PL197752B1

PL197752B1 - Nowe związki o strukturze dendrymeru posiadające właściwości bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne

Info

Publication number: PL197752B1
Application number: PL361821A
Authority: PL
Inventors: Zofia Lipkowska; Jolanta Janiszewska
Original assignee: Pan
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2003-08-25
Publication date: 2008-04-30
Also published as: PL361821A1

Abstract

1. Nowe związki o strukturze dendrymeru posiadające właściwości bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne, o wzorach ogólnych 1, 2, 3 lub 4, w których: n stanowi liczbę naturalną 2, 3 lub 4, R1 i R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, benzyloksykarbonyl (Z), 2-chlorobenzyloksykarbonyl (2-Cl-Z), dansyl (DNS), naftylosulfonyl, podstawniki aromatyczne oraz pochodne lizyny, w tym Lizyna (Lys), D-Lizyna (D-Lys), Z-Lys, Z-D-Lys, Lys- -(ε-Z), D-Lys-(s-Z), (2-Cl-Z)-Lys, (2-Cl-Z)-D-Lys, Lys- -(ε-2-Cl-Z), D-Lys-fs-2-Cl-Z), DNS-(Lys), Lys-(s-DNS) R3 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej amidy lub estry metylowe Phe, D-Phe, Tyr, D-Tyr, Ala, D-Ala, Gly, Ile, D-Ile, amidy lub estry metylowe L i D-Trp; estry metylowe liniowych aminokwasów alifatycznych o długości łańcucha od 3 do 6 atomów węgla, a także tryptaminę, metylobenzyloaminy, benzyloaminę, nitrofenyloaminy, fenyloaminy R4 i R5 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej Gly, Ala, D-Ala, Z-Arg, Z-D-Arg, (2-Cl-Z)-Arg, (2-Cl-Z)-D-Arg, R6 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej Gly, Ala, D-Ala, Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), Pro, D-Pro.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe związki o strukturze dendrymeru posiadające właściwości bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne, o wzorach ogólnych i, 2,3 lub 4, w których:

n stanowi liczbę naturalną 2,3 lub 4,

R1 i R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, benzyloksykarbonyl (Z), 2-chlorobenzyloksykarbonyl (2-Cl-Z), dansyl (DNS), naftylosulfonyl, podstawniki aromatyczne oraz pochodne lizyny, w tym Lizyna (Lys), D-Lizyna (D-Lys), Z-Lys, Z-D-Lys, Lys-(e-Z), D-Lys-(e-Z), (2-Cl-Z)-Lys, (2-Cl-Z)-D-Lys, Lys-(e-2-Cl-Z), D-Lys-(e-2-Cl-Z), DNS-(Lys), Lys-(e-DNS)

R3 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej amidy lub estry metylowe Phe, D-Phe, Tyr, D-Tyr, Ala, D-Ala, Gly, Ile, D-Ile, L i D-Trp; estry metylowe liniowych aminokwasów alifatycznych o długości łańcucha od 3 do 6 atomów węgla a także tryptaminę, metylobenzyloaminy, benzyloaminę, nitrofenylo aminy, fenyloaminy

R4 i R5 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej Gly, Ala, D-Ala, Z-D-Arg, Z-Arg, (2-Cl-Z)-Arg, (2-Cl-Z)-D-Arg,

R6 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej Gly, Ala, D-Ala, Ser-(Bzl), D-Ser-(Bzl), Pro, D-Pro.

Od kilku lat znane i badane są liniowe peptydy biorące udział w mechanizmach obronnych organizmów żywych. Ich funkcje są dopiero poznawane ale do najważniejszych należą obrona przed bakteriami, grzybami, pleśniami itp. Związki takie np. defensyny, protegryny, tachyplesyny, indolicidyna itp. posiadają od 12 do 50 aminokwasów. Wobec rosnącej w skali ogólnoświatowej odporności bakterii na znane i stosowane obecnie antybiotyki, liniowe peptydy uważane są za grupę związków mogącą stanowić ważne źródło nowych farmaceutyków. Pozyskiwać je można ze źródeł naturalnych takich jak ślina ludzka, łzy, skóra, jady gadów i płazów i podobne. Przy ograniczonym dostępie do materiału biologicznego alternatywnym rozwiązaniem mogłaby być synteza chemiczna tych związków. Jednakże, nawet w chwili obecnej synteza związków wielkocząsteczkowych przysparza problemów zarówno technicznych jak i ekonomicznych.

Możliwości zastosowania w medycynie związków o budowie rozgałęzionej (dendrymery) zaczęto badać intensywniej po roku 1986 kiedy opracowano metodykę ich syntezy. Ich podstawową cechą jest możliwość umieszczenia wielu grup funkcyjnych na powierzchni. Przykładowo Tam J. P., Lu Y.A., i Yang, J. L., opublikowali w roku 2002 w European Journal of Biochemistry, 2002, 269, 923-932, pracę pokazującą możliwość zastosowania dendrymerów lizynowych do multiplikowania bakteriostatycznych fragmentów peptydowych protegryny lub tachyplesyny.

Zgłaszający prowadził badania własne właściwości bakteriostatycznych i przciwgrzybicznych różnych dendrymerów, w których grupy funkcyjne niezbędne do przejawienia właściwości bakteriostatycznych i przeciwgrzybicznych są elementami szkieletu dendrymeru.

Nieoczekiwanie okazało się, że związki według wynalazku posiadają taki topograficzny rozkład grup funkcyjnych szkieletu dendrymeru, że wykazują silne właściwości bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne. W dalszych badaniach nieoczekiwanie stwierdzono, że aktywność biologiczną determinuje odpowiedni układ grup zasadowych i aromatycznych.

Nowe związki według wynalazku o strukturze dendrymeru posiadające właściwości bakteriostatyczne, przedstawione są wzorami ogólnymi 1,2, 3 lub 4, w których n stanowi liczbę naturalną 2, 3 lub 4,

R1 i R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, benzyloksykarbonyl (Z), 2-chlorobenzyloksykarbonyl (2-Cl-Z), dansyl (DNS), naftyl, podstawniki aromatyczne, oraz pochodne lizyny w tym Lizyna (Lys), D-Lizyna (D-Lys), Z-Lys, Z-D-Lys, Lys-(e-Z), D-Lys(Z), (2-Cl-Z)-Lys, (2-Cl-Z)-D-Lys, Lys-(e-2-Cl-Z), D-Lys-(e-2-Cl-Z),

R3 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej amidy lub estry metylowe Phe, D-Phe, Tyr. D-Tyr, Ala, D-Ala, Gly, Ile, D-Ile, L i D-Trp; estry metylowe liniowych aminokwasów alifatycznych o długości łańcucha od 3 do 6 atomów węgla a także tryptaminę, metylobenzyloaminy, benzyloaminę, nitrofenyloaminy, fenyloaminy

R4 i R5 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej Gly, Ala, D-Ala, Z-Arg, Z-D-Arg, (2-Cl-Z)-Arg, (2-Cl-Z)-D-Arg,

R6 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej Gly, Ala, D-Ala, Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), Pro, D-Pro.

Zaletą związków według wynalazku jest to, że dzięki odpowiedniej strukturze niskocząsteczkowego dendrymeru, zapewniającej właściwe rozmieszczenie grup odpowiedzialnych za oddziaływanie z błoną komórkową bakterii, uzyskują silne działanie bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne. Taka

PL 197 752 B1 konstrukcja dendrymeru powoduje, że jest on aktywnym związkiem per se, a nie jedynie matrycą do multiplikowania elementów aktywnych.

Związki według wynalazku można otrzymać ogólnie znanymi metodami syntezy peptydów w roztworze, z zastosowaniem aminokwasów blokowanych na N-końcu grupami benzyloksykarbonylowymi (Z) i/lub 2-chlorobenzyloksykarbonylowymi (2-Cl-Z) i/lub t-butyloksykarbonylowymi, sprzęganych za pomocą N.N'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) wobec N-hydroksybenzotriazolu (HOBt).

Otrzymane peptydy oczyszcza się chromatograficznie, korzystnie na kolumnie żelowej zawierającej Sephadex LH-20 (w metanolu), a następnie poprzez użycie preparatywnej kolumny HPLC. Właściwą budowę peptydu i jego czystość potwierdzono przez wykonanie widma ESI-MS (electrospray ionization mass spectrometry).

Syntezę związków oraz ich właściwości bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne zilustrowano w poniższych przykładach wykonania.

P r z y k ł a d y I - VIII.

Związki o wzorach 1,2, 3 i 4 otrzymywano metodą syntezy peptydów w roztworze z zastosowaniem aminokwasów blokowanych na N-końcu grupami benzyloksykarbonylowymi (Z) i/lub 2-Chlorobenzyloksykarbonylowymi (2-Cl-Z) i/lub t-Butyloksykarbonylowymi sprzęganych za pomocą N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) wobec N-hydroksybenzotriazolu (HOBt).

Otrzymane peptydy oczyszczano chromatograficznie na kolumnie żelowej Sephadex LH-20 (w metanolu), a następnie poprzez użycie zawierającej preparatywnej kolumny HPLC. Właściwą budowę peptydu i jego czystość potwierdzano przez wykonanie widma ESI-MS (electrospray ionization mass spectrometry).

W Tabeli 1 przedstawiono aktywność przeciwbakteryjną i przeciwgrzybiczną związków według wynalazku, o strukturze dendrymeru, na szczepy bakterii Escherichia Coli i Staphylococus Aureus oraz grzyby typu Candida Albicans.

T a b e l a 1

Nr przykładu	Związek	MIC (pM) Staphylococ us Aureus ATCC 25923	MIC (pM) Escherichia Coli NCTC 8196	MIC (pM) Candida Albicans ATCC 10231
1	2	3	4	5
I	Z-Lys HCI Z-LysHCI-Lys-PheNH₂	39	39	39
II	HCI Lys(2-CI-Z) HCI Lys(2-CI-Z)-Lys-AlaNH₂	40	85	40
III	HCI Lys(2CI-Z) HCI Lys(2-CI-Z)-D,L-Om-PheNH	170	42	317
IV	HCI Lys(2-CI-Z) HCI Lys(2CI-Z)-Lys-tryptamina	5.1	2.6	167
V	HCI Lys(2-CI-Z) HCI Lys(2-CI-Z)-Lys-MBA[(-)S]	11	55	11
VI	Z-Arg Z-Arg-D-Lys i Z-Arg-D-Lys-D-Lys-PheNH₂ Z-Arg	44	20	20

PL 197 752 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
VII	HCI Lys(2-CI-Z)
	HCI Lys(2-CI-Z)-Lys-Gly-BA	79	79	79
VIII	HCI Lys(2-CI-Z)-Gly
	HCI Lys(2-CI-Z)-Gly-Lys-BA	74	260	132
IX	INDOLICYDYNA	1.5	3.0	—

Testy biologiczne dla badanych związków wykonano dla Staphylococcus aureus ATCC 25923, i Escherichia coli NCTC 8196 oraz dla grzybów typu Candida Albicans ATCC 10231. Dla określenia minimalnego stężenia hamującego - „minimal inhibitory concentration - MIC” zastosowano metodę mikrorozcieńczeń. Stężenie bakterii na mililitr („colony forming units (CFU) per mililiter”) określono przez pomiar absorbancji przy 600 nm.

Związki dendrymeryczne rozpuszczono w pożywce przy pH 7.0 i rozcieńczano 100 μΙ roztworu substancji zmieszano ze 100 μl zawiesiny bakterii. Mieszaniny zawierające 105 CFU i od 1 do 0.003% badanego związku dendrymerycznego poddano inkubacji w 37°C przez 24h. Aktywności wyrażono w jednostkach MIC „minimal inhibitory concentration”, tzn. stężeniu minimalnym, które w 100% zatrzymuje wzrost kultury bakteryjnej. Liczby umieszczone w tabeli 1 są średnią z trzech eksperymentów. Dla porównania podajemy aktywność indolicydyny (Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-TrpArg-Arg-NH2) zmierzoną w naszych warunkach eksperymentalnych.

Claims

1. Nowe związki o strukturze dendrymeru posiadające właściwości bakteriostatyczne i przeciwgrzybiczne, o wzorach ogólnych 1,2, 3 lub 4, w których:

n stanowi liczbę naturalną 2, 3 lub 4,

R1 i R2 są niezależnie wybrane z grupy obejmującej H, benzyloksykarbonyl (Z), 2-chlorobenzyloksykarbonyl (2-Cl-Z), dansyl (DNS), naftylosulfonyl, podstawniki aromatyczne oraz pochodne lizyny, w tym Lizyna (Lys), D-Lizyna (D-Lys), Z-Lys, Z-D-Lys, Lys-(e-Z), D-Lys-(s-Z), (2-Cl-Z)-Lys, (2-Cl-Z)-D-Lys, Lys-(e-2-Cl-Z), D-Lys-(s-2-Cl-Z), DNS-(Lys), Lys-(e-DNS)

R3 jest niezależnie wybrane z grupy obejmującej amidy lub estry metylowe Phe, D-Phe, Tyr, D-Tyr, Ala, D-Ala, Gly, Ile, D-Ile, amidy lub estry metylowe L i D-Trp; estry metylowe liniowych aminokwasów alifatycznych o długości łańcucha od 3 do 6 atomów węgla, a także tryptaminę, metylobenzyloaminy, benzyloaminę, nitrofenyloaminy, fenyloaminy

2. Związki według zastrz. 1, znamienne tym, że przedstawione są wzorem 1, w którym n oznacza 4, R1 oznacza Z-Lys, R2 oznacza Z-Lys, a R3 oznacza PheNH2.

3. Związki według zastrz. 1, znamienne tym, że przedstawione są wzorem 2, w którym n oznacza 4, R4 oznacza Z-Arg, R5 oznacza Z-Arg, a R3 oznacza PheNH2.

4. Związki według zastrz. 1, znamienne tym, że przedstawione są wzorem 3, w którym n oznacza 4, R1 oznacza Lys-(e-2-Cl-Z), R2 oznacza Lys(e-2-Cl-Z), R3 oznacza benzyloaminę (BA) i R6 oznacza Gly.

5. Związki według zastrz. 1, znamienne tym, że przedstawione są wzorem 4, w którym n oznacza 4, R1 oznacza Lys-(e-2-Cl-Z), R2 oznacza Lys(e-2-Cl-Z), a R3 oznacza benzyloaminę (BA) i R6 oznacza Gly.