PL191595B1 - Antagoniści receptorów integryny i kompozycje je zawierające - Google Patents

Abstract

1. Antagonista receptorów integryny, którym jest: sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]-metyloamino]karbonylo]- -5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego; kwas (±)-10,11-dihydro-3-[1-(4,4'-bipiperydynylo)karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10- -octowy; sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego; lub sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[2-(2-pirydylo-amino)etylo]amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są antagoniści receptorów integryny i kompozycje je zawierające. Związki te są przydatne do inhibicji agregacji płytek i łączenia się osteoklastów z kością.

Integryny są rodziną heterodimerycznych białek ogólnie pośredniczących w adhezji komórek. Typowymi takimi białkami jest receptor witronektyny (heterodimer aVb3) i receptor fibrynogenu (heterodimer aIIbb3). Okazało się, że naturalne ligandy tych receptorów (np. witronektyna i fibrynogen) mają wspólną sekwencję aminokwasową -Arg-Gly-Asp-, krytyczną dla wiązania. Wydaje się, że wiele receptorów integryny reaguje krzyżowo z ligandami mającymi taką sekwencję aminokwasową. Na przykład, receptor aIIbb3 reaguje z fibronektyną i witronektyną, trombospondyną i czynnikiem von Willebranda, a także fibrynogenem. Funkcjonalny fibrynogen, dimer mający dwa miejsca wiązania z, reaguje z aktywowanymi receptorami znajdowanymi na powierzchni płytek. Wiązanie receptorów aIIbb3 na sąsiadujących płytkach przez fibrynogen prowadzi do sieciowania i jest uważane za główny czynnik agregacji płytek. Związki inhibitujące wiązanie receptora aIIbb3 z fibrynogenem okazały się inhibitować agregację płytek in vitro, i tworzenie skrzepu in vivo. Patrz, na przykład, zgłoszenie patentowe nr EP-A 0341915.

Receptor witronektyny znajduje się na różnych rodzajach komórek, takich jak osteoklasty i komórki śródbłonka wyścielające naczynia krwionośne. Ostatnie badania wskazują, że w wiązaniu osteoklastów z macierzą kostną biorą udział receptory adhezji do powierzchni tych komórek. Na przykład, Davies, i in., J. Cell Biol., 1989, 109, 1817, ujawnia że funkcjonalny antygen osteoklastów, biorący udział w regulacji resorpcji kości, jest biochemicznie spokrewniony z receptorem witronektyny. Receptor witronektyny wiąże białka macierzy kostnej, takie jak osteopontyna, sialoproteina kości i trombospondyna, które zawierają motyw tripeptydowy Arg-Gly-Asp (lub RGD). Tak więc Horton, i in., Exp. Cell Res. 1991, 195, 368, ujawnia, że zawierające RGD peptydy i przeciwciało antyreceptor witronektyny (23C6) inhibitują resorpcję dentyny i rozprzestrzenianie się komórek przez osteoklasty. Bertolini i in., J. Bone Min. Res., 6, Supl. 1, S146, 252 wykazał, że amid cyklo-S,S-N ^a -acetylocysteinylo-N ^a -metyloargininyloglicyloaspartylopenicylaminy inhibituje przyczepianie się osteoklastów do kości. Dodatkowo, Sato i in., J. Cell Biol. 1990, 111, 1713 ujawnia, że echistatyna, peptyd jadu żmii zawierający sekwencję RGD, jest silnym inhibitorem resorpcji kości w hodowli tkankowej i inhibituje przyczepianie się osteoklastów do kości. Fisher, i in., Endocrinology 1993, 132, 1411, wykazał następnie, że echistatyna inhibituje resorpcję kości in vivo u szczurów. W EP 528587 i 528586 podano, że podstawione fenylowe pochodne inhibitują osteoklastyczną resorpcję kości.

Bondinell, i in. w WO 93/00095 (PCT/US92/05463) i WO 94/14776 (PCT/US93/12436) ujawnia, że pewne związki mające podstawiony 6-7-bicykliczny układ pierścieniowy są przydatne do inhibicji receptora fibrynogenu (aIIbb3). Inne 6-7-bicykliczne układy pierścieniowe inhibitujące receptor fibrynogenu ujawnia Blackburn i in. w publikacji WO 93/08174 (PCT/US92/08788). Blackburn i in w publikacji WO 95104057 (PCT/US94/07989) ujawnia także związki mające pięcio- lub sześcioczłonowy pierścień skondensowany z takim 6-7-bicyklicznym pierścieniem z wytworzeniem tricyklicznego układu pierścieniowego, przydatnego jako antagonista receptora fibrynogenu. Inne związki mające 6-7-bicykliczny układy pierścieniowe selektywnie inhibitujące receptor witronektyny ujawniono w publikacji WO 96/00730 (PCT/US95/08306) i WO 96/00574 (PCT/US95/08146).

Stwierdzono obecnie, że pewne nowe tricykliczne układy pierścieniowe są przydatnymi związkami wzorcowymi do wytwarzania antagonistów receptorów integryny. Stwierdzono też, że takie układy pierścieniowe można stosować jako związki wzorcowe, które można odpowiednio podstawić w celu wytworzenia związków selektywnych wobec receptora fibrynogenu lub receptora witronektyny.

Przedmiotem wynalazku są poniższe związki, wykazujące farmakologiczną aktywność inhibicji receptorów integryny.

Zatem przedmiotem wynalazku jest sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]-metyloamino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego;

kwas (±)-10,11-dihydro-3-[1(4,4'-bipiperydynylo)karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowy;

sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego; lub sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[2-(2-pirydylo-amino)etylo]amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

PL 191 595 B1

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek określony powyżej jako substancję aktywną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Związki będące przedmiotem wynalazku mają zastosowanie w leczeniu chorób, w których patologię można zmieniać przez wiązanie z receptorem integryny, szczególnie witronektyny lub receptorem fibrynogenu. W szczególnym aspekcie, związki według wynalazku są przydatne do leczenia osteoporozy, miażdżycy tętnic, restenozy, raka i stanów, w których pożądana jest inhibicja agregacji płytek, takich jak wylew, przejściowe ataki niedokrwienia, zawał serca i nawrót zakrzepicy po terapii trombolitycznej.

Związki według wynalazku wchodzą w zakres związków o wzorze 1, w którym

A1 oznacza C;

E oznacza fenyl;

X¹-X² oznacza CHR¹-CH;

X³ oznacza CR⁵R^5';

R' oznacza H, C1-C6alkil;

R¹ oznacza H;

R² oznacza -OR';

5'

R⁵ i R^5' oznaczają niezależnie H;

R⁶ oznacza {[(1H-benzoimidazol-2-ilo)metylo]metylo-amino}karbonyl;

1-(4,4'-bipiperydylo)karbonyl;

3-(2-benzimidazolilo)-1-propyl;

2-{[(2-pirydyloamino)etylo]amino}karbonyl;

R³, R⁴ i R⁷ oznaczają niezależnie H.

Związki według wynalazku ogólnie można wytworzyć sposobami opisanymi poniżej dla związków o wzorze 1.

W niniejszym opisie zastosowano skróty i symbole stosowane zazwyczaj w chemii peptydów.

„C1-C6-alkil oznacza metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl i t-butyl, pentyl, n-pentyl, izopentyl, neopentyl i heksyl i oraz ich proste alifatyczne izomery.

Pewne rodniki oznaczono skrótami. t-Bu oznacza trzeciorzędowy rodnik butylowy, Boc oznacza rodnik t-butyloksykarbonylowy, Fmoc oznacza rodnik fluorenylometoksykarbonylowy, Ph oznacza rodnik fenylowy, Cbz oznacza rodnik benzyloksykarbonylowy, BrZ oznacza rodnik o-bromo-benzyloksykarbonylowy, ClZ oznacza rodnik o-chlorobenzyloksykarbonylowy, Bn oznacza rodnik benzylowy, 4-MBzl oznacza rodnik 4-metylobenzylowy, Me oznacza metyl, Et oznacza etyl, Ac oznacza acetyl, Alk oznacza C1-4-alkil, Nph oznacza 1-lub 2-naftyl i cHex oznacza cykloheksyl. MeArg oznacza N^a-metyloargininę. Tet oznacza 5-tetrazolil.

Pewne odczynniki oznaczono skrótami. DCC oznacza dicykloheksylokarbodiimid, DMAP oznacza dimetyloaminopirydynę, DIEA oznacza diizopropyloetyloaminę, EDC oznacza N-etylo-N'(di-metyloaminopropylo)-karbodiimid. HOBt oznacza 1-hydroksybenzotriazol, THF oznacza tetrahydrofuran, DMF oznacza di-metyloformamid, NBS oznacza N-bromosukcynoimid, Pd/C oznacza katalizator, pallad na węglu, DPPA oznacza azydek difenylofosforylu, BOP oznacza heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksytris(dimetyloamino)fosfoniowy, HF oznacza kwas fluorowodorowy, PPA oznacza kwas polifosforowy, TEA oznacza trietyloaminę, TFA oznacza kwas trifluorooctowy, PCC oznacza chlorochromian pirydyniowy.

Szczególnie przydatnym związkiem pośrednim do wytwarzania związków według wynalazku jest związek o wzorze 10, w którym X¹, X², X³, R², R³, R⁴, A1i E są takie, jak zdefiniowano dla wzoru 1, ₁ a L¹ znajduje się w położeniu meta do połączenia pierścieni i oznacza CHO, CO2R', Br, I, OH, ^CF3^SO3^.

Korzystnie, L¹ oznacza OH, CF3SO3 lub CO2R¹.

Związki o wzorze 1 ogólnie wytwarza się sprzęgając związek pośredni o wzorze 10 ze związkiem R^6', który oznacza 2-(metyloamino)metylobenzimidazol,

1-BOC-4,4'-bipiperydynę,

4-(2-tetrahydropyranyloksy)-1-tributylostannylo-1-butyn lub 2-[2-aminoetylo)amino]pirydynę.

Sposoby takiego sprzęgania są dobrze znane. Zgłoszenia patentowe WO 93/08174 (PCT/US92/08788; Genentech), WO 93/08174 (PCT/US92/08788; Genentech), WO 96/00730 (PCT/US95108306; SmithKline Beecham), WO 96/00574 (PCT/US95/08146; SmithKline Beecham), WO 93/00095

PL 191 595 B1 (PCT/US92/05463; SmithKline Beecham) i WO 94/14776 (PCT/US93/12436; SmithKline Beecham) ogólnie ujawniają takie reakcje i są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

Związki o wzorze 10, w którym A1= C, a E oznacza fenyl, wytwarza się sposobem przedstawionym na schemacie 1, gdzie warunki reakcji określono poniżej

a) Tf2O, 2,6-lutydyna, CH2Cl2; b) allilotributylocyna, LiCl, (Ph3P)2PdCl2, DMF; c) RuCl3, H5IO6, CCl4, CH3CN, H2O; d) PPA; e) EtOAc/LiHMDS, THF; f) H2, 10% Pd/C, stęż. HCl, AcOH; g) EtSH, AlCl3, CH2Cl2; h) Tf2O, 2,6-lutydyna, CH2Cl2; i) CO, Pd(OAc)2, KOAc, dppf, DMSO.

2-Benzylo-4-metoksyfenol (J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64) przekształca się w odpowiedni trifluorometanosulfonianowy ester, związek drugi ze schematu 1 (61b) w reakcji z bezwodnikiem trifluorometanosulfonowym (Tf2O) w obecności odpowiedniej zasady, na przykład 2,6-lutydyny, w obojętnym rozpuszczalniku, zwykle CH2Cl2. Reakcja związku o wzorze 61b z alliltributylocyną w obecności LiCl i katalizatora palladowego, np. chlorku bis(trifenylofosfino)palladu (II) ((Ph3P)2PdCl2), w obojętnym rozpuszczalniku takim jak DMF, sposobem opisanym przez Tilleya (J. Org. Chem. 1990, 55, 906), prowadzi do wytworzenia związku o wzorze 61c. Utleniające rozszczepienie olefiny 61c z wytworzeniem bezpośrednio kwasu karboksylowego o wzorze 61d można prowadzić poprzez reakcję z właściwym środkiem utleniającym, klasycznie KMnO4, w odpowiednim wodnym rozpuszczalniku, takim jak wodny roztwór acetonu lub wodny roztwór kwasu octowego. Korzystnie jednak utleniające rozszczepienie olefiny o wzorze 61c z wytworzeniem bezpośrednio kwasu karboksylowego o wzorze 61d prowadzi się zgodnie z ogólnym sposobem Sharplessa (J. Org. Chem. 1981, 4, 3936; J. Org. Chem. 1985, 50, 1560, odnośnik 4), w którym RuO4 wytwarza się in situ w reakcji RuCl3 lub RuO2 z NaIO4 lub H5IO6 w mieszaninie rozpuszczalników CCl4, CH3CN, i H2O. Alternatywnie, utlenianie można prowadzić w dwu operacjach, w pierwszym etapie obejmującym utleniające rozszczepienie olefiny do odpowiedniego aldehydu, które można prowadzić w procedurach dobrze znanych fachowcom, a następnie przez utlenianie aldehydu do kwasu karboksylowego stosując, np., NaClCO2 jak opisuje Pinnick (Tetrahedron 1981, 37, 2091) lub Dalcanale i Montanari (J. Org. Chem. 1986, 51, 567). Cyklizację związku o wzorze 61d do 61e można prowadzić stosując kwas polifosforowy, zgodnie ze sposobem opisanym przez Proctora, Renfrew, i Savage (J. Chem. Soc. (C) 1969, 1000). Alternatywnie, związek o wzorze 61d można przekształcić w związek o wzorze 61e przez odpowiedni chlorek kwasowy 61d, który można wytwarzać sposobami dobrze znanymi fachowcom. Działanie na ten chlorek kwasowy odpowiednim katalizatorem Friedela-Craftsa, takim jak AlCl3 lub SnCl4, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak CH2Cl2 lub CS2, daje cykliczny keton o wzorze 61e. Reakcję związku o wzorze 61e typu aldolowego z enolanem octanu etylu, który można wytworzyć z octanu etylu działaniem właściwego amidu zasadowego, na przykład diizopropyloamidu litu (LDA) lub bis(trimetylosililo)amidu litu (LiHMDS), prowadzi do wytworzenia związku o wzorze 61f. Często THF jest rozpuszczalnikiem z wyboru dla reakcji aldolowej, chociaż często stosuje się THF w obecności różnych dodatków, na przykład HMPA lub TMEDA. Redukcję związku o wzorze 61f z wytworzeniem związku o wzorze 61g można prowadzić przez hydrogenolizę nad właściwym katalizatorem, np. palladem metalicznym na aktywowanym węglu (Pd/C), we właściwym rozpuszczalniku, takim jak kwas octowy, w obecności kwasu mineralnego takiego jak HCl. Alternatywnie, redukcję można prowadzić działając na związek o wzorze 61f trietylosilanem w obecności eteratu trifluorku boru ogólną metodą Orphanopoulosa i Smonu (Synth. Commun. 1988, 833). Usunięcie eteru metylowego ze związku o wzorze 61g z wytworzeniem związku o wzorze 61h można prowadzić stosując BBr3 w obojętnym rozpuszczalniku, np. CH2Cl2, w reakcji z etanotiolem i AlCl3 w obojętnym rozpuszczalniku, korzystnie CH2Cl2. Inne przydatne sposoby usuwania eteru metylowego opisał Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis” (John Wiley i Sons). Związek o wzorze 61i, trifluorometanosulfonianowy ester związku o wzorze 61g, wytworzony sposobem opisanym wcześniej dla konwersji związku o wzorze 61a w związek o wzorze 61b, reaguje z tlenkiem węgla w obecności octanu potasu, 1,1'-bis(difenylofosfino)ferrocenu (dppf), i katalizatora palladowego, np. octanu palladu (Pd(OAc)2), w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie DMSO, zgodnie z ogólnym sposobem opisanym przez Cacchi i Lupi (Tet. Lett. 1992, 33, 3939), z wytworzeniem związku o wzorze 61j.

Proste tripodstawione benzenowe substraty są dostępne w handlu lub wytwarza się je rutynowymi znanymi sposobami.

Sposoby sprzęgania z wytworzeniem wiązań amidowych są ogólnie dobrze znane. Sposoby syntezy peptydów ogólnie podane przez Bodansky i in., THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS, Springer-Verlag, Berlin,1984, Ali i in. w J. Med. Chem. 29, 984 (1986) i J. Med. Chem., 30, 2291 (1987)

PL 191 595 B1 stanowią ilustrację techniki są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe. Odczynniki sprzęgające w niniejszym opisie oznaczają odczynniki, które można stosować do wytwarzania wiązań amidowych. Typowe sposoby sprzęgania wykorzystują karbodiimidy, aktywowane bezwodniki oraz estry i halogenki acylu. Odczynniki takie jak EDC, DCC, DPPA, BOP, HOBt, N-hydroksysukcynimid i chlorek oksalilu są typowymi odczynnikami.

Typowo aminę lub anilinę sprzęga się poprzez wolną grupę aminową z właściwym kwasem karboksylowym stosując odpowiedni karbodiimidowy środek sprzęgający, taki jak N,N'-dicykloheksylokarbodiimid (DCC), ewentualnie w obecności katalizatorów takich jak 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) i dimetylo-aminopirydyna (DMAP). Inne sposoby, takie jak wytwarzanie aktywowanych estrów, bezwodników lub halogenków kwasowych, z wolnego karboksylu dogodnie zabezpieczonego kwasu, i dalszą reakcję z wolną grupą aminową dogodnie zabezpieczonej aminy, ewentualnie w obecności zasady, są także odpowiednie. Przykładowo zabezpieczony Boc aminokwas lub Cbz kwas amidynobenzoesowy traktuje się w bezwodnym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu lub tetrahydrofuran (THF), w obecności zasady, takiej jak N-metylomorfolina, DMAP lub trialkiloamina, chloromrówczanem izobutylu z wytworzeniem „aktywowanych bezwodników”, poddawanych następnie reakcji z wolną grupą aminową drugiego zabezpieczonego aminokwasu lub aniliny.

Związki takie jak związki o wzorze 61j przekształca się w związki o wzorze 1w reakcji sprzęgania, takiej jak reakcja sprzęgania amidu na schemacie 3, gdzie warunki reakcji określono poniżej

a) 1-BOC-4,4'-bipiperydyna [RP), EDC, HOBt-H2O, (i-Pr)2NEt, DMF; b) 1,0 N LiOH, THF, H2O; c) 1,0 N HCl, H2O; d) TFA, CH2Cl2 [R = 1-(4,4'-bipiperydyna)].

(±)-10,11-dihydro-3-karboksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu (o wzorze 61j), wytworzony jak opisano na schemacie 1, przekształca się w aktywowaną postać kwasu karboksylowego stosując, np. EDC i HOBt, lub SOCl2 i aktywowaną postać poddaje się z kolei reakcji z właściwą aminą, na przykład 1-BOC-4,4'-bipiperydyna lub di-chlorowodorkiem 2-(metyloamino)metylobenzimidazolu, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak DMF, CH2Cl2, lub CH3CN, z wytworzeniem związku o wzorze 63a ze schematu reakcji 3. W zależności od tego, czy konieczne jest zobojętnienie kwasu, można stosować zasadę, taką jak diizopropyloetyloamina ((iPr)2NEt) lub pirydyna. Znanych jest wiele dodatkowych sposobów przekształcania kwasu karboksylowego w amid, można je znaleźć w standardowych poradnikach, takich jak „Compendium of Organic Synthetic Methods, tom I-VI (publikacja Wiley Interscience). Ester etylowy 63a hydrolizuje się stosując wodny roztwór zasady, np. LiOH w wodnym roztworze THF lub NaOH w wodnym roztworze metanolu i pośrednią sól karboksylanową zakwasza się odpowiednim kwasem, na przykład TFA lub HCl, z wytworzeniem kwasu karboksylowego 63b. Alternatywnie, pośrednią sól karboksylanową można wydzielić, w razie potrzeby, lub sól karboksylanową wolnego kwasu karboksylowego można wytwarzać sposobami dobrze znanymi specjalistom. Jeśli składnik aminowy reakcji tworzenia wiązania amidowego (61j w 63a) zawiera grupę zabezpieczającą, grupę tę można usunąć przed lub po etapie hydrolizy estru, stosując sposoby odpowiednie dla selektywnego odblokowania konkretnych wykorzystanych grup zabezpieczających. Takie sposoby opisuje Green, „Protective Groups in Organic Synthesis” (publikacja Wiley-Interscience). Przykładowo, jeśli składnik aminowy zawiera grupę azotową zabezpieczoną grupą t-butoksykarbonylową (BOC), taką jak w związku 63b, grupę BOC usuwa się w warunkach kwasowych, stosując, na przykład, 4 N HClw dioksanie lub kwas trifluorooctowy (TFA) w CH2Cl2, z wytworzeniem soli amoniowej 63c. Sól amoniową można zobojętnić, w razie potrzeby, sposobami znanymi specjalistom.

Schemat 4 ilustruje sposób sprzęgania tworzący wiązanie węgiel-węgiel, który można stosować w celu wprowadzania potrójnego wiązania, podwójnego wiązania lub pojedynczego wiązania węgiel-węgiel przez ewentualne zastosowanie właściwych środków redukujących (np. w etapie b). Warunki reakcji na schemacie 4 określono poniżej

a) THPOCH2CH2CCSn(Bu)3, (PPh3)2PdCl2, LiCl, dioksan; b)H2, 10% Pd/C, EtOAc; c) p-TsOHH2O, EtOH; d) chlorek 2,2,6,6-tetrametylooksopiperydyniowy, CH2Cl2; e) NaClO2, Na2HPO3, 2-metylo-2-buten, H2O; f) chloromrówczan izobutylu, 4-metylo-morfolina, następnie 1,2-fenylenodiamina; g) AcOH, THF; h) 1,0 N NaOH, EtOH, następnie zakwaszenie.

Związek o wzorze 61i, poddaje się reakcji z 4-(2-tetrahydropiranyloksy)-1-tributylostannylo-1-butynem w reakcji sprzęgania typu Stille aromatycznych trifluorooctanów i organostannanów (J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 5478-5486) z wytworzeniem związku o wzorze 64a. Reakcję katalizuje sól palladu, korzystnie chlorek bis(trifenylofosfino)palladu (II) ((PPh3)2PdCl2), i prowadzi się ją w obecności chlorku litu, we właściwym obojętnym rozpuszczalniku, zwykle DMF lub 1,4-dioksanie. Redukcję acetylenowych jednostek związku o wzorze 64a prowadzi się w standardowych warunkach uwodornienia

PL 191 595 B1 dobrze znanych fachowcom. Powstający związek o wzorze 64b odblokowuje się w standardowych warunkach w celu usunięcia eteru tetrahydropiranylowego (THP), z wytworzeniem związku o wzorze 64c. Różne warunki odblokowania eterów THP opisano w standardowych poradnikach, takich jak Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis (publikacja Wiley-Interscience). Ugrupowanie pierwszorzędowego alkoholu związku o wzorze 64c utlenia się do odpowiedniego kwasu karboksylowego o wzorze 64d w dwuetapowym sposobie opisanym przez Wovkulicha (J. Org. Chem., 1993, 58, 832-839). Opisano wiele różnych alternatywnych sposobów utleniania pierwszorzędowego alkoholu do odpowiedniego kwasu karboksylowego, i można je znaleźć w takich poradnikach.

Konwersja kwasu karboksylowego o wzorze 64d w benzimidazolową pochodną o wzorze 64e wykorzystuje ogólne procedury opisanym w WO. Tak więc, związek o wzorze 64d przekształca się wstępnie w aktywowane postaci kwasu karboksylowego stosując, np. chloromrówczan izobutylu, w obecności odpowiedniej zasady, zwykle 4-metylomorfoliny, trietyloaminy lub diizopropyloetyloaminy, w obojętnym rozpuszczalniku takim jak THF lub CH2Cl2. Aktywowaną postać poddaje się z kolei reakcji z nadmiarem właściwej 1,2-diaminoaromatycznej pochodnej, na przykład 1,2-fenylenodiaminy, z wytworzeniem odpowiedniego mono-amidu. Mono-amid poddaje się następnie cyklizacji w standardowych warunkach, na przykład kwasie octowym we wrzącym THF, otrzymując związek o wzorze 64e. Jego ester etylowy hydrolizuje się stosując wodny roztwór zasady, np. LiOH w wodnym roztworze THF lub NaOH w wodnym roztworze metanolu lub etanolu, i pośrednią sól karboksylanową zakwasza się odpowiednim kwasem, na przykład TFA lub HCl, z wytworzeniem kwasu karboksylowego o wzorze 64f. Alternatywnie, pośrednią sól karboksylanową można wyodrębnić, w razie potrzeby, lub sól karboksylanową wolnego kwasu karboksylowego można wytwarzać sposobami dobrze znanymi specjalistom.

Schemat 5 ilustruje sposób sprzęgania tworzący wiązanie węgiel-tlen, który można stosować w celu wytworzenia wiązania eterowego. Podobne sposoby sprzęgania można także stosować do wytwarzania wiązań siarczkowych i aminowych. Warunki reakcji na schemacie 5 określono poniżej

a) 2-[(3-hydroksy-1-propylo)amino]pirydyno-N-tlenek, DEAD, (Ph)3P, DMF; b) cykloheksen, 10% Pd/C, 2-propanol; c) 1,0N NaOH, EtOH, następnie zakwaszenie.

Związek o wzorze 61h poddaje się reakcji z 2-((3-hydroksy-1-propylo)amino]pirydyno-N-tlenkiem w reakcji sprzęgania typu Mitsunobu (Organic Reactions 1992, 42, 335-656; Synthesis 1981, 1-28) z wytworzeniem związku 65a. W reakcji pośredniczy kompleks azodikarboksylan dietylu - trifenylofosfina, i prowadzi się ją w aprotonowym rozpuszczalniku, np. THF, CH2Cl2, lub DMF. Ugrupowanie pirydyno-N-tlenkowe związku o wzorze 65a poddaje się redukcji do odpowiedniej pirydyny o wzorze 65b w warunkach uwodornienia z przeniesieniem wodoru stosując katalizator palladowy, korzystnie pallad metaliczny na aktywowanym węglu, w obojętnym rozpuszczalniku, na przykład metanolu, etanolu lub 2-propanolu. Cykloheksen, 1,4-cykloheksadien, kwas mrówkowy i sole kwasu mrówkowego, takie jak mrówczan potasu lub amonu, stosuje się zwykle jako odczynniki przenoszenia wodoru w tym typie reakcji. Ester etylowy związku o wzorze 65b zmydla się w opisany na schemacie sposób 1 z wytworzeniem związku o wzorze 65c.

Związki według wynalazku można stosować do wytwarzania leku. Kompozycje farmaceutyczne tych związków wytworzonych w sposób wyżej opisany można formułować jako roztwory lub liofilizowane proszki do pozajelitowego podawania. Proszki można rekonstytuować przed użyciem przez dodatek odpowiedniego rozcieńczalnika lub innego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Ciekłym preparatem może być buforowany, izotoniczny roztwór wodny. Przykłady odpowiednich rozcieńczalników stanowią normalna izotoniczna solanka, standardowa 5% glukoza w wodzie lub buforowany roztwór octanu sodu lub amonu. Taka kompozycja jest szczególnie przydatna do pozajelitowego podawania, lecz można ją także stosować do doustnego podawania lub umieszczać w odmierzającym dawki inhalatorze lub rozpylaczu do wdychania. Może być pożądane dodanie substancji pomocniczych takich jak poliwinylopirolidon, żelatyna, hydroksyceluloza, guma arabska, poli(glikol etylenowy), mannitol, chlorek lub cytrynian sodu.

Alternatywnie związki te można kapsułkować, tabletkować lub wytwarzać jako emulsję lub syrop do doustnego podawania. Farmaceutycznie dopuszczalne stałe lub ciekłe nośniki można dodawać w celu polepszenia lub stabilizacji kompozycji, lub dla ułatwienia wytwarzania kompozycji. Stałe nośniki obejmują skrobię, laktozę, dihydrat siarczanu wapnia, kaolin, stearynian magnezu lub kwas stearynowy, talk, pektynę, gumę arabską, agar lub żelatynę. Ciekłe nośniki obejmują syrop, olej arachidowy, oliwę z oliwek, solankę i wodę. Nośnik może także obejmować substancję spowolnionego uwalniania taką jak monostearynian di lub stearynian glicerylu, sam lub z woskiem. Ilość stałego nośnika jest zmienna, lecz korzystnie będzie wynosiła od około 20 mg do około 1 g na dawkę jednostkową.

PL 191 595 B1

Farmaceutyczne preparaty sporządza się stosując, w razie potrzeby, konwencjonalne techniki farmaceutyczne obejmujące mielenie, mieszanie, granulowanie i prasowanie, do wytwarzania tabletek; lub mielenie, mieszanie i napełnianie do wytwarzania twardych żelatynowych kapsułek. Gdy stosuje się ciekły nośnik, kompozycja będzie miała postać syropu, eliksiru, emulsji lub zawiesiny wodnej lub niewodnej. Taką ciekłą kompozycję można podawać bezpośrednio doustnie lub wprowadzać do miękkich żelatynowych kapsułek.

Dla doodbytniczego podawania, związki według wynalazku można także połączyć z substancjami pomocniczymi takimi jak masło kakaowe, gliceryna, żelatyna lub poli(glikole etylenowe) i uformować w czopek.

Związki opisane tutaj, będące antagonistami receptora witronektyny, są przydatne do leczenia chorób, których patologię przypisuje się ligandowi lub komórce oddziałującej z receptorem witronektyny. Na przykład, związki te są przydatne do leczenia chorób, w których utrata macierzy kostnej prowadzi do patologii. Tak więc związki są przydatne do leczenia osteoporozy, nadczynności przytarczyc, choroby Pageta, złośliwej hiperkalcemii, osteolitycznych ubytków przy przerzucie na kości, utraty masy kostnej wskutek unieruchomienia lub niedoboru hormonów płciowych. Związki według wynalazku mają też być przydatne jako środki przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, przeciwnaczyniotwórcze i przeciwprzerzutowe, oraz do leczenia raka, miażdżycy tętnic i restenozy. W szczególności, związki według wynalazku są przydatne do inhibicji restenozy po plastyce naczyniowej.

Związki według wynalazku inhibitujące wiązanie fibrynogenu stosuje się do inhibicji agregacji płytek i tworzenia skrzepu u ssaka, szczególnie człowieka, poprzez wewnętrzne podawanie związku według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Wskazania dla takiej terapii obejmują ostry zawał serca (AMI), głęboką zakrzepicę żylną, zator płucny, tętniak rozwarstwiający, przejściowy atak niedokrwienia (TIA), udar i inne związane z zawałem zaburzenia, oraz dusznica niestabilna. Przewlekłe lub ostre stany nadkrzepliwości, takie jak rozsiana wewnątrznaczyniowa koagulacja (DIC), posocznica, wstrząs chirurgiczny lub infekcyjny szok, uraz pooperacyjny i poporodowy, chirurgia sercowo-płucnych bypassów, transfuzja niezgodnej krwi, przedwczesne oddzielenie się łożyska, choroba Moschowitza (TTP), jad żmii i choroby układu odpornościowego, mogą reagować na takie leczenie. Ponadto związki według wynalazku mogą być przydatne w sposobie zapobiegania stanom przerzutowym, zapobiegania lub leczenia infekcji grzybiczych lub bakteryjnych, indukcji immunostymulacji, leczenia anemii sierpowatej i zapobiegania lub leczenia chorób związanych z resorpcją kości.

Ponadto związki według wynalazku są przydatne do inhibicji reokluzji tętnicy lub żyły po terapii fibrynolitycznej. Podawanie tego związku w terapii fibrynolitycznej zapobiega reokluzji całkowicie lub przedłuża czas reokluzji. W kontekście obecnego wynalazku termin „środek fibrynolityczny oznacza dowolny związek, naturalny lub syntetyczny, bezpośrednio lub pośrednio powodujący liżę skrzepu fibrynowego. Aktywatory plazminogenu są dobrze znaną grupą środków fibrynolitycznych. Przydatne aktywatory plazminogenu obejmują, np. anistreplazę, urokinazę (UK), pro-urokinazę (pUK), streptokinazę (SK), tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) i ich mutanty lub warianty.

Związki według wynalazku można także stosować in vitro do inhibicji agregacji płytek we krwi i produktach krwi, np. przy przechowywaniu, lub do manipulacji ex vivo, takich jak w zastosowaniach diagnostycznych lub badawczych.

Związek podaje się doustnie lub pozajelitowo pacjentowi w taki sposób, że stężenie leku jest dostateczne do inhibicji resorpcji kości, lub inhibicji agregacji płytek lub innych takich wskazań. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą związek podaje się doustnie w dawce od około 0,1 do około 50 mg/kg w sposób zależny od stanu pacjenta. Korzystnie doustna dawka wynosi około 0,5 do około 20 mg/kg. Przy terapii ostrej, korzystne jest podawanie pozajelitowe. Dożylna infuzja związku w 5% glikozie w wodzie lub normalnej solance, lub podobna kompozycja z odpowiednimi zaróbkami, jest najskuteczniejsza, chociaż przydatna jest też iniekcja domięśniowa. Typowo pozajelitowa dawka wynosi około 0,01 do około 100 mg/kg; korzystnie pomiędzy 0,1 i 20 mg/kg. Związki podaje się jeden do czterech razy dziennie w ilości pozwalającej osiągnąć dzienną dawkę około 0,4 do około 400 mg/kg/dzień. Dokładną ilość i sposób podawania związków łatwo określi specjalista porównując poziom środka we krwi ze stężeniem dającym efekt terapeutyczny.

Związki można testować jedną z kilku biologicznych prób w celu określenia stężenia związku koniecznego do uzyskania farmakologicznego efektu.

INHIBICJA WIĄZANIA WITRONEKTYNY. Wiązanie w fazie stałej [³H]-SK&F-107260 z avb3. Ludzkie avb3 z łożyska lub płytek krwi (0,1-0,3 mg/ml) w buforze T (zawierającym 2 mM CaCl2 i 1% oktyloglukozydu) rozcieńczono buforem T zawierającym 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2

PL 191 595 B1 (bufor A) i 0,05% NaN3, i następnie natychmiast umieszczono na 96-studzienkowych płytkach ELISA (Corning, New York, NY) w ilości 0,1 ml na studzienkę. Dodano 0,1-0,2 mg avb3 na studzienkę. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. W czasie eksperymentu studzienki przemywano raz buforem A i inkubowano w 0,1 ml 3,5% albuminy surowicy bydlęcej w tym samym buforze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zawartości studzienek odciągnięto całkowicie i przemyto je dwukrotnie 0,2 ml buforu A.

Związki rozpuszczono w 100% DMSO z wytworzeniem 2 mM roztworu podstawowego, który rozcieńczono buforem wiązania (15 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM MgCl2) do końcowego stężenia związku 100 mM. Roztwór ten rozcieńczono następnie do żądanego końcowego stężenia związku. Różne stężenia nieznakowanych antagonistów (0,001-100 mM) dodawano do studzienek w trzech powtórzeniach, dodając następnie 5,0 nM [³H]-SK&F-107260 (65 -86 Ci/mmol).

Płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zawartości studzienek odciągnięto całkowicie i przemywano je raz 0,2 ml lodowato zimnego buforu A, każdą po kolei. Receptory solubilizowano w 0,1 ml 1% SDS i ilość związanego [³H]-SK&F-107260 określono metodą zliczania w ciekłym liczniku scyntylacyjnym przy dodaniu 3 ml Ready Safe w Beckman LS Liquid Scintillation Counter, z wydajnością 40%. Niespecyficzne wiązanie [³H]-SK&F-107260 określono w obecności 2 mM SK&F-107260 i było ono mniejsze niż 1% całości wprowadzonego radioligandu. IC50 (stężenie antagonisty inhibitujące 50% wiązania [³H]-SK&F-107260) określono stosując procedurę nieliniowego dopasowania krzywej metodą najmniejszych kwadratów zmodyfikowaną w programie LUNDON-2. Ki (stałą dysocjacji antagonisty) obliczono zgodnie z równaniem: Ki = IC50, (1 + L/Kd), gdzie L i Kd oznaczają odpowiednio stężenie i stałą dysocjacji [³H]-SK&F-107260.

Związki według wynalazku inhibitują wiązanie witronektyny z SK&F-107260 w zakresie stężeń od 0,1 do 25 mM. Korzystne związki inhibitują wiązanie witronektyny w stężeniu mniejszym niż1 mM.

Związki według wynalazku zbadano także in vitro i in vivo na resorpcję kości w testach standardowych oceny inhibicji tworzenia się masy kostnej, takich jak próba tworzenia wgłobienia ujawniona w zgłoszeniu patentowym nr EP 528 587, którą można także prowadzić stosując ludzkie osteoklasty zamiast szczurzych oraz model szczura po wycięciu jajników, opisany przez Wrońskiego i in., Cells and Materials 1991, dodatek 1, 69-74.

MODEL SZCZURA PO WYCIĘCIU PRZYTARCZYC. Każda eksperymentalna grupa obejmuje 5-6 samców szczurów Spraque-Dawley. Na 7 dni przed stosowaniem w badaniu szczurom wycina się przytarczyce (dostawca, Taconic Farms). 24 godziny przed stosowaniem mierzy się poziomy zjonizowanego wapnia w pełnej krwi zaraz po jej pobraniu przez nakłucie żyły ogonowej do heparynizowanych probówek. Szczury włącza się do badania, jeśli poziom jonów Ca (mierzony analizatorem pH wapnia Ciba-Corning model 634) wynosi £1,2 mM/l. Szczury utrzymuje się następnie na diecie bezwapniowej i na dejonizowanej wodzie. Na początku eksperymentu szczury mają ciężar ciała około 100 g. Mierzy się podstawowe poziomy Ca i szczurom podaje się kontrolny nośnik (solankę) lub związek (rozpuszczony w solance) jako pojedynczy dożylny bolus (żyła ogonowa), po czym natychmiast podaje się pojedyncze podskórne wstrzyknięcia peptydu 1-34 ludzkiego hormonu przytarczyc (hPTH1-34, dawka 0,2 mg/kg w solance/0,1% albuminy surowicy bydlęcej, Bachem, Ca) lub nośnika PTH. Odpowiedź wapniową na PTH (i wszelki wpływ związku na tę odpowiedź) mierzy się 2 godziny po podaniu związku/PTH.

MODEL KOŚCI ŁOKCIOWEJ SZCZURA. Każda eksperymentalna grupa obejmuje 8-10 samców szczurów Spraque-Dawley lub Wistar mających ciężar ciała na początku eksperymentu około 30-40 g. Środek testowany podawano właściwą drogą jako pojedyncze lub wielokrotne dzienne dawki przez okres 7 dni. Przed podawaniem pierwszej dawki, szczurom podaje się pojedynczą dawkę fluorescencyjnego markera (tetracyklina 25 mg/kg, lub kalceina 10 mg/kg), aby znakować pozycje powierzchni tworzących kości w tym momencie. Po zakończeniu dawkowania związku szczury uśmierca się i obie przednie łapy usuwa do łokcia, stopę usuwa się na kostce i usuwa skórę. Próbkę zamraża się i mocuje pionowo w uchwycie mikrotomu. Przekroje środka trzonu kości łokciowej tnie się w kriostacie. Szybkość resorpcji kości mierzy się morfometrycznie w części środkowo-grzbietowej korowej kości. Pomiar wykonuje się następująco: ilość kości resorbowanej na powierzchni okostnowej jest równa odległości, o jaką powierzchnia okostnowa przesunęła się w kierunku fluorescencyjnego znacznika włączonego w śródkostną powierzchnię tworzenia kości w dniu zerowym; odległość tę oblicza się odejmując szerokość kości pomiędzy znacznikiem a powierzchnią okostnową w 7 dniu od szerokości w dniu zerowym; szybkość resorpcji w mm/dzień oblicza się dzieląc wynik przez 7.

PL 191 595 B1

TEST RESORPCJI LUDZKICH OSTEOKLASTÓW („próba wgłobienia). Próbki zawiesin pochodzących z kościogubczaka komórek pobiera się z ciekłego azotu, ogrzewa szybko w temperaturze 37°C i przemywa x1 RPMI-1640 przez odwirowanie (1000 obrotów na minutę, 5 minut w temperaturze 4°C). Pożywkę odsysa się i zastępuje mysim przeciwciałem anty-HLA-DR, rozcieńczonym 1:3 w pożywce RPMI-1640. Inkubuje się przez 30 minut na lodzie często mieszając zawiesinę komórek. Komórki przemywa się x2 zimnym RPMI-1640 przez odwirowanie (1000 obrotów na minutę, 5 minut w temperaturze 4°C)i przenosi do sterylnej 15 ml probówki wirówkowej. Liczbę jednojądrzastych komórek zlicza się w ulepszonej komorze zliczającej Neubauera. Dostateczną ilość magnetycznych kulek (5/jednojądrzastą komórkę), powlekanych kozią anty-mysią IgG, pobiera się z zapasowej butli i umieszcza w 5 ml świeżej pożywki (w ten sposób zmywa się toksyczny konserwujący azydek). Pożywkę usuwa się unieruchamiając kulki magnesem i zastępując ją świeżą pożywką. Kulki miesza się z komórkami i zawiesinę inkubuje przez 30 minut na lodzie. Zawiesinę często miesza się. Komórki pokryte kulkami unieruchamia się magnesem i pozostałe komórki (frakcja bogata w osteoklasty) zlewa się do sterylnej 50 ml probówki wirówkowej. Świeżą pożywkę dodaje się do pokrytych kulkami komórek w celu uwolnienia wszelkich schwytanych osteoklastów. Ten proces przemywania powtarza się x10. Pokryte kulkami komórki odrzuca się. Osteoklasty zlicza się w komorze zliczającej, stosując jednorazową pipetę pasteurowską z tworzywa do napełniania komory próbką. Komórki odwirowuje się, uzyskuje się osad i gęstość osteoklastów ustawia na 1,5x 10⁴/ml w pożywce EMEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą i (1,7 g/litr) wodorowęglanem sodu. Porcje 3 ml zawiesiny komórek (na próbę) zlewa się do 15 ml probówek wirówkowych. Komórki odwirowuje się uzyskując osad. Do każdej probówki 3ml dodaje się odpowiedniego leku (rozcieńczonego do 50 mMw pożywce EMEM). Do eksperymentu włącza się również właściwy nośnik kontrolny, próbę pozytywną (87 MEM1 rozcieńczone do 100 mg/ml) i izotypową próbę kontrolną (IgG2a rozcieńczone do 100 mg/ml). Inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 minut. Próbki 0,5ml komórek wysiewa się na sterylnych plasterkach dentyny w 48-studzienkowych płytkach i inkubuje w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Każde badanie prowadzi się w czterech powtórzeniach. Plasterki przemywa się sześciokrotnie ciepłym PBS (10 ml/studzienkę w 6-studzienkowej płytce) i umieszcza następnie w świeżym leku lub związku kontrolnym. Inkubuje się w temperaturze 37°C przez 48 godzin.

Procedura odpornej na winian kwasowej fosfatazy (TRAP) (selektywne barwienie komórek linii osteoklastów). Plasterki przemywa się w solance buforowanej fosforanem i utrwala 2% aldehydem glutarowym (w 0,2 M kakodylanie sodu) przez 5 minut. Przemywa się je wodą i inkubuje w buforze TRAP przez 5 minut w temperaturze 37°C. Po przemyciu zimną wodą inkubuje się je w zimnym buforze octanowym/trwałym czerwonym granacie przez 5 minut w temperaturze 4°C. Nadmiar buforu odsysa się, i plasterki suszy na powietrzu po przemyciu wodą. Osteoklasty TRAP pozytywne zlicza się przy wykorzystaniu mikroskopowej techniki jasnego pola i usuwa następnie z powierzchni dentyny przez sonikację. Objętości wgłobień określa się stosując mikroskop współogniskowy Nikon/Lasertec ILM21W.

INHIBICJA WIĄZANIA aIIBb3, w KTÓRYM POŚREDNICZY RGD Oczyszczanie aIIBb3. Dziesięć jednostek przeterminowanych, przemytych ludzkich płytek krwi (otrzymanych z Czerwonego Krzyża) poddano lizie łagodnie mieszając w 3% glukozydzie oktylu, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2 w temperaturze 4°C przez 2 godziny. Lizat odwirowano przy 100000 g przez 1 godzinę. Supernatant podano na 5 ml kolumnę sepharose 4B z lektyną soczewicy (E. Y. Labs), zrównoważono wstępnie 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1% glukozydu oktylu (bufor A). Po 2godzinach inkubacji, kolumnę przemyto 50 ml zimnego buforu A. Zatrzymane na lektynie aIIBb3 eluowano buforem A zawierającym 10% glukozy. Wszystkie procedury wykonywano w temperaturze 4°C. Otrzymany aIIBb3 miał czystość >95%, co wykazała poliakryloamidowa elektroforeza żelowa SDS.

Włączanie aIIBb3 w liposomy. Mieszaninę fosfatydyloseryny (70%) i fosfatydylocholiny (30%) (Avanti Polar Lipids) osuszono na ściankach szklanej probówki w strumieniu azotu. Oczyszczone aIIBb3 rozcieńczono do końcowego stężenia 0,5 mg/ml i zmieszano z fosfolipidami w stosunku białko:fosfolipid 1:3 (wag./wag.). Mieszaninę ponownie umieszczono w zawiesinie i sonikowano w łaźniowym sonikatorze przez 5 minut. Mieszaninę następnie dializowano przez noc stosując dializę odcięcia masy cząsteczkowej 12000-14000 wobec 1000-krotnego nadmiaru 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (z 2 wymianami). Liposomy zawierające aIIBb3 odwirowano przy 12000 g przez 15 minut i ponownie zawieszono w buforze do dializy przy końcowym stężeniu białka około 1 mg/ml. Liposomy przechowywano w temperaturze -70°C do czasu użycia.

PL 191 595 B1

Kompetycyjne wiązanie z aIIBb3. Wiązanie receptora fibrynogenu (aIIBb3) testowano metodą pośredniego kompetycyjnego wiązania stosując [³H]-SK&F-107260 jako ligand typu RGD. Próbę wiązania przeprowadzono w zestawie 96-studzienkowych filtracyjnych płytek (Millipore Corporation, Bedford, MA) stosując hydrofilowe membrany z durapore 0,22 mm. Studzienki powleczono wstępnie 11,2 ml polilizyny o stężeniu 10 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) w temperaturze pokojowej przez 1godzinę w celu zablokowania niespecyficznego wiązania. Nieznakowane benzadiazapiny w różnych stężeniach dodano do studzienek w czterech powtórzeniach. [³H]-SK&F-107260 podano do każdej studzienki do końcowego stężenia 4,5 nM, następnie dodano 1 mg oczyszczonych liposomów zawierających płytki aIIBb3. Mieszaniny inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Związane z aIIBb 3 (3H]-SK&F-107260 oddzielono od niezwiązanych przez odsączenie stosując urządzenie filtracyjne Millipore, przemywając następnie lodowato zimnym buforem (2 x po 0,2 ml). Związaną radioaktywność pozostałą na filtrach zliczono w 1,5 ml Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) w liczniku Beckman Liquid Scintillation Counter (Model LS6800), z 40% wydajnością. Niespecyficzne wiązanie określono w obecności 2 mM nieznakowanego SK&F-107260 i było ono mniejsze niż 0,14% całkowitej radioaktywności dodanej do próbek. Wszystkie dane są średnimi czterech oznaczeń.

Dane kompetycyjnego wiązania zanalizowano metodą najmniejszych kwadratów nieliniowego dopasowania krzywej. Sposób daje wartość IC50 antagonistów (stężenia antagonisty hamujące specyficzne wiązanie [³H]-SK&F-107260 o 50% w stanie równowagi). IC50 jest związane ze stałą dysocjacji (Ki) antagonisty obliczoną z równania Chenga i Prusoffa:

Ki = IC50/(1+L/Kd), ₃ gdzie L oznacza stężenia [³H]-SK&F-107260 użyte w próbie kompetycyjnego wiązania (4,5 nM), ₃ a Kd oznacza stałą dysocjacji [³H]-SK&F-107260 wynoszącą 4,5 nM, określoną metodą analizy Scatcharda.

Inhibicję agregacji płytek można zmierzyć sposobem opisanym w zgłoszeniu patentowym WO 93/00095 (PCT/US92/05463). Tworzenie in vivo skrzepu wykazuje się rejestrując układowe i hemodynamiczne efekty infuzji peptydów u znieczulonych psów zgodnie ze sposobami opisanymi przez Aikena i in., Prostaglandins, 19, 620 (1980).

Korzystne związki według wynalazku wykazują powinowactwo do receptora witronektyny, w stosunku do powinowactwa do receptora fibrynogenu, lub do receptora fibrynogenu w stosunku do receptora witronektyny, większe niż 5:1. Korzystniejsze związki mają stosunek aktywności ponad 10:1. Najkorzystniejsze związki mają selektywność ponad 100:1. Porównawcze wyniki polepszonego wiązania związków według wynalazku do receptora witronektyny, względem receptora fibrynogenu podano w tabeli 1 poniżej

Przykład	Związek	Ki/aIIbs3 (μΜ)	Κί/Ογββ (μΜ)
I	H S /=\ =<γγγγΌ ON * Wu silnia 1	>50	0,023
II	rTO^CCP Vco*H	0,009	15

PL 191 595 B1

PRÓBA MIGRACJI KOMÓREK MIĘŚNIA GŁADKIEGO NACZYNIA KRWIONOŚNEGO. Związki według wynalazku zbadano na ich zdolność do inhibicji migracji i namnażania tkanki mięśnia gładkiego w tętnicy lub żyle w celu ocenienia ich zdolności do zapobiegania restenozie arterii, takiej jak typowo występująca po plastyce naczyń.

Użyto szczurzych lub ludzkich komórek mięśnia gładkiego aorty. Migrację komórek obserwowano w komorze do hodowli komórek Transwell stosując poliwęglanową membranę z porami 8 mm (Costar). Dolną powierzchnię filtra powleczono witronektyną. Komórki zawieszono w DMEM uzupełnionym 0,2% albuminy surowicy bydlęcej w stężeniu 2,5-5,0 x 10⁶ komórki/ml, i wstępnie potraktowano badanym związkiem w różnych stężeniach przez 20 minut w temperaturze 20°C. Sam rozpuszczalnik użyto jako próbę kontrolną. 0,2 ml zawiesiny komórek umieszczono w górnym przedziale komory. Dolny przedział zawierał 0,6 ml DMEM uzupełnionego 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Inkubację prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 95% powietrza/5% CO2 przez 24 godziny. Po inkubacji, niemigrujące komórki na górnej powierzchni filtra usunięto odskrobując je ostrożnie. Filtr utrwalono następnie w metanolu i zabarwiono 10% barwnikiem Giemsa. Migrację mierzono a) zliczając komórki migrujące do dolnej powierzchni filtra lub b) ekstrahując zabarwione komórki 10% kwasem octowym i określając absorbancję przy 600 nm.

Widma magnetycznego rezonansu jądrowego zarejestrowano przy 250 lub 400 MHz stosując odpowiednio spektrometr Bruker AM 250 lub Bruker AC 400. CDCl3 oznacza deuterochloroform, DMSO-d6 oznacza heksadeuterodimetylosulfotlenek, i CD3OD oznacza tetradeuteroetanol. Przesunięcia chemiczne podano w częściach na milion (d) w dół pola od wewnętrznego wzorca tetrametylosilanu. Skróty dla danych NMR to: s = singlet, d = dublet, t = tryplet, q = kwartet, m = multiplet, dd = dublet dubletów, dt = dublet trypletów, app = pozorne, br = szeroki. J wskazuje stałą sprzęgania NMR mierzoną w hercach. Widma ciągłe w podczerwieni (IR) rejestrowano na spektrometrze IR Perkin-Elmer 683 a widma IR z transformatą Fouriera na spektrometrze Nicolet Impact 400 D. Widma IR i FTIR rejestrowano w trybie transmisji, a pozycje pasm podano jako odwrotności liczb falowych (cm^-1). Widma mas rejestrowano na urządzeniach VG 70 FE, PE Syx API III, lub VG ZAB HF, stosując techniki jonizacji przez bombardowanie szybkimi atomami (FAB) lub elektronatryskiwanie (ES). Analizy elementarne prowadzono stosując analizator Perkin-Elmer 240C. Temperatury topnienia zarejestrowano na aparacie Thomas-Hoover bez korekty. Wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza.

Do chromatografii cienkowarstwowej Analtech użyto płytki Silica Gel GF i E. Merck Silica Gel 60 F-254. Szybką i grawitacyjną chromatografię prowadzono na żelu krzemionkowym E. Merck Kieselgel 60 (sito 230-400 mesh). Analityczną i preparatywną HPLC prowadzono na chromatografach Rainin lub Beckman. ODS oznacza nośnik chromatograficzny, żel krzemionkowy derywatyzowany oktadecylosililem. 5 m Apex-ODS oznacza żel krzemionkowy derywatyzowany oktadecylosililem jako nośnik chromatograficzny mający nominalne rozmiary cząstek 5 mm, produkcji Jones Chromatography, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQO^® oznacza nośnik chromatograficzny ODS i jest znakiem handlowym zarejestrowanym na rzecz YMC Co. Ltd., Kyoto, Japonia. PRP-1^® oznacza polimeryczny (styren-diwinylobenzen) nośnik chromatograficzny, i jest znakiem handlowym zarejestrowanym na rzecz Hamilton Co., Reno, Nevada. Cellte^® oznacza materiał filtracyjny złożony z przemytej kwasem diatomitowej krzemionki, i jest znakiem handlowym zarejestrowanym na rzecz Manvil-1e Corp., Denver, Colorado.

Przykład wytwarzania 1

Wytwarzanie (+)-10,11-dihydro-3-karboksy-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepteno-10-octanu etylu

a) 3-Benzylo-4-(trifluorometanosulfonyloksy)anizol

Do roztworu 2-benzylo-4-metoksyfenolu (10,71 g, 50 mmol; wytworzonego zgodnie z J. Am.

Chem. Soc. 1949, 71, 64) i bezwodnej 2,6-lutydyny (12,0 ml, 100 mmol) w bezwodnym CH2Cl2 (250 ml) dodano w czasie 3 minut w temperaturze -78°C pod argonem bezwodnik trifluorometanosulfonowy (10,0 ml, 60 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -78°C przez 0,5 godziny, następnie ogrzano do temperatury pokojowej. Po godzinie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono heksanami (250 ml) i przemyto kolejno 1,0 N HCl (2 x 100 ml), 1,0 N NaOH (2 x 50 ml), H2O (100 ml) i solanką (50 ml). Po wysuszeniu (Na2SO4), zatężeniu, i chromatografii na żelu krzemionkowym (10% EtO-Ac/heksany) otrzymano związek tytułowy jako jasnożółte ciało stałe (16,65 g, 96%): TLC Rf 0,51 (10% EtOAc/heksany);

PL 191 595 B1 ¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,10-7,40 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 9,0, 3,1 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 4,03 (s, 2H), 3,73 (s, 3H); FTIR (CCl4) 1492, 1423, 1405, 1249, 1216, 1161, 1144, 1039, 869 cm^-1; MS (ES) m/e 369 (M+Na)⁺, 364,1) (M+NH4)⁺, 347,0 (M +H)⁺.

b) 4-Allilo-3-benzyloanizol

LiCl (3,08 g, 72,8 mmol) w okrągłodennej kolbie osuszono nad płomieniem pod silnie zmniejszonym ciśnieniem, i układ pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej pod argonem, dodano 3-benzylo-4-(trifluorometanosulfonyloksy)anizol (21,0 g, 60,6 mmol), chlorek bis(trifenylofosfino)palladu(II) (2,13 g, 3,0 mmol), bezwodnego DMF (150 ml), i allilotributylocynę (22,6 ml, 72,8 mmol) i mieszaninę przedmuchano argonem w trzech cyklach opróżniania/płukania argonem. Mieszaninę ogrzewano na łaźni olejowej ustawionej na 95°C, dającej żółty, jednorodny roztwór. Po 1,5 godziny, ciemną mieszaninę zatężono na wyparce obrotowej (silnie obniżone ciśnienie), i pozostałość zatężono ponownie z ksylenów. Powstałą pozostałość rozpuszczono w Et2O (120 ml) i mieszano energicznie z 10% KF (120 ml) przez 0,5 godziny. Warstwy oddzielono, i wodną warstwę ekstrahowano Et2O (2 x 120 ml). Połączone części organiczne przesączono przez celit^® w celu usunięcia nierozpuszczalnych ciał stałych, i przesącz przemyto kolejno H2O (60 ml) i solanką (60 ml). Po wysuszeniu (MgSO4) i zatężeniu otrzymano mętny, żółty olej. Chromatografia (żel krzemionkowy, 5% EtOAc/heksany) dała związek tytułowy jako jasnożółty olej (14,21 g, 98%): TLC Rf (5% EtOAc/heksany) 0,51;

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,03-7,31 (m, 6H), 6,74 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 5,79-5,98 (m,1H), 4,89-5,07 (m, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,21-3,33 (m, 2H); FTIR (CCl4) 1610, 1496, 1256, 1046, 914 cm^-1; MS (ES) m/e 239,2 (M +H)⁺.

c) kwas 2-benzylo-4-metoksyfenylooctowy

Roztwór H5IO6 (23,83 g, 104,5 mmol) w H2O (56 ml) dodano do roztworu 4-allilo-3-benzyloanizolu (5,30 g, 22,24 mmol) w CCl4 (28 ml) i CH3CN (28 ml), i dobrze mieszaną mieszaninę ochłodzono dokładnie do 0°C. Dodano RuCl3 (231 mg, 1,11 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano energicznie w temperaturze 0°C przez 4 godziny, następnie w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Mieszaninę przesączono przez celit^®, i filtr przemyto CH2Cl2 (120 ml), następnie H2O (120 ml). Warstwy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano CH2Cl2 (3 x 120 ml). Po wysuszeniu (Na2SO4) i zatężeniu otrzymano brunatny olej. Podzielono go pomiędzy Et2O (90 ml) i 0,25 N NaOH (90 ml), i warstwy oddzielono. Warstwę Et2O ekstrahowano 0,25 N NaOH (2x 10 ml), i połączone warstwy wodne zakwaszono (pH 2) stężonym HCl. W wyniku ekstrakcji CH2Cl2, suszenia (Na2SO4), i zatężenia otrzymano związek tytułowy w postaci żółtego oleju zestalającego się na żółte ciało stałe (4,19 g, 74%):

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,05-7,35 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H); FTIR (CCl4) 2300-3500 (szerokie), 1710, 1611, 1502, 1496, 1285, 1257, 1045 cm^-1; MS (ES) m/e 279,0 (M+Na)⁺, 274,0 (M+NH4)⁺, 257,0 (M+H)⁺.

d) 3-Metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10(11H)-on

Bardzo drobno sproszkowany kwas 2-benzylo-4-metoksyfenylooctowy (3,26 g, 12,72 mmol) dodano do dobrze mieszanego kwasu polifosforowego (165 g) w temperaturze 100-110°C. Po 15 minutach, mieszaninę reakcyjną wylano na lód (330 g). Dodano Et2O (330 ml) i mieszaninę mieszano energicznie przez 15 minut. Warstwy oddzielono, i warstwę wodną ekstrahowano Et2O (330 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto 5% NaHCO3 (2 x 80 ml) następnie solanką (80 ml), osuszono (MgSO4), i zatężono. Pozostałość ponownie zatężono z toluenu, następnie poddano chromatografii (żel krzemionkowy, 20% EcOAc/heksany). Związek tytułowy otrzymano jako żółte ciało stałe (1,44 g, 48%): TLC Rf (20% EtOAc/heksany) 0,46;

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 8,07-8,15 (m, 1H), 7,39-7,48 (m, 1H), 7,25-7,48 (m, 2H), 7,19 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,71 (dd, J = 8,3, 2,6 Hz, 1H), 4,21 (s, 2H), 4,11 (s, 2H), 3,77 (s, 3H); FTIR (CCl4) 1680, 1501, 1282, 1270 cm^-1; MS (ES) m/e 261 (M+Na)⁺, 256,0 (M+NH4)⁺, 239,0 (M+H)⁺.

e) (±)-10,11-dihydro-10-hydroksy-3-metoksy-5H-dibenzo-[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Bezwodny EtOAc (0,58 ml, 6,6 mmol) wkroplono do roztworu bis(trimetylosililo)amidu litu (1,0 M w THF, 6 ml, 6 mmol) w suchym THF (24 ml) w osuszonej nad płomieniem kolbie w temperaturze -78°C pod argonem. Żółty roztwór mieszano w temperaturze -78°C przez 0,5 godziny, następnie wkroplono roztwór 3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10(11H)-onu (715 mg, 3 mmol) w suchym THF (3 ml) w czasie 3 minut. Dodatkowego suchego THF (0,4 ml) użyto przy przenoszeniu. Po 0,5 godziny w temperaturze -78°C, reakcję zatrzymano nasyconym NH4Cl (15 ml), po czym mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej, i ekstrahowano EtOAc (2 x 30 ml). W wyniku suszenia (MgSO4), zatężenia i chromatografii (żel krzemionkowy, 10% EtOAc/heksany (400 ml), następnie 20%

PL 191 595 B1

EtOAc/heksany) uzyskano 3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10(11H)-on (305,4 mg, 43%) jako żółte ciało stałe, a następnie związek tytułowy jako jasnożółty olej (531,9 mg, 54%): TLC Rf 0,37 (20% EtOAc/heksany);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,63 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,00-7,30 (m, 4H), 6,80 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,69 (dd, J = 8,2, 2,6 Hz, 1H), 3,95-4,35 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 3,35 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 2,79 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 2,66 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 1,22 (t, J = 7,2 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 3580 (ostre), 3509 (szerokie), 1735, 1715, 1503, 1261, 1198, 1156, 1044 cm^-1; MS (ES) m/e 675,2 (2M+Na)⁺, 653,2 (2M +H)⁺.

f) (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Do roztworu (±)-10,11-dihydro-10-hydroksy-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu (741,1 mg, 2,27 mmol) i stęż. HCl (0,19 ml, 2,27 mmol) w lodowatym AcOH (23 ml) dodano 10% Pd/C (242 mg, 0,23 mmol) i mieszaninę wytrząsano w aparacie Parra w temperaturze pokojowej pod H2 (344 kPa). Po 6 godzinach mieszaninę reakcyjną przesączono przez celit^®, i filtr przemyto EtOAc. Przesącz zatężono, i pozostałość ponownie zatężono z toluenu. Powstałą bladożółtą, oleistą pozostałość poddano chromatografii (żel krzemionkowy, 20% EtOAc/heksany) z wytworzeniem tytułowego związku jako bezbarwnego oleju (643,6 mg, 91%): TLC Rf 0,57 (20% EtOAc/heksany);

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,05-7,22 (m, 4H), 7,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,7 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,11-4,25 (m, 2H), 3,85 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,70-3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2 Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 5,0 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 1734, 1611, 1504, 1285, 1263, 1155, 1044 cm^-1; MS (ES) m/e 333,0 (M+Na)⁺, 328,0 (M+NH4)⁺, 311,0 (M+H)⁺, 265,0 (M+H-EtOH)⁺.

g) ( + )-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Bezwodny AlCl3 ( 1,38 g, 10,35 mmol) dodano jednorazowo do roztworu (±)-10,11-dihydro-3-metoksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (643,6 mg, 2,07 mmol) w bezwodnym CH2Cl2 (21 ml) w temperaturze 0°C pod argonem. Żółty roztwór ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez 3 godziny, następnie ochłodzono do 0°C i zalano zimnym 3 N HCl (10 ml). Warstwy oddzielono i warstwę wodną ekstrahowano CH2Cl2. Połączone warstwy organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono. Po przeprowadzeniu chromatografii na żelu krzemionkowym (25% EtOAc/heksany) otrzymano związek tytułowy jako prawie bezbarwny olej (611,7 mg, 100%): TLC Rf 0,26 (20% EtOAc/heksany);

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,03-7,22 (m, 4H), 6,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 8,1, 2,6 Hz, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,25 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 4,11-4,25 (m, 2H), 3,73-3,88 (m, 1H), 3,79 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 3,28 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 15,0, 9,3 Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 4,9 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,6, 9,5 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 3611 (ostre), 3447 (szerokie), 1734, 1504, 1291, 1272, 1176, 1152 cm^-1; MS (ES) m/e 314,2 (M+NH4)⁺, 297,2 (M+H)⁺.

h) (±)-10,11-dihydro-3-(trifluorometanosulfonyloksy)-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Do roztworu (±)-10,11-dihydro-3-hydroksy-5H-dibenzo-[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (611,7 mg, 2,06 mmol) i 2,6-lutydiny (0,48 ml, 4,12 mmol) w bezwodnym CH2Cl2 (10,3 ml) wkroplono bezwodnik trifluorometanosulfonowy (0,45 ml, 2,68 mmol) w temperaturze -78°C pod argonem. Po 0,5 godziny, mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez godzinę. Żółty roztwór rozcieńczono Et2O (50 ml) i przemyto kolejno 1,0 N HCl (5 ml); 5% NaHCO3 (5 ml), i solanką (5 ml). W wyniku suszenia (MgSO4), zatężenia i chromatografii na żelu krzemionkowym (20% EtOAc/heksany) uzyskano tytułowy związek jako bezbarwny olej (808,9 mg, 92%): TLC Rf (20% EtOAc/heksany) 0,58;

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 6,98-7,30 (m, 7H), 4,35 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,91 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 3,78-3,95 (m, 1H), 3,37 (dd, J = 15,2, 4,1 Hz, 1H), 3,02 (dd, J = 15,2, 9,6 Hz, 1H), 2,70 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,6 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 1735, 1493, 1427, 1250, 1215, 1144, 961, 856 cm^-1; MS (ES) m/e 451,1 (M+Na)⁺, 446,2 (M+NH4)⁺, 429,2 (M+H)⁺.

i) (±)-10,11-dihydro-3-karboksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Mieszaninę (±)-10,11-dihydro-3-(trifluorometanosulfonyloksy)-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (808,9 mg, 1,89 mmol), KOAc (742 mg, 7,56 mmol), Pd(OAc)2 (21,2 mg, 0,095 mmol), 1,1¹-bis(difenylofosfino)ferrocenu (210 mg, 0,38 mmol), i bezwodnego DMSO (11 ml) przedmuchano tlenkiem węgla (trzy cykle opróżniania/płukania CO, a następnie barbotowanie CO przez mieszaninę przez 5 minut), następnie mieszano pod balonem CO na łaźni olejowej ustawionej na 70°C.

PL 191 595 B1

Po 3,5 godziny mieszaninę reakcyjną rozcieńczono H2O (11 ml), ochłodzono do 0°C i zakwaszono 1,0 N HCl (około 8 ml). W wyniku ekstrakcji CH2Cl2 (3 x 30 ml), suszenia (Na2SO4), zatężenia iponownego zatężenia z toluenu otrzymano czerwonopomarańczową ciecz (2-3 ml). Chromatografia (żel krzemionkowy, 3:2:01 EtOAc/toluen/AcOH; zmieszane frakcje ponownie 1:1:0,1 EtOAc/toluen/AcOH) dała tytułowy związek (581,9 mg, 95%) jako lepki, żółty olej, który częściowo krystalizował pod silnie obniżonym ciśnieniem w temperaturze 40°C: TLC Rf (3:2:0,1 EtOAc/toluene/AcOH) 0,60;

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 7,95 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,87 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz,1H), 7,00-7,35 (m, 5H), 4,40 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,97 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 3,82-4,00 (m, 1H), 3,43 (dd, J = 15,3, 4,0 Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 15,3, 9,5 Hz, 1H), 2,69 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,5 Hz,1H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CCl4) 2357-3378 (szerokie), 1735, 1692, 1280 cm^-1; MS (ES) m/e 342,2 (M+NH4)⁺, 325,2 (M+H)⁺, 307,2 (M+H-H2O)⁺.

Przykład wytwarzania 2

Wytwarzanie 2-karboksy-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptenylo-10-octanu etylu

a) 2-benzoilo-5-metoksyfenylooctan metylu

3-metoksy-fenylooctan metylu potraktowano chlorkiem benzoilu i chlorkiem glinu, jak opisano w J. Chem. Soc., Perkin Trans I, 1991, 171, z wytworzeniem tytułowego związku.

b) 2-benzylo-5-metoksyfenylooctan metylu

Związek z wytwarzania 2(a) traktuje się borowodorkiem sodu i kwasem trifluorooctowym w dichlorometanie zgodnie z ogólną procedurą z Synthesis 1978, 763, otrzymując związek tytułowy.

c) kwas 2-benzylo-5-metoksyfenylooctowy

Związek z wytwarzania 2(b) traktuje się wodnym roztworem wodorotlenku sodu i metanolem i miesza. Mieszaninę zatęża sięi traktuje rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym otrzymując związek tytułowy.

d) 5,11-dihydro-2-metoksy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Związek z wytwarzania 2(c) dodaje się do mieszaniny kwasu fosforowego i pięciochlorku fosforu, miesza i ogrzewa do 80°C zgodnie z ogólną procedurą opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3567730 z wytworzeniem związku tytułowego.

e) 5,11-dihydro-2-hydroksy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Związek z wytwarzania 2(d) traktuje się etanotiolem i chlorkiem glinu zgodnie z ogólną procedurą z Tetrahedron Letters 1978, 5211 z wytworzeniem związku tytułowego.

f) 5,11-dihydro-2-(trifluorometanosulfonyl)oksy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Związek z wytwarzania 2(e) traktuje się bezwodnikiem trifluorometanosulfonylowym zgodnie z ogólną procedurą z J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1987, 904 z wytworzeniem tytułowego związku.

g) 5,11-dihydro-2-metoksykarbonylo-10H-dibenzo[a,d]-cyklohepten-10-on

Związek z wytwarzania 2(f) traktuje się tlenkiem węgla, metanolem, octanem palladu i 1,3-bis(difenylofosfino)propanem w dimetylosulfotlenku zgodnie z ogólną procedurą z J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1987, 904 otrzymując tytułowy związek.

h) 5,11-dihydro-2-karboksy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepten-10-on

Związek z wytwarzania 2(g) miesza się z rozcieńczonym wodnym roztworem wodorotlenku sodu. Mieszaninę traktuje się rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym z wytworzeniem tytułowego związku.

i) 5,11-dihydro-2-t-butoksykarbonylo-10H-dibenzo[a,d]-cyklohepten-10-on

Związek z wytwarzania 2(h) traktuje się di-t-butylo-acetalem N,N-dimetyloformamidu zgodnie z ogólną procedurą z Synthesis 1983, 2, 135 z wytworzeniem tytułowego związku.

j) 2-t-butoksykarbonylo-10H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Związek z wytwarzania 2(i) traktuje się proszkiem cynku i bromooctanem etylu zgodnie z ogólną procedurą z Org. Reactions 1947, 1, 1 i J. Am. Chem. Soc., 1938, 60, 2947 z wytworzeniem związku tytułowego.

k) 2-karboksy-10H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Związek z wytwarzania 2(j) traktuje się kwasem trifluorooctowym w dichlorometanie i miesza. Mieszaninę zatęża się z wytworzeniem związku tytułowego.

1) 2-karboksy-10,11-dihydro-10H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Stosując ogólną procedurę z przykładu I(f), ale zastępując związkiem z wytwarzania 2(k) związek z wytwarzania 1(e), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 3

Wytwarzanie 7-karboksy-9,10-dihydro-4H-benzo[4,5]cyklohepta[1,2b]furano-10-octanu etylu

PL 191 595 B1

Stosując procedurę z wytwarzania 2, ale zastępując chlorek benzoilu chlorkiem 3-furoilu, otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 4

Wytwarzanie 8-karboksy-10,11-dihydro-5H-tetrazolo[5,1-c][1,4]-benzodiazepino-11-octanu metylu

a) 4-[N-(t-butoksykarbonylo)-N-(metoksykarbonylo)amino-metylo]-3-nitrobenzoesan t-butylu Do roztworu 4-bromometylo-3-nitrobenzoesanu t-butylu (2,27 g, 7,2 mmol) (Int. J. Peptide Res.

1990, 36, 31) w dimetyloformamidzie (25 ml) dodano zawiesinę iminodikarboksylanu t-butylu-metylu potasu (J.C.S. Perkin I, 1977, 1088-90) (1,56 g, 7,3 mmol) w dimetyloformamidzie (20 ml). Ciemnobrunatny roztwór mieszano godzinę i wylano do wody (400 ml), ekstrahowano octanem etylu (3 x 100 ml) i połączone organiczne warstwy przemyto wodą (5 x 75 ml), osuszono (siarczan sodu) i zatężono otrzymując jasnopomarańczowy olej, który oczyszczono metodą chromatografii szybkiej na żelu krzemionkowym (20% octan etylu/heksan) z wytworzeniem związku tytułowego (2,15 g, 73%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 8,65 (s, 1H), 8,2 (d, 1H), 7,45 (d, 1H), 5,3 (s, 2H), 3,8 (s, 3H), 1,6 (s, 9H), 1,45 (s, 9H).

b) 4-[N-(t-butoksykarbonylo)aminometylo]-3-nitrobenzoesan t-butylu

Związek z wytwarzania 4(a) (2,15 g, 5,24 mmol) rozpuszczono w mieszaninie metanolu (120 ml) i 0,95 N wodorotlenku sodu (15 ml). Po 15 minutach dodano kwas octowy (3,0 ml) i mieszaninę zatężono. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (300 ml) i ekstrahowano wodą (3 x 75 ml). Warstwę organiczną przemyto solanką (75 ml), osuszono (siarczan sodu) i zatężono z wytworzeniem żółtego oleju, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (20% octan etylu/heksan) z wytworzeniem tytułowego związku (1,0 g, 54%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 8,6 (s, 1H), 8,2 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 5,35 (m, 1H), 4,6 (d, 2H), 1,65 (s, 9H), 1,4 (s, 9H).

c) 3-amino-4-[N-(t-butoksykarbonylo)aminometylo]benzoesan t-butylu

Roztwór związku z wytwarzania 4(b) (0,80 g, 2,27 mmol) w etanolu (100 ml) zawierający 10% palladu na węglu (0,5 g) uwodorniano (279 kPa). Po 30 minutach mieszaninę przesączono i zatężono z wytworzeniem tytułowego związku (0,72 g, 100%):

¹HNMR (400 MHz, CDCl3) d 7,25 (m, 2H), 7,1 (d,1H), 4,9 (b,1H), 4,25 (d, 2H), 1,6 (s, 9H), 1,45 (s, 9H).

d) (E,Z)-4-[N-(t-butoksykarbonylo)aminometylo]-3-[2-(1,4-dimetoksy-1,4-diokso-2-butenylo)amino]benzoesan t-butylu

Mieszaninę związku z wytwarzania 4(c) (0,7 g, 2,2 mmol) i acetylenodikarboksylanu dimetylu (0,37 g, 2,6 mmol) w metanolu (40 ml) ogrzewano do wrzenia przez 30 minut, ochłodzono i zatężono. Pozostałość oczyszczono metodą chromatografii szybkiej (żel krzemionkowy, 20% octan etylu/heksan) z wytworzeniem związku tytułowego (0,7 g, 70%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 9,6 (s, 1H), 7,7 (d, 1H), 7,35 (m, 2H), 5,5 (s, 1H), 5,0 (b, 1H), 4,4 (d, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,7 (s, 3H), 1,6 (s, 9H), 1,45 (s, 9H).

e) 4-[N-(t-butoksykarbonylo)aminometylo]-3-[2-(1,4-dimetoksy-1,4-diokso-2-butylo)amino]benzoesan t-butylu

Związek z wytwarzania 4(d) (0,68 g, 1,5 mmol) i 10% palladu na węglu (11,5 g) w metanolu (71 ml) wytrząsano w atmosferze wodoru (279 kPa) przez godzinę. Mieszaninę przesączono i zatężono z wytworzeniem związku tytułowego (0,66 g, 95%):

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,8 (d, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,1 (d, 1H), 5,4 (b, 1H), 4,9 (b, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 3,65 (s, 3H), 2,9 (m, 2H), 1,6 (s, 9H), 1,45 (s, 9H).

f) kwas 4-(aminometylo)-3-[2-(1,4-dimetoksy-1,4-diokso-2-butylo)amino]benzoesowy

Związek z wytwarzania 4(e) (0,66 g, 1,4 mmol) w chlorku metylenu (10 ml) i kwas trifluorooctowy (10 ml) utrzymywano w temperaturze pokojowej przez godzinę i zatężono z wytworzeniem związku tytułowego.

(g) (R,S)-8-karboksy-2,3,4,5-tetrahydro-3-okso-1H-1,4-benzodiazepino-2-octan metylu

Związek z wytwarzania 4(f) rozpuszczono w metanolu (60 ml) i potraktowano 25% roztworem metanolanu sodu w metanolu (0,73 ml, 3,2 mmol) i ogrzano do 50°C przez godzinę. Mieszaninę zakwaszono 1N chlorowodorem w eterze (3,5 ml) i zatężono z wytworzeniem związku tytułowego (0,44 g, 98%):

¹HNMR (400 MHz, DMSO-d6) d 8,15 (t, 1H), 7,2 (s, 1H), 7,1 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 5,0 (dd, 1H), 4,9 (m, 1H), 3,75 (dd, 1H), 3,6 (s, 3H), 2,8 (dd, 1H), 2,6 (dd, 1H).

h) (R,S)-8-karboksy-10,11-dihydro-5H-tetrazolo[5,1-c]-[1,4]-benzodiazepino-11-octan metylu

PL 191 595 B1

Związek z wytwarzania 4(g) traktuje się trifenylofosfiną, azodikarboksylanem dietylu i azydkiem trimetylosililu w tetrahydrofuranie zgodnie z ogólną procedurą z J. Org. Chem., 1991, 56, 2395 z wytworzeniem związku tytułowego.

Przykład wytwarzania 5

Wytwarzanie (R,S)-8-karboksy-10,11-dihydro-5H-imidazo[2,1-c][1,4]-benzodiazepino-11-octan metylu

a) (R,S)-8-karboksy-2,3,4,5-tetrahydro-3-tiokso-1H-1,4-benzodiazepino-2-octan metylu

Związek z wytwarzania 4(g) traktuje się reagentem Lawessona zgodnie z ogólną procedurą z Tet. Lett., 1980, 21, 4061 z wytworzeniem tytułowego związku.

b) (R, S) -8-karboksy-2, 5-dihydro-3-metylotio-1H-1, 4-benzodiazepino-2-octan metylu

Związek z wytwarzania 5(a) traktuje się jodometanem zgodnie z ogólną procedurą z Tetrahedron 1960, 517 z wytworzeniem tytułowego związku.

c) (R,S)-8-karboksy-2,5-dihydro-3-[(2,2-dimetoksyetylo)-amino]-1H-1,4-benzodiazepino-2-octan metylu

Związek z wytwarzania 5(b) traktuje się dimetyloacetalem aminoacetaldehydu zgodnie z ogólną procedurą z J. Heterocyclic Chem., 1989, 26, 205 z wytworzeniem tytułowego związku.

d) (R,S)-8-karboksy-10,11-dihydro-5H-imidazo[2,1-c]-[1,4]benzodiazepino-11-octan metylu

Związek z wytwarzania 5(c) traktuje się wodnym roztworem kwasu trifluorooctowego z wytworzeniem tytułowego związku.

Przykład wytwarzania 6

Wytwarzanie (R,S)-2-amino-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu

a) 2-Benzyloksykarbonyloamino-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Mieszaninę związku z wytwarzania 2(k), trietyloaminy i fosforyloazydku difenylu w toluenie ogrzewa się. Powstałą mieszaninę traktuje się alkoholem benzylowym, miesza i zatęża, pozostałość poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym z wytworzeniem tytułowego związku.

b) (R,S)-2-amino-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyklo-heptenylo-10-octan etylu

Związek z wytwarzania 6(a) rozpuszcza się w metanolu i traktuje 10% palladem na węglu i 1M chlorowodorem w eterze i mieszaninę wytrząsa się w atmosferze wodoru. Mieszaninę przesącza się i zatęża z wytworzeniem tytułowego związku.

Przykład wytwarzania 7

Wytwarzanie 2-[1-[4-(benzyloksykarbonylo)piperazynylo]]-N-metyloetanaminy

a) 2-[1-[4-(benzyloksykarbonylo)piperazynylo]]etanamina

2-(1-piperazynylo)etyloaminę zabezpieczono zgodnie z ogólną procedurą z Tet. Lett. 1986,

4391. Dodano kroplami roztwór t-butylochlorodifenylosilanu (7,8 ml, 30 mmol) w acetonitrylu (10 ml) do roztworu 2-(1-piperazynylo)etyloaminy (4,0 ml, 31 mmol) i trietyloaminy (6,3 ml, 45 mmol) w acetonitrylu (211 ml) i mieszano w temperaturze 10°C. Mieszaninę mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, ochłodzono do 10°C i potraktowano trietyloaminą (6,3 ml, 45 mmol) i roztworem chloromrówczanu benzylu (4,3 ml, 30 mmol) w dichlorometanie (10 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, przesączono i zatężono. Pozostałość mieszano w 80% kwasie octowym (100 ml) przez noc, wylano do solanki i przemyto octanem etylu. Fazę wodną zalkalizowano nasyconym węglanem sodu, ekstrahowano octanem etylu, a fazę organiczną osuszono (siarczan magnezu), przesączono i zatężono z wytworzeniem związku tytułowego (1,1 g, 14%):

¹HNMR (400 MHz, CDCl3) d 2,43 (6H, m), 2,80 (2H, m), 3,52 (4H, m), 5,14 (2H, s), 7,38 (5H, s).

b) 2-[1-[4-(benzyloksykarbonylo)piperazynylo]]-N-metyloetanamina

Kwas mrówkowy (0,5 ml, 12,2 mmol) wkroplono przez strzykawkę do bezwodnika octowego (1,0 ml, 9,8 mmol) w temperaturze 10°C. Mieszaninę mieszano przez 10 minut i ogrzano do 50°C przez 2 godziny. Mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano bezwodny tetrahydrofuran (10 ml)z a następnie związek z wytwarzania 7(a) (1,0 g, 3,8 mmol) rozpuszczony w tetrahydrofuranie. Mieszaninę mieszano przez 2,5 godzin w temperaturze pokojowej, zatężono i pozostałość rozpuszczono w tetrahydrofuranie (25 ml) i ochłodzono do 10°C. Wkroplono 1,0 M metylosiarczek boru (1ml, 10 mmol) rozpuszczony w tetrahydrofuranie (10 ml) w temperaturze 10°C. Mieszaninę mieszano do zakończenia wydzielania gazu i ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Mieszaninę ochłodzono, potraktowano ostrożnie nasyconym metanolowym roztworem chlorowodoru (20 ml) i ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 1 godzinę. Mieszaninę zatężono z wytworzeniem tytułowego związku (400 mg, 40%): MS (ES) m/e 278,0 [M+H]⁺;

PL 191 595 B1 ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 2,68-3,92 (15H, m), 5,15 (2H, s), 7,37 (5H, s).

Przykład wytwarzania 8

Wytwarzanie chlorku 4-[N-(benzyloksykarbonylo)-(aminoiminometylo)]benzoilu

Mieszaninę kwasu 4-[N-(benzyloksykarbonylo)-(aminoiminometylo)]benzoesowego (0,23 g,

1,0 mmol) i chlorku tionylu (3 ml) w dichlorometanie (3 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 10 minut, zatężono, potraktowano toluenem i zatężono kilka razy z wytworzeniem tytułowego związku.

Przykład wytwarzania 9

Wytwarzanie N-(t-butoksykarbonylo)-4,4'-bipiperydyny

Dichlorowodorek 4,4'-bipiperydyny (2,5 g, 10 mmol) rozpuszczono w wodzie (10 ml) i potraktowano 5N wodorotlenkiem sodu do pH 8-9, rozcieńczono do 120 ml etanolem i mieszano w temperaturze pokojowej. Powstałą mieszaninę potraktowano di-węglanem di-t-butylu (2,4 g, 11 mmol) w etanolu (80 ml) w1 porcji i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej, z okresowym dodawaniem 5N wodorotlenku sodu dla zachowania pH 8-9. Po 5 godzinach mieszaninę zatężono i pozostałość rozpuszczono w mieszaninie 1:1 eter:woda (100 ml) i pH ustawiono na 12 przy pomocy 5N wodorotlenku sodu. Fazę wodną ekstrahowano eterem i organiczną fazę przemyto kolejno solanką, rozcieńczonym kwasem cytrynowym i wodą. Wodną fazę zalkalizowano do pH 12-13 5N wodorotlenkiem sodu i ekstrahowano eterem. Fazę organiczną przemyto solanką, osuszono (siarczan sodu), zatężono do przejrzystego oleju i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem tytułowego związku (1,7 g, 63%) jako ciała stałego. TLC Rf 0,4 (Kieselgel 60 F254, 15:3:2 2-butanol:kwas mrówkowy:woda); MS (ES) m/e 268,3 [M+H]⁺.

Przykład wytwarzania 10

Wytwarzanie dichlorowodorku 2-(metyloaminometylo)benzimidazolu

a) 2-[(t-butoksykarbonylo)sarkozylo]aminoanilina

Roztwór fenylenodiaminy (100 g, 0,924 mol) i Boc-sarkozyny (175 g, 0,924 mol) w DMF (1750 ml) ochłodzono do -10°C pod argonem, i dodano roztwór DCC (190,8 g, 0,924 mol) in CH2Cl2 (1750 ml) powolnym strumieniem w czasie 1 godziny. Temperatura wzrosła do 0°C w czasie dodawania. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc przy wzroście temperatury do temperatury pokojowej. Biały osad odsączono i przesącz rozcieńczono H2O (3,5 l) i nasyconą solanką (1 l). Warstwę CH2Cl2 oddzielono i fazę wodną ekstrahowano EtOAc (2x1 l). Połączone organiczne warstwy przemyto H2O (1 l) i solanką (0,5 l), następnie zatężono do żółtej pozostałości (341 g). Utarto ją z EtOAc z wytworzeniem związku tytułowego (179,4 g, 70%): temperatura topnienia 134-136°C.

b) 2-[(N-(t-butoksykarbonylo)-N-metylo)aminometylo]benzimidazol

Roztwór 2-[(t-butoksykarbonylo)sarkozylo]aminoaniliny (178,4 g, 0,639 mol) w THF (900 ml) i AcOH (900 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod argonem przez godzinę, następnie ostrożnie obniżono ciśnienie i większość THF usunięto destylacyjnie. Resztowy roztwór wylano na mieszaną wodę z lodem i dodano stężony NH4OH (1150 ml) dla ustawienia pH na 10. Powstał olej, który krystalizował przy mieszaniu przez noc. Fazę stałą przesączono i osuszono w temperaturze 50°C pod ciśnieniem atmosferycznym przez dwa dni pozostawiając żółto-białe ciało stałe (167 g, 100%): temperatura topnienia 140-150°C. W wyniku dalszego suszenia w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem atmosferycznym otrzymano surowy tytułowy związek (162 g, 97%).

b) dichlorowodorek 2-(metyloaminometylo)benzimidazolu

Roztwór 4 M HCl/dioksan (616 ml, 2,46 mol) i anizolu (134 ml, 1,23 mol) ochłodzono do 0°C pod argonem, i dodano roztwór 2-[(N-t-butoksykarbonylo-N-metylo)aminometylo)benzimidazolu (161 g, 0,616 mole) w CH2Cl2 (800 ml) powolnym strumieniem w czasie 30 minut. Temperatura wzrosła do 8°C w czasie dodawania, i zaczął się wytwarzać biały osad przed zakończeniem dodawania. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 20 minut, następnie odsączono związek tytułowy (66,6 g, 46%):

temperatura topnienia 250-255°C z rozkładem.

Analiza: obliczone dla C₉H_1:1N₃-2 HCl:

C, 46,17; H, 5,60; N, 17, 95.

Znalezione: C, 46,33; H, 5,68; N, 17,55.

Przesącz rozcieńczono Et2O i mieszaninę odstawiono na noc. W wyniku przesączenia otrzymano dodatkowy tytułowy związek (62 g; łączna wydajność 128,6 g, 89%) jako różowe ciało stałe: temperatura topnienia 248-253°C (z rozkładem).

Przykład wytwarzania 11

Wytwarzanie dichlorowodorku 2-[ (2-aminoetylo)amino]pirydyny

a) Mono-Boc-1,2-etylenodiamina

PL 191 595 B1

Roztwór diwęglanu di-t-butylu (10,91 g, 50 mmol) w CH2Cl2 (50 ml) wkroplono w czasie 30 minut do energicznie mieszanego roztworu 1,2-etylenodiaminy (33 ml, 500 mmol) w CH2Cl2 (250 ml) w temperaturze 0°C pod argonem. Osad wydzielił się w czasie dodawania. Po zakończeniu dodawania całość ogrzano do temperatury pokojowej, mieszano przez godzinę i zatężono na wyparce obrotowej. Pozostałość rozpuszczono wH2O (100 ml) i przesączono dla usunięcia małej ilości nierozpuszczalnych materiałów. Przesącz ekstrahowano CH2Cl2 (3 x 100 ml), i połączone fazy organiczne osuszono (MgSO4) i zatężono z wytworzeniem związku tytułowego (6,00 g, 75%) jako mętnej cieczy:

¹H NMR (250, CDCl3) d 4,75-5,00 (m, 1H), 3,05-3,25 (m, 2H), 2,65-2,85 (m, 2H), 1,46, (s, 9H), 1,12 (br s, 2H)

b) 2-[[2-(Boc-amino)etylo]amino]pirydyno-N-tlenek

Mieszaninę mono-Boc-1,2-etylenodiaminy (5,83 g, 36,39 mmol), chlorowodorku 2-chloropirydyno-N-tlenku (7,25 g, 43,67 mmol), NaHCO3 (15,29 g, 182 mmol), i alkoholu t-amylowego (36 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia. Po 47 godzinach ciemnobrunatną mieszaninę ochłodzono, rozcieńczono CH2Cl2 (100 ml), i przesączono z odsysaniem w celu usunięcia nierozpuszczalnych materiałów. Przesącz zatężono i ponownie zatężono z toluenu. Chromatografia na żelu krzemionkowym (10% MeOH/CHCl3) dała zanieczyszczony tytułowy związek (8,23 g, 89%) jako żółte ciało stałe, którego użyto bez dalszego oczyszczania: TLC (10% MeOH/CHCl3) Rf 0,42;

¹H NMR (250, CDCl3) d 8,16 (dd, J = 6,5, 1,3 Hz, 1H), 7,05-7,30 (m, 2H), 6,68 (br d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,50-6,65 (m, 1H), 5,70-5,95 (m, 1H), 3,25-3,60 (m, 4H), 1,44 (s, 9H); MS (ES) m/e 254 (M+H)⁺.

c) 2-[[2-(Boc-amino)etylo)amino]pirydyna

10% Pd/C (106,4 mg, 0,10 mmol) dodano do roztworu 2-[[2-(Boc-amino)etylo]amino]pirydynoN-tlenku (126,7 mg, 0,5 mmol) i cykloheksenu (0,25 ml, 0,25 mmol) w absolutnym EtOH (5 ml), i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia. Po 16 godzinach mieszaninę przesączono przez celit^® i przesącz zatężono. Pozostałość połączono z pozostałością otrzymaną z odrębnego wytwarzania (skala 0,5 mmol), i połączone materiały oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym (5% MeOH/CHCl3). Związek tytułowy (148,4 mg, 63% z 1 mmol 2-[[2-(Boc-amino)etylo]amino]pirydyno-N-tlenku) otrzymano jako żółty olej: TLC (5% MeOH/CHCl3) Rf 0,43;

¹HNMR (400, CDCl3) d 8,05-8,12 (m, 1H), 7,37-7,46 (m, 1H), 6,53-6,61 (m, 1H), 6,41 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,12 (br s, 1H), 4,86 (br s, 1H), 3,26-3,51 (m, 4H), 1,44 (s, 9H); MS (ES) m/e 238 (M+H)⁺.

d) dichlorowodorek 2-[(2-aminoetylo)amino)pirydyny

Do roztworu 2-[[2-(Boc-amino)etylo)amino]pirydyny (148,4 mg, 0,63 mmol) w bezwodnym CH2Cl2 (3,2 ml) dodano 4N HCl w dioksanie (3,2 ml) w strumieniu w temperaturze 0°C, następnie całość ogrzano do temperatury pokojowej. Po 2 godzinach, mieszaninę przesączono z odsysaniem zbierając strącone ciało stałe, które przemyto bezwodnym Et2Oi osuszono z wytworzeniem tytułowego związku (132,8 mg, jakościowo) jako żółte ciało stałe:

¹H NMR (400, CD3OD) d 7,99-8,07 (m, 1H), 7,92-7,98 (m, 1H), 7,19 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,987,04 (m, 1H), 3,76 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,27 (t, J = 6,2 Hz, 2H, częściowo zasłonięty resztowym sygnałem rozpuszczalnika); MS (ES) m/e 138 (M+H)⁺.

Przykład wytwarzania 12

Wytwarzanie 2-[(3-hydroksy-1-propylo)amino]pirydyno-N-tlenku

a) 2-[(3-hydroksy-1-propylo)amino]pirydyno-N-tlenek

Mieszaninę 2-chloropirydyno-N-tlenku (16,6 g, 0,1 mol), 3-amino-1-propanolu (15,3 ml, 0,1 mol),

NaHCO3 (42 g, 0,5 mol), i alkoholu t-amylowego (100 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia. Po 21 godzinach, mieszaninę reakcyjną ochłodzono, rozcieńczono CH2Cl2 (300 ml), i przesączono z odsysaniem w celu usunięcia nierozpuszczalnych materiałów. Przesącz zatężono i zatężono ponownie z toluenu otrzymując żółty olej. Po poddaniu go chromatografii na żelu krzemionkowym (20% Me-OH/CHCl3) otrzymano tytułowy związek (15,62 g, 93%) jako żółte ciało stałe: TLC (20% MeOH/CHCl3) Rf 0,48;

¹H NMR (250, CDCl3) d 8,07 (dd, J = 6,6, 1,2 Hz, 1H), 7,34 (br t, 1H), 7,10-7,30 (m, 1H), 6,64 (dd, J = 8,5, 1,4 Hz, 1H), 6,40-6,60 (m, 1H), 4,49 (br s, 1H), 3,65 - 3,90 (m, 2H), 3,35-3,60 (m, 2H), 1,75-2,00 (m, 2H); MS (ES) m/e 169 (M+ H)⁺.

Przykład wytwarzania 13

3-karboksy-10,11-dihydro-5-metylodibenzo[b,f]azepino-10-octan metylu

a) 5-metoksy-2-(metoksykarbonylo)difenyloamina

5-metoksy-2-(karboksy)difenyloaminę, wytworzoną jak opisano w Chem. Ber. 1956, 89, 2174-2190, traktuje się chlorowodorem w metanolu, z wytworzeniem tytułowego związku.

PL 191 595 B1

b) 5,11-dihydro-3-metoksy-5-metylo-10H-dibenzo[b,f]azepin-10-on

Stosując ogólną procedurą ze zgłoszenia patentowego nr NL 7011296, i zastępując 5-chloro-2-(metoksykarbonylo)difenyloaminę związkiem z wytwarzania 13(a), otrzymuje się związek tytułowy.

c) 3-karboksy-10,11-dihydro-5-metylo-dibenzo[b,f]-azepino-10-octan metylu

Stosując procedurę z wytwarzania 1(e-i) i zastępując związek z wytwarzania 1(d) związkiem z wytwarzania 13(h), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 14

3-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f]oksepino-10-octan metylu a) 3-metoksy-dibenzo[b,f]oksepin-10-on

Stosując ogólną procedurą z J. Heterocycl. Chem., 1986, 23, 265-9 i zastępując 4-fluorofenol fenolem, otrzymuje się związek tytułowy.

b) 3-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f]oksepino-10-octan metylu

Stosując procedurę z wytwarzania 1(e-i) i zastępując związek z wytwarzania 1(d) związkiem z wytwarzania 14(a), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 15

3-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f]tiepino-10-octan metylu

Stosując ogólną procedurą z wytwarzania 1(e-i) i zastępując związek z wytwarzania 1(d) 3-metoksydibenzo[b,f]tiepin-10(11H)-onem, wytworzonym jak opisano w Collect. Czech. Chem. Commun., 1979, 44, 2108-23, otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 16

2-karboksy-6,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepino-6-octan metylu a) 2-benzylo-4-bromo-N-(formylo)anilina

Stosując ogólną procedurę z Coli. Czech. Chem. Commun., 1965, 30, 1163-1172, 2-benzylo-4-bromo-aniliną, wytworzoną jak w Khim. Geterotsikl. Soedin., 1983, 3, 411-414, ogrzewa się z mrówczanem etylu z wytworzeniem związku tytułowego.

b) 2-bromo-11H-dibenz[b,e]azepina

Stosując ogólną procedurę z Coll. Czech. Chem. Commun., 1965, 30, 1163-1172, związek z wytwarzania 16(a) ogrzewa się w mieszaninie kwasu polifosforowego i tlenochlorku fosforu z wytworzeniem związku tytułowego.

c) 2-bromo-6,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepino-6-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z Bull. Chem. Soc. Jpn, 1990, 63, 3122-3131, związek z wytwarzania 16(b) traktuje się t-butylodimetylosililoketenoacetalem octanu metylu, cyjankiem trimetylosililu i katalityczną ilością di-m-chloro-bis (1,5-cyklooktadieno)dirodu ([Rh(COD)Cl)2) w dichlorometanie w niskiej temperaturze z wytworzeniem związku tytułowego.

d) 2-karboksy-6,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]azepino-6-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 1(i)i zastępując związek z wytwarzania 1(h) związkiem z wytwarzania 16 (c), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 17

7-karboksy-10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[b,e][1,4]-diazepino-11-octan metylu a) 2-amino-5-bromo-N-(metylo)difenyloamina

Stosując ogólną procedurę z Ann. Chem., 1898, 303, 322, i zastępując anilinę N-metylo-aniliną, otrzymuje się 2-nitro-5-bromo-N-(metylo)difenyloaminę, którą poddaje się redukcji chlorkiem cynawym z wytworzeniem związku tytułowego.

b) 7-bromo-5H-dibenzo[b,e][1,4)diazepina

Stosując ogólną procedurę z Helv. Chem. Acta 1964, 47, 1163-72 i zastępując 2-amino-N-(metylo)difenyloaminę związkiem z wytwarzania 17(a), otrzymuje się związek tytułowy.

c) 7-bromo-10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[b,e][1,4]-diazepino-11-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 16(c) i zastępując związek z wytwarzania 16(b) związkiem z wytwarzania 17(b), otrzymuje się związek tytułowy.

d) 7-karboksy-10,11-dihydro-5-metylo-5H-dibenzo[b,e]-[1,4]diazepino-11-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 1(i) i zastępując związek z wytwarzania 1(h) związkiem z wytwarzania 17(c), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 18

7-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,e][1,4]oksazepino-11-octan metylu a) 4-bromo-N-formylo-2-(fenoksy)anilina

PL 191 595 B1

Stosując ogólną procedurę z J. Chem. Soc., Perkin I 1976, 1279-1285, 4-bromo-2-(fenoksy)aniliną, wytworzoną jak opisano w J. Chem. Soc., 1930, 1202-1208, ogrzewa się z kwasem mrówkowym z wytworzeniem związku tytułowego.

b) 7-bromo-dibenz[b,f][1,4]oksazepina

Stosując ogólną procedurę z J. Chem. Soc., Perkin I 1976, 1279-1285, związek z wytwarzania 18(a) ogrzewa się w mieszaninie kwasu polifosforowego i tlenochlorku fosforu z wytworzeniem związku tytułowego.

c) 7-bromo-10,11-dihydro-dibenzo[b,e][1,4]oksazepino-11-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 16(c) i zastępując związek z wytwarzania 16(b) związkiem z wytwarzania 18(b), otrzymuje się związek tytułowy.

d) 7-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,e][1,4]oksazepino-11-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 1(i) i zastępując związek z wytwarzania 1(h) związkiem z wytwarzania 19(c), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 19

7-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepino-11-octan metylu a) 2-fenylotio-4-(bromo)anilina

Disiarczek 3-bromo-6-nitrodifenylu, wytworzony jak opisano w J. Chem. Soc. B 1966, 963-72, poddaje się redukcji chlorkiem cynawym z wytworzeniem tytułowego związku.

b) 7-bromo-dibenz[b,f][1,4]tiazepina

Stosując procedurę z Helv. Chem. Acta 1964, 47, 1163-72, i zastępując 2-(fenylotio)anilinę związkiem z wytwarzania 19(a), otrzymuje się związek tytułowy.

c) 7-bromo-10,11-dihydro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepino-11-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 16(c) i zastępując związek z wytwarzania 16(b) związkiem z wytwarzania 19(b), otrzymuje się związek tytułowy.

d) 7-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f][1,4]tiazepino-11-octan metylu

Stosując ogólną procedurę z wytwarzania 1(i) i zastępując związek z wytwarzania 1(h) związkiem z wytwarzania 19(c), otrzymuje się związek tytułowy.

Przykład wytwarzania 20

2-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f]oksepino-10-octan metylu a) 2-metoksy-dibenzo[b,f]oksepin-10(11H)-on

Stosując ogólną procedurę z J. Heterocycl. Chem., 1986, 23, 265-9 i zastępując 4-fluorofenol fenolem, otrzymuje się związek tytułowy.

b) 2-karboksy-10,11-dihydro-dibenzo[b,f]oksepino-10-octan metylu

Stosując procedurę z wytwarzania 1(e-i) i zastępując związek z wytwarzania 1(d) związkiem z wytwarzania 20(a), otrzymuje się związek tytułowy.

Poniższe związki ilustrują sposoby wytwarzania biologicznie aktywnych związków według wynalazku ze związków pośrednich takich jak opisane w powyższych przykładach wytwarzania.

P r z y k ł a d I

Wytwarzanie soli sodowej kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]metyloamino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.

a) (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]metyloamino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

EDC (202,4 mg, 1,06 mmol) dodano jednorazowo do roztworu (±)10,11-dihydro-3-karboksy-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (285,6 mg, 0,88 mmol), dichlorowodorku 2-(metyloamino)metylobenzimidazolu (247,2 mg, 1,06 mmol), HOBt-H₂O (142,7 mg, 1,06 mmol), i diizopropyloetyloaminy (0,61 ml, 3,52 mmol) w bezwodnym DMF (4,4 ml) w temperaturze pokojowej.

Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 16,5 godziny, następnie zatężono na wyparce obrotowej (silnie obniżone ciśnienie). Pozostałość ponownie zatężono z ksylenów, następnie rozpuszczono w H2O (5 ml). W wyniku ekstrakcji EtOAc (2x5 ml), suszenia (MgSO4), zatężenia, i chromatografii (żel krzemionkowy, 5% MeOH w 1:1 EtOAc/CHCl3) otrzymano tytułowy związek jako bladożółtą pianę (389,2 mg, 95%): TLC Rf(10% MeOH w 1:1 EtOAc/CHCl3) 0,60;

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,70-7,80 (m, 1H), 7,40-7,50 (m, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,21-7,32 (m, 3H), 7,04-7,21 (m, 5H), 4,76-4,88 (m, 2H), 4,36 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,18 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,90 (d, J = 15,2 Hz, 1H). 3,82-3,95 (m, 1H), 3,38 (dd, J = 15,4, 4,0 Hz, 1H), 3,11 (s, 3H), 3,03 (dd, J = 15,4, 9,5 Hz, 1H). 2,69 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,8, 9,6 Hz, 1H), 1,27 (c, J = 7,1 Hz, 3H);

PL 191 595 B1

FTIR (CCl4) 2700-3470 (szerokie), 1735, 1629 (ramię), 1617, 1484, 1454, 1422, 1397, 1271, 1180, 1157 cm^-1; MS (ES) m/e 468,2 (M+H)⁺

b) sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]metyloamino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepteno-10-octowego

Do mieszaniny (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]metyloamino]karbonylo]5H-dibenzo[a,d]cyklo-hepteno-10-octanu etylu (389,2 mg, 0,83 mmol) w THF (4,2 ml) i H2O (3,2 ml) dodano 1,0 N LiOH (1,0 ml, 1,0 mmol) i powstały żółty roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, w temperaturze 40°C przez 15 godzin, następnie w temperaturze wrzenia przez 0,5 godziny. Mieszaninę reakcyjną następnie zatężono do suchej masy na wyparce obrotowej, i pozostałość rozpuszczono w H2O(4 ml). Roztwór przemyto Et2O (2x 4 ml), i warstwy Et2O odrzucono. Warstwę wodną przesączono w celu usunięcia części stałych, następnie zobojętniono 1,0 N HCl (1,0 ml). Strącone ciało stałe odsączono z odsysaniem i przemyto H2O, następnie rozpuszczono w gorącym 1:1 CH3CN/ H2O. Roztwór przesączono na gorąco w celu usunięcia nierozpuszczalnego brunatnego oleju, i pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Ponieważ produkt był olejem, mieszaninę zatężono do suchej masy na wyparce obrotowej. Pozostałość rozpuszczono w MeOH (2 ml), i dodano 5% NaHCO3 (2 ml). Mieszaninę ogrzano do jednorodnego roztworu, następnie zatężono w celu usunięcia MeOH. W wyniku chromatografii ODS (30% MeOH/H2O, powtórnej chromatografii z 1:1 MeOH/H2O), zatężenia i liofilizacji otrzymano tytułowy związek jako bezbarwny proszek (187,5 mg, 45%): HPLC k' 1,47 (Hamilton PRP1®, 35% CH3CN/H2O -0,1% TFA);

¹H NMR (400 MHz, CD3OD) mieszanina rotameryczna; 6,80-7,65 (m, 11H), 4,64-5,05 (m, 2H),

3,68-4,41 (m, 3H), 2,87-3,46 (m, 5H), 2,30-2,58 (m, 2H); MS (ES) m/e 440,2 (M+H)⁺.

Analiza: Obliczone dla C₂₇H₂₄N₃O₃Na-2,25 H₂O:

C, 64,60; H, 5,72; N, 8,37.

Znalezione: C, 64,52; H, 5,80; N, 8,27.

P r z y k ł a d II

Wytwarzanie kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[1-(4,4'-bipiperydynylo)karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

a) (±)-10,11-dihydro-3-[1-(1'-BOC-4,4'-bipiperydynylo)-karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno10-octan etylu

Do roztworu (±)-10,11-dihydro-3-karboksy-5H-di-benzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (296,3mg,

0,91 mmol), 1-BOC-4,4'-bipiperydyny (293 mg, 1,09 mmol), HOBt-H₂O (147,6 mg, 1,09 mmol), i diizopropyloetyloaminy (0,32 ml, 1,82 mmol) w bezwodnym DMF (4,6 ml) dodano w całości EDC (209,3 mg, 1,09 mmol) w temperaturze pokojowej. Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, następnie zatężono na wyparce obrotowej (silnie obniżone ciśnienie). Pozostałość ponownie zatężono z ksylenów, następnie rozpuszczono w H2O (5 ml). W wyniku ekstrakcji EtOAc (2x5 ml), suszenia (MgSO4), zatężeniai chromatografii na żelu krzemionkowym (7:3 EtOAc/heksany) otrzymano tytułowy związek jako jasnożółtą pianę (463,4 mg,89%): TLC Rf (7:3 EtOAc/heksany) 0,59;

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 6,94-7,46 (m, 7H), 4,58-4,88 (m, 1H), 4,37 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,89 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 3,68-4,30 (m, 4H), 3,38 (dd, J = 15,3, 4,1 Hz, 1H), 3,01 (dd, J = 15,3, 9,4 Hz, 1H), 2,40-3,09 (m, 5H), 1,45 (s, 9H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 0,85-1,90 (m, 11H); FTIR (CCl4) 1734, 1694, 1637, 1426, 1171 cm^-1; MS (ES) m/e 1149,8 (2M +H)⁺, 597,4 (M+Na)⁺, 575,4 (M+H)⁺, 519,4 (M+H-C4H8)⁺

b) kwas (±)-10,11-dihydro-3-[1-(4,4'-bipiperydynylo)-karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno10-octowy

Niejednorodną mieszaninę (±)-10,11-dihydro-3-[1-(1'-BOC-4,4'-bipiperydynylo)karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (463,4 mg, 0,81 mmol), 1,0 N LiOH (1,0 ml, 1,0 mmol), THF (4,1 ml), i H2O (3,1 ml) mieszano w temperaturze 40°C. Po 17 godzinach jednorodny roztwór ochłodzono lodem i zakwaszono 1,0 N HCl (1,5 ml). Po ekstrakcji CH2Cl2 (3 x 10 ml), suszeniu (MgSO4), i zatężeniu otrzymano białawą pianę. Rozpuszczono ją w CH2Cl2 (4,1 ml), i roztwór ochłodzonodo 0°C. Dodano TFA (4,1 ml) w jednej porcji, i mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej. Po 1,5 godziny jasnożółty roztwór zatężono do suchej masy na wyparce obrotowej wytwarzając olej. W wyniku chromatografii ODS (30% CH3CN/H2O-0,1% TFA), zatężenia i liofilizacji uzyskano tytułowy związek jako bezbarwny proszek (437,2 mg, 86%): HPLC k' 1,91 (Hamilton PRP-1^® 30% CH3CN/H2O -0,1% TFA);

PL 191 595 B1 ¹H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7,02-7,29 (m, 7H), 4,53-4,73 (m, 1H), 4,34 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,99 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,65-3,89 (m, 2H), 3,30-3,50 (m, 3H), 2,70-3,15 (m, 5H), 2,68 (dd, J = 16,0,

5,2 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 16,0, 9,1 Hz, 1H), 1,06-2,09 (m, 10H); MS (ES) m/e 447,2 (M +H)⁺.

Analiza: obliczone dla: C₂₈H₃₄N₂O₃-1,5 CF₃CO₂H-0,75 H₂O:

C, 59,00; H, 5,91; N, 4,44.

Znalezione: C, 58,96; H, 6,00; N, 4,50

P r z y k ł a d III

Wytwarzanie soli sodowej kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

a) 4-(2-tetrahydropiranyloksy)-1-tributylostannylo-1-butyn

Roztwór n-butylolitu w heksanach (1,6 M, 18,8 ml, 30 mmol) dodano w strumieniu w czasie 2minut do roztworu 2-(3-butynyloksy)tetrahydro-2H-piranu (4,7 ml, 30 mmol) w suchym THF (60 ml) w temperaturze 0°C pod argonem. Po 0,5 godziny dodano w jednej porcji chlorek tributylocyny (8,1 ml, 30 mmol), i całość ogrzano do temperatury pokojowej. Po 3 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono heksanami (300 ml) i przemyto kolejno H2O(2 x 60 ml), 10% KF (2 x 30 ml) i nasyconą solanką (60 ml). W wyniku suszenia (Na2SO4), zatężenia i chromatografii na żelu krzemionkowym (3% EtOAc/heksany) otrzymano tytułowy związek (3,58 g, 27%) jako prawie bezbarwny olej: TLC (5% EtOAc/heksany) Rf 0,37;

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 4,66 (wąskie t, 1H), 3,75-3,96 (m, 2H), 3,49-3,62 (m, 2H), 2,56 (pozorne t, 2H), 1,76-1,91 (m, 1H), 1,65-1,78 (m, 1H), 1,42-1,65 (m, 10H), 1,22-1,41 (m, 6H), 0,82 -1,08 (m, 15H).

b) (±)-3-[4-(2-tetrahydropiranyloksy)-1-butyn-1-ylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Mieszaninę (2)-10,11-dihydro-3-(trifluorometanosulfonyloksy)-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (1,34 g, 3,13 mmol), 4-(2-tetrahydropiranyloksy)1-tributylostannylo-1-butynu (1,66 g, 3,76 mmol), LiCl (398 mg, 9,39 mmol), di-chlorku bis(trifenylofosfino)palladu (110 mg, 0,094 mmol), i bezwodnego dioksanu (31 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod argonem. Po 1,5 godziny, mieszaninę reakcyjną zatężono usuwając większość dioksanu, i pozostałość rozpuszczono w Et2O (100 ml). Dodano 10% KF (50 ml) i mieszaninę mieszano energicznie przez 0,5 godziny. Wodną warstwę usunięto i warstwę Et2O przesączono przez mieszaninę celite^® i MgSO4. Przesącz zatężono i pozostałość poddano chromatografii na żelu krzemionkowym (10% EtOAc/heksany) otrzymując związek tytułowy (1,12 g, 83%) jako bladożółty olej: TLC (20% EtOAc/heksany)Rf 0,40;

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,21-7,30 (m, 1H), 7,06-7,20 (m, 5H), 7,00 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,69 (t, J = 3,6 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,11-4,23 (m, 2H), 3,76-3,97 (m, 4H), 3,59-3,68 (m, 1H), 3,48-3,57 (m, 1H), 3,34 (dd, J = 15,2, 4,1 Hz, 1H), 2,97 (dd, J = 15,2, 9,5 Hz, 1H), 2,70 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,65 (dd, J = 15,7, 4,8 Hz, 1H), 2,51 (dd, J = 15,7, 9,5 Hz, 1H), 1,78-1,92 (m, 1H), 1,68-1,78 (m, 1H), 1,44-1,68 (m, 4H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 455 (M + Na)⁺.

c) (±)-3-[4-(2-tetrahydropiranyloksy)-1-butylo]-5H-di-benzo[a,d]cyklohepteno-1 0-octan etylu

Mieszaninę (±)-3-[4-(2-tetrahydropiranyloksy)-1-butyn-1-ylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (1,2 g, 2,77 mmol), 10% Pd/C (0,3 g, 0,28 mmol), i EtOAc (28 ml) wytrząsano w temperaturze pokojowej pod wodorem (344 kPa) w aparacie Parra. Po 3 godzinach mieszaninę przesączono przez celit^® i przesącz zatężono. Po poddaniu jej chromatografii na żelu krzemionkowym (10% EtOAc/heksany) otrzymano związek tytułowy (1,06 g, 88%) jako bezbarwny olej: TLC (20% EtOAc/heksany) Rf 0,51;

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,05-7,20 (m, 4H), 6,92-7,03 (m, 3H), 4,53-4,60 (m, 1H), 4,34 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 4,12-4,26 (m, 2H), 3,80-3,90 (m, 3H), 3,71-3,80 (m, 1H), 3,44-3,53 (m, 1H), 3,35-3,44 (m, 1H), 3,33 (dd, J = 15,1, 4,1 Hz, 1H), 2,95 (dd, J = 15,1, 9,4 Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,5, 4,9 Hz, 1H), 2,49-2,61 (m, 3H), 1,77-1,90 (m, 1H), 1,45-1,77 (m, 9H), 1,27 (t, J= 7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 459 (M+Na)⁺.

d) (±)-3-[4-hydroksy-1-butylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklo-hepteno-10-octan etylu

Roztwór (±)-3-[4-(2-tetrahydropiranyloksy)-1-butylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (456,0 mg, 1,04 mmol) i monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego (611 mg, 0,31 mmol) w absolutnym EtOH (10 ml) mieszano w temperaturze pokojowej. Po 2 godzinach reakcję zatrzymano 5% NaHCO3 (1 ml) i mieszaninę zatężono dla usunięcia EtOH. Pozostałość rozcieńczono H2O (2 ml) i ekstrahowano CH2Cl2. Po wysuszeniu (MgSO4), zatężeniu i chromatografii na żelu krzemionkowym (1:1 EtOAc/heksany) otrzymano tytułowy związek (342,4 mg, 93%) jako bezbarwny olej: TLC (1:1 EtOAc/heksany) Rf 0,49;

PL 191 595 B1 ¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 6,85-7,25 (m, 7H), 4,34 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 4,08-4,30 (m, 2H), 3,75-3,95 (m, 2H), 3,53-3,72 (m, 2H), 3,33 (dd, J = 15,1, 4,1 Hz, 1H). 2,95 (dd, J = 15,1, 4,1 Hz, 1H), 2,40-2,75 (m, 4H), 1,45-1,80 (m, 4H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 353 (M+ H)⁺.

e) (±)-3-[3-karboksy-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Roztwór (±)-3-[4-hydroksy-1-butylo]-5H-dibenzo-[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (342,4 mg, 0,97 mmol) w bezwodnym CH2Cl2 (19 ml) ochłodzono do 0°C pod argonem, i dodano chlorek 2,2,6,6-tetrametylooksopiperydyniowy (J. Org. Chem., 1985, 50, 1332-1334; 260 mg, 1,36 mmol) w jednej porcji. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez godzinę, następnie dodano 2-metylo-2-buten (1,2 ml, 11,64 mmol) i zimny (0°C) roztwór NaClCO2 (0,88 g, 7,76 mmol) i NaH2PO4 (0,90 g, 6,50 mmol) w H2O (26 ml). Po 10 minutach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono EtOAc (100 ml) i warstwy rozdzielono. Organiczną warstwę przemyto kolejno zimnym 1,0 N HCl (10 ml) i nasyconą solanką (20 ml), osuszono (MgSO4) i zatężono. Po chromatografii na żelu krzemionkowym (gradient: 1:1 EtOAc/CHCl3, potem 9:9:2 EtOAc/CHCl3/EtOH) uzyskano zanieczyszczony związek tytułowy. W wyniku ponownej chromatografii na żelu krzemionkowym (7:3:0,1 toluen/EtOAc/AcOH) otrzymano czysty tytułowy związek (233,7 mg, 66%): TLC (1:1 EtOAc/CHCl3) Rf 0,46;

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,05-7,22 (m, 4H), 6,92-7,05 (m, 3H), 4,34 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,10-4,25 (m, 2H), 3,80-3,90 (m, 2H), 3,33 (dd, J = 15,1, 4,1 Hz, 1H), 2,95 (dd, J = 15,1, 9,4 Hz, 1H), 2,48-2,60 (m, 4H), 2,48-2,60 (m, 4H), 2,37 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,87-2,00 (m, 2H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H); MS (ES) m/e 389 (M + Na)⁺, 367 (M + H)⁺.

f) (±)-3-[3-[[(2-aminofenylo)amino]karbonylo]prop-1-ylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Roztwór (±)-3-[3-karboksy-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]-cyklohepteno-10-octanu etylu (233,7 mg,

0,64 mmol) w suchym THF (6,4 ml) ochłodzono do 0°C pod argonem, i dodano 4-metylomorfolinę (0,14 ml, 1,28 mmol). Roztwór mieszano w temperaturze 0°C przez kilka minut, następnie dodano kroplami chloromrówczan izobutylu (0,11 ml, 0,83 mmol). Mętną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C przez 0,5 godziny, następnie dodano szybko roztwór 1,2-fenylenodiaminy (138 mg, 1,28 mmol) w suchym THF (0,6 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez 3 godziny, następnie rozcieńczono H2O (2 ml) i ekstrahowano EtOAc. Po wysuszeniu (MgSO4), zatężeniu i chromatografii na żelu krzemionkowym (3:2 EtOAc/heksany) otrzymano związek tytułowy (257,6 mg, 88%) jako jasnożółtą pianę: TLC (3:2 EtOAc/heksany) Rf 0,40;

¹H NMR (250 MHz, CDCl3) d 6,90-7,23 (m, 10H), 6,72-6,80 (m, 2H), 4,33 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,10-4,25 (m, 2H), 3,71-3,91 (m, 4H), 3,32 (dd, J = 15,1, 4,0 Hz, 1H), 2,95 (dd, J = 15,1, 9,5 Hz, 1H), 2,59-2,72 (m, 3H), 2,54 (dd, J = 15,6, 9,5 Hz, 1H), 2,34 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 1,98-2,09 (m, 2H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); MS (ES) m/e 457 (M + H)⁺.

g) (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

Roztwór (±)-3-[3-[[(2-aminofenylo)amino]karbonylo]prop-1-ylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu (257,6 mg, 0,56 mmol) w lodowatym AcOH (2,8 ml) i suchym THF (2,8 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia pod argonem. Po 3 godzinach mieszaninę reakcyjną zatężono i pozostałość ponownie zatężono z ksylenów. Powstałą pozostałość roztworzono w Et2O (30 ml) i przemyto kolejno 1,0 N NaOH (2 ml), H2O (2 ml) i nasyconą solanką (2 ml). Po wysuszeniu (MgSO4), zatężeniu i chromatografii na żelu krzemionkowym (2% EtOH w 1:1 EtOAc/heksany) otrzymano związek tytułowy (236,3 mg, 96%) jako białawą pianę: TLC (2% EtOH w 1:1 EtOAc/heksany) Rf 0,34;

¹HNMR (400 MHz, CDCl3) d 7,30-7,80 (m, 2H), 7,03-7,24 (m, 6H), 6,80-6,95 (m, 3H), 4,12-4,28 (m, 3H), 3,77-3,89 (m, 1H), 3,74 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 3,28 (dd, J = 15,2, 4,0 Hz, 1H), 2,90 (dd, J = 15,2, 9,5 Hz, 1H), 2,84 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 2,65 (dd, J = 15,7, 4,9 Hz, 1H), 2,60 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,52 (dd, J = 15,7, 9,6 Hz, 1H), 2,03-2,18 (m, 2H), 1,28 (t, J = 7,1Hz, 3H); MS (ES) m/e 439 (M+H)⁺.

h) sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

Mieszaninę (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno10-octanu etylu (236,3 mg, 0,54 mmol), 1,0 N NaOH (0,65 ml, 0,65 mmol), i absolutnego EtOH (4,8 ml) ogrzewano na łaźni olejowej ustawionej na 50°C. Po 16 godzinach mieszaninę reakcyjną zatężono do suchej masy i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii ODS (gradient: 35% MeOH/H2O, następnie 40% MeOH/H2O). Zatężenie i liofilizacja dała związek tytułowy (143 mg, 58%) jako bezbarwny proszek: HPLC (PRP-1^®, 40% CH3CN/H2Ozawierające 0,1% TFA) K¹ = 1,5;

¹H NMR (400 MHz, CD3OD) d 7,41-7,49 (m, 2H), 6,86-7,27 (m, 9H), 4,24 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,87 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,73-3,85 (m, 1H), 3,23-3,25 (m, 1H, częściowo zasłonięte przez resztowy

PL 191 595 B1 sygnał rozpuszczalnika), 2,80-2,93 (m, 3H), 2,62 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,56 (dd, J = 14,4, 5,1 Hz, 1H),

2,40 (dd, J= 14,4, 9,7 Hz, 1H), 2,05-2,17 (m, 2H); MS (ES) m/e 411 (M+H)⁺.

Analiza: Obliczone dla C27H2₅N2O2Na-1,5 H2O: C, 70,57; H, 6,14; N, 6,10.

Znalezione: C, 70,65; H, 5,95; N, 5,95.

P r z y k ł a d IV

Wytwarzanie soli sodowej kwasu (±)-10,1 1-dihydro-3-[[[2-(2-pirydyloamino)etylo)amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

a) (±)-10,1 1-dihydro-3-[[[2-(2-pirydyloamino)etylo)amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octan etylu

EDC (112,7 mg, 0,59 mmol) dodano w jednej porcji do roztworu (±)-10,11-dihydro-3-karboksy5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (157,8 mg, 0,49 mmol), dichlorowodorku 2-[(2-aminoetylo)amino]pirydyny (123,5 mg, 0,59 mmol), HOBt-H₂O (79,5 mg, 0,59 mmol), i diizopropyloetyloaminy (0,43 ml, 2,45 mmol) w bezwodnym DMF (2,5 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, następnie zatężono. Pozostałość ponownie zatężono z ksylenów, następnie rozcieńczono H2O(5 ml) i ekstrahowano kolejno EtOAc (2x5 ml) i CHCl3 (2x5 ml).Warstwy organiczne połączono i potraktowano niewielką ilością MeOH w celu rozpuszczenia małej ilości nierozpuszczalnej substancji. Po wysuszeniu (MgSO4), zatężeniu i chromatografii na żelu krzemionkowym (5%, MeOH/CHCl3) otrzymano związek tytułowy (199,1 mg, 92%) jako żółty olej: TLC (5% MeOH/CHCl3) Rf 0,42;

¹HNMR (400, CDCl3) d8,10 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 8,02 (br s, 1H), 7,60 (pozorne wąskie d, 1H), 7,53 (pozorne dd, 1H), 7,33-7,42 (m, 1H), 7,08-7,22 (m, 5H), 6,57-6,65 (m, 1H), 6,45 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,79-4,90 (m, 1H), 4,36 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 4,11-4,26 (m, 2H), 3,92 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 3,80-3,95 (m, 1H), 3,55-3,72 (m, 4H), 3,38 (dd, J = 15,2, 4,1 Hz, 1H), 3,03 (dd, J = 15,2, 9,5 Hz, 1H), 2,66 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,50 (dd, J = 15,8, 9,6 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H); MS (ES) m/e 444 (M + H)⁺.

h) sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[2-(2-pirydyloamino)etylo)amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego

Roztwór (±)-10,11-dihydro-3-[[[2-(2-pirydyloamino)-etylo)amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octanu etylu (199,1 mg, 0,45 mmol) i 1,0 N NaOH (0,54 ml, 0,54 mmol) w absolutnym EtOH (4 ml) ogrzewano na łaźni olejowej ustawionej na 45°C. Po 23 godzinach mieszaninę zatężono i pozostałość oczyszczono metodą chromatografii ODS (gradient: 30% MeOH/H2O, potem 40% MeOH/H2O). Po zatężeniu i liofilizacji otrzymano związek tytułowy (95,8 mg, 46%) jako prawie bezbarwny proszek: HPLC (PRP-1^®, 30% CH3CN/H2O zawierające 0,1% TFA) K¹= 2,0;

¹HNMR (400 MHz, CD3OD) d 7,92 (pozorne d, J = 4,2 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,53 (dd, J = 7,9, 1,8 Hz, 1H), 7,38-7,47 (m, 1H), 7,01-7,24 (m, 5H), 6,56 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,50-6,60 (m, 1H), 4,34 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 3,97 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 3,78-3,89 (m, 1H), 3,44-3,61 (m, 4H), 3,39 (dd, J = 15,4, 4,4 Hz, 1H), 3,00 (dd, J = 15,4, 10,2 Hz, 1H), 2,61 (dd, J = 14,9, 5,1 Hz, 1H), 2,43 (dd, J = 14,9, 9,5 Hz, 1H); MS (ES) m/e 416 (M+H)⁺.

Analiza: Obliczone dla C₂₅H₂₄N₃O₃Na-1,33 H₂O:

C,65,07; H, 5,82; N, 9,11.

Znalezione: C, 65,02; H, 5,62; N, 9,17.

Powyższy opis w pełni ujawnia, jak wytwarzać i stosować związki według niniejszego wynalazku. Różne odnośniki do czasopism, patentów i innych publikacji cytowanych tutaj obejmują stan techniki i dołącza się je na zasadzie odniesienia, jak gdyby były załączone w całości.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Antagonista receptorów integryny,którym jest:

   sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[(1H-benzimidazol-2-ilo)metylo]-metyloamino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego;

   kwas (±)-10,11-dihydro-3-[1-(4,4'-bipiperydynylo)karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowy;

   sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-benzimidazolilo)-1-propylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego; lub

   PL 191 595 B1 sól sodowa kwasu (±)-10,11-dihydro-3-[[[2-(2-pirydylo-amino)etylo]amino]karbonylo]-5H-dibenzo[a,d]cyklohepteno-10-octowego.
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i nośnik, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera związek określony w zastrz. 1.