PL183983B1 - Sposób wykorzystania testu ELISA do diagnostyki wirusa krwotocznej choroby królików - pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD) - Google Patents

Abstract

Sposób wykorzystania testu ELISA do diagnostyki wirusa krwotocznej choroby królików- pomoru królików - Viral haemorrhagic disease ofrabbits (VHD), znamienny tym, że stosuje się w nim surowicę opłaszczającą - kurzą surowicę odpornościową anty-VHD, antygeny wzorcowe wirusa VHD dodatni o właściwościach hemaglutynacyjnych (HA+); dodatni pozbawiony tych właściwości (HA-) i ujemny, surowicę wykrywającą - surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny i zestaw tak uzyskany jest wykorzystywany do wykrywania antygenu wirusa pomoru królików oraz standaryzacji wirusa VHD do testu ELISA w kierunku przeciwciał VHD·

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykorzystania testu ELISA do wykrywania wirusa krwotocznej choroby królików - pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD).

Test ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest rutynowo stosowany w diagnostyce wielu chorób zakaźnych. Jest uważany za metodę czułą, specyficzną, powtarzalną szybką w wykonaniu oraz stosunkowo tanią.

W przypadku krwotocznej choroby królików; znane są testy diagnostyczne ELISA, które stosowane są do wykrywania wirusa VHD. Metodę pośrednią (ang. indirect sandwich ELISA) zastosowano w komercyjnie dostępnym zestawie opracowanym w Istituto Zooprofilattico Sperimentale w Bresci (Włochy). Na płytkę opłaszczoną swoistą króliczą surowicą odpornościową anty-VHD, nanosi się badany antygen, który następnie wykrywa się stosując koniugat, czyli swoiste przeciwciała monoklonalne związane z enzymem-peroksydazą chrzanową. Wizualnym

183 983 odzwierciedleniem obecności antygenu wirusa VHD - wynik dodatni, jest reakcja barwna z substratem. Intensywność reakcji barwnej odczytuje się spektrofotometrycznie i analizuje w odniesieniu do prób kontrolnych, negatywnej i pozytywnej. Wyniki interpretuje się ilościowo.

Wadą tego testu są wysokie koszty związane z otrzymaniem i standaryzacją przeciwciał monoklonalnych. Otrzymanie i wybór odpowiednich klonów komórek hybrydowych jest pracochłonny, a wynik trudny do przewidzenia. Dotychczas stosowany do wykrywania wirusa pomoru królików test hemaglutynacji (HA), z powodu niskiej czułości i potrzeby ciągłego posiadania świeżych erytrocytów, ma ograniczoną przydatność diagnostyczną. Ponadto, test jest nieprzydatny do diagnostyki szczepów wirusa VHD pozbawionych właściwości hemaglutynacyjnych. Celem wynalazku jest rozwiązanie tego problemu i dostarczenie weterynaryjnym laboratoriom diagnostycznym sposobu zastosowania testu ELISA do wykrywania antygenu wirusa VHD.

Sposób według wynalazku polega na wykorzystaniu w teście ELISA w modyfikacji pośredniej (ang. indirect sandwich) swoistej surowicy odpornościowej kury oraz świnki morskiej anty-VHD, koniugatu antyglobulinowego, substratu enzymatycznego, oraz antygenu referencyjnego dodatniego i ujemnego. W przypadku, gdy diagnozowana próba zawiera antygen wirusa VHD, to wiąże się on do surowicy opłaszczającej i w związku z tym jest dostępny dla immunoglobulin (IgG) anty-VHD obecnych w surowicy świnki morskiej. W efekcie dochodzi do wiązania koniugatu i powstania reakcji barwnej po inkubacji z substratem. Wyniki interpretuje się w odniesieniu do wartości absorbcji (OD₄₉₂) dla prób kontrolnych. Prawidłowa reakcj a tych prób, .tzn. pełne zabarwienie w zagłębieniu z antygenem dodatnim oraz brak zabarwienia w zagłębieniach kontrolnych, świadczy o właściwym przebiegu reakcji immunoenzymatycznej. Testowane próby, których wartość OD49 jest 2-krotnie wyższa od wartości ekstynkcji dla kontroli ujemnej należy traktować jako dodatnie. W celu określenia miana wirusa należy wykonać rząd kolejnych jego rozcieńczeń.

Swoiste surowice odpornościowe wyprodukowano stosując zinaktywowany, wysoce oczyszczony antygen wirusa pomoru królików (VHD), zawierający dominujący polipeptyd VP60. Surowicę odpornościową kury oraz świnki morskiej uzyskano w wyniku czynnego uodpornienia zwierząt drogą iniekcji podskórnej w/w preparatem. W sposobne według wynakizku jako surowicę opłaszcząjącą stosuje się swoistą kurzą surowicę anty-VHD, uzyskaną w wyniku immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików. Wzorcowy dodatni antygen vHd (VHDV HA+), stanowi 20% zawiesina wątrób królików zakażonych wirusem pomoru królików o właściwościach hemaglutynujących, zinaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem. Wzorcowy dodatni antygen VHD (VHDV HA-), stanowi 20% zawiesina wątrób królików zakażonych wirusem pomoru królików nie posiadającym właściwości hemaglutynujących, zinaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem.

Wzorcowy antygen ujemny stanowi 20% zawiesina uzyskana z wątroby zdrowych królików, oczyszczona chloroformem i zakonserwowana glicerolem. Jako surowicę wykrywającą stosuje się swoistą anty-VHD surowicę świnki morskiej uzyskaną drogą immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików. Koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-lgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydaząchrzanową. Substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride OPD zaktywowany H₂O₂.

Tak przygotowane reagenty stanowią gotowy zestaw diagnostyczny w kierunku obecności antygenu wirusa krwotocznej choroby królików oraz do standaryzacji reagentów niezbędnych do serologicznego testu ELISA w kierunku przeciwciał VHD.

Użycie w teście ELISA swoistych surowic odpornościowych uzyskanych w oparciu o oczyszczony antygen wirusa VHD, gwarantuje wysoką czułość, specyficzność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników. Możliwość zastosowania komercyjnie dostępnego koniugatu znacznie ułatwia przygotowanie zestawu oraz obniża koszty badania. Wykorzystanie w teście układu kontrolnego złożonego z antygenu kontrolnego dodatniego o właściwościach

183 983 hemaglutynacyjnych (HA+) oraz pozbawionego tych właściwości (HA-) a także antygenu kontrolnego ujemnego pozwala łatwo i precyzyjnie określić badane próby jako pozytywne lub negatywne.

Przykład wykonania

Do wykonania testu ELISA z użyciem surowic króliczych wykorzystano w zestawie mikropłytki ELISA o dużych właściwościach sorpcyjnych IgG oraz płytki okrągłodenne. Płytki ELISA opłaszcza się surowicą odpornościową kurzą anty-VHD w optymalnym rozcieńczeniu 1 /8000 w buforze węglanowym o pH 9.6 i pozostawia na noc w temperaturze 4°C.Po przemyciu buforem PBS + 0.05% Tween 20 (PBST), na płytkę nakrapla się próby badane oraz antygeny referencyjne w rozcieńczeniu 1/10, po czym płytkę umieszczoną na wytrząsarce inkubuje się przez 1 godz. w temp. 37°C. W następnym etapie, płytki przemywa 5-cio krotnie buforem PBST i do wszystkich zagłębień nakrapla się po 50 pl surowicy odpornościowej anty-VHD świnki morskiej rozcieńczonej w stosunku 1/5000 w buforze PBST zawierającym 3% albuminy bydlęcej (PBST-BSA). Płytkę inkubuje się 1 godzinę w temp. 37°C i po przemyciuj/w nakrapla się koniugat (50 pl/zagłębienie) w rozcieńczeniu 1/1000 w buforze PBST-BSA. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C i przemyciu j/w reakcję barwną wywoływano dodając substrat (50 pl/zagłębienie) zawierający H2O2, w buforze cytrynianowym o pH 5.0. Po 15 minutach reakcję hamuje się nakraplając po 50 pl 1.25 M H2SO4. Wyniki odczytywać spektrofotometrycznie przy długości fali 492 nm, stosując czytnik do mikropłytek. Próby badane, których wartość OD492 w badaniu punktowym jest dwukrotnie wyższa od wartości ekstynkcji dla kontroli negatywnej, uznaje się za dodatnie. Antygeny wzorcowe dodatnie, o właściwościach hemaglutynacyjnych (HA+) oraz pozbawiony tej właściwości (HA-), stanowią dodatkową kontrolę prawidłowości wykonania badania.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykorzystania testu ELISA do diagnostyki wirusa krwotocznej choroby królików - pomoru królików - Viral haemorrhagic disease of rabbits (VHD), znamienny tym, że stosuje się w nim surowicę opłaszczającą - kurzą surowicę odpornościową anty-VHD, antygeny wzorcowe wirusa VHD dodatni o właściwościach hemaglutynacyjnych (HA+); dodatni pozbawiony tych właściwości (HA-) i ujemny, surowicę wykrywającą - surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny i zestaw tak uzyskany jest wykorzystywany do wykrywania antygenu wirusa pomoru królików oraz standaryzacji wirusa VHD do testu ELISA w kierunku przeciwciał VHD.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako surowicę opłaszczającą stosuje się swoistą, kurzą surowicę anty-VHD, uzyskaną w wyniku immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako antygen wzorcowy dodatni (VHDV HA+) stosuje się 20% zawiesinę wątroby królików zakażonych wirusem VHD o właściwościach hemaglutynacyjnych, oczyszczonąprzez chloroformowanie, odwirowanie i zakonserwowanąglicerolem.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, żejako antygen wzorcowy dodatni (VHDV HA-) stosuje się 20% zawiesinę wątroby królików zakażonych wirusem VHD nie posiadającym właściwości hemaglutynacyjnych, oczyszczonąprzez chloroformowanie, odwirowanie i zakonserwowaną glicerolem.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako antygen wzorcowy ujemny stosuje się 20% zawiesinę wątroby królików zdrowych klinicznie, oczyszczoną przez chloroformowanie, odwirowanie i zakonserwowaną glicerolem.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako surowicę wykrywającą stosuje się swoistą anty-VHD surowicę świnki morskiej uzyskaną drogą immunizacji zwierząt oczyszczonym antygenem wirusa pomoru królików.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-lgG świnki morskiej związane z enzymem-peroksydazą chrzanową
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substratem enzymatycznym jest OPD z dodatkiem H2O2.