PL183976B1

PL183976B1 - Sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików - pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD)

Info

Publication number: PL183976B1
Application number: PL97320274A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Fitzner; Wiesław Niedbalski; Andrzej Kęsy; Grażyna Paprocka
Original assignee: Panstwowy Inst Weterynaryjny
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1997-05-28
Publication date: 2002-08-30
Also published as: PL320274A1

Abstract

Sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików - pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD), znamienny tym, że stosuje się w nim surowicę opłaszczającą kurzą surowicę odpornościową anty-VHD, antygen wirusa pomoru królików, surowicę wykrywającąsurowicę odpornościową świnki morskiej anty-VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny oraz surowice referencyjne królicze, ujemną wysokododatnią i niskododatnią- progową przeciw wirusowi VHD i zestaw tak uzyskany jest wykorzystywany do oceny obecności i określania miana przeciwciał w surowicach zwierząt.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików -pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD).

Test ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)jest powszechnie znany i wykorzystywany w diagnostyce wielu chorób zakaźnych. Jest uważany za metodę czułą i specyficzną a przy tym szybką i prostą w wykonaniu.

183 976

W przypadku pomoru królików, znane są testy diagnostyczne ELISA, które stosowane są do wykryWania i ilościowej oceny przeciwciał neutralizujących. W komercyjnie dostępnym zestawie opracowanym w Istituto Zooprofilattico Sperimentale w Brescii (Włochy) wykorzystano zasadę współzawodnictwa (ang. competition ELISA). Płytkę opłaszcza się swoistą króliczą surowicą odpornościową po czym nanosi się mieszaninę badanej surowicy oraz stałej dawki antygenu wirusa pomoru królików. W następnym etapie wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne VHDV związane z peroksydazą chrzanową (koniugat) a obecność przeciwciał określa się w po reakcji barwnej z substratem. Oceny wyników dokonuje się poprzez porównanie OD492 badanych prób, z wartościami ekstynkcji prób kontrolnych, dodatniej i ujemnej.

Wadą tego testu są wysokie koszty związane z otrzymaniem i standaryzacją przeciwciał monoklonalnych. Otrzymanie i wybór odpowiednich klonów komórek hybrydowych jest pracochłonny, a wynik trudny do przewidzenia.

Dotychczas stosowana metoda serologiczna do oceny przeciwciał - odczyn zahamowania hemaglutynacji (HI), ze względu na stosunkowo niską czułość, pracochłonność, a także konieczność ciągłego posiadania świeżych erytrocytów, w ograniczonym zakresie spełnia kryteria diagnostyczne.

Celem wynalazku jest rozwiązanie tego problemu i dostarczenie weterynaryjnym laboratoriom diagnostycznym testu ELISA do badania surowic królików oraz innych gatunków zwierząt na obecność przeciwciał VHD.

Sposób według wynalazku polega na wykorzystaniu w teście ELISA w modyfikacji LPBE (ang. liquid-phase blocking ELISA) swoistej odpornościowej surowicy kurzej antyVHD, antygenu wirusa pomoru, swoistej surowicy odpornościowej świnki morskiej antyVHD, koniugatu antyglobulinowego, substratu enzymatycznego oraz króliczych surowic kontrolnych - wysokododatniej w kierunku VHD, niskododatniej - progowej w kierunku VHD i ujemnej. W przypadku gdy surowica badana zawiera przeciwciała dla użytego antygenu, to w fazie płynnej (ang. liquid phase) następuje ich związanie z antygenem, w związku z tym jest on niedostępny dla surowic wykrywających - kurzej i świnki morskiej. W efekcie nie dochodzi do wiązania koniugatu i w konsekwencji brak jest reakcji barwnej. Wyniki interpretuje się w odniesieniu do wartości absorbcji (OD₄₉₂) dla prób kontrolnych. Prawidłowa reakcja tych prób, tzn. surowicy kontrolnej ujemnej, wysokododatniej oraz progowej a także kontroli antygenu - bez surowicy jest wykładnikiem właściwego przebiegu reakcji immunoenzymatycznej. Surowicę, której wartość OD^nm jest niższa niż 50% średniej wartości ekstynkcji dla kontroli antygenu należy traktować jako dodatnią. Miano surowic określa się metodą kolejnych rozcieńczeń, po określeniu punktu końcowego wynoszącego 50% wartości OD₄₉₂dla kontroli antygenu.

Swoiste surowice odpornościowe wyprodukowano stosując zinaktywowany, wysoce oczyszczony antygen wirusa pomoru królików (VHD) - zawierający dominujący polipeptyd VP60. Surowicę odpornościowy kury oraz świnki morskiej uzyskano w wyniku czynnego uodpornienia drogą iniekcji podskórnej w/w preparatem. W sposobie według wynalazku jako surowicę opłaszczającą stosuje się swoistą kurzą surowicę anty-VHD, uzyskaną w wyniku immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików. Antygen pomoru królików stanowi 20% zawiesina wątrób królików zakażonych wirusem pomoru królików, zinaktywowana 1 oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowanie glicerolem. Jako surowicę wykrywającą stosuje się swoistą anty-VHD surowicę świnki morskiej uzyskaną drogą immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików. Koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową. Substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride -OPD zaktywowany H₂O.. Surowicę referencyjną ujemną w kierunku w kierunku krwotocznej choroby królików - VHD otrzymuje się przez zmieszanie w równych ilościach wielu porcji surowic pochodzących od królików klinicznie zdrowych, nieszczepionych, takich które nigdy nie miały kontaktu z wirusem pomoru. Surowicę referencyjną wysokododatnią (miano Hi > 2560) w kierunku krwotocznej choroby królików -VHD, stanowi surowica królicza otrzymana po immunizacji szczepionką przeciwko pomorowi królików i po zakażeniu zjadliwym wirusem VHD. Surowicę

183 976 referencyjną niskododatnią - progową stanowi surowica otrzymana po immunizacji królików szczepioiiką przeciwko pomorowi królików, po wystandaryzowaniu polegającym na rozcieńczeniu do miana HI 1/20 -1/40 przy pomocy surowicy ujemnej. Tak przygotowane reagenty stanowią gotowy zestaw diagnostyczny w kierunku przeciwciał VHD.

Użycie w teście ELISA swoistych surowic odpornościowych uzyskanych w oparciu o oczyszczony antygen wirusa VHD, gwarantuje wymaganą czułość, specyficzność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników. Możliwość zastosowania komercyjnie dostępnego koniugatu znacznie ułatwia przygotowanie zestawu oraz zmniejsza koszty badania. Wykorzystanie w teście układu kontrolnego złożonego z odpowiednich surowic referencyjnych pozwala szybko i precyzyjnie określić badane surowice jako dodatnie bądź ujemne.

Przykład wykonania

Do wykonania testu ELISA z użyciem surowic króliczych wykorzystano w zestawie płaskodenne mikropłytki ELISA o dużych właściwościach sorpcyjnych IgG oraz płytki okrągłodenne. Płytki ELISA opłaszcza się surowicą odpornościową kurzą anty-VHD w optymalnym rozcieńczeniu 1/8000 w buforze węglanowym o pH 9.6. Równolegle, na płytki okrągłodenne nanosi się surowice badane oraz referencyjne w rozcieńczeniu 1/10 lub w kolejnych rozcieńczeniach w postępie 2-krotnym, tj. 1/10,1/20,1/40 itd. w buforze PBS + 0.05% Tween 20 (PBST), po czym do wszystkich zagłębień nanosi się po 50 μΐ antygenu w rozcieńczeniu 1/10. Płytki inkubuje się przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia płytki ELISA przemywa się

5-ciokrotnie buforem PBST i do odpowiednich zagłębień przenosi po 50 μΐ mieszaniny antygen/surowica z płytki okrągłodennej. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C, płytkę przemywa się j/w i do każdej studzienki nakrapla się po 50 μΐ surowicy odpornościowej anty-VHD świnki morskiej rozcieńczonej w stosunku 1/5000 w buforze PBST zawierającym 3% albuminy bydlęcej (PBST-BSA). Płytkę inkubuje się 1 godzinę w temp. 37°C i po przemyciu j/w nakrapla koniugat (50 pl/zagłębienie) w rozcieńczeniu U1000 w buforze PBST +BSA. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C i po przemyciu j/w reakcję barwną wywołuje się dodając substrat (50 pl/zagłębienie) zawierający H₂O₂, w buforze cytrynianowym o pH 5.0. Po 15 minutach reakcję barwną hamuje się nakraplając po 50 pl 1.25 M H₂SO4

Wyniki odczytywać spektrofotometrycznie przy użyciu czytnika do mikropłytek przy długości fali 492 nm. Surowice, których wartość ekstynkcji w badaniu punktowym jest niższa niż 50% średniej wartości OD4 dla kontroli antygenu traktować jako pozytywne. Miano przeciwciał wyraża końcowe rozcieńczenie surowicy, przy którym wartość ekstynkcji stanowi 50% OD492 dla kontroli antygenu. Surowice referencyjne (ujemne, dodatnia i progowa) stanowią kontrolę prawidłowości wykonania badania.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików - pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD), znamienny tym, że stosuje się w nim surowicę opłaszczającą kurzą surowicę odpornościową anty-VHD, antygen wirusa pomoru królików, surowicę wykrywającą-surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny oraz surowice referencyjne królicze, ujemną wysokododatnią i niskododatnią- progową przeciw wirusowi VHD i zestaw tak uzyskany jest wykorzystywany do oceny obecności i określania miana przeciwciał w surowicach zwierząt.
2. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako surowicę opłaszczającą stosuje się swoistą kurzą surowicę anty-VHD, uzyskaną w wyniku immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików.
3. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że antygen wirusa pomoru królików - VHD stanowi 20% zawiesina wątrób królików zakażonych wirusem pomoru królików, zinaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem.
4. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako surowicę wykrywającą stosuje się swoistą anty-VHD surowicę świnki morskiej uzyskaną drogą immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików.
5. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową.
6. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że substratem enzymatycznym jest OPD z dodatkiem H2O2.
7. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną ujemną w kierunku krwotocznej choroby królików - VHD otrzymuje się przez zmieszanie w równych ilościach wielu porcji surowic pochodzących od królików klinicznie zdrowych, nieszczepionych, takich które nigdy nie miały kontaktu z wirusem pomoru.
8. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną wysokododatnią miano HI > 2560 w kierunku krwotocznej choroby królików - VHD stanowi surowica królicza otrzymana po immunizacji szczepionką przeciwko pomorowi królików i po zakażeniu zjadliwym wirusem VHD.
9. Sposób wg zastrzeżenia 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną niskododatniąprogową stanowi surowica otrzymana po immunizacji królików szczepionką przeciwko pomorowi królików, po wystandaryzowaniu polegającym na rozcieńczeniu do miana HI 1/20 - 1/40 przy pomocy surowicy negatywnej.