym drukiem na figurze 6.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Mutant proteazy UBP1, znamienny tym, że posiada sekwencję aminokwasową zawierającą przynajmniej jedną z następujących modyfikacji:

- zamiana proliny znajdującej się w pozycji 415 sekwencji UBP1 na leucynę,

- zamiana fenyloalaniny znajdują cej się w pozycji 739 sekwencji UBP1 na leucynę ,

- zamiana glutaminy znajdującej się w pozycji 754 sekwencji UBP1 na leucynę,

- przyłączenie wią zaniem peptydowym polipeptydu ubikwityny do aminokwasu znajdują cego się na N-końcu,

- delecja co najmniej części aminokwasów znajdują cych się w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1.
2. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że delecja obejmuje wszystkie aminokwasy znajdujące się w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1.
3. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada jedną z sekwencji aminokwasowych mutantów przedstawionych na figurach 6, 8-10.
4. Sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta proteazy UBP1, znamienna tym, że zawiera przynajmniej jedną z następujących mutacji:

- zamiana kodonu proliny znajdują cego się w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu fenyloalaniny znajdują cego się w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu glutaminy znajdującego się w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- przyłączenie sekwencji kodują cej ubikwitynę , korzystnie w regionie rozpoczynają cym ramkę odczytu,

- delecja co najmniej części kodonów spośród początkowych 54 kodonów sekwencji kodującej UBP1.
5. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 4, znamienna tym, że delecja obejmuje początkowe 132 nukleotydy.
6. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera ponadto zmiany kodonów uwzględniające preferencje układu ekspresyjnego.
7. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 6, znamienna tym, że gospodarzem ekspresyjnym jest E. coli, a zmiany kodonów obejmują zastąpienie co najmniej jednego spośród kodonów argininowych w pozycjach 96, 476, 482, 487, 702, 705, 710, 796, 801 sekwencji aminokwasowej UBP1 kodonem CGT lub CGC.
8. Sekwencja nukleotydowa według jednego z zastrz. 4-7, znamienna tym, że posiada jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 1, 5, 8-10.
9. Zastosowanie mutanta proteazy UBP1 do otrzymywania aktywności enzymu odcinającego ubikwitynę, przy czym stosowany mutant posiada sekwencję aminokwasową zawierającą przynajmniej jedną z następujących modyfikacji:

- zamiana proliny znajdującej się w pozycji 415 sekwencji UBP1 na leucynę,

- zamiana fenyloalaniny znajdują cej się w pozycji 739 sekwencji UBP1 na leucynę ,

PL 201 867 B1

- zamiana glutaminy znajdującej się w pozycji 754 sekwencji UBP1 na leucynę,

- przyłączenie wiązaniem peptydowym polipeptydu ubikwityny do aminokwasu znajdującego się na N-końcu,

- delecja co najmniej części aminokwasów znajdują cych się w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że delecja obejmuje wszystkie aminokwasy znajdujące się w pozycjach od 1 do 54 sekwencji UBP1.
11. Zastosowanie według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że stosowany mutant posiada jedną z sekwencji aminokwasowych mutantów przedstawionych na figurach 6, 8-10.
12. Zastosowanie według jednego z zastrz. 9-11, znamienne tym, że otrzymany enzym odcinający ubikwitynę stosuje się do otrzymywania białka z białka hybrydowego składającego się z ubikwityny i rzeczonego białka.
13. Zastosowanie według zastrz. 12. znamienne tym, że otrzymywanym białkiem jest białko lecznicze, korzystnie interleukina, interferon, hormon wzrostu, insulina albo erytropoetyna.
14. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej kodującej mutanta proteazy UBP1 do otrzymywania enzymu odcinającego ubikwitynę, przy czym stosowana sekwencja zawiera przynajmniej jedną z następujących mutacji:

- zamiana kodonu proliny znajdują cego się w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu fenyloalaniny znajdują cego się w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu glutaminy znajdującego się w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- przyłączenie sekwencji kodującej ubikwitynę , korzystnie w regionie rozpoczynającym ramkę odczytu,

- delecja co najmniej części kodonów spośród począ tkowych 54 kodonów sekwencji kodującej UBP1.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że delecja obejmuje początkowe 132 nukleotydy.
16. Zastosowanie według jednego z zastrz. 14-15, znamienne tym, że stosowana sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto kodony preferowane przez wykorzystywany układ ekspresyjny.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że enzym otrzymuje się poprzez ekspresję sekwencji nukleotydowej w E. coli.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że gospodarzem ekspresyjnym jest E. coli, a zmiany kodonów obejmują zastąpienie co najmniej jednego spośród kodonów argininowych w pozycjach 96, 476, 482, 487, 702, 705, 710, 796, 801 sekwencji aminokwasowej UBP1 kodonem CGT lub CGC.
19. Zastosowanie według jednego z zastrz. 14-18, znamienne tym, że stosowana sekwencja posiada jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 1, 5, 8-10.
20. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą mutanta proteazy UBP1 zawierającą przynajmniej jedną z następujących mutacji:

- zamiana kodonu proliny znajdują cego się w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu fenyloalaniny znajdują cego się w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu glutaminy znajduj ącego się w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- przyłączenie sekwencji kodują cej ubikwitynę , korzystnie w regionie rozpoczynającym ramkę odczytu,

- delecja co najmniej części kodonów spośród począ tkowych 54 kodonów sekwencji kodującej UBP1.
21. Wektor ekspresyjny według zastrz. 20, znamienny tym, że delecja obejmuje początkowe

132 nukleotydy.
22. Wektor ekspresyjny według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta protezy UBP1 zawiera kodony preferowane przez wykorzystywany układ ekspresyjny.

PL 201 867 B1
23. Wektor ekspresyjny według zastrz. 22, znamienny tym, że gospodarzem ekspresyjnym jest E. coli, a zmiany kodonów obejmują zastąpienie co najmniej jednego spośród kodonów argininowych w pozycjach 96, 476, 482, 487, 702, 705, 710, 796, 801 sekwencji aminokwasowej UBP1 kodonem CGT lub CGC.
24. Wektor ekspresyjny według zastrz. 20, znamienny tym, że zawiera jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 1, 5, 8-10.
25. Wektor ekspresyjny według jednego z zastrz. 20-24, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta protezy UBP1 jest zawarta w plazmidzie pT7-7ArgStop.
26. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą mutanta proteazy UBP1 zawierającą przynajmniej jedną z następujących mutacji:

- zamiana kodonu proliny znajdują cego się w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu fenyloalaniny znajdują cego się w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu glutaminy znajduj ącego się w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- przyłączenie sekwencji kodującej ubikwitynę, korzystnie w regionie rozpoczynającym ramkę odczytu,

- delecja co najmniej części kodonów spoś ród począ tkowych 54 kodonów sekwencji kodującej UBP1.
27. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że delecja obejmuje początkowe 132 nukleotydy.
28. Komórka według zastrz. 26 albo 27, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta protezy UBP1 zawiera kodony preferowane przez wykorzystywany układ ekspresyjny.
29. Komórka według zastrz. 28, znamienna tym, że jest komórką E. coli, a zmiany kodonów obejmują zastąpienie co najmniej jednego spośród kodonów argininowych w pozycjach 96, 476, 482, 487, 702, 705, 710, 796, 801 sekwencji aminokwasowej UBP1 kodonem CGT lub CGC.
30. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że zawiera jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 1, 5, 8-10.
31. Sposób otrzymywania białka odcinającego ubikwitynę, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą mutanta proteazy UBP1, a następnie izoluje się pożądany enzym lub zawierającą go frakcję, przy czym sekwencja nukleotydowa kodująca mutanta proteazy UBP1 zawiera przynajmniej jedną z następujących mutacji:

- zamiana kodonu proliny znajdują cego się w pozycji 415 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu fenyloalaniny znajdują cego się w pozycji 739 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- zamiana kodonu glutaminy znajdującego się w pozycji 754 sekwencji aminokwasowej UBP1 na kodon leucyny,

- przyłączenie sekwencji kodującej ubikwitynę , korzystnie w regionie rozpoczynającym ramkę odczytu,

- delecja co najmniej części kodonów spośród począ tkowych 54 kodonów sekwencji kodującej UBP1.
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że delecja obejmuje początkowe 132 nukleotydy.
33. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że stosowana sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto kodony preferowane przez wykorzystywany układ ekspresyjny.
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że stosowanym gospodarzem ekspresyjnym jest E. coli, a zmiany kodonów obejmują zastąpienie co najmniej jednego spośród kodonów argininowych w pozycjach 96, 476, 482, 487, 702, 705, 710, 796, 801 sekwencji aminokwasowej UBP1 kodonem CGT lub CGC.
35. Sposób według jednego z zastrz. 31-34, znamienny tym, że stosowana sekwencja nukleotydowa posiada jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na figurach 1,5, 8-10.